引用本文： 張昭遠, 衛愉軒, 張長青, 袁霆. 應用不同離心條件優化富白細胞富血小板血漿制作方案研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(8): 1025-1030. doi: 10.7507/1002-1892.201911054 復制
富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是一種通過離心自體外周血獲得的血小板濃縮物[1]。研究已證實 PRP 激活后，血小板中的 α 顆粒可釋放 PDGF、VEGF、TGF-β、IGF 和 EGF 等多種生長因子[2-3]。PRP 具有促進組織修復的作用，且來源于自體，具有無排斥反應和來源便捷等優勢，臨床上已廣泛用于骨不連、慢性肌腱損傷、慢性創面、關節內軟骨損傷和骨關節炎等多種疾病的治療[4-7]。
目前，臨床上使用的 PRP 制備套裝主要采用兩次離心法和一次離心法。袁霆等[8]對 Anitua 法[2]（一次離心，160×g、6 min）、Petrungaro 法[9]（兩次離心，1 500×g、6 min，1 000×g、6 min）、Landesberg 法[10]（兩次離心，200×g、10 min，200×g、10 min）和 Aghaloo 法[11]（兩次離心，215×g、10 min，863×g、10 min）4 種 PRP 制備方法進行了比較。結果顯示，兩次離心法的血小板回收率高于一次離心法，并且 Petrungaro 法的血小板回收率較 Landesberg 法、Aghaloo 法低，存在統計學差異。目前關于 PRP 制作原理的文獻中，對最佳離心參數的描述差異較大，第 1 次離心力（200～1 100）×g，第 2 次離心力（200～2 330）×g，離心時間差異也較大，但血小板回收率均超過 46.9%[12-16]。此外，研究者認為，離心力（g）與離心時間（min）的乘積超過 11 000 g·min 將造成血小板大量破壞、生長因子流失[17-18]。
國內臨床上目前較常用的 PRP 套裝（山東威高集團醫用高分子制品股份有限公司）也是采用兩次離心法[19]（1 360×g、10 min，1 360×g、10 min），制備所得的 PRP 為富白細胞 PRP（leukocytes-rich PRP，L-PRP）。然而，臨床實踐中我們觀察到，該方法制備的 L-PRP 實際測得的血小板回收率波動性較大，存在一定推廣局限性。根據上海交通大學附屬第六人民醫院骨傷愈合 PRP 合作中心的 PRP 制備經驗，該方法導致血小板回收率波動性較大的原因可能是，第 1 次離心后血小板與白細胞聚集的白膜層非常薄，在移除紅細胞層的過程中容易誤將白膜層一起移除，造成血小板富集系數與血小板回收率降低。因此，該方法要求操作者具有更高的精細化操作能力和容錯率，不利于臨床進一步推廣，同時也導致不同制備者的成品 L-PRP 質量（血小板回收率和富集系數）和效果可能存在參差不齊的現象。鑒于此，我們擬進一步優化 L-PRP 離心方案，以提高 L-PRP 的可推廣性。
1 材料與方法
1.1 實驗對象選擇標準
取 76 例成年健康志愿者的外周血 45.0 mL/例。男 35 例，女 41 例；年齡 18～70 歲，平均 45.4 歲。志愿者納入標準：① 符合《中華人民共和國獻血法》和中華人民共和國衛生部頒布的《獻血體格檢查標準》，血紅蛋白：男性≥120 g/L，女性≥110 g/L；血小板計數≥100×109/L［正常值（100～300）×109/L］。② 采血前 7 d 內未服用影響血小板功能和凝血系統的藥物。③ 無傳染性疾病、相關血液疾病、惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病及感染等。
1.2 主要試劑與儀器
輸血用枸櫞酸鈉注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；一次性使用采血針（浙江康德萊醫療器械股份有限公司，0.8×28TW 或 1.2×28TW）；PRP 制備套裝、離心機、WG-YLJ-1 全自動血液分析儀（山東威高集團醫用高分子制品股份有限公司）。
