引用本文： 倘艷鋒, 楊玉霞, 李紅軍, 習嘉寧, 李無陰, 岳辰, 王會超, 劉又文. 經皮自體骨髓濃集液和富血小板血漿聯合注射治療骨折延遲愈合. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(9): 1130-1135. doi: 10.7507/1002-1892.202002028 復制
骨折順利愈合依賴于骨折端良好的穩定性及生物學環境，萎縮性骨不連多表現為骨折端穩定性良好而生物學環境差[1]。自體骨移植術仍是治療骨折不愈合的金標準，但存在創傷大、造成骨缺損、存在并發癥等問題[2-3]，并且對于骨折延遲愈合采取骨移植治療可能為過激治療。20 世紀 80 年代，有學者采取經皮自體骨髓血注射提供骨折愈合所需的 BMSCs 治療骨折延遲愈合或不愈合，療效確切[4]。但自體紅骨髓中 BMSCs 數量相對較少；骨髓濃集液（concentrated bone marrow aspirate，cBMA）是將骨髓血濃集，增加了單位體積 BMSCs 數量，因此經皮注射 cBMA 效果更佳[5]。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是通過對自體靜脈血離心處理，富集血小板并裂解釋放各種生長因子，包括 PDGF、TGF-β、bFGF、VEGF 等，其中 PDGF、TGF-β 具有骨誘導作用，VEGF 具有促進骨修復作用，同時可以促進局部微血管生成[6]。對于骨缺損和骨折不愈合的治療需要充足 BMSCs，同時需要自體生長因子激活促進細胞成骨轉化，共同組成局部生物室促進骨修復[7]。2016 年 3 月—2018 年 7 月，我們開展前瞻性隨機對照單盲病例研究，選擇骨折延遲愈合但骨折端穩定的患者，分別采用經皮自體骨髓血注射和經皮自體 cBMA+PRP 注射治療，探討 cBMA+PRP 注射治療骨折延遲愈合的效果。報告如下。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① 患者骨折愈合過程中 3 個月無進展，骨折術后 6～9 個月未實現骨性愈合；② 骨折端內固定牢靠，未出現內固定物斷裂、松動失效；③ 骨折端骨缺損≤5 mm；④ 單光子發射計算機斷層掃描/CT 提示骨折端核素濃聚，存在愈合可能性[8]；⑤ 隨訪時間超過 12 個月；⑥ 愿意參加研究并遵守研究方案及完成數據收集者。排除標準：① 感染性骨不連；② 合并嚴重代謝性疾病，如糖尿病等影響骨折愈合者；③ 有嚴重吸煙、嗜酒史而又不能戒除者。
2016 年 3 月—2018 年 7 月共 210 例骨折延遲愈合患者于我院治療，其中 66 例符合選擇標準納入研究。采用隨機數字表法將患者隨機分為對照組（31 例，采用經皮自體骨髓血注射治療）和研究組（35 例，采用經皮自體 cBMA+PRP 注射治療）。
1.2 一般資料
對照組：男 23 例，女 8 例；年齡 20～56 歲，平均 38.2 歲。病程 4～9 個月，平均 6.5 個月。骨折延遲愈合部位：股骨 13 例，脛骨 11 例，鎖骨 2 例，肱骨 3 例，橈骨 2 例。體質量指數（25.3±3.4）kg/m2。骨缺損長度為（2.19±0.60）mm。術前脛骨骨折影像學愈合評分系統（RUST）評分為（0.9±0.7）分。
研究組：男 25 例，女 10 例；年齡 28～55 歲，平均 41.1 歲。病程 4～9 個月，平均 6.8 個月。骨折延遲愈合部位：股骨 11 例，脛骨 17 例，橈骨 3 例，尺骨 1 例，肱骨 3 例。體質量指數（24.9±3.1）kg/m2。骨缺損長度為（2.14±0.68）mm。術前 RUST 評分（0.9±0.7）分。
兩組患者性別、年齡、體質量指數、骨折延遲愈合部位、骨折端骨缺損長度、術前 RUST 評分等一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.3 治療方法
1.3.1 抽取骨髓血
研究組抽骨髓血前將 800 U 肝素鈉加入 60 mL 注射器中反復抽拉，制備抗凝管。兩組于患者髂后上棘或對側脛骨平臺處消毒鋪巾，穿刺針有突破骨皮質感后再進入 1～2 cm，避免抽到外周血影響療效；注意每抽取 10 mL 骨髓血，需將穿刺點移離 1 cm 重新穿刺抽取。根據骨折部位連續抽取 30～60 mL。研究組骨髓血抽入抗凝管待制備 cBMA，對照組抽取骨髓血后直接注射。
1.3.2 cBMA+PRP 制備
