引用本文： 連強強, 遲博婧, 張柳, 田發明. Wnt信號通路對軟骨和軟骨下骨雙靶向調控及其在骨關節炎進展中的作用. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(6): 797-803. doi: 10.7507/1002-1892.201909088 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是最常見的退化性關節疾病之一，也是中老年人致殘的主要原因之一[1-2]。結構性 OA 在 50 歲以上人群中女性比男性更常見，且無論男女患病率都會隨年齡增長而急劇上升[3]。60 歲以上老年人患病率為 11%，且發病呈年輕化趨勢，給社會及家庭造成沉重經濟負擔[4]。既往對 OA 的定義一直集中在關節軟骨的變化，而現在其被認為是一種全關節疾病，伴隨軟組織及礦化組織的相互作用[5]，包括軟骨丟失、骨贅形成，關節軟骨、軟骨下骨、韌帶、關節囊和滑膜改變，最終導致關節功能衰竭[3-5]，其中軟骨、軟骨下骨及滑膜在 OA 病理改變的發生發展中扮演重要角色[6-7]。多年來國內外學者對 OA 發生發展的分子機制進行了研究，發現與 Wnt/β-catenin、TGF-β、JAK/STAT、NF-κB 等信號通路相關[8-11]，其中 Wnt 信號通路在骨、軟骨發育中起到雙重作用[12]，通過影響 Wnt 信號通路的活性可以對軟骨下骨及關節軟骨的代謝造成影響。本文通過整理近年文獻，對 Wnt 信號通路在細胞功能調控和 OA 發生發展中其對軟骨下骨、關節軟骨的具體分子機制進行綜述，探討 Wnt 信號通路對軟骨、軟骨下骨雙靶向調控在 OA 進展中的作用，為探索 OA 的有效治療藥物提供新的思路和靶點。
1 Wnt 信號通路的組成及細胞內調控機制
Wnt 信號通路分為依賴 β-catenin 的經典 Wnt 信號通路和不依賴 β-catenin 的非經典 Wnt 信號通路。見圖 1。經典 Wnt 信號通路通過 Wnt 蛋白結合至 Frizzled 和低密度脂蛋白受體相關蛋白 5/6（low density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6）[13-14]，通過下游復合體蛋白間的相互作用、構象變化及磷酸化狀態的轉變增加了 β-catenin 穩定性，從而被激活[14-16]。β-catenin 氨基酸末端磷酸化導致 β-catenin 核轉位，并通過核效應因子 T 細胞因子/淋巴增強因子（lymphoid enhancing factor，LEF）轉換因子激活下游靶基因的轉錄[15]，磷酸化的 β-catenin 被 β-轉導素重復序列包含蛋白（β-TrCP）識別，經泛素蛋白酶體途徑降解。非經典 Wnt 信號通路主要由 Wnt5a 激活，可分為 Wnt/Ca2+和平面細胞極性（planar cell polarity，PCP）通路。Wnt/Ca2+信號通路通過蛋白激酶 C 和鈣調蛋白激酶Ⅱ激活鈣信號，并與 T 細胞相關轉錄因子結合轉錄，調控細胞骨架重排、細胞黏附和遷移。在 PCP 通路中，Wnt5a 激活 Rho/Rho 相關激酶和 Rac/c-Jun N-末端激酶信號通路，調控細胞中的肌動蛋白聚合[17]。細胞外分泌的 Dickkopf（DKK）蛋白可通過結合 LRP5/6 抑制 β-catenin 核轉位，從而阻斷 Wnt 信號通路調節細胞功能[16，18]。
圖1
Wnt 信號通路傳導示意圖 a. 經典 Wnt 信號通路；b. 非經典 Wnt 信號通路
注：Dvl：Dishevelled；CK1：酪蛋白激酶 1；P：磷酸化；Ub：泛素；Proteasome：蛋白酶體；APC：腺瘤性息肉病大腸桿菌蛋白；PKC：蛋白激酶 C；TCF：T 細胞因子；CaMKⅡ：鈣調蛋白激酶Ⅱ；NFAT：活化 T 細胞核因子；JNK：Jun N 端激酶；Rho：Ras homologous；Rac：Ras-related C3 botulinum toxin substrate
Figure1. Schematic diagram of the Wnt signaling pathway transduction a. Classic Wnt signaling pathway; b. Non-classical Wnt signaling pathway2 Wnt 信號通路對軟骨及軟骨下骨發育的調控作用
