引用本文： 許剛, 張長春, 朱坤, 葉雨辰, 鮑正齊. 慢病毒介導的 IGF-1 與 PDGF 基因對人退變椎間盤髓核組織的影響. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(7): 907-914. doi: 10.7507/1002-1892.201910101 復制
腰椎間盤退變性疾病是引起腰腿痛的主要原因，嚴重影響人們日常生活。研究發現，退變的椎間盤組織內髓核細胞大量凋亡并且功能下降，表現為水分及糖蛋白、Ⅱ型膠原蛋白等細胞外基質合成減少[1-2]。目前對于椎間盤退變性疾病的臨床治療，無論是保守治療、開放手術還是微創手術，都僅僅從改善臨床癥狀入手，并未著眼于椎間盤本身的病理變化，故治療效果往往有限[3-5]。本實驗從髓核入手，通過多種實驗方法比較退變與正常髓核組織在細胞形態、生化成分等方面的不同，并利用基因工程技術將 IGF-1 和 PDGF 基因轉染至退變的髓核細胞，就兩種細胞因子如何逆轉髓核的退變作深入研究。
1 材料與方法
1.1 研究標本
退變髓核組織（退變組）取自 2018 年 7 月—2019 年 2 月，我科收治的因腰椎間盤退變突出需行髓核摘除術的 15 例患者，其中男 10 例，女 5 例；年齡 48～76 歲，平均 62.8 歲。納入標準：MRI 示腰椎間盤嚴重退變，不合并黃韌帶、后縱韌帶鈣化者；不合并腰椎感染、腫瘤及其他嚴重軀體疾病者。
正常髓核組織（正常組）取自 2018 年 7 月—2019 年 2 月，我科收治的因外傷致腰椎爆裂性骨折需行椎間盤髓核摘除術的 15 例患者，其中男 9 例，女 6 例；年齡 16～38 歲，平均 23.4 歲。納入標準：年齡<40 歲；無脊柱外傷及脊柱手術病史；術前影像學檢查無腰椎間盤退變及其他病變者。
1.2 主要試劑及儀器
H-DMEM 培養基（HyClone 公司，美國）；澳洲血源 FBS、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；小鼠抗人Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白抗體一抗，山羊抗小鼠 FITC 標記的 IgG 二抗，山羊抗小鼠二抗免疫組織化學試劑盒，兔抗人 IGF-1、PDGF 蛋白一抗，FITC 標記的山羊抗兔 IgG 二抗（Chemicon 公司，美國）；小鼠抗人 B 淋巴細胞瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體一抗、小鼠抗人 Bcl-2 相關 X（Bcl-2 associate X，Bax）抗體一抗、濃縮型 DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Western blot 及 IP 細胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；預染蛋白 Marker（Fermentas 公司，立陶宛）；聚偏二氟乙烯（poluvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore 公司，美國）；抗 β-actin 抗體（Sigma 公司，美國）。CO2 恒溫細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；流式細胞儀（Beckman 公司，美國）。
1.3 正常和退變髓核細胞學觀察
1.3.1 HE 染色觀察
取部分退變組及正常組髓核組織，經漂洗、乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（片厚 5 μm）、貼片處理后，常規行 HE 染色觀察。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
取上述部分切片行Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Bcl-2、Bax 免疫組織化學染色。主要步驟：先將切片脫蠟、乙醇水化后，進行抗原修復，阻斷過氧化物酶活性；然后依次滴加一抗（小鼠抗人Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白及 Bcl-2、Bax 單克隆抗體）、山羊抗小鼠 FITC 標記的 IgG 二抗；最后 DAB 溶液顯色，中性樹膠蓋玻片封閉。倒置顯微鏡下觀察，Ⅰ、Ⅱ型膠原及 Bcl-2、Bax 陽性結果為髓核細胞質內可見棕黃色顆粒狀陽性產物。每個樣本隨機觀察 10 個高倍（×400）視野并計數陽性細胞數和總細胞數，計算各蛋白陽性細胞百分比。
1.3.3 髓核細胞形態觀察
取部分退變組及正常組髓核組織，分別用 75%乙醇浸泡消毒、PBS 沖洗后，組織剪除周圍肌肉韌帶，眼科剪剪去周圍纖維環組織，并將髓核剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小；再將髓核組織消化、離心（半徑 6 cm、1 000 r/min 離心 5 min）后，在含 15%FBS 的 H-DMEM 培養基上進行原代和傳代培養，倒置顯微鏡下觀察髓核細胞形態。
1.3.4 Western blot 檢測
取兩組髓核細胞，根據 Western blot 檢測試劑盒說明進行總蛋白提取、蛋白定量、Ⅱ型膠原及內參 β-actin 蛋白電泳、轉膜、封閉和孵育、PVDF 膜化學發光、顯影及定影。顯影條帶使用 Image-Pro Plus 軟件分析并掃描條帶吸光度（A）值，以目的條帶與 β-actin 的 A 值比值作為各蛋白相對表達量。