1.3 L-PRP 制備方法
方法：① 用預先裝有 5.0 mL 枸櫞酸鈉注射液的 50 mL 注射器于志愿者的肘正中靜脈或大隱靜脈處采血 45.0 mL，注意邊采血邊搖勻，搖勻后共計 50.0 mL 血樣。② 將血樣注入 PRP 制備套裝的 60 mL 無菌離心管中，取 200 μL 血液進行血常規分析。③ 剩余血樣通過兩次離心法制備 PRP 5.0 mL，操作過程中嚴格遵循無菌原則。根據兩次離心法參數不同將所有血樣分為 3 組：實驗組 A（12 例，400×g、10 min，1 100×g、10 min）、實驗組 B（27 例，800×g、10 min，1 100×g、10 min）及對照組（37 例，1 360×g、10 min，1 360×g、10 min）。④ 第 1 次離心后，全血分為 3 層，上層為上清液，中層為白膜層，下層為紅細胞層。用注射器從離心管中心孔抽出紅細胞層（保留約 1 mL 下層頂部的紅細胞），棄去紅細胞，剩余血樣進行第 2 次離心；第 2 次離心后，血樣也分為 3 層，上層為上清液，中層為白膜層，下層為紅細胞層。用注射器連接無菌移液管，從離心管側孔貼壁抽出上清液，保留下層共計 5.0 mL 分層血樣，搖勻，即 L-PRP 5.0 mL。取 200 μL L-PRP 進行血常規分析。
1.4 觀測指標
計算并比較各組血小板富集系數和回收率、白細胞富集系數。公式：血小板富集系數=L-PRP 中血小板濃度/全血中血小板濃度；血小板回收率=（L-PRP 體積×L-PRP 中血小板濃度）/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%；白細胞富集系數=L-PRP 中白細胞濃度/全血中白細胞濃度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；若數據不符合正態分布或方差齊性，組間比較采用 Kruskal-Wallis 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
76 例志愿者中，14 例血樣的血小板回收率>100%，其中實驗組 A 2 例，實驗組 B 4 例，對照組 8 例；7 例血樣的 L-PRP 在第 2 次離心后，出現透明斑塊（血小板激活、聚集）導致血小板計數低于相應血樣的全血血小板計數，其中實驗組 B 2 例，對照組 5 例。將上述異常血樣剔除后剩余 55 例，其中實驗組 A 10 例，實驗組 B 21 例，對照組 24 例。實驗組 B 血小板富集系數和血小板回收率顯著高于實驗組 A 及對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組 A 和對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。實驗組 A、B 和對照組的白細胞富集系數差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
各組 L-PRP 的血小板回收率及血小板和白細胞富集系數比較（
）
Table1.
Comparison of platelet recovery rate and platelet and leukocyte enrichment coefficient of L-PRP in each group (
)
3 討論
PRP 是含有數倍于血小板生理濃度的血小板濃縮物，通常認為，PRP 中的血小板計數達到全血 3～6 倍以上才能達到有效的治療濃度[20]。本研究中，各組制備的 L-PRP 血小板濃度均在全血的 6 倍以上。在剔除異常血樣后，只有 2 個血樣制備的 L-PRP 血小板濃度未達全血的 3 倍，其中實驗組 A 和對照組各 1 例；而實驗組 B 中所有 L-PRP 的血小板濃度均在全血的 5 倍以上。無論采用上述哪種離心條件，均可制備出滿足臨床要求、合格的 PRP。因此我們認為，除了離心力及離心時間，可能還有其他重要因素影響 L-PRP 的制備質量、穩定性和推廣性。