2.1 對軟骨細胞功能和軟骨發育的調控作用
關節軟骨是一種生理上非自我更新的無血管組織，具有獨特的細胞類型——軟骨細胞，軟骨細胞的功能是產生和維持軟骨細胞外基質。Wnt/β-catenin 信號通路是骨、軟骨和關節發育及內穩態的關鍵調節器，它在許多生物學過程中發揮著重要作用，包括間充質細胞的凝聚和分化、成熟關節軟骨表型的維持、軟骨內成骨過程中肥厚組織的成熟等[19]。
Wnt 信號通路除了在軟骨形成和軟骨細胞成熟過程中發揮作用外，還參與維持完全分化的軟骨細胞表型，因此可能在維持整個成年期的軟骨穩態中發揮重要作用[20]。Chen 等[21]通過研究 Wnt 家族 mRNA 及蛋白在 C57BL/6 小鼠出生前及出生后下頜骨髁突軟骨中的表達，發現在胚胎時期，Wnt9a 主要見于增生性和礦化性肥大軟骨細胞，并在分化軟骨細胞及未分化軟骨細胞的細胞核中可見明顯的 Lef1 表達；而在出生后階段，肥厚和礦化的軟骨細胞中 Wnt4a 表達逐漸降低。結果表明 Wnt 信號通路在不同時期可調控下頜髁突軟骨細胞功能，并與軟骨的發育狀況息息相關。Zhang 等[22]研究發現，軟骨細胞可經 Wnt/β-catenin 信號通路產生一種基質蛋白——富含半胱氨酸蛋白 61（cysteine-rich protein 61，CCN1），在體外分離的胸骨軟骨細胞、胚胎軟骨和出生后軟骨中均發現 β-catenin 信號轉導可以增加 CCN1 表達并促進軟骨細胞的成熟，而且過表達 CCN1 的轉基因小鼠成年后出現發育異常和軟骨變性。Huang 等[23]利用 Wnt 信號阻斷劑 PKF118-310 和激動劑 6-溴聯苯-3’-氧基（BIO）觀察人 MSCs 的成軟骨分化，隨后建立球粒培養體系，進行 5 周的三維軟骨分化。結果顯示激活經典 Wnt 信號通路顯著下調了軟骨特異性基因 SRY-box 轉錄因子 9（SRY-box transcription factor 9，SOX9）、Ⅱ型膠原 α1 鏈（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）和聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGG）以及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、9、13 的表達，但增加了含凝血酶敏感素基序的整合素和金屬蛋白酶 4、5（a sidintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4、5，ADAMTS-4、5）的表達；PKF118-310 對 Wnt 信號的抑制增加了 SOX9、COL2A1、AGG 和 MMP-9 的表達，但降低了 MMP-13 和 ADAMTS-4、5 的表達，表明 Wnt 信號的過表達或過抑制在一定程度上都會對軟骨細胞分化產生影響。上述研究表明，生理狀態下 Wnt 信號通路通過上調或下調關鍵分子表達，調控 MSCs 向軟骨細胞方向分化、促進軟骨細胞成熟、維持軟骨細胞表型，并通過減少 MMP-1、3、9、13 的表達維持軟骨的正常結構及生理功能。
2.2 對成骨細胞、破骨細胞及骨細胞功能和軟骨下骨內環境穩態的調控作用
Wnt/β-catenin 信號通路在調控成骨細胞、破骨細胞及骨細胞的功能中發揮重要作用，并影響骨骼發育和內穩態，異常的 Wnt 信號可導致骨骼缺陷等疾病[24]。Yang 等[25]研究表明，BMSCs 通過 Wnt5a/Ror2 信號對破骨細胞的遷移與分化起到重要作用，并導致骨量減少，抗酒石酸酸性磷酸酶陽性細胞增加，最終表現為軟骨下小梁骨丟失。Esen 等[26]研究發現，mTORC2-AKT 信號下游 Rac1 可調節 LRP5，并通過在體外實驗中抑制 Wnt3a 誘導的代謝酶類表達影響成骨細胞分化，體內實驗中敲除小鼠 LRP5 可致出生后骨量減少，表明了 Wnt 信號通路在調控成骨細胞分化與代謝方面有潛在作用。