引用本文： 張培, 劉泉, 樊宗慶, 吳敏, 朱坤, 周建生, 項平. 帶肌腹血供腓骨長肌腱移植重建對兔前交叉韌帶止點轉歸影響的研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(7): 848-853. doi: 10.7507/1002-1892.201912048 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關節重要穩定裝置，有限制脛骨前移、防止膝關節過伸、控制脛骨旋轉、維持脛骨和股骨對應關系的作用[1]。ACL 斷裂后無法自愈，如不予以治療將會導致膝關節不穩，繼發軟骨和半月板損傷，加速膝關節退變，最終導致骨關節炎，嚴重影響膝關節功能[2]。
關節鏡下自體肌腱重建是臨床治療 ACL 損傷常用方法。血供是影響重建術后腱-骨愈合的重要因素之一，良好血供可以促進移植物腱-骨界面生長，進而有利于韌帶止點的形成，對膝關節功能恢復起到積極作用。吳波等[3]研究認為 ACL 殘端內有大量生長因子，重建時保留韌帶殘端可以明顯增加移植物血供，進而促進重建韌帶功能恢復。周祥興等[4]采用帶血管蒂髕韌帶修復重建 ACL，獲得良好治療效果。因此，如何充分利用移植物周圍血管促進其重建術后血管化，以提高重建效果，是需要關注的方向。為此，我們從肌腹到肌腱的血供著手，探討采用帶肌腹血供腓骨長肌腱重建兔 ACL 后，移植物在骨隧道內愈合以及韌帶止點轉歸情況，以期為臨床提高 ACL 重建療效提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康新西蘭大白兔 80 只，雌雄不拘，體質量 2～3 kg，購自蚌埠醫學院實驗動物中心。經前、后抽屜試驗及側方應力試驗檢查膝關節均正常后，隨機分成 A、B 兩組，每組 40 只，分別制備帶或不帶肌腹血供的自體腓骨長肌腱移植重建 ACL 模型。
1.2 動物模型制備方法
兩組動物術前禁食水 24 h。術前 30 min 肌肉注射阿托品（0.5 mg/kg）、耳緣靜脈注射 20% 氨基甲酸乙酯（5 mL/kg），同時緩慢注射 20 mm 平衡液。麻醉滿意后，將實驗動物固定于手術操作臺上，術野聚維酮碘溶液消毒后鋪巾。
1.2.1 移植物切取
自右后肢跟骨外側至足跖趾關節中后 1/3 處作一縱切口，分離皮膚和皮下，可見腓骨長肌腱從外上斜向內下繞至足底；從足外側緣切斷該肌腱，向近端游離達 5 cm 長。A 組將腓骨長肌腱連同肌腹經皮下隧道向上游離至膝關節；B 組不保留肌腹，僅切取腓骨長肌腱。
1.2.2 ACL 損傷模型制備
沿右后肢髕骨內側作長約 3.5 cm 切口，依次切開皮膚、皮下組織、髕骨內側支持帶及關節囊，使髕骨外側脫位，充分暴露股骨髁和脛骨平臺，在股骨和脛骨 ACL 止點處切除 ACL，檢查前抽屜試驗陽性提示 ACL 損傷模型制備成功。手術時注意保護關節面、關節軟骨、后交叉韌帶及髕下脂肪墊。
1.2.3 ACL 重建
① 制備脛骨隧道：屈膝 90°，利用脛骨 ACL 瞄準器，選用直徑 2 mm 克氏針裝于電鉆制備脛骨隧道。骨隧道入口在脛骨結節內側，與脛骨成 45° 角，出口在原 ACL 脛骨止點中心。② 制備股骨隧道：屈膝 100°，沿 ACL 方向安置股骨隧道定位器（Smith & Nephew 公司，美國），外側髁定位為 11:00 點處，由關節內向關節外鉆穿股骨外側髁，制作股骨隧道。③ 移植物重建：將腓骨長肌腱遠端用細線固定，以帶鉤的注射器針頭引導，將細線穿過脛骨和股骨隧道，牽拉細線將腓骨長肌腱自遠端依次穿過脛骨和股骨隧道。屈膝 30°，將腓骨長肌腱兩端縫線懸吊固定，A 組注意保護肌腹血供，移植物近端與腓骨長肌肌腹相連。生理鹽水沖洗，逐層縫合關節腔及切口。術后即刻膝關節腔內注射慶大霉素 1 萬 U。術后兩組實驗動物自由負重，每天肌肉注射青霉素 8 萬 U，共 6 d。見圖 1。
圖1
A 組 ACL 損傷重建模型制備示意圖
a. ACL 損傷（箭頭）；b. 切取的帶肌腹血供的自體腓骨長肌腱（箭頭）；c. ACL 重建（箭頭）
