引用本文： 黃振明, 蔡卓, 錢靜, 汪建雄, 胡寧. 微小 RNA-335-5p 調控 BMP-2 對人 BMSCs 成骨分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(6): 781-786. doi: 10.7507/1002-1892.201910097 復制
人 BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）是人骨髓基質中的一種具有多向分化潛能的細胞亞群[1]，在特定條件誘導下可分化為成肌細胞、軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞等細胞系[2]。hBMSCs 的成骨分化與骨質疏松癥的發生發展密切相關[3]，且在骨組織工程中發揮重要作用[4]。因此探討 BMSCs 的成骨分化機制，提高其分化能力，具有重要意義。微小 RNA（micro RNA，miR）-335-5p 是一種進化上高度保守的非編碼單鏈小分子 RNA，可介導 MSCs 的成骨、成脂及成軟骨分化[5]，在成骨細胞中高表達，可通過下調 Wnt 拮抗劑 DKK1 的表達促進成骨細胞增殖和分化，增強骨形成及骨再生[6-7]。BMP-2 屬于 TGF-β 超家族，具有促進成骨細胞生長和分化的作用[8]，能增強骨細胞外基質合成，并可促進 MSCs 成骨分化，廣泛用于骨組織工程研究，對臨床骨組織缺損、軟骨損傷、骨再生等的療效確切[9-10]。但 miR-335-5p 是否可通過調控 BMP-2 促進 hBMSCs 成骨分化，目前還不清楚。本研究通過過表達或抑制體外培養的 hBMSCs 細胞系中 miR-335-5p 表達，對 miR-335-5p 通過調控 BMP-2 對 hBMSCs 成骨分化的影響進行研究。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞、試劑及儀器
hBMSCs（上海中喬新舟生物科技有限公司）；miR-335-5p mimics（模擬物）、miR-335-5p mimics 陰性對照、miR-335-5p inhibitor（抑制劑）、miR-335-5p inhibitor 陰性對照（上海吉瑪基因有限公司）；H-DMEM 培養基（上海微科生物技術有限公司）；FBS、PBS 緩沖液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；Opti-MEM 減血清培養基、LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美國）；ALP 染色試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司）；茜素紅染色液（上海聯碩生物科技有限公司）；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（Takara 公司，日本）；兔源 BMP-2、Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）及 GAPDH 一抗、羊抗兔二抗（Abcam 公司，美國）；蛋白提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。
CKX41-F32F 光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；3900 型高通量 DNA 合成儀（美國應用生物系統公司）；Centrifuge 5424R 低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；CFX96 Touch Deep Well qRT-PCR 儀、1659001 蛋白電泳儀、Trans-Blot Turbo 轉膜儀（Bio-Rad 公司，美國）；IBright CL 1500 凝膠成像系統（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；恒溫水浴鍋（上海析達儀器有限公司）；XB-70 制冰機（GRANT 公司，美國）。
1.2 細胞培養
將凍存的 hBMSCs 細胞株置于 39 ℃ 水浴中快速凍融，然后離心（1 000×g，5 min）；取細胞沉淀，加入完全培養基（500 mL H-DMEM 培養基中含 10%FBS、100 U/mL 青鏈霉素混合液）重懸，接種至 25 cm2培養瓶中，放入 37 ℃、5%CO2 培養箱中培養。當細胞生長至融合率 85% 左右時，胰蛋白酶-EDTA 消化后以完全培養基重懸，按 1∶3 比例傳代培養。
1.3 實驗分組及方法
待第 2 代 hBMSCs 融合率達 85% 左右時，以胰蛋白酶-EDTA 消化后重懸，吹打均勻后計數，以 5×105個/mL 密度接種于 4 個 24 孔板中，培養 24 h 后，每板細胞隨機分為對照組（A 組）、miR-335-5p mimics 組（B 組）、miR-335-5p mimics 陰性對照組（C 組）、miR-335-5p inhibitor 組（D 組）、miR-335-5p inhibitor 陰性對照組（E 組），每組設 3 個復孔。參照說明書步驟，以 50 μL Opti-MEM 減血清培養基溶解 1 μL LipofectamineTM2000 混勻，同時分別以 50 μL Opti-MEM 減血清培養基溶解 miR-335-5p mimics、miR-335-5p mimics 陰性對照、miR-335-5p inhibitor、miR-335-5p inhibitor 陰性對照（濃度參照說明書）混勻，均靜置 20 min。將 LipofectamineTM2000 溶液分別與 miR-335-5p mimics、miR-335-5p mimics 陰性對照、miR-335-5p inhibitor、miR-335-5p inhibitor 陰性對照溶液混勻，分別處理各組細胞，并將培養基更換成 Opti-MEM 減血清培養基培養。6 h 后再換為成骨誘導分化培養基（500 mL 完全培養基中含 10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 維生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉）[11]繼續培養 1 周后，收集細胞進行以下觀測。其中 2 個 24 孔板中的各組細胞收集后分別用于 qRT-PCR 及 Western blot 檢測；另 2 個 24 孔板中的各組細胞去除培養基后以 PBS 漂洗干凈，然后加入 4% 多聚甲醛固定 2 h，用于 ALP 及茜素紅染色觀察。
