引用本文： 尤武林, 黃桂成, 王建偉. 微囊化轉基因 BMSCs 移植修復兔早期激素性股骨頭壞死實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(11): 1446-1453. doi: 10.7507/1002-1892.202003021 復制
激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of femoral head，SONFH）是大劑量激素作用引起脂肪代謝紊亂、股骨頭骨細胞變性、骨細胞有活力成分凋亡的病理過程[1-2]。目前治療 SONFH 的方式較多，包括脈沖電刺激、高壓氧治療等非手術方法，以及髓芯減壓、帶或不帶血管蒂骨瓣移植術等手術方法[3-5]，但均未達理想療效。如何有效防治 SONFH 是現階段研究熱點[6-7]。
采用微囊化組織或細胞移植是近年發展起來的一項新技術，它利用微囊的免疫阻隔作用以及半透膜特性，移植后可避免免疫排斥反應，同時發揮移植物的分泌功能等生物效應，達到治療相關疾病的目的[8]。而海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉（sodium alginate-poly-L-lysine-sodium alginate，APA）微囊具有半透性以及良好免疫隔離作用。BMSCs 具有強大的自我增殖能力和多向分化潛能，轉基因 BMSCs 可定向成骨分化。Foxc2 是屬于人類 forkhead 家族的一個重要轉錄因子，最初克隆于小鼠腦組織。過表達 Foxc2 的 BMSCs 具有較高的細胞活性，Foxc2 能促進 BMSCs 成骨分化，抑制其成脂分化。
微囊化轉基因 BMSCs 對于諸多疾病的治療意義重大，尤其對器官重建和損傷修復等疾病的治療更具前景。轉基因 BMSCs 微囊化后，因可持續分泌組織再生所需生長因子，微囊創造的三維環境為 BMSCs 生長和分化提供了有利場所。Ding 等[9]研究發現轉染 BMP-2 基因的 BMSCs 微囊化后，能誘導成骨細胞分化。Paek 等[10]研究發現，微囊化轉染 TGF-β1 基因的 BMSCs 能夠長期分泌目的蛋白 3 周。目前微囊化轉基因 BMSCs 技術在修復股骨頭壞死領域尚未見報道。為此，本研究通過制備 APA 微囊化轉基因 BMSCs，并移植至兔 SONFH 模型，觀察其治療作用，并分析可能作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 月齡健康純種新西蘭大白兔 46 只，雌雄不限，體質量（3.0±0.3）kg，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗前適應性喂養 1 周。
內毒素（Sigma 公司，美國）；造模用甲基強的松龍琥珀酸鈉（輝瑞公司，美國）；抗人 Foxc2 一抗、二抗（Santa Cruz 公司，美國）；抗兔骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、過氧化酶體增殖劑激活受體 γ 2（peroxisome proliferative activated receptor γ 2，PPARγ2）、VEGF、β-actin 一抗（Abcam 公司，美國）；SP 法免疫組織化學試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。萬能電子材料試驗機（濟南捷德機械設備有限公司）；H-7650 透射電鏡（Hitachi 公司，日本）；3.0T 超導型 MRI 掃描儀（GE 公司，美國）。
1.2 微囊化轉基因 BMSCs 的制備
取 2 只新西蘭大白兔，參照前期研究方法[11]制備 Foxc2 基因轉染的 BMSCs。依據高壓靜電法[12]實驗步驟，將 Foxc2 基因轉染的 BMSCs 以 1.5% 海藻酸鈉溶液重懸，調整細胞濃度至 1×106個/孔，加入注射器形成液滴，滴入 2.0%CaCl2 溶液中形成膠珠；置于 0.05% 多聚賴氨酸溶液中反應 5～10 min，浸入 0.03% 海藻酸鈉溶液中 5～10 min，PBS 清洗，置于 55 mmol/L 檸檬酸鈉溶液中使微囊液化，制備微囊化轉基因 BMSCs。
1.3 微囊化轉基因 BMSCs 成骨誘導培養及觀察
將制備的微囊化轉基因 BMSCs 以含 10%FBS 的 DMEM 培養液洗滌 2 次；將細胞沉淀以含 10%FBS 的 DMEM 培養液重懸，30 s 后加入培養瓶培養。以離心半徑 8 cm、900 r/min 離心 5 min，棄上清，加入培養液重懸后滴入培養瓶。取出 5 mL 微囊化轉基因 BMSCs 的 L-DMEM 培養液，加入 5 mL 破囊液破囊。將破囊后的微囊化轉基因 BMSCs 按 1×104個/孔接種于 24 孔板中，置于 4℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養，培養 2 周后更換為成骨誘導培養基（含 1×10–8 mol/L 地塞米松、50 μg/mL 抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉的 DMEM 培養基），行成骨誘導分化培養。培養 2、3 周分別取培養板行茜素紅染色，光鏡下觀察有無鈣結節形成。
1.4 SONFH 模型制備及實驗分組
1.4.1 SONFH 模型制備
取 40 只新西蘭大白兔經耳緣靜脈注射內毒素（10 μg/kg），24 h 后臀肌注射甲基強的松龍琥珀酸鈉（20 mg/kg）3 次，每次間隔 24 h。實驗過程中 4 只動物因腹瀉、發熱死亡。末次注射 6 周后剩余 36 只兔行 MRI 篩選，造模成功標準：符合早期 ONFH 影像學特征[13]，其中 T1 加權像股骨頭表現為片狀或點狀信號、T2 加權像表現為不規則片狀高信號（圖1）。共 32 只兔造模成功進行后續實驗。
圖1
造模 6 周后股骨頭 MRI
Figure1.