cBMA 制備：研究組將抽取的骨髓血轉移到 50 mL 無菌離心管內，以 600×g 離心 15 min 后呈現 3 層，抽取上 2 層液體，去除底部紅細胞；再次在 50 mL 離心管中以 200×g 離心 5 min，取底層液體置于無菌注射器中備用。取 0.5 mL cBMA 送實驗室檢測單核細胞數量，以（5～10）×105 個/L 為佳，0.5 mL 留樣行細菌培養。
PRP 制備：抽血前將枸櫞酸鈉 3 mL 加入 60 mL 注射器中，反復抽拉制備抗凝管，無菌條件下經肘部抽取外周血 27 mL。將抽取的靜脈血裝入 50 mL 無菌離心管中，以 200×g 離心 15 min，可見全血分 3 層；棄下層紅細胞層，吸取上層淡黃色血漿層裝入 10 mL 離心管中，以 180×g 離心 6 min；棄底部以白細胞為主的沉淀物，取上層血漿層以1 000×g 離心 8 min，取底部血小板及上方的血漿即為 PRP。將制備好的 PRP 抽取 1 mL 留樣行細菌培養。
1.3.3 手術治療
兩組均采取持續硬膜外麻醉聯合蛛網膜下腔阻滯麻醉，患者仰臥于可透視手術床上。首先，透視下應用 1 枚直徑 3.0 mm 克氏針，動力下對骨折端遠近側骨膜及纖維骨痂進行刺激，克氏針需深入到骨折端及骨缺損部位，并圍繞骨折端遠近 2 cm 范圍內刺削骨膜，造成局部微損傷。然后，對照組將抽取的骨髓血直接于透視下用 18 號腰椎穿刺針經皮注射到骨折端周圍。注射時針尖刺入骨折端纖維組織，需緩慢注入，避免壓力過大造成骨髓血飛濺。需觀察局部腫脹情況，尤其對于脛骨或前臂尺橈骨骨髓血注射量應<40 mL，避免引發筋膜間室綜合征。研究組將 3 mL cBMA 和 2 mL PRP 混合后，透視下用 18 號腰椎穿刺針經皮注射到骨折端周圍，具體方法及注意事項同對照組。
1.4 術后處理
術后無需預防性應用抗生素，囑患者第 2 日開始下床活動，患肢置于體質量秤上負重練習，記錄感覺到骨折端疼痛時的質量，之后在小于該質量下不完全負重練習。囑患者絕對戒煙并離開吸煙環境，控制體質量，治療后 6 周首次攝 X 線片檢查。治療后 3、6、12 個月門診隨訪，攝 X 線片了解骨折愈合情況，并根據骨折愈合情況指導患者負重強度及鍛煉方法。
1.5 療效評價標準
記錄并比較兩組患者骨折愈合時間、治療費用（入院至骨折愈合期間總費用）及不良反應（術后發燒、白細胞計數異常、局部腫脹及感染情況等）；采用疼痛視覺模擬評分（VAS）評價患者疼痛改善情況。
將脛骨 RUST 評分擴展到管狀骨愈合評價，通過觀察正側位 X 線片所呈現的 4 層骨皮質來評價骨折愈合程度[9-10]。骨折端無骨痂出現，1 分；骨折端有骨痂出現，2 分；骨折端有橋接骨痂出現，3 分；骨折端骨痂塑形折線消失，4 分。將骨折愈合定義為至少 3 個骨皮質出現橋接骨痂；骨折不愈合定義為無影像學進展 3 個月以上或術后 9 個月仍未愈合者。
1.6 統計學方法
采用 SPSS24.0 統計軟件進行分析。計量資料若符合正態分布，數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，組內手術前后比較采用配對 t 檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用 χ2 檢驗；檢驗水準取雙側 α=0.05。
2 結果
兩組骨髓穿刺針眼均無感染發生。對照組 5 例術后局部腫脹明顯，11 例術后 1 d 疼痛加重，經對癥治療后明顯緩解；研究組術后腫脹及疼痛不明顯，但有 2 例出現局部紅腫疼痛，考慮 PRP 局部炎癥反應，對癥處理后緩解。術后兩組患者均獲隨訪，隨訪時間對照組 16～36 個月，平均 21.8 個月；研究組 14～33 個月，平均 23.2 個月。研究組骨髓血抽取量顯著少于對照組，差異有統計學意義（t=4.610，P=0.000）；研究組術后疼痛程度較對照組輕，治療費用較對照組高，但差異均無統計學意義（P>0.05）。對照組 19 例獲得骨折愈合，愈合率 61.3%；研究組 30 例獲得骨折愈合，愈合率 85.7%；兩組骨折愈合率比較差異有統計學意義（χ2=5.128，P=0.024）。研究組骨折愈合時間和末次隨訪時 RUST 評分均顯著優于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組末次隨訪時 RUST 評分均較術前顯著改善（P<0.05）。見表 1、圖 1。
表1
兩組患者各臨床指標比較（
）
Table1.