Figure1. Preparation of ACL reconstruction model in group Aa. ACL rupture (arrow); b. Autogenous peroneus longus tendon with blood supply (arrow); c. ACL reconstruction (arrow)
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察術后兩組實驗動物飲食、切口愈合以及雙膝關節活動情況。
1.3.2 大體觀察
于 4、8、16 周兩組各取 3 只實驗動物，同上法麻醉后從原切口進入，使髕骨外脫位，充分顯露重建韌帶。觀察移植物色澤、有無滑膜包裹、滑膜上有無血管浸潤，以及半月板、關節軟骨有無退變。完整切取兩組膝關節，置于 10% 中性甲醛固定 3 d 后，觀察關節內移植物與骨隧道間有無空隙。然后將標本置于 50% 甲酸脫鈣液脫鈣后縱形剖開，觀察腱-骨愈合情況。
1.3.3 組織學觀察
大體觀察后，取兩組脫鈣后腱-骨標本修整成 1 cm×1 cm×1 cm 組織塊，常規脫水、透明、石蠟包埋，切片，片厚 4 μm。常規 HE 染色后，光鏡下觀察移植物與骨隧道間組織類型，有無血管長入及纖維連接，軟骨細胞生長情況，有無炎癥細胞浸潤，以及有無“潮線”結構。取正常膝關節標本作為對照。
1.3.4 生物力學測試
于 8、16 周兩組各取 12 只動物，空氣栓塞處死后，于膝關節上、下 3 cm 處截斷股骨和脛骨，取完整膝關節，剔除周圍軟組織，包括半月板、后交叉韌帶，脛骨和股骨間只保留移植物相連。將股骨與脛骨分別固定于萬能材料試驗機（Zwick 公司，德國），調整膝關節于屈曲 30°位，脛骨、股骨以膝關節為中心按 5 mm/min 速度向相反方向加載負荷，最大加載負荷為 500 N，測試并記錄腱-骨界面最大抗拉強度。同時觀察 ACL 止點（韌帶與骨隧道接觸部位）斷裂發生例數，計算止點斷裂率。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；計數資料組間比較采用 Fisher 確切概率法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
兩組動物均存活至實驗完成；麻醉蘇醒后自動覓食及飲水，切口愈合良好，均恢復正常活動。
2.2 大體觀察
術后 4 周，兩組移植物表面均有滑膜包裹，且 A 組滑膜多于 B 組。A、B 組腱-骨界面有軟組織生長，并且軟組織內有血管浸潤，但 A 組軟組織更致密、血管浸潤更豐富。兩組骨隧道與移植物間均有空隙，骨隧道均有擴大現象。
術后 8 周，兩組移植物表面滑膜包裹更明顯，滑膜表面有光澤，重建韌帶彈性較好，腱-骨界面軟組織變硬，A 組較 B 組變硬明顯。A 組移植物與骨隧道間空隙相對 4 周時明顯減小，移植物與骨隧道愈合良好，與骨組織相連的周邊部分腱性結構模糊；而 B 組仍有輕度骨隧道擴大。
術后 16 周，兩組移植物滑膜包裹明顯，關節液清亮，重建韌帶彈性較好，骨隧道與移植物愈合。A 組移植物腱-骨間分界不清，無骨隧道擴大現象，形成類似正常韌帶止點結構；而 B 組腱-骨間仍存在明顯分界。見圖 2。
圖2
各組術后大體觀察
從左至右分別為術后 4、8、16 周 a. A 組；b. B 組
Figure2. Gross observation of the two groups after operationFrom left to right for 4, 8, and 16 weeks after operation a. Group A; b. Group B
2.3 組織學觀察
正常 ACL 止點處從韌帶到骨組織具有韌帶、纖維軟骨、鈣化軟骨和骨 4 層移行結構，纖維軟骨和鈣化軟骨之間有典型的“潮線”相隔。
術后 4 周，兩組移植物和骨隧道間充滿肉芽組織，血管增生。A 組移植物膠原纖維增生，其中可見血管，成纖維細胞增生；腱-骨之間無縫隙，軟骨細胞增生，可見少量膠原纖維，但排列紊亂。B 組移植物膠原纖維增生相對 A 組少；腱-骨之間組織疏松，成纖維細胞較少，可見少量膠原纖維。