MRI of femoral head at 6 weeks after modeling
1.4.2 實驗分組
將 32 只 SONFH 模型動物隨機分為對照組（A 組）、髓芯減壓組（B 組）、髓芯減壓+BMSCs 組（C 組）及髓芯減壓+APA 微囊化轉基因 BMSCs 組（D 組），每組 8 只。另取 6 只正常兔作為正常對照組（E 組）。A 組模型動物不作任何處理。B、C、D 組采用 3% 戊巴比妥鈉（25 mg/kg）腹腔注射麻醉，取雙側后肢股骨頭進行髓芯減壓處理，縱行切開大轉子，切口長約 2 cm，沿外側肌間隙進入，充分暴露股骨大粗隆端，透視下自大粗隆下沿股骨頸向股骨頭中心鉆入一直徑 2.5 mm 斯氏針，深達關節軟骨面下 1～2 mm。減壓后，B 組于減壓區注入 5 μL 生理鹽水；C、D 組分別植入前期實驗[14]培養的 5 μL 同種異體兔 BMSCs 及 APA 微囊化轉基因 BMSCs，復合明膠海綿植入股骨頭病灶，骨蠟封閉減壓口，防止細胞溢出。術后連續 3 d 臀肌注射青霉素鈉預防感染，每天注射 1 次，每次 2×105 U。
1.5 觀測指標
1.5.1 一般情況
觀察各組動物術后存活及肢體運動情況。
1.5.2 組織學觀察
術后 6、12 周 A～D 組分別取 2 只動物，空氣栓塞法處死后取雙側股骨頭標本，置于 10% 中性甲醛緩沖液固定，脫鈣、脫水、透明、包埋、切片，片厚 4 μm。取部分切片，常規 HE 染色，光鏡下觀察骨長入情況。
1.5.3 免疫組織化學染色觀察
術后 6、12 周，取 A～D 組切片按 SP 法免疫組織化學染色試劑盒說明進行染色，光鏡下觀察 OCN、PPARγ-2 和 VEGF 蛋白表達，蛋白表達定位于細胞質及細胞膜，陽性染色呈棕黃色。各組每個股骨頭隨機選取 3 張切片，每張切片隨機選取 10 個視野（×200），SP 法免疫組織化學分析灰度值，取均值。E 組取 3 只動物兩側股骨頭制備切片進行染色觀測。
1.5.4 透射電鏡觀察
術后 12 周，A～D 組分別取 2 只動物，同上法處死后，用刀片刮取 1 mm×1 mm×1 mm 大小股骨頭軟骨下區組織，對標本進行固定、脫鈣，1% 鋨酸后固定，樹脂包埋，切片，片厚 4 μm。檸檬酸鋁和醋酸鈾進行染色，透射電鏡觀察組織超微結構。
1.5.5 生物力學測試
術后 12 周各組分別取 2 只動物，同上法處死后取雙側股骨頭標本，切取帶軟骨下骨骨塊及圓柱形垂直松質骨塊各 1 塊。游標卡尺測量軟骨下骨骨塊長 4.0 mm、寬 3.5 mm、高 3.0 mm，松質骨塊長 4.0 mm、寬 3.0 mm、高 2.0 mm。所有標本用生理鹽水持續沖洗，保持濕潤，密封，?30℃ 保存。將標本固定于萬能電子材料試驗機支架上，加載速度為 5 mm/min，松質骨及軟骨下骨均采用點壓技術，壓頭外徑為 2.54 mm，計算骨塊的最大壓縮強度及平均彈性模量。E 組取 3 只動物 6 個股骨頭負重區骨塊進行測量。
1.6 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；組內各時間點間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 微囊化轉基因 BMSCs 成骨誘導培養觀察
誘導培養 2、3 周，茜素紅染色后均可見鈣結節形成，且 3 周時數量較 2 周時增加。見圖2。
圖2
微囊化轉基因 BMSCs 成骨誘導培養觀察（茜素紅染色×100）
a. 培養 2 周；b. 培養 3 周
Figure2. Osteogenesis induction observation of the microcap-sulated transgenic BMSCs (Alizarin red staining×100)a. Cultured for 2 weeks; b. Cultured for 3 weeks
2.2 動物體內植入實驗
2.2.1 一般情況
各組實驗動物均存活至實驗完成。激素注射后第 2 天，動物出現精神萎靡，進食量、活動量減少情況；1 周，動物體質量減輕，但進食量及四肢負重已恢復正常；4 周，動物精神、體質量、進食及四肢活動負重情況均正常；6 周，動物出現輕度跛行；8 周，動物跛行加重。
2.2.2 組織學觀察
HE 染色示，A 組：骨壞死表現隨時間延長逐漸加重，股骨頭出現輕微塌陷。B 組：骨小梁稀疏，未見斷裂，12 周時髓腔內脂肪細胞較 6 周時減少，骨細胞生成不明顯。C 組：骨小梁排列尚規則，12 周時骨小梁內骨細胞較 6 周時略減少，脂肪細胞略增加，骨髓造血細胞減少，可見少量空骨陷窩。D 組：骨小梁排列較整齊，飽滿致密，可見部分骨細胞形成，骨細胞核大居中，12 周時髓腔內脂肪細胞較 6 周時明顯減少，空骨陷窩較少見，核固縮不明顯。見圖3。
圖3
術后各組組織學觀察（HE×100）
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. 術后 6 周；b. 術后 12 周