1.4 基因轉染退變髓核細胞相關研究
1.4.1 實驗分組及基因轉染
利用慢病毒載體系統構建 IGF-1 基因慢病毒顆粒、PDGF 基因慢病毒顆粒及攜帶 IGF-1 和 PDGF 雙基因的慢病毒顆粒（IGF-1-P2A-PDGF）。實驗分為 4 組，A 組為退變髓核細胞對照組；B、C、D 組分別用 IGF-1、PDGF 和 IGF-1-P2A-PDGF 基因慢病毒顆粒轉染退變髓核細胞。具體轉染方法：分別將 0.2 μg 上述基因慢病毒質粒稀釋到 25 μL Reduced Serum Medium（一種可減少血清補充的改良培養基）中，另將 0.5 μL Lipofectamin2000 稀釋到 25 μL Reduced Serum Medium 中，將兩種溶液輕輕混勻后靜置，再分別加入 4 組細胞培養孔中培養。
1.4.2 細胞形態觀察
轉染后 21 d 取出各組細胞，胰蛋白酶消化后離心（半徑 6 cm、1 000 r/min、離心 5 min），收集沉淀細胞，PBS 清洗后取其中一部分加入含有 H-DMEM 培養基的細胞培養瓶中進行傳代培養，倒置顯微鏡下觀察轉染后各組細胞形態變化。剩余部分調整為濃度 1×106個/mL 的細胞懸液進行后續實驗。
1.4.3 流式細胞儀檢測
將各組細胞懸液分別加入兔抗人 IGF-1、PDGF 蛋白一抗，室溫孵育 30 min；PBS 洗 2 次，加入 FITC 標記的山羊抗兔 IgG 二抗，避光孵育 15 min；PBS 洗 2 次，混勻后上流式細胞儀檢測各組細胞 IGF-1、PDGF 陽性率。實驗重復 6 次取均值。
1.4.4 免疫組織化學染色觀察
轉染后 21 d 取出各組細胞分別放在 6 孔板內爬片，多聚甲醛固定，3%H2O2 室溫孵育 15 min；0.2%Triton X-100 溶液透化固定后的細胞，山羊血清封閉，室溫孵育 10 min；加入小鼠抗人Ⅱ型膠原抗體，4℃ 孵育過夜，再加山羊抗小鼠二抗，37℃ 孵育 15 min；滴加 DAB 顯色液，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.4.5 Western blot 檢測
同 1.3.4 方法檢測各組細胞Ⅱ型膠原蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 正常和退變髓核細胞學觀察
2.1.1 髓核細胞形態觀察
正常組培養 24 h 后有髓核細胞貼壁，初貼壁細胞呈圓形或橢圓形，部分伸出偽足，似扇形；然后貼壁細胞不斷增多，72 h 后細胞無明顯增多，逐漸伸展為梭形或多角形，呈極性排列；傳代后髓核細胞貼壁速度加快，2 h 后可見細胞排列緊密，鋪滿瓶底，呈長梭形或多角形，放射狀或鋪路石樣外觀。退變組髓核細胞隨培養時間延長，形態逐漸變得極不規則且排列較疏松，胞體變長，細胞質內出現發亮的顆粒狀物及空泡，并出現凋亡細胞。見圖 1。
圖1
退變組和正常組髓核細胞形態觀察（倒置顯微鏡×200）
a. 培養 72 h 的退變髓核細胞（黃箭頭示凋亡的髓核細胞，紅箭頭示細胞質內發亮的顆粒狀物及空泡）；b. 培養 24 h 的正常髓核細胞；c. 培養 72 h 的正常髓核細胞；d. 第 2 代正常髓核細胞
Figure1. Morphological observation of NPCs in degeneration group and normal group (Inverted microscope×200)a. The degenerated NPCs cultured for 72 hours (Yellow arrow indicated the apoptotic NPCs, red arrow indicated the shiny granules and vacuoles in the cytoplasm); b. Normal NPCs cultured for 24 hours; c. Normal NPCs cultured for 72 hours; d. The 2nd generation of normal NPCs
2.1.2 HE 染色觀察
退變組髓核細胞逐漸減少，髓核組織內可見大量纖維軟骨組織；正常組中央髓核組織可見大量脊索細胞和少量類軟骨細胞。見圖 2。
圖2
退變組和正常組 HE 染色觀察
從左至右依次為×100、×400 a. 退變組 箭頭示纖維軟骨細胞；b. 正常組 箭頭示脊索細胞
Figure2. HE staining observation in degeneration group and normal groupFrom left to right for ×100 and ×400, respectively a. Degeneration group Arrow indicated fibrochondrocytes; b. Normal group Arrow indicated notochord cells
2.1.3 免疫組織化學染色觀察
退變組Ⅰ型膠原、Bax 蛋白呈強陽性染色，Ⅱ型膠原、Bcl-2 蛋白呈弱陽性染色；而正常組Ⅰ型膠原、Bax 蛋白呈弱陽性染色，Ⅱ型膠原、Bcl-2 蛋白呈強陽性染色。見圖 3。退變組Ⅰ型膠原、Bax 蛋白陽性細胞百分比顯著高于正常組，Ⅱ型膠原、Bcl-2 蛋白陽性細胞百分比顯著低于正常組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
退變組與正常組髓核組織各蛋白陽性細胞百分比（n=15，
，%）
Table1.