術后 8 周，A 組移植物與骨隧道間纖維組織增生較多，腱-骨之間形成致密的纖維連接，并進一步形成纖維軟骨帶，呈現新骨組織包繞腱組織并向其中長入，但“潮線”結構不明顯；軟骨細胞增生，分泌細胞外基質并逐漸鈣化，骨小梁周圍有成骨細胞增生。B 組變化與 A 組相似，腱-骨之間也形成纖維連接帶，但纖維軟骨連接組織沒有 A 組致密，軟骨細胞增生和鈣化較 A 組明顯減少，也未形成“潮線”結構。
術后 16 周，A 組移植物和骨隧道未見明顯分界，腱-骨界面之間形成連續的纖維軟骨連接，腱-骨移行部分分化成熟，從韌帶到骨組織出現韌帶、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨組織，鈣化組織和非鈣化組織之間有“潮線”結構；軟骨細胞增生明顯并鈣化。B 組移植物和骨隧道之間也形成纖維軟骨連接，按應力方向排列，但骨組織和韌帶組織分界尚清楚，“潮線”結構亦不明顯。見圖 3。
圖3
各組術后組織學觀察（HE×100）
從左至右分別為術后 4、8、16 周 a. A 組；b. B 組
Figure3. Histological observation of the two groups after operation (HE×100)From left to right for 4, 8, and 16 weeks after operation a. Group A; b. Group B
2.4 生物力學測試
術后 8 周，A、B 組分別有 4、6 例發生 ACL 止點斷裂，止點斷裂率分別為 33.3%、50.0%；最大抗拉強度分別為（43.42±4.15）、（38.35±4.39）N。術后 16 周，A、B 組分別有 1、3 例發生 ACL 止點斷裂，止點斷裂率分別為 8.3%、25.0%；最大抗拉強度分別為（74.30±7.62）、（65.94±5.77）N。術后 8、16 周 A、B 組止點斷裂率比較，差異均無統計學意義（P=0.680；P=0.590）；而最大抗拉強度比較差異有統計學意義（t=18.503，P=0.001；t=25.391，P=0.001）。
3 討論
重建術后 ACL 止點的良好轉歸有利于移植物發揮正常生理功能，移植物和骨隧道之間的轉歸過程是腱-骨界面宿主細胞生長、膠原纖維生成，而后由纖維細胞長入肌腱。張冉等[5]將肌腱周圍組織包繞移植物后植入骨隧道，發現可以顯著增加 VEGF 水平和血管生成，加速再血管化過程，進而促進 ACL 止點轉歸。有學者認為，ACL 殘端中具有促進血管、神經修復的基因，因此保留殘端重建 ACL 有利于上述相關基因的表達[6-7]，進而降低患者膝關節疼痛評分、促進膝關節活動度的恢復、提高關節功能評分，加速患者術后關節功能康復[8]。并且，Nguyen 等[9]研究認為保留韌帶血管的網絡纖維，可以進一步促進 ACL 止點轉歸。Kanamoto 等[10]在兔 ACL 重建過程中，發現血管生成速度和數量與術后關節功能恢復程度相關。同時，研究顯示在術中保留髕下脂肪墊能夠促進 ACL 移植物的再血管化過程[11]。本研究發現與 B 組相比，A 組重建韌帶內血管增生較多，周圍細胞增生并逐漸長入韌帶組織，有較多增生的纖維軟骨。說明 A 組移植物從肌腹直接提供的部分血供有利于移植物和骨隧道之間纖維組織填充、血管再生，而再生的血管又可以與移植物內血供連接，增加了腱-骨間血供，為成纖維細胞再生、膠原纖維分泌、軟骨細胞再生以及軟骨細胞鈣化奠定基礎。