Figure3. Histological observation of each group after operation (HE×100)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. Postoperative at 6 weeks; b. Postoperative at 12 weeks
2.2.3 免疫組織化學染色觀察
術后 6、12 周，A、B、C 組 OCN 及 VEGF 表達均低于 D、E 組，B、C 組高于 A 組，E 組高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。A、B、C 組 PPARγ-2 表達均高于 D、E 組，A 組高于 B、C 組，D 組高于 E 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。A～D 組組內術后 6 周與 12 周間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4 及表1。
表1
術后各組 OCN、VEGF 及 PPARγ-2 蛋白表達比較（n=4，
，%）
Table1.
Comparison of expressions of OCN, VEGF, and PPARγ-2 protein of each group after operation (n=4, 
, %)
圖4
術后各組免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. 術后 6 周 OCN；b. 術后 12 周 OCN；c. 術后 6 周 VEGF；d. 術后 12 周 VEGF；e. 術后 6 周 PPARγ-2；f. 術后 12 周 PPARγ-2
Figure4. Immunohistochemical staining observation of each groups after operation (×100)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. OCN at 6 weeks after operation; b. OCN at 12 weeks after operation; c. VEGF at 6 weeks after operation; d. VEGF at 12 weeks after operation; e. PPARγ-2 at 6 weeks after operation; f. PPARγ-2 at 12 weeks after operation
2.2.4 透射電鏡觀察
術后 12 周，A 組骨細胞縮小，細胞核呈扭曲狀態，核染色質固縮，呈塊狀，形成新月小體，細胞質內線粒體嵴斷裂，而細胞器相對正常；B、C 組骨細胞周圍的脂膜突起部分深入至骨小管內，核內有少量染色質濃集，細胞質內少量脂滴，核膜連續；D 組骨細胞占據整個骨陷窩，骨細胞周圍突起較多，具有豐富的功能細胞器以及發達的粗面內質網和線粒體，嵴上可見細小顆粒，骨陷窩邊緣以及鄰近的骨基質可見有周期性橫紋的膠原纖維出現。見圖5。
圖5
術后 12 周透射電鏡觀察（×8 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Transmission electron microscope observation at 12 weeks after operation (×8 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.5 生物力學測試
術后 12 周，D、E 組股骨頭松質骨、軟骨下骨平均彈性模量和最大壓縮強度均高于 A～C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A～C 組間及 D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6。
圖6
術后 12 周各組生物力學測試最大壓縮強度及平均彈性模量
a. 股骨頭松質骨；b. 股骨頭軟骨下骨
Figure6. The maximum compressive strength and average elastic modulus of each group measured by biomechanics at 12 weeks after operationa. Femoral head cancellous bone; b. Femoral head subchondral bone
3 討論