Percentage of protein-positive cells in the NP tissue of the degeneration group and the normal group (n=15, 
, %)
圖3
退變組和正常組髓核組織免疫組織化學染色觀察（倒置顯微鏡×400）
從左至右依次為Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Bcl-2、Bax 蛋白a. 退變組；b. 正常組
Figure3. Immunohistochemical staining observation of NP tissue in degeneration group and normal group (Inverted microscope×400)From left to right for collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ, Bcl-2, and Bax proteins, respectively a. Degeneration group; b. Normal group
2.1.4 Western blot 檢測
兩組在相對分子質量為 130×103附近均出現了蛋白條帶，提示兩組細胞均能表達Ⅱ型膠原蛋白。見圖 4。退變組Ⅱ型膠原蛋白相對表達量為 0.157 5±0.026 1，與正常組 0.870 3±0.033 1 比較差異有統計學意義（t=65.493，P=0.000）。
圖4
Western blot 檢測兩組細胞Ⅱ型膠原蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：退變組 2：正常組
Figure4. Collagen type Ⅱ expression of the two groups detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Degeneration group 2: Normal group
2.2 基因轉染退變髓核細胞相關研究
2.2.1 細胞形態觀察
A 組細胞排列疏松且不規則，細胞質內出現發亮的顆粒狀物及空泡，并出現大量凋亡細胞。轉染后 21 d，B、C、D 組細胞經傳代后形態變得較為規則，細胞質內發亮的顆粒狀物及空泡消失，凋亡細胞明顯減少，提示細胞活力已明顯提高。B、C 組細胞形態差別不大，但 C 組細胞密度更大；D 組細胞形態最為規則，細胞密度最大且呈極性排列。見圖 5。
圖5
轉染后 21 d 各組細胞形態觀察（倒置顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Cell morphology observation in each group at 21 days after transfection (Inverted microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.2 流式細胞儀檢測
與 A、C 組比較，B、D 組 IGF-1 陽性率明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間 IGF-1 陽性率差異無統計學意義（P>0.05）。與 A、B 組比較，C、D 組 PDGF 陽性率明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間及 C、D 組間 PDGF 陽性率差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6，表 2。
表2
轉染后 21 d 流式細胞儀檢測各組細胞 IGF-1 和 PDGF 陽性率（n=6，
，%）
Table2.
Percentages of IGF-1- and PDGF-positive cells detected by flow cytometry in each group at 21 days after transfection (n=6, 
, %)
圖6
轉染后 21 d 流式細胞儀檢測各組細胞 IGF-1、PDGF 陽性率
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. IGF-1；b. PDGF
Figure6. IGF-1 and PDGF positive rates detected by flow cytometry at 21 days after transfectionFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. IGF-1; b. PDGF
2.2.3 免疫組織化學染色觀察
A、B、C、D 組Ⅱ型膠原蛋白陽性染色情況依次為（±）、（+）、（+）、（++）。A 組僅有很少一部分細胞呈淡棕色；B、C 組大多數細胞呈棕色；D 組細胞全部染色，且大部分為深棕色。見圖 7。
圖7
轉染后 21 d 各組細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. Immunohistochemical staining observation in each group at 21 days after transfection (Inverted fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.4 Western blot 檢測
各組在相對分子質量為 130×103附近均出現了蛋白條帶，提示各組細胞均能表達Ⅱ型膠原蛋白。見圖 8。A、B、C、D 組Ⅱ型膠原蛋白相對表達量分別為 0.141 8±0.012 9、0.334 6±0.029 5、0.415 2±0.032 9、0.530 9±0.028 4，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖8
Western blot 檢測各組細胞Ⅱ型膠原蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組
Figure8. Collagen type Ⅱ protein expression of each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 討論
3.1 髓核的結構功能及椎間盤的退變過程
椎間盤是連接上下椎體的生物結構，由內層的髓核、外層的纖維環及上下軟骨終板構成，其中纖維環主要由成纖維細胞及其合成的Ⅰ型膠原蛋白構成，而髓核是由類軟骨細胞及其合成的Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖構成[3]。髓核組織是一種彈性膠凍狀無定型物質，具有吸收震蕩、平衡應力的作用。椎間盤退變的過程十分復雜，在人們日常工作勞動中，椎間盤要承受垂直壓力、旋轉剪切力等多種應力，使得椎間盤細胞長期處于高壓環境中，再加上低氧、低營養、高滲透壓的內環境因素，使得椎間盤細胞極易發生退變。需要指出的是，椎間盤細胞的退變并不代表椎間盤退變，椎間盤細胞退變、凋亡都是正常生理過程，當以上這些損傷因素加快了細胞的退變，使得椎間盤細胞合成、增殖速度代償不了細胞退變凋亡速度時，椎間盤才會發生退變。而椎間盤退變主要表現為髓核細胞凋亡和細胞活力下降，包括蛋白多糖及Ⅱ型膠原蛋白等細胞外基質合成減少，髓核內水分含量下降，髓核組織變硬，髓核細胞從類軟骨細胞變為類纖維細胞，而這些病理改變與腰椎間盤突出、腰椎管狹窄、腰椎滑脫等腰椎退行性疾病密切相關[4-6]。