移植物在骨隧道內的血管化受諸多因素影響，如骨隧道直徑、骨隧道位置、移植物固定是否牢固、移植物在骨隧道內的長度、移植物來源、移植物血供等[12-13]，而再血管化是重建韌帶成功的重要因素。紀慶明等[14]研究表明，臨床 ACL 重建時將自體富血小板血漿植入骨隧道中，可以明顯促進止點再血管化。郝滋辰等[15]研究認為相對于 BMSCs，ACL 來源的 MSCs 可以明顯促進移植物在骨隧道內的早期血管化。重建韌帶的肌腱由于游離后很容易失去血供，其血循環重建需要較長時間才能完成。術后重建 ACL 血供來源于手術創傷刺激引起的炎癥介質以及各種生長因子的釋放，同時髕下脂肪墊中的毛細血管增生并向移植物表面包裹[16]。本課題組前期以兔為實驗模型，將 TGF-β1、bFGF 植入移植物骨隧道中，術后發現韌帶內的血管增生明顯，而細胞壞死、膠原崩解減少。然而這些方法均為血管再生，并不是來源于移植物本身的血供[17]。本研究 A 組是用近端與肌腹相連的腓骨長肌腱移植重建 ACL，充分利用肌腹血供，實驗結果顯示 A 組 ACL 止點愈合快于 B 組，止點較早形成成熟的纖維軟骨連接，說明從肌腹進入肌腱的血供對移植后的腱-骨愈合有直接促進作用，使腱-骨之間血供更豐富，有利于成纖維細胞增生并分泌膠原纖維，更有利于軟骨細胞增生和鈣化。
移植物的良好轉歸對韌帶的生物力學改善起到重要作用，一般認為肌腱移植重建 ACL 后都要經歷變性壞死、重新血管化、細胞增殖和重新塑形過程，在此過程中移植物生物力學性能會下降[18]。之后，隨著時間延長，移植物止點愈合逐漸成熟，最大抗拉強度等力學性能逐漸改善[19-20]。本實驗結果顯示兩組止點斷裂率無明顯差異，但 A 組最大抗拉強度明顯大于 B 組，說明 A 組肌腱組織由于有來自肌腹的血供，移植后早期變性壞死不明顯，肌腱抗拉強度較 B 組大。組織學觀察結果也進一步驗證了生物力學測試結果。8 周時 A 組 ACL 止點愈合較 B 組好，已經形成致密纖維軟骨連接，而 B 組軟骨鈣化明顯少于 A 組，所形成的纖維軟骨連接亦不明顯，8 周時的止點斷裂率較高。因此，肌腹直接血供可以明顯減少移植物變性壞死，對力學性能的改善起到積極作用。
目前認為韌帶或者肌腱止點根據其結構不同可分為直接止點和間接止點，直接止點有典型的 4 層結構，從韌帶到骨組織依次是纖維組織、纖維軟骨、鈣化軟骨和骨，纖維軟骨和鈣化軟骨之間有“潮線”結構。間接止點根據結構不同又分為兩種亞型：骨膜型間接止點和骨型間接止點，前者是纖維組織間接通過骨膜連于骨，后者則直接連于骨，一般認為間接止點是在肌腱與骨組織之間形成穿透性的膠原纖維連接，即 Sharpey 纖維，Sharpey 纖維是將肌腱、韌帶或骨膜錨定在骨上的纖維結構[21]。以 Sharpey 纖維為止點的愈合成為間接愈合，而以纖維軟骨為止點的愈合則認為是直接愈合。關于腱-骨愈合的組織學轉歸，相關研究結果不一致，主要與學者們對間接止點和直接止點的界定標準不同有關，另外觀察部位也會影響組織學結果。本研究發現，4 周時 A 組腱-骨之間相對 B 組有較多肉芽組織填充、血管增生、成纖維細胞增生，并分泌膠原纖維，軟骨細胞增生，此時的腱-骨連接主要是肉芽組織和膠原纖維，亦可認為是間接止點；8 周時 A 組膠原纖維進一步增多，軟骨細胞增生，鈣化增多，腱-骨之間形成纖維軟骨連接；16 周時此連接更加緊密，鈣化區和非鈣化區形成“潮線”結構，4 層結構逐漸明顯，此時肌腱和骨隧道之間形成成熟的纖維軟骨連接，亦可認為是直接止點。上述結果提示移植物肌腹血供有利于移植韌帶直接止點的形成。此外，腓骨長肌腱切取時保留肌腹的同時保留了部分腓淺神經，對肌腱具有神經營養作用，膝關節的穩定和功能維持離不開正常的本體感覺，保留肌腹的血供更有利于移植物以及周圍滑膜神經的恢復[22]。
綜上述，帶肌腹血供的腓骨長肌腱移植重建對 ACL 止點轉歸具有明顯促進作用，進而提高重建效果，同時也進一步說明了移植物血供是影響 ACL 移植重建后止點轉歸的重要因素。在保證血供條件下如何有效固定移植物止點，以及血供促進止點轉歸的基因表達機制，尚需進一步探討。
作者貢獻：劉泉、周建生、吳敏、張培負責科研課題設計；張培、樊宗慶、項平負責實驗實施及文章撰寫；朱坤負責數據收集、整理。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經蚌埠醫學院動物倫理委員會批準（倫動批字［2016］第 032 號）。實驗過程中對動物處置嚴格遵守國家科學技術部 2006 年《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求。實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2016-006。