BMSCs 具有較高可塑性及可移植性，能大量增殖、分化為多種組織細胞[14]，易于接受和穩定表達外源目的基因，其不僅可以作為基因傳送的載體，還可參與組織修復。早期已有研究進行動物實驗向兔骨髓腔內注射自體 BMSCs 防治 ONFH 的報道[13]。國內外學者也嘗試于減壓孔處注射移植 BMSCs 治療 ONFH，療效滿意[15-17]。目前認為此種療法的原理主要是基于骨髓內的 BMSCs 具有成骨細胞分化潛能及活躍的增殖特性，可促進骨組織的修復。BMSCs 移植主要采用微創方法，包括髓芯減壓、動脈灌注、聯合填充材料及基因轉染 BMSCs 移植。自體 BMSCs 移植雖不存在免疫排斥反應，但數量有限；同種異體 BMSCs 可解決來源不足的問題，但可能會發生免疫排斥反應[17]。
隨著轉基因技術的迅速發展，人們將微囊化技術和基因治療結合，形成微囊化基因給藥技術，利用基因重組干細胞產生的特定代謝產物來調節機體生理功能，治療相關疾病。微囊化除了為干細胞生長提供良好的三維微環境，保證干細胞的體外大規模培養外，還可利用選擇透過性膜將移植物與宿主免疫系統隔離，有效避免同種異體移植過程中的免疫排斥反應。BMSCs 向成骨細胞定向分化是一個復雜過程，體外的定向誘導體系應建立于體內轉化機制的基礎上，即體外模擬體內“成骨微環境”[18]，才能獲得具有正常生理功能的分化細胞。“成骨微環境”主要由成骨細胞、生長因子、細胞外基質等構成，其中成骨細胞是重要組成部分，它可分泌多種生長因子以及鈣基質等，這些調節分子對 BMSCs 向成骨細胞定向分化具有重要的促進作用。轉基因的 BMSCs 微囊化后，可持續分泌組織再生所需的生長因子。同時，共微囊化可利用其他細胞分泌的細胞因子促進干細胞分化，增加細胞間信號傳導。微膠囊內細胞呈高密度生長，利于保持其正常分泌功能[8]，并提高了囊內生長因子的濃度，使得囊內外濃度差增加，推動力增大，更有利于生長因子等向微膠囊外傳遞。Ding 等[9]報道微囊包裹轉染 BMP-2 的 BMSCs 成骨分化誘導，結果表明微囊化轉基因干細胞生長良好，能持續分泌 BMP-2 蛋白并促進干細胞向成骨細胞分化。Babister 等[19]將轉 Sox-9 基因的人間質祖細胞用微囊包裹后移植入宿主體內，可以促進軟骨結構的形成，預示其有用于治療骨折和骨缺損等疾病的前景。
本研究提出一種非接觸式微囊化轉基因 BMSCs 體外定向分化為成骨細胞的新體系，利用微囊化轉基因 BMSCs 誘導成骨治療 SONFH。結果顯示，術后 6、12 周 B、C 組只有較少新骨形成，12 周時減壓孔道有纖維性骨痂形成，說明單純髓芯減壓及減壓后干細胞移植均能產生少量新骨，延緩股骨頭壞死；D 組均有明顯成骨，12 周時壞死區被完全修復。術后 6、12 周，A～C 組 OCN 及 VEGF 表達明顯低于 D 組，而 PPARγ-2 在 A 組表達最高、D 組最低，差異均有統計學意義。以上結果表明，微囊化轉基因 BMSCs 能促進成骨、成血管因子表達，而抑制成脂因子表達。術后 12 周，D 組股骨頭松質骨、軟骨下骨的平均彈性模量和最大壓縮強度均高于其他 3 組；透射電鏡示 A 組標本內骨細胞體積縮小；D 組標本內骨細胞占據整個骨陷窩，具有豐富的功能細胞器；其余兩組僅見骨細胞周圍的突起部分深入到骨小管內。研究發現[20]，Foxc2 可抑制前脂肪細胞的分化，機制可能與阻礙 PPARγ2活性有關。
綜上述，利用微囊化轉基因 BMSCs 移植干預早期兔 SONFH，可以有效延緩股骨頭軟骨下骨細胞凋亡及骨量減少的時間，一定程度上延緩了股骨頭壞死，為早期 SONFH 治療提供了一種新方法。但還有以下幾個方面需要改進和深入研究：① 微囊化干細胞移植技術目前仍然停留在體外研究水平，體內研究僅限于動物實驗階段，離臨床應用尚有一段距離；② 雖然我們制備的微囊能使細胞在囊內長期存活，但體內移植仍然面臨微囊內細胞存活時間短、炎癥細胞浸潤和纖維化包裹的難題[21-22]，對于微囊材料的選擇及制備技術仍有很大的改進空間；③ 微囊化干細胞體內移植后，細胞的生長及分化或信號傳導、調控研究較少；④ 對于安全性問題如微囊的回收效率、破損率等研究缺乏，動物實驗時間相對較短，干細胞分化的具體機制尚不明晰。因此，對于移植后微囊和囊內干細胞在動物體內最終歸宿、轉化應深入研究。
作者貢獻：尤武林負責科研設計、數據收集及具體實施；王建偉指導課題設計及實驗；黃桂成負責科研設計、指導論文撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經無錫市中醫醫院倫理委員會批準（SZYYKJ2019100801）。實驗動物使用許可證批準號：SYXK（蘇）2018-0049。
激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of femoral head，SONFH）是大劑量激素作用引起脂肪代謝紊亂、股骨頭骨細胞變性、骨細胞有活力成分凋亡的病理過程[1-2]。目前治療 SONFH 的方式較多，包括脈沖電刺激、高壓氧治療等非手術方法，以及髓芯減壓、帶或不帶血管蒂骨瓣移植術等手術方法[3-5]，但均未達理想療效。如何有效防治 SONFH 是現階段研究熱點[6-7]。