3.2 椎間盤退變的再生組織工程
由于腰椎承受應力大，活動度高，故椎間盤退變大多發生在腰椎[7]。以往的手術治療方法都是摘除退變的椎間盤，或者椎間植骨融合釘棒固定，但手術不僅創傷大，而且破壞了脊柱的結構和力學平衡，容易引起鄰近節段退變，所以越來越多學者著眼于椎間盤細胞再生的組織工程研究。Naqvi 等[8]首先提取骨髓基質細胞，體外進行“微膠囊化”，在低溫保存前與 TGF-β3 共培養 14 d，然后將這種微膠囊注射入牛退變的椎間盤髓核中，發現牛退變的椎間盤髓核細胞發生了逆轉，產生了大量糖胺聚糖及膠原蛋白等細胞外基質成分，并且該方法比不進行“微膠囊化”而直接將 TGF-β3 誘導的骨髓基質細胞注射入牛髓核組織內，會產生更多的細胞外基質，說明“微膠囊化”能夠有效避免外源細胞在體內的分解。Ishiguro 等[9]開發了一種脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）衍生的無支架組織工程構建物（tissue-engineered construct，TEC），并將 ADSC-TEC 植入髓核摘除術后的大鼠椎間盤內，獲得了良好效果。Tao 等[10]提取并培養了髓核 MSCs，并將其在體外高滲透壓環境下與髓核細胞共培養，發現髓核 MSCs 增殖能力強大，并且能促進蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白的合成。
3.3 基因工程技術
通過基因治療椎間盤退變性疾病也是目前研究的熱點，主要方法是通過病毒或非病毒載體攜帶外源性基因轉染到退變椎間盤細胞中進行人工干預，達到治療目的。Farhang 等[11]從手術室獲取人退變椎間盤髓核細胞，再將慢病毒介導的規律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR）表觀基因轉染至髓核細胞并監測信號通路，發現重組細胞內 Cas9 蛋白失活，1 型 TNF 受體/1 型 IL1 受體信號轉導中斷，TNF-α 及 IL-1β 表達下調，退變的椎間盤得到修復。雷濤等[12]建立兔椎間盤退變模型，再將攜帶 BMP-2 及分化抑制因子 1（inhibitor 1 of differentiation，Id1）基因轉染至兔退變椎間盤髓核細胞內，發現 BMP-2 和 Id1 基因可穩定表達相應的蛋白并增加細胞外基質的表達，抑制椎間盤的退變。基因轉染過程中的載體包括非病毒載體和病毒載體，非病毒載體主要是細菌質粒，由于其轉染效率很低，幾乎很少使用；而病毒載體包括腺病毒、腺相關病毒及慢病毒載體等，慢病毒載體相比其他病毒載體具有基因容量大、轉染率高、能夠整合到宿主細胞染色體基因組中長期穩定表達等優勢[13-14]。本實驗對椎間盤退變的研究已轉向再生醫學和基因治療領域。直接向細胞注射生長因子促進細胞再生的方法，因生長因子半衰期太短，而椎間盤退變又是長期慢性過程，故局限性很大[15]。而基因治療的出現打破了桎梏。本實驗利用慢病毒作為載體，將外源性 IGF-1 和 PDGF 基因通過基因酶的切割、聚合，整合到退變髓核細胞的細胞核 DNA 基因組中，隨著細胞分裂、DNA 復制，子代細胞長期穩定地表達這兩種外源性蛋白。腺病毒等其他病毒載體只能將外源性基因整合到宿主的細胞質 DNA 中，故蛋白表達長久性不如慢病毒[13-14]。雖然研究表明慢病毒免疫原性很低[16]，但應用于臨床治療，大量病毒進入人體是否會引起毒性反應、病毒是否會變異等問題仍有待考證。
3.4 IGF-1 和 PDGF 的生物效應
IGF-1 是一種多功能細胞調控因子，化學結構是活性多肽，在人體中廣泛存在，主要通過內分泌、自分泌或旁分泌的方式作用于靶細胞，具有提高細胞生物活性、促進分裂增殖、抑制細胞凋亡的作用[17]。An 等[18]通過體外培養鼠椎間盤細胞，發現維生素 D 能促進椎間盤細胞分裂增殖，有效預防椎間盤退變，究其原因是維生素 D 能提高椎間盤細胞 IGF-1 含量。李大鵬等[19]體外培養人退變椎間盤髓核細胞，然后用 IGF-1 刺激這些細胞，發現細胞合成的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白大量增加，進一步研究發現是由于 IGF-1 能夠激活 P13K/Akt 信號通路。Zhang 等[20]利用腺病毒載體將 IGF-1 基因轉染至家兔退變的腰椎間盤髓核細胞中，結果退變髓核細胞的凋亡率明顯下降，證實 IGF-1 具有抑制髓核細胞凋亡的作用。
PDGF 也是一種活性多肽分子，且在人體內含量極少，甚至常規測量儀器難以檢測出，但其作用廣泛而強大。與 IGF-1 類似，PDGF 對于椎間盤細胞的作用是促進細胞增殖分裂，顯著抑制細胞凋亡，同時也促進細胞外基質的合成。與 IGF-1 不同的是，PDGF 的作用更強大，并且它是一種促有絲分裂原，最主要的作用是促進細胞增殖分裂，抑制凋亡[21]。PDGF 與椎間盤細胞結合后，能激活磷脂酶 C，促進肌醇二磷酸和二酰基甘油的合成，提高細胞內 Ca2+ 濃度，促使椎間盤細胞從 G0/G1 期進入 S 期，按照堿基配對原則合成 DNA 新鏈，最后進入 G2 期完成有絲分裂[22]。Presciutti 等[21]體外培養人退變的椎間盤細胞，再將 PDGF 加入培養基中，發現 PDGF 能夠顯著抑制椎間盤細胞的凋亡，刺激其分裂增殖。Kuo 等[23]分別制作大鼠體內和體外椎間盤細胞退變模型，用 IGF-1 聯合 PDGF 對退變的細胞進行人工干預，結果細胞凋亡被強烈抑制，得出 IGF-1 和 PDGF 有望應用于臨床治療椎間盤退變類疾病的結論。
本實驗成功將外源性 IGF-1、PDGF 基因轉染至體外培養的退變椎間盤細胞中，結果顯示二者具有逆轉椎間盤退變的生物效應；PDGF 促進細胞增殖、Ⅱ型膠原蛋白合成的作用稍強于 IGF-1，且 IGF-1 和 PDGF 共同作用效果更強。由于體內髓核細胞所處的環境和壓力與體外完全不同，故 IGF-1 和 PDGF 對體內退變的髓核細胞能否達到與體外一樣的作用，尚需進一步實驗證實。
綜上述，IGF-1、PDGF 均能促進髓核細胞增殖，抑制其凋亡；IGF-1、PDGF 還能促進髓核細胞的細胞外基質（Ⅱ型膠原蛋白）分泌，二者具有協同作用。
作者貢獻：許剛負責實驗設計及實施，起草文章；張長春參與實驗設計、指導實驗實施過程；朱坤參與實驗設計，參與論文撰寫并負責實驗數據的收集及統計學分析；葉雨辰參與實驗實施；鮑正齊對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經蚌埠醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（BYYFY-2018KY24）。