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關節重要穩定裝置，有限制脛骨前移、防止膝關節過伸、控制脛骨旋轉、維持脛骨和股骨對應關系的作用[1]。ACL 斷裂后無法自愈，如不予以治療將會導致膝關節不穩，繼發軟骨和半月板損傷，加速膝關節退變，最終導致骨關節炎，嚴重影響膝關節功能[2]。
關節鏡下自體肌腱重建是臨床治療 ACL 損傷常用方法。血供是影響重建術后腱-骨愈合的重要因素之一，良好血供可以促進移植物腱-骨界面生長，進而有利于韌帶止點的形成，對膝關節功能恢復起到積極作用。吳波等[3]研究認為 ACL 殘端內有大量生長因子，重建時保留韌帶殘端可以明顯增加移植物血供，進而促進重建韌帶功能恢復。周祥興等[4]采用帶血管蒂髕韌帶修復重建 ACL，獲得良好治療效果。因此，如何充分利用移植物周圍血管促進其重建術后血管化，以提高重建效果，是需要關注的方向。為此，我們從肌腹到肌腱的血供著手，探討采用帶肌腹血供腓骨長肌腱重建兔 ACL 后，移植物在骨隧道內愈合以及韌帶止點轉歸情況，以期為臨床提高 ACL 重建療效提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
健康新西蘭大白兔 80 只，雌雄不拘，體質量 2～3 kg，購自蚌埠醫學院實驗動物中心。經前、后抽屜試驗及側方應力試驗檢查膝關節均正常后，隨機分成 A、B 兩組，每組 40 只，分別制備帶或不帶肌腹血供的自體腓骨長肌腱移植重建 ACL 模型。
1.2 動物模型制備方法
兩組動物術前禁食水 24 h。術前 30 min 肌肉注射阿托品（0.5 mg/kg）、耳緣靜脈注射 20% 氨基甲酸乙酯（5 mL/kg），同時緩慢注射 20 mm 平衡液。麻醉滿意后，將實驗動物固定于手術操作臺上，術野聚維酮碘溶液消毒后鋪巾。
1.2.1 移植物切取
自右后肢跟骨外側至足跖趾關節中后 1/3 處作一縱切口，分離皮膚和皮下，可見腓骨長肌腱從外上斜向內下繞至足底；從足外側緣切斷該肌腱，向近端游離達 5 cm 長。A 組將腓骨長肌腱連同肌腹經皮下隧道向上游離至膝關節；B 組不保留肌腹，僅切取腓骨長肌腱。
1.2.2 ACL 損傷模型制備
沿右后肢髕骨內側作長約 3.5 cm 切口，依次切開皮膚、皮下組織、髕骨內側支持帶及關節囊，使髕骨外側脫位，充分暴露股骨髁和脛骨平臺，在股骨和脛骨 ACL 止點處切除 ACL，檢查前抽屜試驗陽性提示 ACL 損傷模型制備成功。手術時注意保護關節面、關節軟骨、后交叉韌帶及髕下脂肪墊。
1.2.3 ACL 重建
① 制備脛骨隧道：屈膝 90°，利用脛骨 ACL 瞄準器，選用直徑 2 mm 克氏針裝于電鉆制備脛骨隧道。骨隧道入口在脛骨結節內側，與脛骨成 45° 角，出口在原 ACL 脛骨止點中心。② 制備股骨隧道：屈膝 100°，沿 ACL 方向安置股骨隧道定位器（Smith & Nephew 公司，美國），外側髁定位為 11:00 點處，由關節內向關節外鉆穿股骨外側髁，制作股骨隧道。③ 移植物重建：將腓骨長肌腱遠端用細線固定，以帶鉤的注射器針頭引導，將細線穿過脛骨和股骨隧道，牽拉細線將腓骨長肌腱自遠端依次穿過脛骨和股骨隧道。屈膝 30°，將腓骨長肌腱兩端縫線懸吊固定，A 組注意保護肌腹血供，移植物近端與腓骨長肌肌腹相連。生理鹽水沖洗，逐層縫合關節腔及切口。術后即刻膝關節腔內注射慶大霉素 1 萬 U。術后兩組實驗動物自由負重，每天肌肉注射青霉素 8 萬 U，共 6 d。見圖 1。
圖1
A 組 ACL 損傷重建模型制備示意圖
a. ACL 損傷（箭頭）；b. 切取的帶肌腹血供的自體腓骨長肌腱（箭頭）；c. ACL 重建（箭頭）