1.4 觀測指標
1.4.1 ALP 染色觀察
取 1 個 24 孔板，采用 ALP 染色試劑盒對各組細胞進行染色，光鏡下觀察，呈紫色的為 ALP 陽性細胞。隨機選擇 5 個視野拍照，并按以下公式計算各組 ALP 陽性細胞相對比例：實驗組陽性細胞數/對照組陽性細胞數×100%。
1.4.2 茜素紅染色觀察
取 1 個 24 孔板，加入茜素紅染色液室溫染色 30 min，去除染色液后以 PBS 漂洗 2 次，光鏡下觀察礦化結節染色情況，呈紅色的為礦化結節。隨機選擇 5 個視野拍照，并按以下公式計算各組細胞礦化結節相對比例：實驗組礦化結節數/對照組礦化結節數×100%。
1.4.3 qRT-PCR 檢測各組細胞相關基因表達
取 1 個 24 孔板收集各組細胞，以 RNAiso Plus 提取細胞總 RNA，然后以逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成 cDNA，采用 qRT-PCR 試劑盒進行定量 PCR 反應。miR-335-5p、BMP-2、Runx2、OPN、OCN、U6、GAPDH 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；使用 GADPH 作為 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 的內參基因，U6 作為 miR-335-5p 的內參基因。操作步驟、反應體系的配制、反應條件的設定均參照說明書進行。以 2–ΔΔCt法對數據進行分析，得出各組各目的基因的 mRNA 相對表達量。qRT-PCR 引物序列見表1。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence of qRT-PCR
1.4.4 Western blot 檢測各組細胞相關蛋白表達
取 1 個 24 孔板收集各組細胞，使用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白后，以 BCA 試劑盒測定其總濃度，具體步驟均按說明書進行。將各組蛋白濃度調整至相同，煮沸變性后取相同體積蛋白樣品液行 SDS-PAGE 電泳分離蛋白，然后將其轉移至硝酸纖維膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h。根據相對分子質量截取目的蛋白條帶置于孵育盒中，分別加入兔源 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 及 GAPDH 一抗，4℃ 孵育過夜，TBST 漂洗 3 次；加入羊抗兔二抗，室溫孵育 2 h，TBST 漂洗 3 次；以 ECL 顯色，使用凝膠成像系統拍攝蛋白條帶，并以 Image Lab 軟件分析各組各蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS24.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，各組與對照組間比較采用 Dunnett t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ALP 染色觀察
A、B、C、D、E 組 ALP 陽性細胞相對比例分別為 100%、159.81%±30.18%、98.43%±21.46%、21.13%±5.12%、100.96%±22.01%。與 A 組比較，B 組 ALP 陽性細胞相對比例明顯升高，D 組明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、E 組無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。
圖1
各組細胞 ALP 染色觀察（×200）
箭頭示 ALP 陽性細胞 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure1. ALP staining observation of cells in each group (×200)Arrow indicated ALP positive cells a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 茜素紅染色觀察
A、B、C、D、E 組細胞礦化結節相對比例分別為 100%、205.18%±52.67%、99.54%±22.05%、23.38%±5.26%、98.96%±21.18%。與 A 組比較，B 組礦化結節相對比例明顯升高，D 組明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、E 組無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
各組細胞茜素紅染色觀察（×200）
箭頭示礦化結節 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure2. Alizarin red staining observation of cells in each group (×200)Arrow indicated mineralized nodule a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 qRT-PCR 檢測各組細胞相關基因表達
與 A 組比較，B 組細胞 miR-335-5p 及 BMP-2、OCN、OPN、Runx2 mRNA 相對表達量均明顯升高，D 組均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；C、E 組無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
表2
qRT-PCR 檢測各組細胞相關基因 mRNA 相對表達量（n=3，
）
Table2.