Comparison of clinical indexes between the two groups (
)
圖1
研究組患者，男，55 歲，交通事故傷致右股骨轉子下骨折，行切開復位鋼板內固定術
a. 術后 4 個月 X 線片示內固定失效；b. 行鋼板取出髓內釘內固定術后即刻 X 線片，骨折端未植骨；c. 二次術后 4 個月 X 線片示骨折端無骨痂生成；d～g. 透視下用克氏針行骨折端骨皮質“刺削”并于骨折端注射 cBMA+PRP；h. 注射后 26 周 X 線片示骨折端骨愈合
Figure1. A 55-year-old male patient with right subtrochanteric fracture of the femur caused by traffic accident in the study group, treated with open reduction and plate internal fixationa. X-ray film at 4 months after operation showed that the internal fixation failed; b. X-ray film at immediate after plate removal and intramedullary nail internal fixation, showed that the fracture end was not implanted; c. X-ray film showed that no callus formed at the fracture end at 4 months after the second-stage operation; d-g. Using Kirschner wire to “prick” the bone cortex at the fracture end and injecting cBMA+PRP at the fracture end under fluoroscopy; h. X-ray film showed bone union at fracture end at 26 weeks after injection
3 討論
骨折后可因骨折端嚴重粉碎、骨折周圍軟組織破壞明顯、骨折端血供損傷及伴有感染等局部因素，以及吸煙、飲酒、代謝性疾病等全身因素，而導致延遲愈合甚至不愈合[11]。骨折術后連續 3 個月無進展或術后 9 個月骨折未愈合，可定義為骨折延遲愈合，采取何種方法促進骨折愈合避免骨不連發生，是骨科醫師面臨的一個挑戰[12]。骨折延遲愈合經過積極治療可避免不愈合發生，方法包括骨折端電刺激和沖擊波等[13]，自體骨移植仍是治療骨折延遲愈合或不愈合的“金標準”，但自體骨移植存在骨缺損、增加創傷及髂骨取出處血腫或感染等風險。有研究指出萎縮性骨不連患者 BMSCs 增殖能力和成骨能力均降低，其治療需提高 BMSCs 質量和活性[14]。Connolly 等[4]于 1986 年首次采取自體骨髓血局部注射治療骨折延遲愈合，認為自體骨髓血局部注射增加了骨折端 BMSCs 數量。隨后，研究者們應用自體骨髓血經皮注射治療骨折延遲愈合或不愈合，均取得了較好臨床療效，并認為該方法可作為開放性手術自體骨移植之前的最佳選擇方法[15-17]。Wu 等[18]采取自體骨髓血直接注射治療 53 例兒童（平均年齡 6.7 歲）骨折延遲愈合和不愈合，結果 47 例骨折愈合，有效率 88.7%，他們認為自體骨髓血直接注射促進骨折愈合操作簡單、安全、經濟且微創。Braly 等[19]應用自體骨髓血經皮注射治療脛骨遠端骨折延遲愈合和不愈合患者 11 例，注射量 40～80 mL，治療后 6 個月 9 例獲得愈合，并強調該方法治療需要骨折端內固定穩定牢靠。Gross 等[20]認為骨髓血局部注射治療骨折延遲愈合或不愈合與其中的成纖維細胞集落形成單位有關，并指出骨髓血注射可能存在筋膜間室綜合征風險，尤其對于小腿和前臂局部注射者。我們在取自體骨髓血直接注射治療中發現，注射后次日局部疼痛明顯增加，尤其是脛骨骨折患者，并且局部可注射量僅平均 32.5 mL，相對于股骨側平均 65 mL 明顯偏少；另外因局部組織間隙小，阻力大，難以順利注射。2005 年法國學者 Hernigou 等[5]認為，局部注射自體骨髓血能治療骨折不愈合，與骨髓血中干細胞的數量和濃度有關，不經濃縮的骨髓血中干細胞的數量和濃度相對較低，會影響臨床療效，采取濃集技術增加骨髓血中干細胞的數量和濃度可提高療效。