腰椎間盤退變性疾病是引起腰腿痛的主要原因，嚴重影響人們日常生活。研究發現，退變的椎間盤組織內髓核細胞大量凋亡并且功能下降，表現為水分及糖蛋白、Ⅱ型膠原蛋白等細胞外基質合成減少[1-2]。目前對于椎間盤退變性疾病的臨床治療，無論是保守治療、開放手術還是微創手術，都僅僅從改善臨床癥狀入手，并未著眼于椎間盤本身的病理變化，故治療效果往往有限[3-5]。本實驗從髓核入手，通過多種實驗方法比較退變與正常髓核組織在細胞形態、生化成分等方面的不同，并利用基因工程技術將 IGF-1 和 PDGF 基因轉染至退變的髓核細胞，就兩種細胞因子如何逆轉髓核的退變作深入研究。
1 材料與方法
1.1 研究標本
退變髓核組織（退變組）取自 2018 年 7 月—2019 年 2 月，我科收治的因腰椎間盤退變突出需行髓核摘除術的 15 例患者，其中男 10 例，女 5 例；年齡 48～76 歲，平均 62.8 歲。納入標準：MRI 示腰椎間盤嚴重退變，不合并黃韌帶、后縱韌帶鈣化者；不合并腰椎感染、腫瘤及其他嚴重軀體疾病者。
正常髓核組織（正常組）取自 2018 年 7 月—2019 年 2 月，我科收治的因外傷致腰椎爆裂性骨折需行椎間盤髓核摘除術的 15 例患者，其中男 9 例，女 6 例；年齡 16～38 歲，平均 23.4 歲。納入標準：年齡<40 歲；無脊柱外傷及脊柱手術病史；術前影像學檢查無腰椎間盤退變及其他病變者。
1.2 主要試劑及儀器
H-DMEM 培養基（HyClone 公司，美國）；澳洲血源 FBS、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美國）；小鼠抗人Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白抗體一抗，山羊抗小鼠 FITC 標記的 IgG 二抗，山羊抗小鼠二抗免疫組織化學試劑盒，兔抗人 IGF-1、PDGF 蛋白一抗，FITC 標記的山羊抗兔 IgG 二抗（Chemicon 公司，美國）；小鼠抗人 B 淋巴細胞瘤 2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體一抗、小鼠抗人 Bcl-2 相關 X（Bcl-2 associate X，Bax）抗體一抗、濃縮型 DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Western blot 及 IP 細胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；預染蛋白 Marker（Fermentas 公司，立陶宛）；聚偏二氟乙烯（poluvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore 公司，美國）；抗 β-actin 抗體（Sigma 公司，美國）。CO2 恒溫細胞培養箱（SANYO 公司，日本）；倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；流式細胞儀（Beckman 公司，美國）。
1.3 正常和退變髓核細胞學觀察
1.3.1 HE 染色觀察
取部分退變組及正常組髓核組織，經漂洗、乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（片厚 5 μm）、貼片處理后，常規行 HE 染色觀察。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
取上述部分切片行Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Bcl-2、Bax 免疫組織化學染色。主要步驟：先將切片脫蠟、乙醇水化后，進行抗原修復，阻斷過氧化物酶活性；然后依次滴加一抗（小鼠抗人Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白及 Bcl-2、Bax 單克隆抗體）、山羊抗小鼠 FITC 標記的 IgG 二抗；最后 DAB 溶液顯色，中性樹膠蓋玻片封閉。倒置顯微鏡下觀察，Ⅰ、Ⅱ型膠原及 Bcl-2、Bax 陽性結果為髓核細胞質內可見棕黃色顆粒狀陽性產物。每個樣本隨機觀察 10 個高倍（×400）視野并計數陽性細胞數和總細胞數，計算各蛋白陽性細胞百分比。
1.3.3 髓核細胞形態觀察
取部分退變組及正常組髓核組織，分別用 75%乙醇浸泡消毒、PBS 沖洗后，組織剪除周圍肌肉韌帶，眼科剪剪去周圍纖維環組織，并將髓核剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小；再將髓核組織消化、離心（半徑 6 cm、1 000 r/min 離心 5 min）后，在含 15%FBS 的 H-DMEM 培養基上進行原代和傳代培養，倒置顯微鏡下觀察髓核細胞形態。
1.3.4 Western blot 檢測
取兩組髓核細胞，根據 Western blot 檢測試劑盒說明進行總蛋白提取、蛋白定量、Ⅱ型膠原及內參 β-actin 蛋白電泳、轉膜、封閉和孵育、PVDF 膜化學發光、顯影及定影。顯影條帶使用 Image-Pro Plus 軟件分析并掃描條帶吸光度（A）值，以目的條帶與 β-actin 的 A 值比值作為各蛋白相對表達量。
1.4 基因轉染退變髓核細胞相關研究
1.4.1 實驗分組及基因轉染
利用慢病毒載體系統構建 IGF-1 基因慢病毒顆粒、PDGF 基因慢病毒顆粒及攜帶 IGF-1 和 PDGF 雙基因的慢病毒顆粒（IGF-1-P2A-PDGF）。實驗分為 4 組，A 組為退變髓核細胞對照組；B、C、D 組分別用 IGF-1、PDGF 和 IGF-1-P2A-PDGF 基因慢病毒顆粒轉染退變髓核細胞。具體轉染方法：分別將 0.2 μg 上述基因慢病毒質粒稀釋到 25 μL Reduced Serum Medium（一種可減少血清補充的改良培養基）中，另將 0.5 μL Lipofectamin2000 稀釋到 25 μL Reduced Serum Medium 中，將兩種溶液輕輕混勻后靜置，再分別加入 4 組細胞培養孔中培養。
1.4.2 細胞形態觀察
轉染后 21 d 取出各組細胞，胰蛋白酶消化后離心（半徑 6 cm、1 000 r/min、離心 5 min），收集沉淀細胞，PBS 清洗后取其中一部分加入含有 H-DMEM 培養基的細胞培養瓶中進行傳代培養，倒置顯微鏡下觀察轉染后各組細胞形態變化。剩余部分調整為濃度 1×106個/mL 的細胞懸液進行后續實驗。
1.4.3 流式細胞儀檢測
將各組細胞懸液分別加入兔抗人 IGF-1、PDGF 蛋白一抗，室溫孵育 30 min；PBS 洗 2 次，加入 FITC 標記的山羊抗兔 IgG 二抗，避光孵育 15 min；PBS 洗 2 次，混勻后上流式細胞儀檢測各組細胞 IGF-1、PDGF 陽性率。實驗重復 6 次取均值。
1.4.4 免疫組織化學染色觀察
轉染后 21 d 取出各組細胞分別放在 6 孔板內爬片，多聚甲醛固定，3%H2O2 室溫孵育 15 min；0.2%Triton X-100 溶液透化固定后的細胞，山羊血清封閉，室溫孵育 10 min；加入小鼠抗人Ⅱ型膠原抗體，4℃ 孵育過夜，再加山羊抗小鼠二抗，37℃ 孵育 15 min；滴加 DAB 顯色液，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.4.5 Western blot 檢測