Heilmann 等[27]研究發現，非經典 Wnt 信號可通過 Frizzled 家族 Fzd9 受體調控成骨細胞，并正向促進膜內和軟骨內的骨形成，而不參與軟骨形成或破骨細胞對礦化基質的降解，表明 Wnt 信號通路在促進 BMSCs 成骨分化中具有重要作用，并且 Wnt 信號通路參與膜內成骨和軟骨內成骨[28]。Zhang 等[29]研究發現，Wnt/β-catenin 信號活躍在各種成骨細胞或成骨細胞前體細胞系中，包括 MC3T3-E1、2T3、C2C12 及 C3H10T1/2 細胞系；此外，Wnt 信號通過與 BMP 通路的交聯，影響 BMP 信號活性、成骨細胞分化和骨形成。成骨細胞內 Wnt 信號通路變化可引起骨量變化，成骨細胞來源的 Wnt5a 可以通過激活 Ror2 受體促進破骨細胞分化，正常的破骨細胞分化需要 β-catenin 的動態調節，表明 Wnt 配體在成骨過程中可能具有階段性的特異性作用[30]。Roberts 等[31]應用條件性敲除成熟破骨細胞中 Wnt5a 的組織蛋白酶 K-cre（Ctsk-cre）小鼠進行研究，發現這些小鼠小梁骨和皮質骨減少，并且該低骨量表型并非破骨細胞介導的骨吸收增加，而是骨形成減少，表明破骨細胞來源的 Wnt5a 對維持骨內平衡有重要影響。Alam 等[32]用骨細胞中過表達人 Wnt16 的轉基因小鼠進行研究，發現轉基因小鼠骨形態計量學參數、骨密度及皮質骨厚度均顯著高于野生型小鼠，表明 Wnt16 通過對骨細胞的調控，在皮質骨和小梁骨的質量和強度方面起著關鍵作用。
上述研究表明經典 Wnt 信號通路可激活成骨細胞活性，促進成骨細胞分化和膜內及軟骨內的骨形成，并在骨量調節中起到關鍵作用，而不同來源的 Wnt5a 信號通路可促進破骨細胞分化及調控骨形成，不僅對破骨細胞形成有重要調控作用，還能維持正常骨量。因此，Wnt/β-catenin 信號通路對成骨細胞、破骨細胞及骨細胞功能調控的同時，維持了軟骨及軟骨下骨內環境穩態。
3 Wnt 信號通路在 OA 狀態下對軟骨及軟骨下骨的影響
3.1 Wnt 信號異常對 OA 發生發展中軟骨的作用
OA 關節的病理變化包括關節軟骨退化、軟骨下骨增厚、骨贅形成、滑膜炎癥、韌帶退化、膝關節半月板及關節囊肥大，這些病理改變導致 OA 或 OA 癥狀的發生[33]。OA 狀態下基質蛋白和基質降解酶類的產生增加，軟骨細胞穩態失衡，基質重塑及異常的肥大樣成熟，導致軟骨鈣化。在 OA 中基質降解酶類包括聚集蛋白聚糖酶、膠原酶、MMP 家族成員以及多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶。OA 早期的基質降解起因是可降解 AGG 的 MMP-3 和 ADAMTS-5 表達增加，隨后是分解膠原的酶活性增加，尤其是 MMP-13，可高效降解Ⅱ型膠原蛋白，一旦膠原蛋白網絡被降解，這種改變無法逆轉[34]。
軟骨細胞表達多種 Wnt 信號家族成員，Wnt 信號過度激活與 OA 嚴重程度成正相關。Hou 等[35]發現在 OA 軟骨和 IL-1β 刺激的軟骨細胞中 Wnt3a 表達增強，并且 Wnt3a 的過表達降低了軟骨基質分子Ⅱ型膠原和 AGG 的表達，并增加了 MMP-13 和 ADAMTS-4 的表達。Liu 等[36]在 IL-1β 誘導的軟骨 OA 模型中研究發現，軟骨細胞中 β-catenin、Runx2 及 Wnt5a 的表達增加。Nalesso 等[37]研究發現，Wnt16 缺陷小鼠表現出更嚴重的 OA，表現為潤滑素表達降低和軟骨細胞凋亡增加，并且 Wnt16 降低了 Wnt3a 激活經典 Wnt 信號通路的能力。Monteagudo 等[38]研究發現，Wnt 信號通路被過度激活時會導致 OA，DOT1L（一種參與組蛋白甲基化的酶）通過抑制 Wnt 信號通路保護軟骨，而 DOT1L 缺失破壞了體外正常的軟骨細胞分子特征，并導致小鼠 OA。Klotho 是一種 Wnt/β-catenin 信號轉導的內源性拮抗劑，Gu 等[39]研究發現與正常小鼠相比，OA 小鼠中 Klotho 表達顯著降低，Wnt/β-catenin 的活性及其靶基因表達上調。在 OA 軟骨中，Klotho 表達降低可激活 Wnt/β-catenin 信號轉導，從而誘發軟骨損傷。Deshmukh 等[40]研究發現應用新型小分子 Wnt 信號通路抑制劑 SM04690，可使人 BMSCs 分化為成熟有功能的軟骨細胞，并使軟骨分解代謝標志物水平降低，并且在嚙齒類 OA 模型關節內注射 SM04690，可使軟骨厚度增加，并觀察到軟骨再生，降低 MMP-1、3、13 和 ADAMTS-5 的表達，保護軟骨免受分解代謝的影響。