Figure1. Preparation of ACL reconstruction model in group Aa. ACL rupture (arrow); b. Autogenous peroneus longus tendon with blood supply (arrow); c. ACL reconstruction (arrow)
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察術后兩組實驗動物飲食、切口愈合以及雙膝關節活動情況。
1.3.2 大體觀察
于 4、8、16 周兩組各取 3 只實驗動物，同上法麻醉后從原切口進入，使髕骨外脫位，充分顯露重建韌帶。觀察移植物色澤、有無滑膜包裹、滑膜上有無血管浸潤，以及半月板、關節軟骨有無退變。完整切取兩組膝關節，置于 10% 中性甲醛固定 3 d 后，觀察關節內移植物與骨隧道間有無空隙。然后將標本置于 50% 甲酸脫鈣液脫鈣后縱形剖開，觀察腱-骨愈合情況。
1.3.3 組織學觀察
大體觀察后，取兩組脫鈣后腱-骨標本修整成 1 cm×1 cm×1 cm 組織塊，常規脫水、透明、石蠟包埋，切片，片厚 4 μm。常規 HE 染色后，光鏡下觀察移植物與骨隧道間組織類型，有無血管長入及纖維連接，軟骨細胞生長情況，有無炎癥細胞浸潤，以及有無“潮線”結構。取正常膝關節標本作為對照。
1.3.4 生物力學測試
于 8、16 周兩組各取 12 只動物，空氣栓塞處死后，于膝關節上、下 3 cm 處截斷股骨和脛骨，取完整膝關節，剔除周圍軟組織，包括半月板、后交叉韌帶，脛骨和股骨間只保留移植物相連。將股骨與脛骨分別固定于萬能材料試驗機（Zwick 公司，德國），調整膝關節于屈曲 30°位，脛骨、股骨以膝關節為中心按 5 mm/min 速度向相反方向加載負荷，最大加載負荷為 500 N，測試并記錄腱-骨界面最大抗拉強度。同時觀察 ACL 止點（韌帶與骨隧道接觸部位）斷裂發生例數，計算止點斷裂率。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；計數資料組間比較采用 Fisher 確切概率法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
兩組動物均存活至實驗完成；麻醉蘇醒后自動覓食及飲水，切口愈合良好，均恢復正常活動。
2.2 大體觀察
術后 4 周，兩組移植物表面均有滑膜包裹，且 A 組滑膜多于 B 組。A、B 組腱-骨界面有軟組織生長，并且軟組織內有血管浸潤，但 A 組軟組織更致密、血管浸潤更豐富。兩組骨隧道與移植物間均有空隙，骨隧道均有擴大現象。
術后 8 周，兩組移植物表面滑膜包裹更明顯，滑膜表面有光澤，重建韌帶彈性較好，腱-骨界面軟組織變硬，A 組較 B 組變硬明顯。A 組移植物與骨隧道間空隙相對 4 周時明顯減小，移植物與骨隧道愈合良好，與骨組織相連的周邊部分腱性結構模糊；而 B 組仍有輕度骨隧道擴大。
術后 16 周，兩組移植物滑膜包裹明顯，關節液清亮，重建韌帶彈性較好，骨隧道與移植物愈合。A 組移植物腱-骨間分界不清，無骨隧道擴大現象，形成類似正常韌帶止點結構；而 B 組腱-骨間仍存在明顯分界。見圖 2。
圖2
各組術后大體觀察
從左至右分別為術后 4、8、16 周 a. A 組；b. B 組
Figure2. Gross observation of the two groups after operationFrom left to right for 4, 8, and 16 weeks after operation a. Group A; b. Group B
2.3 組織學觀察
正常 ACL 止點處從韌帶到骨組織具有韌帶、纖維軟骨、鈣化軟骨和骨 4 層移行結構，纖維軟骨和鈣化軟骨之間有典型的“潮線”相隔。
術后 4 周，兩組移植物和骨隧道間充滿肉芽組織，血管增生。A 組移植物膠原纖維增生，其中可見血管，成纖維細胞增生；腱-骨之間無縫隙，軟骨細胞增生，可見少量膠原纖維，但排列紊亂。B 組移植物膠原纖維增生相對 A 組少；腱-骨之間組織疏松，成纖維細胞較少，可見少量膠原纖維。