同 1.3.4 方法檢測各組細胞Ⅱ型膠原蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 正常和退變髓核細胞學觀察
2.1.1 髓核細胞形態觀察
正常組培養 24 h 后有髓核細胞貼壁，初貼壁細胞呈圓形或橢圓形，部分伸出偽足，似扇形；然后貼壁細胞不斷增多，72 h 后細胞無明顯增多，逐漸伸展為梭形或多角形，呈極性排列；傳代后髓核細胞貼壁速度加快，2 h 后可見細胞排列緊密，鋪滿瓶底，呈長梭形或多角形，放射狀或鋪路石樣外觀。退變組髓核細胞隨培養時間延長，形態逐漸變得極不規則且排列較疏松，胞體變長，細胞質內出現發亮的顆粒狀物及空泡，并出現凋亡細胞。見圖 1。
圖1
退變組和正常組髓核細胞形態觀察（倒置顯微鏡×200）
a. 培養 72 h 的退變髓核細胞（黃箭頭示凋亡的髓核細胞，紅箭頭示細胞質內發亮的顆粒狀物及空泡）；b. 培養 24 h 的正常髓核細胞；c. 培養 72 h 的正常髓核細胞；d. 第 2 代正常髓核細胞
Figure1. Morphological observation of NPCs in degeneration group and normal group (Inverted microscope×200)a. The degenerated NPCs cultured for 72 hours (Yellow arrow indicated the apoptotic NPCs, red arrow indicated the shiny granules and vacuoles in the cytoplasm); b. Normal NPCs cultured for 24 hours; c. Normal NPCs cultured for 72 hours; d. The 2nd generation of normal NPCs
2.1.2 HE 染色觀察
退變組髓核細胞逐漸減少，髓核組織內可見大量纖維軟骨組織；正常組中央髓核組織可見大量脊索細胞和少量類軟骨細胞。見圖 2。
圖2
退變組和正常組 HE 染色觀察
從左至右依次為×100、×400 a. 退變組 箭頭示纖維軟骨細胞；b. 正常組 箭頭示脊索細胞
Figure2. HE staining observation in degeneration group and normal groupFrom left to right for ×100 and ×400, respectively a. Degeneration group Arrow indicated fibrochondrocytes; b. Normal group Arrow indicated notochord cells
2.1.3 免疫組織化學染色觀察
退變組Ⅰ型膠原、Bax 蛋白呈強陽性染色，Ⅱ型膠原、Bcl-2 蛋白呈弱陽性染色；而正常組Ⅰ型膠原、Bax 蛋白呈弱陽性染色，Ⅱ型膠原、Bcl-2 蛋白呈強陽性染色。見圖 3。退變組Ⅰ型膠原、Bax 蛋白陽性細胞百分比顯著高于正常組，Ⅱ型膠原、Bcl-2 蛋白陽性細胞百分比顯著低于正常組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
退變組與正常組髓核組織各蛋白陽性細胞百分比（n=15，，%）
Table1.
Percentage of protein-positive cells in the NP tissue of the degeneration group and the normal group (n=15, , %)
圖3
退變組和正常組髓核組織免疫組織化學染色觀察（倒置顯微鏡×400）
從左至右依次為Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Bcl-2、Bax 蛋白a. 退變組；b. 正常組
Figure3. Immunohistochemical staining observation of NP tissue in degeneration group and normal group (Inverted microscope×400)From left to right for collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ, Bcl-2, and Bax proteins, respectively a. Degeneration group; b. Normal group
2.1.4 Western blot 檢測
兩組在相對分子質量為 130×103附近均出現了蛋白條帶，提示兩組細胞均能表達Ⅱ型膠原蛋白。見圖 4。退變組Ⅱ型膠原蛋白相對表達量為 0.157 5±0.026 1，與正常組 0.870 3±0.033 1 比較差異有統計學意義（t=65.493，P=0.000）。
圖4
Western blot 檢測兩組細胞Ⅱ型膠原蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：退變組 2：正常組
Figure4. Collagen type Ⅱ expression of the two groups detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Degeneration group 2: Normal group
2.2 基因轉染退變髓核細胞相關研究
2.2.1 細胞形態觀察
A 組細胞排列疏松且不規則，細胞質內出現發亮的顆粒狀物及空泡，并出現大量凋亡細胞。轉染后 21 d，B、C、D 組細胞經傳代后形態變得較為規則，細胞質內發亮的顆粒狀物及空泡消失，凋亡細胞明顯減少，提示細胞活力已明顯提高。B、C 組細胞形態差別不大，但 C 組細胞密度更大；D 組細胞形態最為規則，細胞密度最大且呈極性排列。見圖 5。
圖5
轉染后 21 d 各組細胞形態觀察（倒置顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Cell morphology observation in each group at 21 days after transfection (Inverted microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.2 流式細胞儀檢測
與 A、C 組比較，B、D 組 IGF-1 陽性率明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間及 B、D 組間 IGF-1 陽性率差異無統計學意義（P>0.05）。與 A、B 組比較，C、D 組 PDGF 陽性率明顯增高，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間及 C、D 組間 PDGF 陽性率差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6，表 2。
表2
轉染后 21 d 流式細胞儀檢測各組細胞 IGF-1 和 PDGF 陽性率（n=6，，%）
Table2.