3.1 全血離心后血小板與白細胞的分布情況
離心條件設置是影響 PRP 制備質量的重要因素。全血一次離心后分為 3 層，即上清液、白膜層和紅細胞層。Piao 等[21]認為，血液離心后，紅細胞在離心管中的分布將呈現上清液（α=0）、延遲沉降區（0<α≤αmax）和填充層（α=αmax），其中 α 為紅細胞的濃度，且隨著離心力增大或離心時間增加，延遲沉降區的紅細胞將完全沉降至填充層。本研究的預實驗中，我們對第 1 次離心后紅細胞層與第 2 次離心后上清液進行分層采樣，即根據深度將紅細胞層和上清液自上而下分為四等分，在四等分點采集血樣，并對白膜層進行取樣分析。我們觀察到，第一次離心后的細胞層各深度的血小板與白細胞計數基本相似，且遠低于全血血小板及白細胞計數，并且第 2 次離心（1 100×g、10 min）后的上清液中僅含有極少量細胞成分，白膜層的血小板計數比全血基線濃度高 20～40 倍以上，白細胞計數也遠高于其余各層。即兩次離心后，血小板和白細胞的濃度在分層血樣中并非呈現隨深度遞增的梯度分布。據此，我們推測，在填充層中，當紅細胞濃度達到最大時，血小板與白細胞將因空間被擠壓而離開填充層，并與因離心而沉降的血小板及白細胞聚集，形成白膜層（圖 1）；在白膜層中，血小板和白細胞濃度最高，向上（上清層）或向下（紅細胞層）血小板濃度急劇降低，且在不同深度血小板的濃度較為相近。因此，我們認為，在避免抽吸到白膜層的前提下，可確保血小板及白細胞的回收率和富集系數，并通過改變最終 L-PRP 的體積（即減少上清和紅細胞層）來提高 L-PRP 中血小板的富集系數。
圖1
當填充層中紅細胞濃度達最大后，白細胞將因空間被擠壓而離開填充層
紅色圓形示紅細胞，白色圓形示白細胞及血小板，F 示離心力及其方向
Figure1. When the concentration of erythrocytes in the filling layer reaches the maximum, the leukocytes will be crushed out of the filling layerRed circles represented erythrocytes, white circles represented leukocytes and platelets, and F represented the centrifugal force and its direction
3.2 影響 PRP 成品質量的重要因素
在 Piao 等[21]建立的 PRP 中血小板和白細胞的回收率預測模型中，全血體積和離心時間固定時，血小板與白細胞的回收率將隨離心力的增加而增加，并逐漸達到峰值；此后，隨著離心力逐漸增大，血小板與白細胞的回收率將趨于穩定，并逐漸下降（全血的體積越大，下降趨勢越不明顯）；并且在一定離心力區間內，血小板回收率與第 1 次離心上清獲取率成正相關。本研究預實驗觀察到，小離心力組［（400～600）×g］第 1 次離心后血液分層效果不滿意（離心后上清液體積<40%）的情況較多，按照上述 PRP 制備操作步驟易出現低濃度的血小板。其原因可能是過小的離心力無法使血液有效分層，不能有效地使血小板從上清液中沉降至白膜層，或較多血小板混雜在紅細胞層，進而導致 PRP 制備質量不理想。超過一定離心力和離心時間后，PRP 中血小板回收率開始逐漸下降，這種回收率下降的趨勢可能與過大的離心力造成血小板與白細胞破壞有關[17-18]。此外，L-PRP 制備過程的手工操作也非常重要。在血液樣本第 1 次離心后移除紅細胞層時，注射器應緩慢抽吸，避免抽吸過猛而抽出過多的白膜層；第 2 次離心后，移液管口應時刻緊貼離心管內壁，貼近液面（圖 2），從上至下緩慢抽吸。整個操作過程須嚴格遵守無菌原則。
圖2
血液離心后移除紅細胞和上清液時，移液管口應時刻 緊貼液面
Figure2.