術后 8 周，A 組移植物與骨隧道間纖維組織增生較多，腱-骨之間形成致密的纖維連接，并進一步形成纖維軟骨帶，呈現新骨組織包繞腱組織并向其中長入，但“潮線”結構不明顯；軟骨細胞增生，分泌細胞外基質并逐漸鈣化，骨小梁周圍有成骨細胞增生。B 組變化與 A 組相似，腱-骨之間也形成纖維連接帶，但纖維軟骨連接組織沒有 A 組致密，軟骨細胞增生和鈣化較 A 組明顯減少，也未形成“潮線”結構。
術后 16 周，A 組移植物和骨隧道未見明顯分界，腱-骨界面之間形成連續的纖維軟骨連接，腱-骨移行部分分化成熟，從韌帶到骨組織出現韌帶、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨組織，鈣化組織和非鈣化組織之間有“潮線”結構；軟骨細胞增生明顯并鈣化。B 組移植物和骨隧道之間也形成纖維軟骨連接，按應力方向排列，但骨組織和韌帶組織分界尚清楚，“潮線”結構亦不明顯。見圖 3。
圖3
各組術后組織學觀察（HE×100）
從左至右分別為術后 4、8、16 周 a. A 組；b. B 組
Figure3. Histological observation of the two groups after operation (HE×100)From left to right for 4, 8, and 16 weeks after operation a. Group A; b. Group B
2.4 生物力學測試
術后 8 周，A、B 組分別有 4、6 例發生 ACL 止點斷裂，止點斷裂率分別為 33.3%、50.0%；最大抗拉強度分別為（43.42±4.15）、（38.35±4.39）N。術后 16 周，A、B 組分別有 1、3 例發生 ACL 止點斷裂，止點斷裂率分別為 8.3%、25.0%；最大抗拉強度分別為（74.30±7.62）、（65.94±5.77）N。術后 8、16 周 A、B 組止點斷裂率比較，差異均無統計學意義（P=0.680；P=0.590）；而最大抗拉強度比較差異有統計學意義（t=18.503，P=0.001；t=25.391，P=0.001）。
3 討論
重建術后 ACL 止點的良好轉歸有利于移植物發揮正常生理功能，移植物和骨隧道之間的轉歸過程是腱-骨界面宿主細胞生長、膠原纖維生成，而后由纖維細胞長入肌腱。張冉等[5]將肌腱周圍組織包繞移植物后植入骨隧道，發現可以顯著增加 VEGF 水平和血管生成，加速再血管化過程，進而促進 ACL 止點轉歸。有學者認為，ACL 殘端中具有促進血管、神經修復的基因，因此保留殘端重建 ACL 有利于上述相關基因的表達[6-7]，進而降低患者膝關節疼痛評分、促進膝關節活動度的恢復、提高關節功能評分，加速患者術后關節功能康復[8]。并且，Nguyen 等[9]研究認為保留韌帶血管的網絡纖維，可以進一步促進 ACL 止點轉歸。Kanamoto 等[10]在兔 ACL 重建過程中，發現血管生成速度和數量與術后關節功能恢復程度相關。同時，研究顯示在術中保留髕下脂肪墊能夠促進 ACL 移植物的再血管化過程[11]。本研究發現與 B 組相比，A 組重建韌帶內血管增生較多，周圍細胞增生并逐漸長入韌帶組織，有較多增生的纖維軟骨。說明 A 組移植物從肌腹直接提供的部分血供有利于移植物和骨隧道之間纖維組織填充、血管再生，而再生的血管又可以與移植物內血供連接，增加了腱-骨間血供，為成纖維細胞再生、膠原纖維分泌、軟骨細胞再生以及軟骨細胞鈣化奠定基礎。
移植物在骨隧道內的血管化受諸多因素影響，如骨隧道直徑、骨隧道位置、移植物固定是否牢固、移植物在骨隧道內的長度、移植物來源、移植物血供等[12-13]，而再血管化是重建韌帶成功的重要因素。紀慶明等[14]研究表明，臨床 ACL 重建時將自體富血小板血漿植入骨隧道中，可以明顯促進止點再血管化。郝滋辰等[15]研究認為相對于 BMSCs，ACL 來源的 MSCs 可以明顯促進移植物在骨隧道內的早期血管化。重建韌帶的肌腱由于游離后很容易失去血供，其血循環重建需要較長時間才能完成。術后重建 ACL 血供來源于手術創傷刺激引起的炎癥介質以及各種生長因子的釋放，同時髕下脂肪墊中的毛細血管增生并向移植物表面包裹[16]。