隨著骨組織工程技術發展，有學者應用“菱形理念”治療骨折不愈合[13，21]，在骨折端局部提供活性細胞、生長因子、生物材料改善生物學環境，骨祖細胞在生長因子的誘導下向成骨細胞分化，從而促進骨折愈合。自體骨髓血中含有較多的 BMSCs，局部注射自體骨髓血就是利用局部的細胞促進骨折愈合，但因局部可注射量有限而影響療效。Hernigou 等[5] 認為濃縮技術可以提高骨髓血中 BMSCs 的濃度，濃縮前骨髓血中 BMSCs 數量為（612±134）個/cm3，而濃縮后為（2 579±1 121）個/cm3。El-Jawhari 等[14]分析了正常愈合和萎縮性骨不連患者的骨髓組織，結果發現萎縮性骨不連患者骨髓中多能基質細胞增殖能力和成骨能力較低。萎縮性骨不連因骨折端血供差，無法誘導較多 BMSCs 歸巢到骨折端局部，因此局部給予較高濃度的 BMSCs 有利于骨折修復，而骨髓濃集技術可以在不破壞骨髓血中骨細胞的基礎上提取高濃度的 BMSCs。Sch?fer 等[22]定量分析骨髓血及濃縮骨髓血中細胞及生長因子含量，發現濃縮的骨髓血中表達 CD45–CD73+、CD45–CD73+、CD90+的細胞群顯著增加，并且還增加了 PDGF、VEGF、巨噬細胞集落刺激因子等生長因子數量，認為富集技術不會破壞細胞及生長因子的活性。骨組織修復需要充足的 BMSCs，而 PRP 中富含多種生長因子，可以提高 BMSCs 向成骨細胞轉化[23-24]。骨組織是高度血管化的組織，治療骨折不愈合必須重視局部血管化，而生長因子如 VEGF、PDGF 等可促進血管形成。另外，骨折的愈合和重建過程是通過骨細胞、活性因子和細胞外基質協調，刺激 BMSCs 增殖、分化而實現的[25]。我們在研究中發現，cBMA 聯合 PRP 經皮注射可以提供充足的干細胞，同時 PRP 中生長因子可提高干細胞成骨能力，促進骨折端局部血管化，更能加速骨折修復[26-27]。本研究中自體骨髓血注射組骨折愈合率為 61.3%，而 cBMA 聯合 PRP 注射組骨折愈合率為 85.7%，顯著高于前者，并且骨折愈合時間明顯短于前者。可見 cBMA 聯合 PRP 注射不僅可提高骨折愈合率，還可以縮短骨折愈合時間。
本研究中自體骨髓血均來自患者本身，通過濃縮富集技術增加了單位體積中 BMSCs 數量，富集后注射量明顯減少，可以減少注射局部反應。經皮注射 cBMA 聯合 PRP 除了增加 BMSCs 數量，同時提供了促進干細胞成骨活性的生長因子，提高了骨折愈合率并縮短骨折愈合時間，該方法微創、治療費用低且臨床療效確切。注意注射前需透視下對骨折端遠近 2 cm 范圍皮質行微損傷處理，并且確保注射到骨折斷端。本研究不足之處為病例較少，并且未對 cBMA 和 PRP 分組研究。
作者貢獻：倘艷鋒負責研究設計、實施，資料收集及文章撰寫；楊玉霞參與資料收集及文章撰寫；李紅軍參與研究實施；習嘉寧參與研究實施及資料收集；李無陰、岳辰、王會超參與負責研究評估及數據統計；劉又文負責研究設計、實施、評估，資料收集及數據統計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經河南省洛陽正骨醫院（河南省骨科醫院）倫理委員會批準[（科研）2016-002]。