Yazici 等[41]的研究得出類似結論，應用 SM04690 對人膝關節中重度 OA 癥狀有緩解作用。van den Bosch 等[42]用腺病毒載體在 C57BL/6 小鼠滑膜中過表達 Wnt5a、Wnt8a、Wnt16 及 WISP1，其中過表達 Wnt8a 和 Wnt16 可導致軟骨內經典 Wnt 信號傳導，經典 Wnt 信號激活可增加蛋白酶活性進而導致軟骨損傷，Wnt 信號通路下游蛋白 WISP1 的過表達能加重軟骨損傷。用 DKK1 特異性阻斷典型 Wnt 信號通路，可減輕 Wnt 信號導致的軟骨損傷。上述研究表明，在 OA 狀態下軟骨中 Wnts 和 Wnt 相關分子表達增加參與了 OA 的發生發展，Wnt 過度激活和不足均可導致軟骨降解，抑制 Wnt 信號通路可以減緩 OA 進展、增加軟骨厚度、減少軟骨細胞凋亡、促進軟骨再生。
3.2 Wnt 信號異常對 OA 發生發展中軟骨下骨的作用
Meo 等[43]對 HMW 轉基因小鼠誘導的 OA 模型研究發現，關節中 DKK1、硬化蛋白（sclerostin，SOST）和 LRP6 的表達降低，Wnt5a、Wnt7b、LRP5、軸抑制蛋白 2（Axin2）、磷酸化的糖原合成激酶 3β（GSK3β）、LEF1 及核內 β-catenin 增加，并發現 FGF-23 中和抗體療法能夠部分改善軟骨下骨中的 OA 病理改變，并減少關節中軟骨降解和肥大性軟骨形成標志物的表達。Chan 等[44]在手術誘導的綿羊和小鼠 OA 模型研究中，發現 Wnt 信號通路抑制劑 SOST 在軟骨損傷區域中表達增加，而在與軟骨損傷相對應的軟骨下骨中表達減少，軟骨中 MMP 和 ADAMTS 的表達降低，表明 SOST 通過抑制 Wnt 信號通路抑制了軟骨降解，并同時促進了軟骨下骨硬化。Martineau 等[45]的研究發現，人 OA 軟骨下骨成骨細胞較正常成骨細胞 Wnt5a、骨鈣素及 ALP 表達增加，表明 OA 成骨細胞的變化與非經典 Wnt 信號通路的轉導有關。Weng 等[46]應用前交叉韌帶橫斷術及膠原酶誘導大鼠膝關節 OA 模型，并用 DKK1 反義寡核苷酸（DKK1-AS）干預，研究結果顯示 OA 組與對照組相比軟骨下骨骨密度明顯下降，軟骨出現裂隙及炎癥細胞浸潤，應用 DKK1-AS 可減輕 OA 相關的軟骨及軟骨下骨丟失。Funck-Brentano 等[18]對骨組織特異性過表達 DKK 的轉基因小鼠行內側半月板切除術（destabilization of medial meniscus model，DMM）誘導膝關節 OA，發現 OA 狀態中的 Wnt 信號活化影響整個關節的穩態，尤其是軟骨下骨，結果表明通過過表達 DKK 可使關節國際骨關節炎研究會（OARSI）評分降低及骨贅形成減少，從而延緩 OA 發展。Frzb 和 Sfrp1 是內源性 Wnt 信號調節劑，Thysen 等[47]通過對 Frzb-/- 和 Sfrp1-/- 轉基因小鼠行 DMM 術誘導 OA，發現 Frzb-/- 小鼠的脛骨平臺 OARSI 評分與同窩野生型小鼠相比顯著增高，而 Sfrp1-/- 小鼠與同窩野生型小鼠比較無明顯變化；Frzb-/- 小鼠、Sfrp1-/- 小鼠及野生型小鼠與各自假手術組相比，DMM 模型導致軟骨下骨厚度明顯增加，但在 DMM 模型下，Frzb-/- 小鼠的軟骨下骨厚度和同窩野生型小鼠相比無顯著差異，相反，Sfrp1-/- 小鼠的軟骨下骨厚度與野生型小鼠相比顯著降低。結果表明 Frzb 可以調控軟骨發育及代謝，Sfrp1 對軟骨下骨發育及代謝有調控作用，并為內源性 Wnt 調節劑在 OA 中的關鍵作用提供了進一步證據。
上述結果表明在 OA 狀態下，軟骨下骨中 Wnt 信號通過 Frizzled 受體被激活，Wnt 信號激活增加了 β-catenin 活性并進一步促進 MMP 和 ADAMTS 等因子的表達，最終導致軟骨基質的降解及軟骨下骨硬化。應用內源性或外源性 Wnt 信號通路抑制劑抑制 Wnt 信號通路活性及相關蛋白表達，可以減輕 OA 的病理表現及臨床癥狀。
3.3 Wnt 信號通路調控軟骨及軟骨下骨間信息交流的分子機制