本課題組前期以兔為實驗模型，將 TGF-β1、bFGF 植入移植物骨隧道中，術后發現韌帶內的血管增生明顯，而細胞壞死、膠原崩解減少。然而這些方法均為血管再生，并不是來源于移植物本身的血供[17]。本研究 A 組是用近端與肌腹相連的腓骨長肌腱移植重建 ACL，充分利用肌腹血供，實驗結果顯示 A 組 ACL 止點愈合快于 B 組，止點較早形成成熟的纖維軟骨連接，說明從肌腹進入肌腱的血供對移植后的腱-骨愈合有直接促進作用，使腱-骨之間血供更豐富，有利于成纖維細胞增生并分泌膠原纖維，更有利于軟骨細胞增生和鈣化。
移植物的良好轉歸對韌帶的生物力學改善起到重要作用，一般認為肌腱移植重建 ACL 后都要經歷變性壞死、重新血管化、細胞增殖和重新塑形過程，在此過程中移植物生物力學性能會下降[18]。之后，隨著時間延長，移植物止點愈合逐漸成熟，最大抗拉強度等力學性能逐漸改善[19-20]。本實驗結果顯示兩組止點斷裂率無明顯差異，但 A 組最大抗拉強度明顯大于 B 組，說明 A 組肌腱組織由于有來自肌腹的血供，移植后早期變性壞死不明顯，肌腱抗拉強度較 B 組大。組織學觀察結果也進一步驗證了生物力學測試結果。8 周時 A 組 ACL 止點愈合較 B 組好，已經形成致密纖維軟骨連接，而 B 組軟骨鈣化明顯少于 A 組，所形成的纖維軟骨連接亦不明顯，8 周時的止點斷裂率較高。因此，肌腹直接血供可以明顯減少移植物變性壞死，對力學性能的改善起到積極作用。
目前認為韌帶或者肌腱止點根據其結構不同可分為直接止點和間接止點，直接止點有典型的 4 層結構，從韌帶到骨組織依次是纖維組織、纖維軟骨、鈣化軟骨和骨，纖維軟骨和鈣化軟骨之間有“潮線”結構。間接止點根據結構不同又分為兩種亞型：骨膜型間接止點和骨型間接止點，前者是纖維組織間接通過骨膜連于骨，后者則直接連于骨，一般認為間接止點是在肌腱與骨組織之間形成穿透性的膠原纖維連接，即 Sharpey 纖維，Sharpey 纖維是將肌腱、韌帶或骨膜錨定在骨上的纖維結構[21]。以 Sharpey 纖維為止點的愈合成為間接愈合，而以纖維軟骨為止點的愈合則認為是直接愈合。關于腱-骨愈合的組織學轉歸，相關研究結果不一致，主要與學者們對間接止點和直接止點的界定標準不同有關，另外觀察部位也會影響組織學結果。本研究發現，4 周時 A 組腱-骨之間相對 B 組有較多肉芽組織填充、血管增生、成纖維細胞增生，并分泌膠原纖維，軟骨細胞增生，此時的腱-骨連接主要是肉芽組織和膠原纖維，亦可認為是間接止點；8 周時 A 組膠原纖維進一步增多，軟骨細胞增生，鈣化增多，腱-骨之間形成纖維軟骨連接；16 周時此連接更加緊密，鈣化區和非鈣化區形成“潮線”結構，4 層結構逐漸明顯，此時肌腱和骨隧道之間形成成熟的纖維軟骨連接，亦可認為是直接止點。上述結果提示移植物肌腹血供有利于移植韌帶直接止點的形成。此外，腓骨長肌腱切取時保留肌腹的同時保留了部分腓淺神經，對肌腱具有神經營養作用，膝關節的穩定和功能維持離不開正常的本體感覺，保留肌腹的血供更有利于移植物以及周圍滑膜神經的恢復[22]。
綜上述，帶肌腹血供的腓骨長肌腱移植重建對 ACL 止點轉歸具有明顯促進作用，進而提高重建效果，同時也進一步說明了移植物血供是影響 ACL 移植重建后止點轉歸的重要因素。在保證血供條件下如何有效固定移植物止點，以及血供促進止點轉歸的基因表達機制，尚需進一步探討。
作者貢獻：劉泉、周建生、吳敏、張培負責科研課題設計；張培、樊宗慶、項平負責實驗實施及文章撰寫；朱坤負責數據收集、整理。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經蚌埠醫學院動物倫理委員會批準（倫動批字［2016］第 032 號）。實驗過程中對動物處置嚴格遵守國家科學技術部 2006 年《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求。實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2016-006。