The relative mRNA expressions of related genes in each group detected by qRT-PCR (n=3, 
)
2.4 Western blot 檢測各組細胞相關蛋白表達
與 A 組比較，B 組細胞 Runx2、OPN、OCN、BMP-2 蛋白相對表達量均明顯升高，D 組均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；C、E 組無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3，圖3。
表3
Western blot 檢測各組細胞相關蛋白相對表達量（n=3，
）
Table3.
The relative expressions of related proteins in each group detected by Western blot (n=3, 
)
圖3
Western blot 檢測各組細胞相關蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：A 組 2：C 組 3：B 組 4：E 組 5：D 組
Figure3. Western blot analysis of related protein expression in each groupMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group C 3: Group B 4: Group E 5: Group D
3 討論
骨組織是一個連續的動態平衡組織，主要由成骨細胞和破骨細胞組成，成骨細胞促進骨形成，破骨細胞促進骨吸收，從而形成正常的骨代謝平衡，調控骨代謝平衡對骨質疏松、骨折、骨缺損等骨疾病的治療具有重要意義[12]。hBMSCs 具有成骨分化潛能[13]，在骨質疏松癥的臨床治療以及骨組織工程修復骨缺損中具有關鍵作用[14]。因此，關于 hBMSCs 成骨分化的探討是臨床研究熱點。研究表明 miRNA 對細胞增殖、凋亡及干細胞的分化具有重要調控作用，其中 miR-335-5p 與骨組織代謝平衡直接相關，能介導骨質疏松、骨關節炎等骨疾病的發生發展，還可作為骨質疏松患者骨轉換的標志物[15-16]。另外，miR-335-5p 可上調成骨相關因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表達，促進成骨前體細胞分化，增強骨形成[5-6, 17]，但其對 hBMSCs 成骨分化的影響還未見報道。本研究以 miR-335-5p mimics 及 inhibitor 分別處理 hBMSCs 細胞系，結果顯示，miR-335-5p mimics 可上調細胞 miR-335-5p 表達，上調 Runx2、OPN、OCN mRNA 及蛋白表達，提高其 ALP 陽性細胞、礦化結節相對比例，表明上調 miR-335-5p 水平可促進成骨相關因子表達，增強成骨分化。miR-335-5p inhibitor 處理后，上述指標變化與 miR-335-5p mimics 相反，表明下調 miR-335-5p 水平可抑制成骨相關因子表達，減弱成骨分化。
BMP-2 是一種有效的成骨細胞生長和分化的誘導因子，具有極強的促進骨細胞外基質合成及成骨分化的作用，被廣泛應用于骨修復治療[18]；還可促進 BMSCs 成骨分化，通過阻斷 BMP-2 信號可減弱骨形成，抑制血管鈣化[19-20]。因此，可推測 miR-335-5p 可能通過調控 BMP-2 影響 hBMSCs 成骨分化。本研究結果顯示，miR-335-5p mimics 可上調 hBMSCs 中 BMP-2 mRNA 及蛋白表達水平，促進成骨分化；miR-335-5p inhibitor 可下調 hBMSCs 中 BMP-2 mRNA 及蛋白表達水平，抑制成骨分化。表明 miR-335-5p 對 hBMSCs 中 BMP-2 表達有正調控作用，并可促使成骨分化。提示調控 BMP-2 表達可能是 miR-335-5p 介導 hBMSCs 成骨分化的作用機制。
綜上述，miR-335-5p 可調控 hBMSCs 的成骨分化，上調 miR-335-5p 表達可促進 hBMSCs 中成骨相關因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表達，增強成骨分化；下調 miR-335-5p 表達可抑制 hBMSCs 中成骨相關因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表達，減弱成骨分化。表明 miR-335-5p 是治療骨質疏松癥、骨缺損、骨折等的一個新靶點，為臨床治療各種骨疾病提供了新的思路，其作用機制可能是調控 BMP-2 表達。但本研究未通過上調或下調 BMP-2 的表達對其進行對照驗證，尚存在不足，其更為精確完整的作用機制還需進一步深入研究。
作者貢獻：黃振明、錢靜負責實驗設計及實施；蔡卓負責數據收集整理；汪建雄負責統計分析；黃振明負責文章撰寫；胡寧對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