The mouth of pipette should touch the liquid surface close at all times, when erythrocytes and supernatant were removed after centrifugation
3.3 離心條件設定
結合臨床實踐及調查研究后，我們觀察到根據對照組方案制備的 L-PRP 血小板回收率波動性較大，并且制備的 L-PRP 質量對操作者技術的依賴性較強。可能原因是兩次離心后白膜層較薄，在移除紅細胞和上清液的過程中容易誤將白膜層一起移除，因而造成血小板富集系數與血小板回收率降低。為了提高 L-PRP 制備的可操作性、穩定性和制備的容錯率，我們根據全血離心后血小板與白細胞的分布情況進行分析，下調了第 1 次離心的離心力；同時，為了更好地減少離心對血小板形態和功能的損害，也下調了第 2 次離心的離心力。實驗中我們發現，2 個實驗組的白膜層均較對照組厚，更易被操作者觀察到，在移除紅細胞和上清液過程中，可更好地避免誤吸白膜層。既往 Yin 等[16]將 35 mL 血樣（包含 3 mL 枸櫞酸鈉抗凝劑）按離心力 400×g、離心時間 10 min 離心 2 次，制備的 PRP 中血小板富集系數為 5.18±0.59，血小板回收率為 57.87%±6.45%。袁霆等[8]有關 PRP 制備原理的研究發現，Petrungaro 法、Landesberg 法和 Aghaloo 法的血小板回收率高于 Anitua 法，并且 Landesberg 法和 Aghaloo 法的效果最佳，兩者的血小板回收率均可達 85% 以上。本研究中，實驗組 B 的每一個 L-PRP 樣本血小板計數均>5 倍，并且實驗組 B 與實驗組 A 及對照組的血小板富集系數比較差異有統計學意義，說明實驗組 B 的離心參數設置使血小板富集效果更佳。實驗組 A、B 與對照組在白細胞富集系數上無統計學意義，可見第 1 次離心力的大小對白細胞富集效果不會產生明顯影響。因此，根據實驗組 B 離心方案制備的 L-PRP 血小板富集系數和回收率區間更為穩定，且白膜層較厚，容錯率較高，便于臨床推廣。
3.4 影響 PRP 成品質量的其他因素
影響 PRP 成品質量（血小板富集系數和回收率）和準確性的其他因素還包括血樣基線、異常白色斑塊形成、紅細胞破損、血小板激活、溫度等。在制備 L-PRP 的過程中我們發現，若第 2 次離心前，保留的紅細胞過少或不保留紅細胞，離心后可出現白色斑塊，PRP 搖勻后白色斑塊不溶解（圖 3）。當出現白色斑塊時，PRP 中的血小板計數將明顯下降，低于全血血小板濃度。我們推斷，這種白色半透明凝膠狀物質可能屬于一種白色斑塊，主要成分為血小板；由于離心力過大或離心時間過長等誘發血小板激活、聚集，形成白色斑塊，因而影響血小板的濃度與功能[16, 22-23]。同時，我們發現當保留紅細胞層較少或不保留時，白色斑塊形成的例數較多。此外，在血液離心時，如果發生溶血，全血細胞測試儀可能會將紅細胞的碎片誤認為是血小板，從而導致計數錯誤，使血小板計數異常偏高。并且，在血常規分析前，未將血樣搖勻也將影響血細胞測試儀計數的準確性。本研究中部分樣本 PRP 的血小板回收率超過 100% 或遠低于預期值均與上述原因有關。制備 PRP 時的環境溫度和全血血樣保存溫度也是影響 PRP 質量的重要因素。Du 等[15]發現，相同體積的同源血樣，在 4℃ 下 PRP 分層情況優于室溫下以相同離心條件制備的 PRP（對照組），血小板富集系數和回收率均高于對照組。然而，Amable 等[12]認為溫度對血小板富集系數和回收率不會產生影響。我們在制備 PRP 時發現，在相同離心條件下，相比于室溫（18～25℃）保存，4℃ 保存的全血離心后更易出現難以分層的情況（圖 4），進而導致提取困難，血小板回收率下降。因此，溫度對 PRP 制備的影響仍然需要更多研究去探索。
圖3
白色斑塊
Figure3.