骨折順利愈合依賴于骨折端良好的穩定性及生物學環境，萎縮性骨不連多表現為骨折端穩定性良好而生物學環境差[1]。自體骨移植術仍是治療骨折不愈合的金標準，但存在創傷大、造成骨缺損、存在并發癥等問題[2-3]，并且對于骨折延遲愈合采取骨移植治療可能為過激治療。20 世紀 80 年代，有學者采取經皮自體骨髓血注射提供骨折愈合所需的 BMSCs 治療骨折延遲愈合或不愈合，療效確切[4]。但自體紅骨髓中 BMSCs 數量相對較少；骨髓濃集液（concentrated bone marrow aspirate，cBMA）是將骨髓血濃集，增加了單位體積 BMSCs 數量，因此經皮注射 cBMA 效果更佳[5]。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是通過對自體靜脈血離心處理，富集血小板并裂解釋放各種生長因子，包括 PDGF、TGF-β、bFGF、VEGF 等，其中 PDGF、TGF-β 具有骨誘導作用，VEGF 具有促進骨修復作用，同時可以促進局部微血管生成[6]。對于骨缺損和骨折不愈合的治療需要充足 BMSCs，同時需要自體生長因子激活促進細胞成骨轉化，共同組成局部生物室促進骨修復[7]。2016 年 3 月—2018 年 7 月，我們開展前瞻性隨機對照單盲病例研究，選擇骨折延遲愈合但骨折端穩定的患者，分別采用經皮自體骨髓血注射和經皮自體 cBMA+PRP 注射治療，探討 cBMA+PRP 注射治療骨折延遲愈合的效果。報告如下。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① 患者骨折愈合過程中 3 個月無進展，骨折術后 6～9 個月未實現骨性愈合；② 骨折端內固定牢靠，未出現內固定物斷裂、松動失效；③ 骨折端骨缺損≤5 mm；④ 單光子發射計算機斷層掃描/CT 提示骨折端核素濃聚，存在愈合可能性[8]；⑤ 隨訪時間超過 12 個月；⑥ 愿意參加研究并遵守研究方案及完成數據收集者。排除標準：① 感染性骨不連；② 合并嚴重代謝性疾病，如糖尿病等影響骨折愈合者；③ 有嚴重吸煙、嗜酒史而又不能戒除者。
2016 年 3 月—2018 年 7 月共 210 例骨折延遲愈合患者于我院治療，其中 66 例符合選擇標準納入研究。采用隨機數字表法將患者隨機分為對照組（31 例，采用經皮自體骨髓血注射治療）和研究組（35 例，采用經皮自體 cBMA+PRP 注射治療）。
1.2 一般資料
對照組：男 23 例，女 8 例；年齡 20～56 歲，平均 38.2 歲。病程 4～9 個月，平均 6.5 個月。骨折延遲愈合部位：股骨 13 例，脛骨 11 例，鎖骨 2 例，肱骨 3 例，橈骨 2 例。體質量指數（25.3±3.4）kg/m2。骨缺損長度為（2.19±0.60）mm。術前脛骨骨折影像學愈合評分系統（RUST）評分為（0.9±0.7）分。
研究組：男 25 例，女 10 例；年齡 28～55 歲，平均 41.1 歲。病程 4～9 個月，平均 6.8 個月。骨折延遲愈合部位：股骨 11 例，脛骨 17 例，橈骨 3 例，尺骨 1 例，肱骨 3 例。體質量指數（24.9±3.1）kg/m2。骨缺損長度為（2.14±0.68）mm。術前 RUST 評分（0.9±0.7）分。
兩組患者性別、年齡、體質量指數、骨折延遲愈合部位、骨折端骨缺損長度、術前 RUST 評分等一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.3 治療方法
1.3.1 抽取骨髓血
研究組抽骨髓血前將 800 U 肝素鈉加入 60 mL 注射器中反復抽拉，制備抗凝管。兩組于患者髂后上棘或對側脛骨平臺處消毒鋪巾，穿刺針有突破骨皮質感后再進入 1～2 cm，避免抽到外周血影響療效；注意每抽取 10 mL 骨髓血，需將穿刺點移離 1 cm 重新穿刺抽取。根據骨折部位連續抽取 30～60 mL。研究組骨髓血抽入抗凝管待制備 cBMA，對照組抽取骨髓血后直接注射。
1.3.2 cBMA+PRP 制備
cBMA 制備：研究組將抽取的骨髓血轉移到 50 mL 無菌離心管內，以 600×g 離心 15 min 后呈現 3 層，抽取上 2 層液體，去除底部紅細胞；再次在 50 mL 離心管中以 200×g 離心 5 min，取底層液體置于無菌注射器中備用。取 0.5 mL cBMA 送實驗室檢測單核細胞數量，以（5～10）×105 個/L 為佳，0.5 mL 留樣行細菌培養。