人 BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）是人骨髓基質中的一種具有多向分化潛能的細胞亞群[1]，在特定條件誘導下可分化為成肌細胞、軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞等細胞系[2]。hBMSCs 的成骨分化與骨質疏松癥的發生發展密切相關[3]，且在骨組織工程中發揮重要作用[4]。因此探討 BMSCs 的成骨分化機制，提高其分化能力，具有重要意義。微小 RNA（micro RNA，miR）-335-5p 是一種進化上高度保守的非編碼單鏈小分子 RNA，可介導 MSCs 的成骨、成脂及成軟骨分化[5]，在成骨細胞中高表達，可通過下調 Wnt 拮抗劑 DKK1 的表達促進成骨細胞增殖和分化，增強骨形成及骨再生[6-7]。BMP-2 屬于 TGF-β 超家族，具有促進成骨細胞生長和分化的作用[8]，能增強骨細胞外基質合成，并可促進 MSCs 成骨分化，廣泛用于骨組織工程研究，對臨床骨組織缺損、軟骨損傷、骨再生等的療效確切[9-10]。但 miR-335-5p 是否可通過調控 BMP-2 促進 hBMSCs 成骨分化，目前還不清楚。本研究通過過表達或抑制體外培養的 hBMSCs 細胞系中 miR-335-5p 表達，對 miR-335-5p 通過調控 BMP-2 對 hBMSCs 成骨分化的影響進行研究。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞、試劑及儀器
hBMSCs（上海中喬新舟生物科技有限公司）；miR-335-5p mimics（模擬物）、miR-335-5p mimics 陰性對照、miR-335-5p inhibitor（抑制劑）、miR-335-5p inhibitor 陰性對照（上海吉瑪基因有限公司）；H-DMEM 培養基（上海微科生物技術有限公司）；FBS、PBS 緩沖液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；Opti-MEM 減血清培養基、LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美國）；ALP 染色試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司）；茜素紅染色液（上海聯碩生物科技有限公司）；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（Takara 公司，日本）；兔源 BMP-2、Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）及 GAPDH 一抗、羊抗兔二抗（Abcam 公司，美國）；蛋白提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。
CKX41-F32F 光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；3900 型高通量 DNA 合成儀（美國應用生物系統公司）；Centrifuge 5424R 低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；CFX96 Touch Deep Well qRT-PCR 儀、1659001 蛋白電泳儀、Trans-Blot Turbo 轉膜儀（Bio-Rad 公司，美國）；IBright CL 1500 凝膠成像系統（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；恒溫水浴鍋（上海析達儀器有限公司）；XB-70 制冰機（GRANT 公司，美國）。
1.2 細胞培養
將凍存的 hBMSCs 細胞株置于 39 ℃ 水浴中快速凍融，然后離心（1 000×g，5 min）；取細胞沉淀，加入完全培養基（500 mL H-DMEM 培養基中含 10%FBS、100 U/mL 青鏈霉素混合液）重懸，接種至 25 cm2培養瓶中，放入 37 ℃、5%CO2 培養箱中培養。當細胞生長至融合率 85% 左右時，胰蛋白酶-EDTA 消化后以完全培養基重懸，按 1∶3 比例傳代培養。
1.3 實驗分組及方法
待第 2 代 hBMSCs 融合率達 85% 左右時，以胰蛋白酶-EDTA 消化后重懸，吹打均勻后計數，以 5×105個/mL 密度接種于 4 個 24 孔板中，培養 24 h 后，每板細胞隨機分為對照組（A 組）、miR-335-5p mimics 組（B 組）、miR-335-5p mimics 陰性對照組（C 組）、miR-335-5p inhibitor 組（D 組）、miR-335-5p inhibitor 陰性對照組（E 組），每組設 3 個復孔。參照說明書步驟，以 50 μL Opti-MEM 減血清培養基溶解 1 μL LipofectamineTM2000 混勻，同時分別以 50 μL Opti-MEM 減血清培養基溶解 miR-335-5p mimics、miR-335-5p mimics 陰性對照、miR-335-5p inhibitor、miR-335-5p inhibitor 陰性對照（濃度參照說明書）混勻，均靜置 20 min。將 LipofectamineTM2000 溶液分別與 miR-335-5p mimics、miR-335-5p mimics 陰性對照、miR-335-5p inhibitor、miR-335-5p inhibitor 陰性對照溶液混勻，分別處理各組細胞，并將培養基更換成 Opti-MEM 減血清培養基培養。6 h 后再換為成骨誘導分化培養基（500 mL 完全培養基中含 10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 維生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉）[11]繼續培養 1 周后，收集細胞進行以下觀測。其中 2 個 24 孔板中的各組細胞收集后分別用于 qRT-PCR 及 Western blot 檢測；另 2 個 24 孔板中的各組細胞去除培養基后以 PBS 漂洗干凈，然后加入 4% 多聚甲醛固定 2 h，用于 ALP 及茜素紅染色觀察。
1.4 觀測指標
1.4.1 ALP 染色觀察