White plaque
圖4
溫度對全血離心后分層的影響
a. 室溫（18～25℃）下，以 800×g 離心 10 min 即可得到滿意分層；b. 4℃ 時即使增加離心力至 1 100×g 離心 10 min 也難以獲得理想分層
Figure4. The effect of temperature on the stratification of whole blood after centrifugationa. Centrifugation with 800×g for 10 minutes can obtain satisfactory stratification at room temperature (18-25℃); b. Even if the centrifugal force is increased to 1 100×g for 10 minutes, it is difficult to obtain ideal stratification at 4℃
綜上述，PPR 質量受多種因素影響，包括離心力、離心時間、溫度和操作過程等。通過本研究我們認為，兩次離心法（800×g、10 min，1 100×g、10 min）是一種較為理想且可行的離心方法，可以獲得滿意的血小板回收率和富集系數，且兩次離心后白膜層較厚，可降低對操作者的精細化要求，具有較高的容錯率及可推廣性。
作者貢獻：張昭遠參與實驗設計與實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；衛愉軒參與實驗設計與實施、數據收集整理及統計分析；袁霆參與實驗設計與實施；張長青、袁霆對實驗方案和文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經上海市第六人民醫院倫理委員會批準（2019-010）。
富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是一種通過離心自體外周血獲得的血小板濃縮物[1]。研究已證實 PRP 激活后，血小板中的 α 顆粒可釋放 PDGF、VEGF、TGF-β、IGF 和 EGF 等多種生長因子[2-3]。PRP 具有促進組織修復的作用，且來源于自體，具有無排斥反應和來源便捷等優勢，臨床上已廣泛用于骨不連、慢性肌腱損傷、慢性創面、關節內軟骨損傷和骨關節炎等多種疾病的治療[4-7]。
目前，臨床上使用的 PRP 制備套裝主要采用兩次離心法和一次離心法。袁霆等[8]對 Anitua 法[2]（一次離心，160×g、6 min）、Petrungaro 法[9]（兩次離心，1 500×g、6 min，1 000×g、6 min）、Landesberg 法[10]（兩次離心，200×g、10 min，200×g、10 min）和 Aghaloo 法[11]（兩次離心，215×g、10 min，863×g、10 min）4 種 PRP 制備方法進行了比較。結果顯示，兩次離心法的血小板回收率高于一次離心法，并且 Petrungaro 法的血小板回收率較 Landesberg 法、Aghaloo 法低，存在統計學差異。目前關于 PRP 制作原理的文獻中，對最佳離心參數的描述差異較大，第 1 次離心力（200～1 100）×g，第 2 次離心力（200～2 330）×g，離心時間差異也較大，但血小板回收率均超過 46.9%[12-16]。此外，研究者認為，離心力（g）與離心時間（min）的乘積超過 11 000 g·min 將造成血小板大量破壞、生長因子流失[17-18]。
國內臨床上目前較常用的 PRP 套裝（山東威高集團醫用高分子制品股份有限公司）也是采用兩次離心法[19]（1 360×g、10 min，1 360×g、10 min），制備所得的 PRP 為富白細胞 PRP（leukocytes-rich PRP，L-PRP）。然而，臨床實踐中我們觀察到，該方法制備的 L-PRP 實際測得的血小板回收率波動性較大，存在一定推廣局限性。根據上海交通大學附屬第六人民醫院骨傷愈合 PRP 合作中心的 PRP 制備經驗，該方法導致血小板回收率波動性較大的原因可能是，第 1 次離心后血小板與白細胞聚集的白膜層非常薄，在移除紅細胞層的過程中容易誤將白膜層一起移除，造成血小板富集系數與血小板回收率降低。因此，該方法要求操作者具有更高的精細化操作能力和容錯率，不利于臨床進一步推廣，同時也導致不同制備者的成品 L-PRP 質量（血小板回收率和富集系數）和效果可能存在參差不齊的現象。鑒于此，我們擬進一步優化 L-PRP 離心方案，以提高 L-PRP 的可推廣性。