PRP 制備：抽血前將枸櫞酸鈉 3 mL 加入 60 mL 注射器中，反復抽拉制備抗凝管，無菌條件下經肘部抽取外周血 27 mL。將抽取的靜脈血裝入 50 mL 無菌離心管中，以 200×g 離心 15 min，可見全血分 3 層；棄下層紅細胞層，吸取上層淡黃色血漿層裝入 10 mL 離心管中，以 180×g 離心 6 min；棄底部以白細胞為主的沉淀物，取上層血漿層以1 000×g 離心 8 min，取底部血小板及上方的血漿即為 PRP。將制備好的 PRP 抽取 1 mL 留樣行細菌培養。
1.3.3 手術治療
兩組均采取持續硬膜外麻醉聯合蛛網膜下腔阻滯麻醉，患者仰臥于可透視手術床上。首先，透視下應用 1 枚直徑 3.0 mm 克氏針，動力下對骨折端遠近側骨膜及纖維骨痂進行刺激，克氏針需深入到骨折端及骨缺損部位，并圍繞骨折端遠近 2 cm 范圍內刺削骨膜，造成局部微損傷。然后，對照組將抽取的骨髓血直接于透視下用 18 號腰椎穿刺針經皮注射到骨折端周圍。注射時針尖刺入骨折端纖維組織，需緩慢注入，避免壓力過大造成骨髓血飛濺。需觀察局部腫脹情況，尤其對于脛骨或前臂尺橈骨骨髓血注射量應<40 mL，避免引發筋膜間室綜合征。研究組將 3 mL cBMA 和 2 mL PRP 混合后，透視下用 18 號腰椎穿刺針經皮注射到骨折端周圍，具體方法及注意事項同對照組。
1.4 術后處理
術后無需預防性應用抗生素，囑患者第 2 日開始下床活動，患肢置于體質量秤上負重練習，記錄感覺到骨折端疼痛時的質量，之后在小于該質量下不完全負重練習。囑患者絕對戒煙并離開吸煙環境，控制體質量，治療后 6 周首次攝 X 線片檢查。治療后 3、6、12 個月門診隨訪，攝 X 線片了解骨折愈合情況，并根據骨折愈合情況指導患者負重強度及鍛煉方法。
1.5 療效評價標準
記錄并比較兩組患者骨折愈合時間、治療費用（入院至骨折愈合期間總費用）及不良反應（術后發燒、白細胞計數異常、局部腫脹及感染情況等）；采用疼痛視覺模擬評分（VAS）評價患者疼痛改善情況。
將脛骨 RUST 評分擴展到管狀骨愈合評價，通過觀察正側位 X 線片所呈現的 4 層骨皮質來評價骨折愈合程度[9-10]。骨折端無骨痂出現，1 分；骨折端有骨痂出現，2 分；骨折端有橋接骨痂出現，3 分；骨折端骨痂塑形折線消失，4 分。將骨折愈合定義為至少 3 個骨皮質出現橋接骨痂；骨折不愈合定義為無影像學進展 3 個月以上或術后 9 個月仍未愈合者。
1.6 統計學方法
采用 SPSS24.0 統計軟件進行分析。計量資料若符合正態分布，數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，組內手術前后比較采用配對 t 檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用 χ2 檢驗；檢驗水準取雙側 α=0.05。
2 結果
兩組骨髓穿刺針眼均無感染發生。對照組 5 例術后局部腫脹明顯，11 例術后 1 d 疼痛加重，經對癥治療后明顯緩解；研究組術后腫脹及疼痛不明顯，但有 2 例出現局部紅腫疼痛，考慮 PRP 局部炎癥反應，對癥處理后緩解。術后兩組患者均獲隨訪，隨訪時間對照組 16～36 個月，平均 21.8 個月；研究組 14～33 個月，平均 23.2 個月。研究組骨髓血抽取量顯著少于對照組，差異有統計學意義（t=4.610，P=0.000）；研究組術后疼痛程度較對照組輕，治療費用較對照組高，但差異均無統計學意義（P>0.05）。對照組 19 例獲得骨折愈合，愈合率 61.3%；研究組 30 例獲得骨折愈合，愈合率 85.7%；兩組骨折愈合率比較差異有統計學意義（χ2=5.128，P=0.024）。研究組骨折愈合時間和末次隨訪時 RUST 評分均顯著優于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組末次隨訪時 RUST 評分均較術前顯著改善（P<0.05）。見表 1、圖 1。
表1
兩組患者各臨床指標比較（）
Table1.