采用微囊化組織或細胞移植是近年發展起來的一項新技術，它利用微囊的免疫阻隔作用以及半透膜特性，移植后可避免免疫排斥反應，同時發揮移植物的分泌功能等生物效應，達到治療相關疾病的目的[8]。而海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉（sodium alginate-poly-L-lysine-sodium alginate，APA）微囊具有半透性以及良好免疫隔離作用。BMSCs 具有強大的自我增殖能力和多向分化潛能，轉基因 BMSCs 可定向成骨分化。Foxc2 是屬于人類 forkhead 家族的一個重要轉錄因子，最初克隆于小鼠腦組織。過表達 Foxc2 的 BMSCs 具有較高的細胞活性，Foxc2 能促進 BMSCs 成骨分化，抑制其成脂分化。
微囊化轉基因 BMSCs 對于諸多疾病的治療意義重大，尤其對器官重建和損傷修復等疾病的治療更具前景。轉基因 BMSCs 微囊化后，因可持續分泌組織再生所需生長因子，微囊創造的三維環境為 BMSCs 生長和分化提供了有利場所。Ding 等[9]研究發現轉染 BMP-2 基因的 BMSCs 微囊化后，能誘導成骨細胞分化。Paek 等[10]研究發現，微囊化轉染 TGF-β1 基因的 BMSCs 能夠長期分泌目的蛋白 3 周。目前微囊化轉基因 BMSCs 技術在修復股骨頭壞死領域尚未見報道。為此，本研究通過制備 APA 微囊化轉基因 BMSCs，并移植至兔 SONFH 模型，觀察其治療作用，并分析可能作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 月齡健康純種新西蘭大白兔 46 只，雌雄不限，體質量（3.0±0.3）kg，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗前適應性喂養 1 周。
內毒素（Sigma 公司，美國）；造模用甲基強的松龍琥珀酸鈉（輝瑞公司，美國）；抗人 Foxc2 一抗、二抗（Santa Cruz 公司，美國）；抗兔骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、過氧化酶體增殖劑激活受體 γ 2（peroxisome proliferative activated receptor γ 2，PPARγ2）、VEGF、β-actin 一抗（Abcam 公司，美國）；SP 法免疫組織化學試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）。萬能電子材料試驗機（濟南捷德機械設備有限公司）；H-7650 透射電鏡（Hitachi 公司，日本）；3.0T 超導型 MRI 掃描儀（GE 公司，美國）。
1.2 微囊化轉基因 BMSCs 的制備
取 2 只新西蘭大白兔，參照前期研究方法[11]制備 Foxc2 基因轉染的 BMSCs。依據高壓靜電法[12]實驗步驟，將 Foxc2 基因轉染的 BMSCs 以 1.5% 海藻酸鈉溶液重懸，調整細胞濃度至 1×106個/孔，加入注射器形成液滴，滴入 2.0%CaCl2 溶液中形成膠珠；置于 0.05% 多聚賴氨酸溶液中反應 5～10 min，浸入 0.03% 海藻酸鈉溶液中 5～10 min，PBS 清洗，置于 55 mmol/L 檸檬酸鈉溶液中使微囊液化，制備微囊化轉基因 BMSCs。
1.3 微囊化轉基因 BMSCs 成骨誘導培養及觀察
將制備的微囊化轉基因 BMSCs 以含 10%FBS 的 DMEM 培養液洗滌 2 次；將細胞沉淀以含 10%FBS 的 DMEM 培養液重懸，30 s 后加入培養瓶培養。以離心半徑 8 cm、900 r/min 離心 5 min，棄上清，加入培養液重懸后滴入培養瓶。取出 5 mL 微囊化轉基因 BMSCs 的 L-DMEM 培養液，加入 5 mL 破囊液破囊。將破囊后的微囊化轉基因 BMSCs 按 1×104個/孔接種于 24 孔板中，置于 4℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養，培養 2 周后更換為成骨誘導培養基（含 1×10–8 mol/L 地塞米松、50 μg/mL 抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉的 DMEM 培養基），行成骨誘導分化培養。培養 2、3 周分別取培養板行茜素紅染色，光鏡下觀察有無鈣結節形成。
1.4 SONFH 模型制備及實驗分組
1.4.1 SONFH 模型制備
取 40 只新西蘭大白兔經耳緣靜脈注射內毒素（10 μg/kg），24 h 后臀肌注射甲基強的松龍琥珀酸鈉（20 mg/kg）3 次，每次間隔 24 h。實驗過程中 4 只動物因腹瀉、發熱死亡。末次注射 6 周后剩余 36 只兔行 MRI 篩選，造模成功標準：符合早期 ONFH 影像學特征[13]，其中 T1 加權像股骨頭表現為片狀或點狀信號、T2 加權像表現為不規則片狀高信號（圖1）。共 32 只兔造模成功進行后續實驗。
圖1
造模 6 周后股骨頭 MRI
Figure1.