Percentages of IGF-1- and PDGF-positive cells detected by flow cytometry in each group at 21 days after transfection (n=6, , %)
圖6
轉染后 21 d 流式細胞儀檢測各組細胞 IGF-1、PDGF 陽性率
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. IGF-1；b. PDGF
Figure6. IGF-1 and PDGF positive rates detected by flow cytometry at 21 days after transfectionFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. IGF-1; b. PDGF
2.2.3 免疫組織化學染色觀察
A、B、C、D 組Ⅱ型膠原蛋白陽性染色情況依次為（±）、（+）、（+）、（++）。A 組僅有很少一部分細胞呈淡棕色；B、C 組大多數細胞呈棕色；D 組細胞全部染色，且大部分為深棕色。見圖 7。
圖7
轉染后 21 d 各組細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. Immunohistochemical staining observation in each group at 21 days after transfection (Inverted fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.4 Western blot 檢測
各組在相對分子質量為 130×103附近均出現了蛋白條帶，提示各組細胞均能表達Ⅱ型膠原蛋白。見圖 8。A、B、C、D 組Ⅱ型膠原蛋白相對表達量分別為 0.141 8±0.012 9、0.334 6±0.029 5、0.415 2±0.032 9、0.530 9±0.028 4，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖8
Western blot 檢測各組細胞Ⅱ型膠原蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組
Figure8. Collagen type Ⅱ protein expression of each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
3 討論
3.1 髓核的結構功能及椎間盤的退變過程
椎間盤是連接上下椎體的生物結構，由內層的髓核、外層的纖維環及上下軟骨終板構成，其中纖維環主要由成纖維細胞及其合成的Ⅰ型膠原蛋白構成，而髓核是由類軟骨細胞及其合成的Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖構成[3]。髓核組織是一種彈性膠凍狀無定型物質，具有吸收震蕩、平衡應力的作用。椎間盤退變的過程十分復雜，在人們日常工作勞動中，椎間盤要承受垂直壓力、旋轉剪切力等多種應力，使得椎間盤細胞長期處于高壓環境中，再加上低氧、低營養、高滲透壓的內環境因素，使得椎間盤細胞極易發生退變。需要指出的是，椎間盤細胞的退變并不代表椎間盤退變，椎間盤細胞退變、凋亡都是正常生理過程，當以上這些損傷因素加快了細胞的退變，使得椎間盤細胞合成、增殖速度代償不了細胞退變凋亡速度時，椎間盤才會發生退變。而椎間盤退變主要表現為髓核細胞凋亡和細胞活力下降，包括蛋白多糖及Ⅱ型膠原蛋白等細胞外基質合成減少，髓核內水分含量下降，髓核組織變硬，髓核細胞從類軟骨細胞變為類纖維細胞，而這些病理改變與腰椎間盤突出、腰椎管狹窄、腰椎滑脫等腰椎退行性疾病密切相關[4-6]。
3.2 椎間盤退變的再生組織工程
由于腰椎承受應力大，活動度高，故椎間盤退變大多發生在腰椎[7]。以往的手術治療方法都是摘除退變的椎間盤，或者椎間植骨融合釘棒固定，但手術不僅創傷大，而且破壞了脊柱的結構和力學平衡，容易引起鄰近節段退變，所以越來越多學者著眼于椎間盤細胞再生的組織工程研究。Naqvi 等[8]首先提取骨髓基質細胞，體外進行“微膠囊化”，在低溫保存前與 TGF-β3 共培養 14 d，然后將這種微膠囊注射入牛退變的椎間盤髓核中，發現牛退變的椎間盤髓核細胞發生了逆轉，產生了大量糖胺聚糖及膠原蛋白等細胞外基質成分，并且該方法比不進行“微膠囊化”而直接將 TGF-β3 誘導的骨髓基質細胞注射入牛髓核組織內，會產生更多的細胞外基質，說明“微膠囊化”能夠有效避免外源細胞在體內的分解。Ishiguro 等[9]開發了一種脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）衍生的無支架組織工程構建物（tissue-engineered construct，TEC），并將 ADSC-TEC 植入髓核摘除術后的大鼠椎間盤內，獲得了良好效果。Tao 等[10]提取并培養了髓核 MSCs，并將其在體外高滲透壓環境下與髓核細胞共培養，發現髓核 MSCs 增殖能力強大，并且能促進蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白的合成。