Comparison of clinical indexes between the two groups ()
圖1
研究組患者，男，55 歲，交通事故傷致右股骨轉子下骨折，行切開復位鋼板內固定術
a. 術后 4 個月 X 線片示內固定失效；b. 行鋼板取出髓內釘內固定術后即刻 X 線片，骨折端未植骨；c. 二次術后 4 個月 X 線片示骨折端無骨痂生成；d～g. 透視下用克氏針行骨折端骨皮質“刺削”并于骨折端注射 cBMA+PRP；h. 注射后 26 周 X 線片示骨折端骨愈合
Figure1. A 55-year-old male patient with right subtrochanteric fracture of the femur caused by traffic accident in the study group, treated with open reduction and plate internal fixationa. X-ray film at 4 months after operation showed that the internal fixation failed; b. X-ray film at immediate after plate removal and intramedullary nail internal fixation, showed that the fracture end was not implanted; c. X-ray film showed that no callus formed at the fracture end at 4 months after the second-stage operation; d-g. Using Kirschner wire to “prick” the bone cortex at the fracture end and injecting cBMA+PRP at the fracture end under fluoroscopy; h. X-ray film showed bone union at fracture end at 26 weeks after injection
3 討論
骨折后可因骨折端嚴重粉碎、骨折周圍軟組織破壞明顯、骨折端血供損傷及伴有感染等局部因素，以及吸煙、飲酒、代謝性疾病等全身因素，而導致延遲愈合甚至不愈合[11]。骨折術后連續 3 個月無進展或術后 9 個月骨折未愈合，可定義為骨折延遲愈合，采取何種方法促進骨折愈合避免骨不連發生，是骨科醫師面臨的一個挑戰[12]。骨折延遲愈合經過積極治療可避免不愈合發生，方法包括骨折端電刺激和沖擊波等[13]，自體骨移植仍是治療骨折延遲愈合或不愈合的“金標準”，但自體骨移植存在骨缺損、增加創傷及髂骨取出處血腫或感染等風險。有研究指出萎縮性骨不連患者 BMSCs 增殖能力和成骨能力均降低，其治療需提高 BMSCs 質量和活性[14]。Connolly 等[4]于 1986 年首次采取自體骨髓血局部注射治療骨折延遲愈合，認為自體骨髓血局部注射增加了骨折端 BMSCs 數量。隨后，研究者們應用自體骨髓血經皮注射治療骨折延遲愈合或不愈合，均取得了較好臨床療效，并認為該方法可作為開放性手術自體骨移植之前的最佳選擇方法[15-17]。Wu 等[18]采取自體骨髓血直接注射治療 53 例兒童（平均年齡 6.7 歲）骨折延遲愈合和不愈合，結果 47 例骨折愈合，有效率 88.7%，他們認為自體骨髓血直接注射促進骨折愈合操作簡單、安全、經濟且微創。Braly 等[19]應用自體骨髓血經皮注射治療脛骨遠端骨折延遲愈合和不愈合患者 11 例，注射量 40～80 mL，治療后 6 個月 9 例獲得愈合，并強調該方法治療需要骨折端內固定穩定牢靠。