MRI of femoral head at 6 weeks after modeling
1.4.2 實驗分組
將 32 只 SONFH 模型動物隨機分為對照組（A 組）、髓芯減壓組（B 組）、髓芯減壓+BMSCs 組（C 組）及髓芯減壓+APA 微囊化轉基因 BMSCs 組（D 組），每組 8 只。另取 6 只正常兔作為正常對照組（E 組）。A 組模型動物不作任何處理。B、C、D 組采用 3% 戊巴比妥鈉（25 mg/kg）腹腔注射麻醉，取雙側后肢股骨頭進行髓芯減壓處理，縱行切開大轉子，切口長約 2 cm，沿外側肌間隙進入，充分暴露股骨大粗隆端，透視下自大粗隆下沿股骨頸向股骨頭中心鉆入一直徑 2.5 mm 斯氏針，深達關節軟骨面下 1～2 mm。減壓后，B 組于減壓區注入 5 μL 生理鹽水；C、D 組分別植入前期實驗[14]培養的 5 μL 同種異體兔 BMSCs 及 APA 微囊化轉基因 BMSCs，復合明膠海綿植入股骨頭病灶，骨蠟封閉減壓口，防止細胞溢出。術后連續 3 d 臀肌注射青霉素鈉預防感染，每天注射 1 次，每次 2×105 U。
1.5 觀測指標
1.5.1 一般情況
觀察各組動物術后存活及肢體運動情況。
1.5.2 組織學觀察
術后 6、12 周 A～D 組分別取 2 只動物，空氣栓塞法處死后取雙側股骨頭標本，置于 10% 中性甲醛緩沖液固定，脫鈣、脫水、透明、包埋、切片，片厚 4 μm。取部分切片，常規 HE 染色，光鏡下觀察骨長入情況。
1.5.3 免疫組織化學染色觀察
術后 6、12 周，取 A～D 組切片按 SP 法免疫組織化學染色試劑盒說明進行染色，光鏡下觀察 OCN、PPARγ-2 和 VEGF 蛋白表達，蛋白表達定位于細胞質及細胞膜，陽性染色呈棕黃色。各組每個股骨頭隨機選取 3 張切片，每張切片隨機選取 10 個視野（×200），SP 法免疫組織化學分析灰度值，取均值。E 組取 3 只動物兩側股骨頭制備切片進行染色觀測。
1.5.4 透射電鏡觀察
術后 12 周，A～D 組分別取 2 只動物，同上法處死后，用刀片刮取 1 mm×1 mm×1 mm 大小股骨頭軟骨下區組織，對標本進行固定、脫鈣，1% 鋨酸后固定，樹脂包埋，切片，片厚 4 μm。檸檬酸鋁和醋酸鈾進行染色，透射電鏡觀察組織超微結構。
1.5.5 生物力學測試
術后 12 周各組分別取 2 只動物，同上法處死后取雙側股骨頭標本，切取帶軟骨下骨骨塊及圓柱形垂直松質骨塊各 1 塊。游標卡尺測量軟骨下骨骨塊長 4.0 mm、寬 3.5 mm、高 3.0 mm，松質骨塊長 4.0 mm、寬 3.0 mm、高 2.0 mm。所有標本用生理鹽水持續沖洗，保持濕潤，密封，?30℃ 保存。將標本固定于萬能電子材料試驗機支架上，加載速度為 5 mm/min，松質骨及軟骨下骨均采用點壓技術，壓頭外徑為 2.54 mm，計算骨塊的最大壓縮強度及平均彈性模量。E 組取 3 只動物 6 個股骨頭負重區骨塊進行測量。
1.6 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；組內各時間點間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 微囊化轉基因 BMSCs 成骨誘導培養觀察
誘導培養 2、3 周，茜素紅染色后均可見鈣結節形成，且 3 周時數量較 2 周時增加。見圖2。
圖2
微囊化轉基因 BMSCs 成骨誘導培養觀察（茜素紅染色×100）
a. 培養 2 周；b. 培養 3 周
Figure2. Osteogenesis induction observation of the microcap-sulated transgenic BMSCs (Alizarin red staining×100)a. Cultured for 2 weeks; b. Cultured for 3 weeks
2.2 動物體內植入實驗
2.2.1 一般情況
各組實驗動物均存活至實驗完成。激素注射后第 2 天，動物出現精神萎靡，進食量、活動量減少情況；1 周，動物體質量減輕，但進食量及四肢負重已恢復正常；4 周，動物精神、體質量、進食及四肢活動負重情況均正常；6 周，動物出現輕度跛行；8 周，動物跛行加重。
2.2.2 組織學觀察
HE 染色示，A 組：骨壞死表現隨時間延長逐漸加重，股骨頭出現輕微塌陷。B 組：骨小梁稀疏，未見斷裂，12 周時髓腔內脂肪細胞較 6 周時減少，骨細胞生成不明顯。C 組：骨小梁排列尚規則，12 周時骨小梁內骨細胞較 6 周時略減少，脂肪細胞略增加，骨髓造血細胞減少，可見少量空骨陷窩。D 組：骨小梁排列較整齊，飽滿致密，可見部分骨細胞形成，骨細胞核大居中，12 周時髓腔內脂肪細胞較 6 周時明顯減少，空骨陷窩較少見，核固縮不明顯。見圖3。