OA 軟骨退變是一種類似于生長板的軟骨內骨化過程，關節軟骨從靜息狀態轉變為軟骨的高轉換狀態，繼而發生軟骨不斷鈣化和鈣化軟骨不斷骨化重塑，可能是導致 OA 發生發展的中心環節[48]。這一環節可能通過 Wnt 信號通路同時影響軟骨和軟骨下骨的病理改變，從而促進 OA 的進展。經典 Wnt 信號促進成骨細胞分化，這一過程由 Wnt 及其受體拮抗劑 SOST 相互調控，形成一個對機械負荷變化敏感的反饋回路，并依賴于成骨細胞和破骨細胞的活性調節骨重建周期[49]。
Carpintero-Fernandez 等[50]通過共培養體系培養軟骨細胞、骨細胞和滑膜細胞，發現這些細胞通過建立縫隙連接直接交換有效的信號分子和代謝產物進行細胞間通訊。Prasadam 等[51]發現用 OA 軟骨下骨的成骨細胞與正常軟骨細胞共培養，可導致正常軟骨細胞內 ADAMTS 及 MMP 表達增加，為軟骨下骨及軟骨間存在信息交流提供了間接證據。Chen 等[52]通過研究透明質酸鈉與海藻酸鈉支架聯合小檗堿互穿聚合物網絡系統對骨軟骨修復的影響，發現通過激活 Wnt 信號通路可使軟骨下骨得到部分修復，并通過自噬的增強防止軟骨退化。Funck-Brentano 等[18]應用骨組織特異性過表達 DKK 的轉基因小鼠行 DMM 造成小鼠膝關節 OA，體外實驗表明過表達 DKK 小鼠的成骨細胞中 VEGF 表達降低，并且軟骨細胞中 MMP 的 mRNA 表達降低，提示成骨細胞通過過表達 DKK 抑制 Wnt 信號通路活性，進而降低 VEGF 表達，最終對軟骨細胞起保護作用，表明軟骨下骨的成骨細胞可通過調控 Wnt 信號調控軟骨細胞功能。Li 等[53]在手術誘導的 OA 小鼠模型中發現，破骨細胞活性與 OARSI 評分成正相關，應用動態膝關節負荷可顯著降低 OARSI 評分，并且通過對膝關節進行動態負荷治療，可完全抑制軟骨下骨破骨細胞的骨吸收及骨髓來源的破骨細胞分化，并通過 Wnt 信號轉導抑制破骨細胞生成，調節軟骨下骨的重塑及軟骨基質的降解，從而發揮對軟骨的保護作用。
通過對共培養體系培養細胞、特異性過表達 Wnt 信號通路相關分子的轉基因動物模型的研究，發現軟骨與軟骨下骨間存在直接或間接的信息交流，并且在 OA 狀態下互相影響。
4 小結與展望
Wnt 信號在生理條件下通過調控軟骨細胞、成骨細胞、骨細胞以及破骨細胞的分化與代謝，影響軟骨及軟骨下骨的發育。同時，OA 的發生發展及病理改變受到 Wnt 信號通路及其相關配體的調控，也可與其他信號通路及其他關鍵分子發生關聯，聯合調控 OA 的發病機制及病理過程。但是，OA 的發生及發展是一個復雜的病理過程，Wnt 信號過度激活和抑制均可影響軟骨及軟骨下骨穩態，導致 OA 發生。并且在 OA 的不同病理階段，Wnt 信號的活性及具體作用機制尚未明確，還需更進一步研究。更重要的是，近年研究表明，軟骨及軟骨下骨間的分子信息交流在 OA 發生發展中可能起到重要作用，為未來的 OA 發病機制研究提供了新思路和方向。因此，基于 Wnt 信號通路活性調控、軟骨及軟骨下骨間的分子信息交流研究，尤其是明確上述過程中的關鍵靶點和信號分子，是未來研究中應該著力解決的關鍵問題。
作者貢獻：連強強、遲博婧負責文章撰寫；張柳、田發明負責整體文章的觀點形成及修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是最常見的退化性關節疾病之一，也是中老年人致殘的主要原因之一[1-2]。結構性 OA 在 50 歲以上人群中女性比男性更常見，且無論男女患病率都會隨年齡增長而急劇上升[3]。60 歲以上老年人患病率為 11%，且發病呈年輕化趨勢，給社會及家庭造成沉重經濟負擔[4]。既往對 OA 的定義一直集中在關節軟骨的變化，而現在其被認為是一種全關節疾病，伴隨軟組織及礦化組織的相互作用[5]，包括軟骨丟失、骨贅形成，關節軟骨、軟骨下骨、韌帶、關節囊和滑膜改變，最終導致關節功能衰竭[3-5]，其中軟骨、軟骨下骨及滑膜在 OA 病理改變的發生發展中扮演重要角色[6-7]。多年來國內外學者對 OA 發生發展的分子機制進行了研究，發現與 Wnt/β-catenin、TGF-β、JAK/STAT、NF-κB 等信號通路相關[8-11]，其中 Wnt 信號通路在骨、軟骨發育中起到雙重作用[12]，通過影響 Wnt 信號通路的活性可以對軟骨下骨及關節軟骨的代謝造成影響。本文通過整理近年文獻，對 Wnt 信號通路在細胞功能調控和 OA 發生發展中其對軟骨下骨、關節軟骨的具體分子機制進行綜述，探討 Wnt 信號通路對軟骨、軟骨下骨雙靶向調控在 OA 進展中的作用，為探索 OA 的有效治療藥物提供新的思路和靶點。