取 1 個 24 孔板，采用 ALP 染色試劑盒對各組細胞進行染色，光鏡下觀察，呈紫色的為 ALP 陽性細胞。隨機選擇 5 個視野拍照，并按以下公式計算各組 ALP 陽性細胞相對比例：實驗組陽性細胞數/對照組陽性細胞數×100%。
1.4.2 茜素紅染色觀察
取 1 個 24 孔板，加入茜素紅染色液室溫染色 30 min，去除染色液后以 PBS 漂洗 2 次，光鏡下觀察礦化結節染色情況，呈紅色的為礦化結節。隨機選擇 5 個視野拍照，并按以下公式計算各組細胞礦化結節相對比例：實驗組礦化結節數/對照組礦化結節數×100%。
1.4.3 qRT-PCR 檢測各組細胞相關基因表達
取 1 個 24 孔板收集各組細胞，以 RNAiso Plus 提取細胞總 RNA，然后以逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成 cDNA，采用 qRT-PCR 試劑盒進行定量 PCR 反應。miR-335-5p、BMP-2、Runx2、OPN、OCN、U6、GAPDH 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；使用 GADPH 作為 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 的內參基因，U6 作為 miR-335-5p 的內參基因。操作步驟、反應體系的配制、反應條件的設定均參照說明書進行。以 2–ΔΔCt法對數據進行分析，得出各組各目的基因的 mRNA 相對表達量。qRT-PCR 引物序列見表1。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence of qRT-PCR
1.4.4 Western blot 檢測各組細胞相關蛋白表達
取 1 個 24 孔板收集各組細胞，使用蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白后，以 BCA 試劑盒測定其總濃度，具體步驟均按說明書進行。將各組蛋白濃度調整至相同，煮沸變性后取相同體積蛋白樣品液行 SDS-PAGE 電泳分離蛋白，然后將其轉移至硝酸纖維膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h。根據相對分子質量截取目的蛋白條帶置于孵育盒中，分別加入兔源 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 及 GAPDH 一抗，4℃ 孵育過夜，TBST 漂洗 3 次；加入羊抗兔二抗，室溫孵育 2 h，TBST 漂洗 3 次；以 ECL 顯色，使用凝膠成像系統拍攝蛋白條帶，并以 Image Lab 軟件分析各組各蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS24.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，各組與對照組間比較采用 Dunnett t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ALP 染色觀察
A、B、C、D、E 組 ALP 陽性細胞相對比例分別為 100%、159.81%±30.18%、98.43%±21.46%、21.13%±5.12%、100.96%±22.01%。與 A 組比較，B 組 ALP 陽性細胞相對比例明顯升高，D 組明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、E 組無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。
圖1
各組細胞 ALP 染色觀察（×200）
箭頭示 ALP 陽性細胞 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure1. ALP staining observation of cells in each group (×200)Arrow indicated ALP positive cells a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 茜素紅染色觀察
A、B、C、D、E 組細胞礦化結節相對比例分別為 100%、205.18%±52.67%、99.54%±22.05%、23.38%±5.26%、98.96%±21.18%。與 A 組比較，B 組礦化結節相對比例明顯升高，D 組明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、E 組無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
各組細胞茜素紅染色觀察（×200）
箭頭示礦化結節 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure2. Alizarin red staining observation of cells in each group (×200)Arrow indicated mineralized nodule a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 qRT-PCR 檢測各組細胞相關基因表達
與 A 組比較，B 組細胞 miR-335-5p 及 BMP-2、OCN、OPN、Runx2 mRNA 相對表達量均明顯升高，D 組均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；C、E 組無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
表2
qRT-PCR 檢測各組細胞相關基因 mRNA 相對表達量（n=3，）
Table2.