1 材料與方法
1.1 實驗對象選擇標準
取 76 例成年健康志愿者的外周血 45.0 mL/例。男 35 例，女 41 例；年齡 18～70 歲，平均 45.4 歲。志愿者納入標準：① 符合《中華人民共和國獻血法》和中華人民共和國衛生部頒布的《獻血體格檢查標準》，血紅蛋白：男性≥120 g/L，女性≥110 g/L；血小板計數≥100×109/L［正常值（100～300）×109/L］。② 采血前 7 d 內未服用影響血小板功能和凝血系統的藥物。③ 無傳染性疾病、相關血液疾病、惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病及感染等。
1.2 主要試劑與儀器
輸血用枸櫞酸鈉注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；一次性使用采血針（浙江康德萊醫療器械股份有限公司，0.8×28TW 或 1.2×28TW）；PRP 制備套裝、離心機、WG-YLJ-1 全自動血液分析儀（山東威高集團醫用高分子制品股份有限公司）。
1.3 L-PRP 制備方法
方法：① 用預先裝有 5.0 mL 枸櫞酸鈉注射液的 50 mL 注射器于志愿者的肘正中靜脈或大隱靜脈處采血 45.0 mL，注意邊采血邊搖勻，搖勻后共計 50.0 mL 血樣。② 將血樣注入 PRP 制備套裝的 60 mL 無菌離心管中，取 200 μL 血液進行血常規分析。③ 剩余血樣通過兩次離心法制備 PRP 5.0 mL，操作過程中嚴格遵循無菌原則。根據兩次離心法參數不同將所有血樣分為 3 組：實驗組 A（12 例，400×g、10 min，1 100×g、10 min）、實驗組 B（27 例，800×g、10 min，1 100×g、10 min）及對照組（37 例，1 360×g、10 min，1 360×g、10 min）。④ 第 1 次離心后，全血分為 3 層，上層為上清液，中層為白膜層，下層為紅細胞層。用注射器從離心管中心孔抽出紅細胞層（保留約 1 mL 下層頂部的紅細胞），棄去紅細胞，剩余血樣進行第 2 次離心；第 2 次離心后，血樣也分為 3 層，上層為上清液，中層為白膜層，下層為紅細胞層。用注射器連接無菌移液管，從離心管側孔貼壁抽出上清液，保留下層共計 5.0 mL 分層血樣，搖勻，即 L-PRP 5.0 mL。取 200 μL L-PRP 進行血常規分析。
1.4 觀測指標
計算并比較各組血小板富集系數和回收率、白細胞富集系數。公式：血小板富集系數=L-PRP 中血小板濃度/全血中血小板濃度；血小板回收率=（L-PRP 體積×L-PRP 中血小板濃度）/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%；白細胞富集系數=L-PRP 中白細胞濃度/全血中白細胞濃度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；若數據不符合正態分布或方差齊性，組間比較采用 Kruskal-Wallis 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
76 例志愿者中，14 例血樣的血小板回收率>100%，其中實驗組 A 2 例，實驗組 B 4 例，對照組 8 例；7 例血樣的 L-PRP 在第 2 次離心后，出現透明斑塊（血小板激活、聚集）導致血小板計數低于相應血樣的全血血小板計數，其中實驗組 B 2 例，對照組 5 例。將上述異常血樣剔除后剩余 55 例，其中實驗組 A 10 例，實驗組 B 21 例，對照組 24 例。實驗組 B 血小板富集系數和血小板回收率顯著高于實驗組 A 及對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組 A 和對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。實驗組 A、B 和對照組的白細胞富集系數差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
各組 L-PRP 的血小板回收率及血小板和白細胞富集系數比較（）
Table1.
Comparison of platelet recovery rate and platelet and leukocyte enrichment coefficient of L-PRP in each group ()