1 Wnt 信號通路的組成及細胞內調控機制
Wnt 信號通路分為依賴 β-catenin 的經典 Wnt 信號通路和不依賴 β-catenin 的非經典 Wnt 信號通路。見圖 1。經典 Wnt 信號通路通過 Wnt 蛋白結合至 Frizzled 和低密度脂蛋白受體相關蛋白 5/6（low density lipoprotein receptor related protein 5/6，LRP5/6）[13-14]，通過下游復合體蛋白間的相互作用、構象變化及磷酸化狀態的轉變增加了 β-catenin 穩定性，從而被激活[14-16]。β-catenin 氨基酸末端磷酸化導致 β-catenin 核轉位，并通過核效應因子 T 細胞因子/淋巴增強因子（lymphoid enhancing factor，LEF）轉換因子激活下游靶基因的轉錄[15]，磷酸化的 β-catenin 被 β-轉導素重復序列包含蛋白（β-TrCP）識別，經泛素蛋白酶體途徑降解。非經典 Wnt 信號通路主要由 Wnt5a 激活，可分為 Wnt/Ca2+和平面細胞極性（planar cell polarity，PCP）通路。Wnt/Ca2+信號通路通過蛋白激酶 C 和鈣調蛋白激酶Ⅱ激活鈣信號，并與 T 細胞相關轉錄因子結合轉錄，調控細胞骨架重排、細胞黏附和遷移。在 PCP 通路中，Wnt5a 激活 Rho/Rho 相關激酶和 Rac/c-Jun N-末端激酶信號通路，調控細胞中的肌動蛋白聚合[17]。細胞外分泌的 Dickkopf（DKK）蛋白可通過結合 LRP5/6 抑制 β-catenin 核轉位，從而阻斷 Wnt 信號通路調節細胞功能[16，18]。
圖1
Wnt 信號通路傳導示意圖 a. 經典 Wnt 信號通路；b. 非經典 Wnt 信號通路
注：Dvl：Dishevelled；CK1：酪蛋白激酶 1；P：磷酸化；Ub：泛素；Proteasome：蛋白酶體；APC：腺瘤性息肉病大腸桿菌蛋白；PKC：蛋白激酶 C；TCF：T 細胞因子；CaMKⅡ：鈣調蛋白激酶Ⅱ；NFAT：活化 T 細胞核因子；JNK：Jun N 端激酶；Rho：Ras homologous；Rac：Ras-related C3 botulinum toxin substrate
Figure1. Schematic diagram of the Wnt signaling pathway transduction a. Classic Wnt signaling pathway; b. Non-classical Wnt signaling pathway2 Wnt 信號通路對軟骨及軟骨下骨發育的調控作用
2.1 對軟骨細胞功能和軟骨發育的調控作用
關節軟骨是一種生理上非自我更新的無血管組織，具有獨特的細胞類型——軟骨細胞，軟骨細胞的功能是產生和維持軟骨細胞外基質。Wnt/β-catenin 信號通路是骨、軟骨和關節發育及內穩態的關鍵調節器，它在許多生物學過程中發揮著重要作用，包括間充質細胞的凝聚和分化、成熟關節軟骨表型的維持、軟骨內成骨過程中肥厚組織的成熟等[19]。
Wnt 信號通路除了在軟骨形成和軟骨細胞成熟過程中發揮作用外，還參與維持完全分化的軟骨細胞表型，因此可能在維持整個成年期的軟骨穩態中發揮重要作用[20]。Chen 等[21]通過研究 Wnt 家族 mRNA 及蛋白在 C57BL/6 小鼠出生前及出生后下頜骨髁突軟骨中的表達，發現在胚胎時期，Wnt9a 主要見于增生性和礦化性肥大軟骨細胞，并在分化軟骨細胞及未分化軟骨細胞的細胞核中可見明顯的 Lef1 表達；而在出生后階段，肥厚和礦化的軟骨細胞中 Wnt4a 表達逐漸降低。結果表明 Wnt 信號通路在不同時期可調控下頜髁突軟骨細胞功能，并與軟骨的發育狀況息息相關。