Gross 等[20]認為骨髓血局部注射治療骨折延遲愈合或不愈合與其中的成纖維細胞集落形成單位有關，并指出骨髓血注射可能存在筋膜間室綜合征風險，尤其對于小腿和前臂局部注射者。我們在取自體骨髓血直接注射治療中發現，注射后次日局部疼痛明顯增加，尤其是脛骨骨折患者，并且局部可注射量僅平均 32.5 mL，相對于股骨側平均 65 mL 明顯偏少；另外因局部組織間隙小，阻力大，難以順利注射。2005 年法國學者 Hernigou 等[5]認為，局部注射自體骨髓血能治療骨折不愈合，與骨髓血中干細胞的數量和濃度有關，不經濃縮的骨髓血中干細胞的數量和濃度相對較低，會影響臨床療效，采取濃集技術增加骨髓血中干細胞的數量和濃度可提高療效。
隨著骨組織工程技術發展，有學者應用“菱形理念”治療骨折不愈合[13，21]，在骨折端局部提供活性細胞、生長因子、生物材料改善生物學環境，骨祖細胞在生長因子的誘導下向成骨細胞分化，從而促進骨折愈合。自體骨髓血中含有較多的 BMSCs，局部注射自體骨髓血就是利用局部的細胞促進骨折愈合，但因局部可注射量有限而影響療效。Hernigou 等[5] 認為濃縮技術可以提高骨髓血中 BMSCs 的濃度，濃縮前骨髓血中 BMSCs 數量為（612±134）個/cm3，而濃縮后為（2 579±1 121）個/cm3。El-Jawhari 等[14]分析了正常愈合和萎縮性骨不連患者的骨髓組織，結果發現萎縮性骨不連患者骨髓中多能基質細胞增殖能力和成骨能力較低。萎縮性骨不連因骨折端血供差，無法誘導較多 BMSCs 歸巢到骨折端局部，因此局部給予較高濃度的 BMSCs 有利于骨折修復，而骨髓濃集技術可以在不破壞骨髓血中骨細胞的基礎上提取高濃度的 BMSCs。Sch?fer 等[22]定量分析骨髓血及濃縮骨髓血中細胞及生長因子含量，發現濃縮的骨髓血中表達 CD45–CD73+、CD45–CD73+、CD90+的細胞群顯著增加，并且還增加了 PDGF、VEGF、巨噬細胞集落刺激因子等生長因子數量，認為富集技術不會破壞細胞及生長因子的活性。骨組織修復需要充足的 BMSCs，而 PRP 中富含多種生長因子，可以提高 BMSCs 向成骨細胞轉化[23-24]。骨組織是高度血管化的組織，治療骨折不愈合必須重視局部血管化，而生長因子如 VEGF、PDGF 等可促進血管形成。另外，骨折的愈合和重建過程是通過骨細胞、活性因子和細胞外基質協調，刺激 BMSCs 增殖、分化而實現的[25]。我們在研究中發現，cBMA 聯合 PRP 經皮注射可以提供充足的干細胞，同時 PRP 中生長因子可提高干細胞成骨能力，促進骨折端局部血管化，更能加速骨折修復[26-27]。本研究中自體骨髓血注射組骨折愈合率為 61.3%，而 cBMA 聯合 PRP 注射組骨折愈合率為 85.7%，顯著高于前者，并且骨折愈合時間明顯短于前者。可見 cBMA 聯合 PRP 注射不僅可提高骨折愈合率，還可以縮短骨折愈合時間。
本研究中自體骨髓血均來自患者本身，通過濃縮富集技術增加了單位體積中 BMSCs 數量，富集后注射量明顯減少，可以減少注射局部反應。經皮注射 cBMA 聯合 PRP 除了增加 BMSCs 數量，同時提供了促進干細胞成骨活性的生長因子，提高了骨折愈合率并縮短骨折愈合時間，該方法微創、治療費用低且臨床療效確切。注意注射前需透視下對骨折端遠近 2 cm 范圍皮質行微損傷處理，并且確保注射到骨折斷端。本研究不足之處為病例較少，并且未對 cBMA 和 PRP 分組研究。
作者貢獻：倘艷鋒負責研究設計、實施，資料收集及文章撰寫；楊玉霞參與資料收集及文章撰寫；李紅軍參與研究實施；習嘉寧參與研究實施及資料收集；李無陰、岳辰、王會超參與負責研究評估及數據統計；劉又文負責研究設計、實施、評估，資料收集及數據統計。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經河南省洛陽正骨醫院（河南省骨科醫院）倫理委員會批準[（科研）2016-002]。