3 討論
PRP 是含有數倍于血小板生理濃度的血小板濃縮物，通常認為，PRP 中的血小板計數達到全血 3～6 倍以上才能達到有效的治療濃度[20]。本研究中，各組制備的 L-PRP 血小板濃度均在全血的 6 倍以上。在剔除異常血樣后，只有 2 個血樣制備的 L-PRP 血小板濃度未達全血的 3 倍，其中實驗組 A 和對照組各 1 例；而實驗組 B 中所有 L-PRP 的血小板濃度均在全血的 5 倍以上。無論采用上述哪種離心條件，均可制備出滿足臨床要求、合格的 PRP。因此我們認為，除了離心力及離心時間，可能還有其他重要因素影響 L-PRP 的制備質量、穩定性和推廣性。
3.1 全血離心后血小板與白細胞的分布情況
離心條件設置是影響 PRP 制備質量的重要因素。全血一次離心后分為 3 層，即上清液、白膜層和紅細胞層。Piao 等[21]認為，血液離心后，紅細胞在離心管中的分布將呈現上清液（α=0）、延遲沉降區（0<α≤αmax）和填充層（α=αmax），其中 α 為紅細胞的濃度，且隨著離心力增大或離心時間增加，延遲沉降區的紅細胞將完全沉降至填充層。本研究的預實驗中，我們對第 1 次離心后紅細胞層與第 2 次離心后上清液進行分層采樣，即根據深度將紅細胞層和上清液自上而下分為四等分，在四等分點采集血樣，并對白膜層進行取樣分析。我們觀察到，第一次離心后的細胞層各深度的血小板與白細胞計數基本相似，且遠低于全血血小板及白細胞計數，并且第 2 次離心（1 100×g、10 min）后的上清液中僅含有極少量細胞成分，白膜層的血小板計數比全血基線濃度高 20～40 倍以上，白細胞計數也遠高于其余各層。即兩次離心后，血小板和白細胞的濃度在分層血樣中并非呈現隨深度遞增的梯度分布。據此，我們推測，在填充層中，當紅細胞濃度達到最大時，血小板與白細胞將因空間被擠壓而離開填充層，并與因離心而沉降的血小板及白細胞聚集，形成白膜層（圖 1）；在白膜層中，血小板和白細胞濃度最高，向上（上清層）或向下（紅細胞層）血小板濃度急劇降低，且在不同深度血小板的濃度較為相近。因此，我們認為，在避免抽吸到白膜層的前提下，可確保血小板及白細胞的回收率和富集系數，并通過改變最終 L-PRP 的體積（即減少上清和紅細胞層）來提高 L-PRP 中血小板的富集系數。
圖1
當填充層中紅細胞濃度達最大后，白細胞將因空間被擠壓而離開填充層
紅色圓形示紅細胞，白色圓形示白細胞及血小板，F 示離心力及其方向
Figure1. When the concentration of erythrocytes in the filling layer reaches the maximum, the leukocytes will be crushed out of the filling layerRed circles represented erythrocytes, white circles represented leukocytes and platelets, and F represented the centrifugal force and its direction
3.2 影響 PRP 成品質量的重要因素
在 Piao 等[21]建立的 PRP 中血小板和白細胞的回收率預測模型中，全血體積和離心時間固定時，血小板與白細胞的回收率將隨離心力的增加而增加，并逐漸達到峰值；此后，隨著離心力逐漸增大，血小板與白細胞的回收率將趨于穩定，并逐漸下降（全血的體積越大，下降趨勢越不明顯）；并且在一定離心力區間內，血小板回收率與第 1 次離心上清獲取率成正相關。本研究預實驗觀察到，小離心力組［（400～600）×g］第 1 次離心后血液分層效果不滿意（離心后上清液體積<40%）的情況較多，按照上述 PRP 制備操作步驟易出現低濃度的血小板。其原因可能是過小的離心力無法使血液有效分層，不能有效地使血小板從上清液中沉降至白膜層，或較多血小板混雜在紅細胞層，進而導致 PRP 制備質量不理想。超過一定離心力和離心時間后，PRP 中血小板回收率開始逐漸下降，這種回收率下降的趨勢可能與過大的離心力造成血小板與白細胞破壞有關[17-18]。此外，L-PRP 制備過程的手工操作也非常重要。在血液樣本第 1 次離心后移除紅細胞層時，注射器應緩慢抽吸，避免抽吸過猛而抽出過多的白膜層；第 2 次離心后，移液管口應時刻緊貼離心管內壁，貼近液面（圖 2），從上至下緩慢抽吸。整個操作過程須嚴格遵守無菌原則。
圖2
血液離心后移除紅細胞和上清液時，移液管口應時刻 緊貼液面
Figure2.