Zhang 等[22]研究發現，軟骨細胞可經 Wnt/β-catenin 信號通路產生一種基質蛋白——富含半胱氨酸蛋白 61（cysteine-rich protein 61，CCN1），在體外分離的胸骨軟骨細胞、胚胎軟骨和出生后軟骨中均發現 β-catenin 信號轉導可以增加 CCN1 表達并促進軟骨細胞的成熟，而且過表達 CCN1 的轉基因小鼠成年后出現發育異常和軟骨變性。Huang 等[23]利用 Wnt 信號阻斷劑 PKF118-310 和激動劑 6-溴聯苯-3’-氧基（BIO）觀察人 MSCs 的成軟骨分化，隨后建立球粒培養體系，進行 5 周的三維軟骨分化。結果顯示激活經典 Wnt 信號通路顯著下調了軟骨特異性基因 SRY-box 轉錄因子 9（SRY-box transcription factor 9，SOX9）、Ⅱ型膠原 α1 鏈（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）和聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGG）以及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-1、3、9、13 的表達，但增加了含凝血酶敏感素基序的整合素和金屬蛋白酶 4、5（a sidintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4、5，ADAMTS-4、5）的表達；PKF118-310 對 Wnt 信號的抑制增加了 SOX9、COL2A1、AGG 和 MMP-9 的表達，但降低了 MMP-13 和 ADAMTS-4、5 的表達，表明 Wnt 信號的過表達或過抑制在一定程度上都會對軟骨細胞分化產生影響。上述研究表明，生理狀態下 Wnt 信號通路通過上調或下調關鍵分子表達，調控 MSCs 向軟骨細胞方向分化、促進軟骨細胞成熟、維持軟骨細胞表型，并通過減少 MMP-1、3、9、13 的表達維持軟骨的正常結構及生理功能。
2.2 對成骨細胞、破骨細胞及骨細胞功能和軟骨下骨內環境穩態的調控作用
Wnt/β-catenin 信號通路在調控成骨細胞、破骨細胞及骨細胞的功能中發揮重要作用，并影響骨骼發育和內穩態，異常的 Wnt 信號可導致骨骼缺陷等疾病[24]。Yang 等[25]研究表明，BMSCs 通過 Wnt5a/Ror2 信號對破骨細胞的遷移與分化起到重要作用，并導致骨量減少，抗酒石酸酸性磷酸酶陽性細胞增加，最終表現為軟骨下小梁骨丟失。Esen 等[26]研究發現，mTORC2-AKT 信號下游 Rac1 可調節 LRP5，并通過在體外實驗中抑制 Wnt3a 誘導的代謝酶類表達影響成骨細胞分化，體內實驗中敲除小鼠 LRP5 可致出生后骨量減少，表明了 Wnt 信號通路在調控成骨細胞分化與代謝方面有潛在作用。Heilmann 等[27]研究發現，非經典 Wnt 信號可通過 Frizzled 家族 Fzd9 受體調控成骨細胞，并正向促進膜內和軟骨內的骨形成，而不參與軟骨形成或破骨細胞對礦化基質的降解，表明 Wnt 信號通路在促進 BMSCs 成骨分化中具有重要作用，并且 Wnt 信號通路參與膜內成骨和軟骨內成骨[28]。Zhang 等[29]研究發現，Wnt/β-catenin 信號活躍在各種成骨細胞或成骨細胞前體細胞系中，包括 MC3T3-E1、2T3、C2C12 及 C3H10T1/2 細胞系；此外，Wnt 信號通過與 BMP 通路的交聯，影響 BMP 信號活性、成骨細胞分化和骨形成。成骨細胞內 Wnt 信號通路變化可引起骨量變化，成骨細胞來源的 Wnt5a 可以通過激活 Ror2 受體促進破骨細胞分化，正常的破骨細胞分化需要 β-catenin 的動態調節，表明 Wnt 配體在成骨過程中可能具有階段性的特異性作用[30]。Roberts 等[31]應用條件性敲除成熟破骨細胞中 Wnt5a 的組織蛋白酶 K-cre（Ctsk-cre）小鼠進行研究，發現這些小鼠小梁骨和皮質骨減少，并且該低骨量表型并非破骨細胞介導的骨吸收增加，而是骨形成減少，表明破骨細胞來源的 Wnt5a 對維持骨內平衡有重要影響。Alam 等[32]用骨細胞中過表達人 Wnt16 的轉基因小鼠進行研究，發現轉基因小鼠骨形態計量學參數、骨密度及皮質骨厚度均顯著高于野生型小鼠，表明 Wnt16 通過對骨細胞的調控，在皮質骨和小梁骨的質量和強度方面起著關鍵作用。