The relative mRNA expressions of related genes in each group detected by qRT-PCR (n=3, )
2.4 Western blot 檢測各組細胞相關蛋白表達
與 A 組比較，B 組細胞 Runx2、OPN、OCN、BMP-2 蛋白相對表達量均明顯升高，D 組均明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；C、E 組無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3，圖3。
表3
Western blot 檢測各組細胞相關蛋白相對表達量（n=3，）
Table3.
The relative expressions of related proteins in each group detected by Western blot (n=3, )
圖3
Western blot 檢測各組細胞相關蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：A 組 2：C 組 3：B 組 4：E 組 5：D 組
Figure3. Western blot analysis of related protein expression in each groupMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group C 3: Group B 4: Group E 5: Group D
3 討論
骨組織是一個連續的動態平衡組織，主要由成骨細胞和破骨細胞組成，成骨細胞促進骨形成，破骨細胞促進骨吸收，從而形成正常的骨代謝平衡，調控骨代謝平衡對骨質疏松、骨折、骨缺損等骨疾病的治療具有重要意義[12]。hBMSCs 具有成骨分化潛能[13]，在骨質疏松癥的臨床治療以及骨組織工程修復骨缺損中具有關鍵作用[14]。因此，關于 hBMSCs 成骨分化的探討是臨床研究熱點。研究表明 miRNA 對細胞增殖、凋亡及干細胞的分化具有重要調控作用，其中 miR-335-5p 與骨組織代謝平衡直接相關，能介導骨質疏松、骨關節炎等骨疾病的發生發展，還可作為骨質疏松患者骨轉換的標志物[15-16]。另外，miR-335-5p 可上調成骨相關因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表達，促進成骨前體細胞分化，增強骨形成[5-6, 17]，但其對 hBMSCs 成骨分化的影響還未見報道。本研究以 miR-335-5p mimics 及 inhibitor 分別處理 hBMSCs 細胞系，結果顯示，miR-335-5p mimics 可上調細胞 miR-335-5p 表達，上調 Runx2、OPN、OCN mRNA 及蛋白表達，提高其 ALP 陽性細胞、礦化結節相對比例，表明上調 miR-335-5p 水平可促進成骨相關因子表達，增強成骨分化。miR-335-5p inhibitor 處理后，上述指標變化與 miR-335-5p mimics 相反，表明下調 miR-335-5p 水平可抑制成骨相關因子表達，減弱成骨分化。
BMP-2 是一種有效的成骨細胞生長和分化的誘導因子，具有極強的促進骨細胞外基質合成及成骨分化的作用，被廣泛應用于骨修復治療[18]；還可促進 BMSCs 成骨分化，通過阻斷 BMP-2 信號可減弱骨形成，抑制血管鈣化[19-20]。因此，可推測 miR-335-5p 可能通過調控 BMP-2 影響 hBMSCs 成骨分化。本研究結果顯示，miR-335-5p mimics 可上調 hBMSCs 中 BMP-2 mRNA 及蛋白表達水平，促進成骨分化；miR-335-5p inhibitor 可下調 hBMSCs 中 BMP-2 mRNA 及蛋白表達水平，抑制成骨分化。表明 miR-335-5p 對 hBMSCs 中 BMP-2 表達有正調控作用，并可促使成骨分化。提示調控 BMP-2 表達可能是 miR-335-5p 介導 hBMSCs 成骨分化的作用機制。
綜上述，miR-335-5p 可調控 hBMSCs 的成骨分化，上調 miR-335-5p 表達可促進 hBMSCs 中成骨相關因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表達，增強成骨分化；下調 miR-335-5p 表達可抑制 hBMSCs 中成骨相關因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表達，減弱成骨分化。表明 miR-335-5p 是治療骨質疏松癥、骨缺損、骨折等的一個新靶點，為臨床治療各種骨疾病提供了新的思路，其作用機制可能是調控 BMP-2 表達。但本研究未通過上調或下調 BMP-2 的表達對其進行對照驗證，尚存在不足，其更為精確完整的作用機制還需進一步深入研究。
作者貢獻：黃振明、錢靜負責實驗設計及實施；蔡卓負責數據收集整理；汪建雄負責統計分析；黃振明負責文章撰寫；胡寧對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