3.3 基因工程技術
通過基因治療椎間盤退變性疾病也是目前研究的熱點，主要方法是通過病毒或非病毒載體攜帶外源性基因轉染到退變椎間盤細胞中進行人工干預，達到治療目的。Farhang 等[11]從手術室獲取人退變椎間盤髓核細胞，再將慢病毒介導的規律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR）表觀基因轉染至髓核細胞并監測信號通路，發現重組細胞內 Cas9 蛋白失活，1 型 TNF 受體/1 型 IL1 受體信號轉導中斷，TNF-α 及 IL-1β 表達下調，退變的椎間盤得到修復。雷濤等[12]建立兔椎間盤退變模型，再將攜帶 BMP-2 及分化抑制因子 1（inhibitor 1 of differentiation，Id1）基因轉染至兔退變椎間盤髓核細胞內，發現 BMP-2 和 Id1 基因可穩定表達相應的蛋白并增加細胞外基質的表達，抑制椎間盤的退變。基因轉染過程中的載體包括非病毒載體和病毒載體，非病毒載體主要是細菌質粒，由于其轉染效率很低，幾乎很少使用；而病毒載體包括腺病毒、腺相關病毒及慢病毒載體等，慢病毒載體相比其他病毒載體具有基因容量大、轉染率高、能夠整合到宿主細胞染色體基因組中長期穩定表達等優勢[13-14]。本實驗對椎間盤退變的研究已轉向再生醫學和基因治療領域。直接向細胞注射生長因子促進細胞再生的方法，因生長因子半衰期太短，而椎間盤退變又是長期慢性過程，故局限性很大[15]。而基因治療的出現打破了桎梏。本實驗利用慢病毒作為載體，將外源性 IGF-1 和 PDGF 基因通過基因酶的切割、聚合，整合到退變髓核細胞的細胞核 DNA 基因組中，隨著細胞分裂、DNA 復制，子代細胞長期穩定地表達這兩種外源性蛋白。腺病毒等其他病毒載體只能將外源性基因整合到宿主的細胞質 DNA 中，故蛋白表達長久性不如慢病毒[13-14]。雖然研究表明慢病毒免疫原性很低[16]，但應用于臨床治療，大量病毒進入人體是否會引起毒性反應、病毒是否會變異等問題仍有待考證。
3.4 IGF-1 和 PDGF 的生物效應
IGF-1 是一種多功能細胞調控因子，化學結構是活性多肽，在人體中廣泛存在，主要通過內分泌、自分泌或旁分泌的方式作用于靶細胞，具有提高細胞生物活性、促進分裂增殖、抑制細胞凋亡的作用[17]。An 等[18]通過體外培養鼠椎間盤細胞，發現維生素 D 能促進椎間盤細胞分裂增殖，有效預防椎間盤退變，究其原因是維生素 D 能提高椎間盤細胞 IGF-1 含量。李大鵬等[19]體外培養人退變椎間盤髓核細胞，然后用 IGF-1 刺激這些細胞，發現細胞合成的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白大量增加，進一步研究發現是由于 IGF-1 能夠激活 P13K/Akt 信號通路。Zhang 等[20]利用腺病毒載體將 IGF-1 基因轉染至家兔退變的腰椎間盤髓核細胞中，結果退變髓核細胞的凋亡率明顯下降，證實 IGF-1 具有抑制髓核細胞凋亡的作用。
PDGF 也是一種活性多肽分子，且在人體內含量極少，甚至常規測量儀器難以檢測出，但其作用廣泛而強大。與 IGF-1 類似，PDGF 對于椎間盤細胞的作用是促進細胞增殖分裂，顯著抑制細胞凋亡，同時也促進細胞外基質的合成。與 IGF-1 不同的是，PDGF 的作用更強大，并且它是一種促有絲分裂原，最主要的作用是促進細胞增殖分裂，抑制凋亡[21]。PDGF 與椎間盤細胞結合后，能激活磷脂酶 C，促進肌醇二磷酸和二酰基甘油的合成，提高細胞內 Ca2+ 濃度，促使椎間盤細胞從 G0/G1 期進入 S 期，按照堿基配對原則合成 DNA 新鏈，最后進入 G2 期完成有絲分裂[22]。Presciutti 等[21]體外培養人退變的椎間盤細胞，再將 PDGF 加入培養基中，發現 PDGF 能夠顯著抑制椎間盤細胞的凋亡，刺激其分裂增殖。Kuo 等[23]分別制作大鼠體內和體外椎間盤細胞退變模型，用 IGF-1 聯合 PDGF 對退變的細胞進行人工干預，結果細胞凋亡被強烈抑制，得出 IGF-1 和 PDGF 有望應用于臨床治療椎間盤退變類疾病的結論。
本實驗成功將外源性 IGF-1、PDGF 基因轉染至體外培養的退變椎間盤細胞中，結果顯示二者具有逆轉椎間盤退變的生物效應；PDGF 促進細胞增殖、Ⅱ型膠原蛋白合成的作用稍強于 IGF-1，且 IGF-1 和 PDGF 共同作用效果更強。由于體內髓核細胞所處的環境和壓力與體外完全不同，故 IGF-1 和 PDGF 對體內退變的髓核細胞能否達到與體外一樣的作用，尚需進一步實驗證實。
綜上述，IGF-1、PDGF 均能促進髓核細胞增殖，抑制其凋亡；IGF-1、PDGF 還能促進髓核細胞的細胞外基質（Ⅱ型膠原蛋白）分泌，二者具有協同作用。
作者貢獻：許剛負責實驗設計及實施，起草文章；張長春參與實驗設計、指導實驗實施過程；朱坤參與實驗設計，參與論文撰寫并負責實驗數據的收集及統計學分析；葉雨辰參與實驗實施；鮑正齊對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經蚌埠醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會批準（BYYFY-2018KY24）。