圖3
術后各組組織學觀察（HE×100）
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. 術后 6 周；b. 術后 12 周
Figure3. Histological observation of each group after operation (HE×100)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. Postoperative at 6 weeks; b. Postoperative at 12 weeks
2.2.3 免疫組織化學染色觀察
術后 6、12 周，A、B、C 組 OCN 及 VEGF 表達均低于 D、E 組，B、C 組高于 A 組，E 組高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。A、B、C 組 PPARγ-2 表達均高于 D、E 組，A 組高于 B、C 組，D 組高于 E 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。A～D 組組內術后 6 周與 12 周間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4 及表1。
表1
術后各組 OCN、VEGF 及 PPARγ-2 蛋白表達比較（n=4，，%）
Table1.
Comparison of expressions of OCN, VEGF, and PPARγ-2 protein of each group after operation (n=4, , %)
圖4
術后各組免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. 術后 6 周 OCN；b. 術后 12 周 OCN；c. 術后 6 周 VEGF；d. 術后 12 周 VEGF；e. 術后 6 周 PPARγ-2；f. 術后 12 周 PPARγ-2
Figure4. Immunohistochemical staining observation of each groups after operation (×100)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. OCN at 6 weeks after operation; b. OCN at 12 weeks after operation; c. VEGF at 6 weeks after operation; d. VEGF at 12 weeks after operation; e. PPARγ-2 at 6 weeks after operation; f. PPARγ-2 at 12 weeks after operation
2.2.4 透射電鏡觀察
術后 12 周，A 組骨細胞縮小，細胞核呈扭曲狀態，核染色質固縮，呈塊狀，形成新月小體，細胞質內線粒體嵴斷裂，而細胞器相對正常；B、C 組骨細胞周圍的脂膜突起部分深入至骨小管內，核內有少量染色質濃集，細胞質內少量脂滴，核膜連續；D 組骨細胞占據整個骨陷窩，骨細胞周圍突起較多，具有豐富的功能細胞器以及發達的粗面內質網和線粒體，嵴上可見細小顆粒，骨陷窩邊緣以及鄰近的骨基質可見有周期性橫紋的膠原纖維出現。見圖5。
圖5
術后 12 周透射電鏡觀察（×8 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Transmission electron microscope observation at 12 weeks after operation (×8 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.5 生物力學測試
術后 12 周，D、E 組股骨頭松質骨、軟骨下骨平均彈性模量和最大壓縮強度均高于 A～C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A～C 組間及 D、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6。
圖6
術后 12 周各組生物力學測試最大壓縮強度及平均彈性模量
a. 股骨頭松質骨；b. 股骨頭軟骨下骨
Figure6. The maximum compressive strength and average elastic modulus of each group measured by biomechanics at 12 weeks after operationa. Femoral head cancellous bone; b. Femoral head subchondral bone