The mouth of pipette should touch the liquid surface close at all times, when erythrocytes and supernatant were removed after centrifugation
3.3 離心條件設定
結合臨床實踐及調查研究后，我們觀察到根據對照組方案制備的 L-PRP 血小板回收率波動性較大，并且制備的 L-PRP 質量對操作者技術的依賴性較強。可能原因是兩次離心后白膜層較薄，在移除紅細胞和上清液的過程中容易誤將白膜層一起移除，因而造成血小板富集系數與血小板回收率降低。為了提高 L-PRP 制備的可操作性、穩定性和制備的容錯率，我們根據全血離心后血小板與白細胞的分布情況進行分析，下調了第 1 次離心的離心力；同時，為了更好地減少離心對血小板形態和功能的損害，也下調了第 2 次離心的離心力。實驗中我們發現，2 個實驗組的白膜層均較對照組厚，更易被操作者觀察到，在移除紅細胞和上清液過程中，可更好地避免誤吸白膜層。既往 Yin 等[16]將 35 mL 血樣（包含 3 mL 枸櫞酸鈉抗凝劑）按離心力 400×g、離心時間 10 min 離心 2 次，制備的 PRP 中血小板富集系數為 5.18±0.59，血小板回收率為 57.87%±6.45%。袁霆等[8]有關 PRP 制備原理的研究發現，Petrungaro 法、Landesberg 法和 Aghaloo 法的血小板回收率高于 Anitua 法，并且 Landesberg 法和 Aghaloo 法的效果最佳，兩者的血小板回收率均可達 85% 以上。本研究中，實驗組 B 的每一個 L-PRP 樣本血小板計數均>5 倍，并且實驗組 B 與實驗組 A 及對照組的血小板富集系數比較差異有統計學意義，說明實驗組 B 的離心參數設置使血小板富集效果更佳。實驗組 A、B 與對照組在白細胞富集系數上無統計學意義，可見第 1 次離心力的大小對白細胞富集效果不會產生明顯影響。因此，根據實驗組 B 離心方案制備的 L-PRP 血小板富集系數和回收率區間更為穩定，且白膜層較厚，容錯率較高，便于臨床推廣。
3.4 影響 PRP 成品質量的其他因素
影響 PRP 成品質量（血小板富集系數和回收率）和準確性的其他因素還包括血樣基線、異常白色斑塊形成、紅細胞破損、血小板激活、溫度等。在制備 L-PRP 的過程中我們發現，若第 2 次離心前，保留的紅細胞過少或不保留紅細胞，離心后可出現白色斑塊，PRP 搖勻后白色斑塊不溶解（圖 3）。當出現白色斑塊時，PRP 中的血小板計數將明顯下降，低于全血血小板濃度。我們推斷，這種白色半透明凝膠狀物質可能屬于一種白色斑塊，主要成分為血小板；由于離心力過大或離心時間過長等誘發血小板激活、聚集，形成白色斑塊，因而影響血小板的濃度與功能[16, 22-23]。同時，我們發現當保留紅細胞層較少或不保留時，白色斑塊形成的例數較多。此外，在血液離心時，如果發生溶血，全血細胞測試儀可能會將紅細胞的碎片誤認為是血小板，從而導致計數錯誤，使血小板計數異常偏高。并且，在血常規分析前，未將血樣搖勻也將影響血細胞測試儀計數的準確性。本研究中部分樣本 PRP 的血小板回收率超過 100% 或遠低于預期值均與上述原因有關。制備 PRP 時的環境溫度和全血血樣保存溫度也是影響 PRP 質量的重要因素。Du 等[15]發現，相同體積的同源血樣，在 4℃ 下 PRP 分層情況優于室溫下以相同離心條件制備的 PRP（對照組），血小板富集系數和回收率均高于對照組。然而，Amable 等[12]認為溫度對血小板富集系數和回收率不會產生影響。我們在制備 PRP 時發現，在相同離心條件下，相比于室溫（18～25℃）保存，4℃ 保存的全血離心后更易出現難以分層的情況（圖 4），進而導致提取困難，血小板回收率下降。因此，溫度對 PRP 制備的影響仍然需要更多研究去探索。
圖3
白色斑塊
Figure3.
White plaque
圖4
溫度對全血離心后分層的影響
a. 室溫（18～25℃）下，以 800×g 離心 10 min 即可得到滿意分層；b. 4℃ 時即使增加離心力至 1 100×g 離心 10 min 也難以獲得理想分層
Figure4. The effect of temperature on the stratification of whole blood after centrifugationa. Centrifugation with 800×g for 10 minutes can obtain satisfactory stratification at room temperature (18-25℃); b. Even if the centrifugal force is increased to 1 100×g for 10 minutes, it is difficult to obtain ideal stratification at 4℃
綜上述，PPR 質量受多種因素影響，包括離心力、離心時間、溫度和操作過程等。通過本研究我們認為，兩次離心法（800×g、10 min，1 100×g、10 min）是一種較為理想且可行的離心方法，可以獲得滿意的血小板回收率和富集系數，且兩次離心后白膜層較厚，可降低對操作者的精細化要求，具有較高的容錯率及可推廣性。
作者貢獻：張昭遠參與實驗設計與實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；衛愉軒參與實驗設計與實施、數據收集整理及統計分析；袁霆參與實驗設計與實施；張長青、袁霆對實驗方案和文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經上海市第六人民醫院倫理委員會批準（2019-010）。