3 討論
BMSCs 具有較高可塑性及可移植性，能大量增殖、分化為多種組織細胞[14]，易于接受和穩定表達外源目的基因，其不僅可以作為基因傳送的載體，還可參與組織修復。早期已有研究進行動物實驗向兔骨髓腔內注射自體 BMSCs 防治 ONFH 的報道[13]。國內外學者也嘗試于減壓孔處注射移植 BMSCs 治療 ONFH，療效滿意[15-17]。目前認為此種療法的原理主要是基于骨髓內的 BMSCs 具有成骨細胞分化潛能及活躍的增殖特性，可促進骨組織的修復。BMSCs 移植主要采用微創方法，包括髓芯減壓、動脈灌注、聯合填充材料及基因轉染 BMSCs 移植。自體 BMSCs 移植雖不存在免疫排斥反應，但數量有限；同種異體 BMSCs 可解決來源不足的問題，但可能會發生免疫排斥反應[17]。
隨著轉基因技術的迅速發展，人們將微囊化技術和基因治療結合，形成微囊化基因給藥技術，利用基因重組干細胞產生的特定代謝產物來調節機體生理功能，治療相關疾病。微囊化除了為干細胞生長提供良好的三維微環境，保證干細胞的體外大規模培養外，還可利用選擇透過性膜將移植物與宿主免疫系統隔離，有效避免同種異體移植過程中的免疫排斥反應。BMSCs 向成骨細胞定向分化是一個復雜過程，體外的定向誘導體系應建立于體內轉化機制的基礎上，即體外模擬體內“成骨微環境”[18]，才能獲得具有正常生理功能的分化細胞。“成骨微環境”主要由成骨細胞、生長因子、細胞外基質等構成，其中成骨細胞是重要組成部分，它可分泌多種生長因子以及鈣基質等，這些調節分子對 BMSCs 向成骨細胞定向分化具有重要的促進作用。轉基因的 BMSCs 微囊化后，可持續分泌組織再生所需的生長因子。同時，共微囊化可利用其他細胞分泌的細胞因子促進干細胞分化，增加細胞間信號傳導。微膠囊內細胞呈高密度生長，利于保持其正常分泌功能[8]，并提高了囊內生長因子的濃度，使得囊內外濃度差增加，推動力增大，更有利于生長因子等向微膠囊外傳遞。Ding 等[9]報道微囊包裹轉染 BMP-2 的 BMSCs 成骨分化誘導，結果表明微囊化轉基因干細胞生長良好，能持續分泌 BMP-2 蛋白并促進干細胞向成骨細胞分化。Babister 等[19]將轉 Sox-9 基因的人間質祖細胞用微囊包裹后移植入宿主體內，可以促進軟骨結構的形成，預示其有用于治療骨折和骨缺損等疾病的前景。
本研究提出一種非接觸式微囊化轉基因 BMSCs 體外定向分化為成骨細胞的新體系，利用微囊化轉基因 BMSCs 誘導成骨治療 SONFH。結果顯示，術后 6、12 周 B、C 組只有較少新骨形成，12 周時減壓孔道有纖維性骨痂形成，說明單純髓芯減壓及減壓后干細胞移植均能產生少量新骨，延緩股骨頭壞死；D 組均有明顯成骨，12 周時壞死區被完全修復。術后 6、12 周，A～C 組 OCN 及 VEGF 表達明顯低于 D 組，而 PPARγ-2 在 A 組表達最高、D 組最低，差異均有統計學意義。以上結果表明，微囊化轉基因 BMSCs 能促進成骨、成血管因子表達，而抑制成脂因子表達。術后 12 周，D 組股骨頭松質骨、軟骨下骨的平均彈性模量和最大壓縮強度均高于其他 3 組；透射電鏡示 A 組標本內骨細胞體積縮小；D 組標本內骨細胞占據整個骨陷窩，具有豐富的功能細胞器；其余兩組僅見骨細胞周圍的突起部分深入到骨小管內。研究發現[20]，Foxc2 可抑制前脂肪細胞的分化，機制可能與阻礙 PPARγ2活性有關。
綜上述，利用微囊化轉基因 BMSCs 移植干預早期兔 SONFH，可以有效延緩股骨頭軟骨下骨細胞凋亡及骨量減少的時間，一定程度上延緩了股骨頭壞死，為早期 SONFH 治療提供了一種新方法。但還有以下幾個方面需要改進和深入研究：① 微囊化干細胞移植技術目前仍然停留在體外研究水平，體內研究僅限于動物實驗階段，離臨床應用尚有一段距離；② 雖然我們制備的微囊能使細胞在囊內長期存活，但體內移植仍然面臨微囊內細胞存活時間短、炎癥細胞浸潤和纖維化包裹的難題[21-22]，對于微囊材料的選擇及制備技術仍有很大的改進空間；③ 微囊化干細胞體內移植后，細胞的生長及分化或信號傳導、調控研究較少；④ 對于安全性問題如微囊的回收效率、破損率等研究缺乏，動物實驗時間相對較短，干細胞分化的具體機制尚不明晰。因此，對于移植后微囊和囊內干細胞在動物體內最終歸宿、轉化應深入研究。
作者貢獻：尤武林負責科研設計、數據收集及具體實施；王建偉指導課題設計及實驗；黃桂成負責科研設計、指導論文撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經無錫市中醫醫院倫理委員會批準（SZYYKJ2019100801）。實驗動物使用許可證批準號：SYXK（蘇）2018-0049。