上述研究表明經典 Wnt 信號通路可激活成骨細胞活性，促進成骨細胞分化和膜內及軟骨內的骨形成，并在骨量調節中起到關鍵作用，而不同來源的 Wnt5a 信號通路可促進破骨細胞分化及調控骨形成，不僅對破骨細胞形成有重要調控作用，還能維持正常骨量。因此，Wnt/β-catenin 信號通路對成骨細胞、破骨細胞及骨細胞功能調控的同時，維持了軟骨及軟骨下骨內環境穩態。
3 Wnt 信號通路在 OA 狀態下對軟骨及軟骨下骨的影響
3.1 Wnt 信號異常對 OA 發生發展中軟骨的作用
OA 關節的病理變化包括關節軟骨退化、軟骨下骨增厚、骨贅形成、滑膜炎癥、韌帶退化、膝關節半月板及關節囊肥大，這些病理改變導致 OA 或 OA 癥狀的發生[33]。OA 狀態下基質蛋白和基質降解酶類的產生增加，軟骨細胞穩態失衡，基質重塑及異常的肥大樣成熟，導致軟骨鈣化。在 OA 中基質降解酶類包括聚集蛋白聚糖酶、膠原酶、MMP 家族成員以及多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶。OA 早期的基質降解起因是可降解 AGG 的 MMP-3 和 ADAMTS-5 表達增加，隨后是分解膠原的酶活性增加，尤其是 MMP-13，可高效降解Ⅱ型膠原蛋白，一旦膠原蛋白網絡被降解，這種改變無法逆轉[34]。
軟骨細胞表達多種 Wnt 信號家族成員，Wnt 信號過度激活與 OA 嚴重程度成正相關。Hou 等[35]發現在 OA 軟骨和 IL-1β 刺激的軟骨細胞中 Wnt3a 表達增強，并且 Wnt3a 的過表達降低了軟骨基質分子Ⅱ型膠原和 AGG 的表達，并增加了 MMP-13 和 ADAMTS-4 的表達。Liu 等[36]在 IL-1β 誘導的軟骨 OA 模型中研究發現，軟骨細胞中 β-catenin、Runx2 及 Wnt5a 的表達增加。Nalesso 等[37]研究發現，Wnt16 缺陷小鼠表現出更嚴重的 OA，表現為潤滑素表達降低和軟骨細胞凋亡增加，并且 Wnt16 降低了 Wnt3a 激活經典 Wnt 信號通路的能力。Monteagudo 等[38]研究發現，Wnt 信號通路被過度激活時會導致 OA，DOT1L（一種參與組蛋白甲基化的酶）通過抑制 Wnt 信號通路保護軟骨，而 DOT1L 缺失破壞了體外正常的軟骨細胞分子特征，并導致小鼠 OA。Klotho 是一種 Wnt/β-catenin 信號轉導的內源性拮抗劑，Gu 等[39]研究發現與正常小鼠相比，OA 小鼠中 Klotho 表達顯著降低，Wnt/β-catenin 的活性及其靶基因表達上調。在 OA 軟骨中，Klotho 表達降低可激活 Wnt/β-catenin 信號轉導，從而誘發軟骨損傷。Deshmukh 等[40]研究發現應用新型小分子 Wnt 信號通路抑制劑 SM04690，可使人 BMSCs 分化為成熟有功能的軟骨細胞，并使軟骨分解代謝標志物水平降低，并且在嚙齒類 OA 模型關節內注射 SM04690，可使軟骨厚度增加，并觀察到軟骨再生，降低 MMP-1、3、13 和 ADAMTS-5 的表達，保護軟骨免受分解代謝的影響。Yazici 等[41]的研究得出類似結論，應用 SM04690 對人膝關節中重度 OA 癥狀有緩解作用。van den Bosch 等[42]用腺病毒載體在 C57BL/6 小鼠滑膜中過表達 Wnt5a、Wnt8a、Wnt16 及 WISP1，其中過表達 Wnt8a 和 Wnt16 可導致軟骨內經典 Wnt 信號傳導，經典 Wnt 信號激活可增加蛋白酶活性進而導致軟骨損傷，Wnt 信號通路下游蛋白 WISP1 的過表達能加重軟骨損傷。用 DKK1 特異性阻斷典型 Wnt 信號通路，可減輕 Wnt 信號導致的軟骨損傷。上述研究表明，在 OA 狀態下軟骨中 Wnts 和 Wnt 相關分子表達增加參與了 OA 的發生發展，Wnt 過度激活和不足均可導致軟骨降解，抑制 Wnt 信號通路可以減緩 OA 進展、增加軟骨厚度、減少軟骨細胞凋亡、促進軟骨再生。
3.2 Wnt 信號異常對 OA 發生發展中軟骨下骨的作用
Meo 等[43]對 HMW 轉基因小鼠誘導的 OA 模型研究發現，關節中 DKK1、硬化蛋白（sclerostin，SOST）和 LRP6 的表達降低，Wnt5a、Wnt7b、LRP5、軸抑制蛋白 2（Axin2）、磷酸化的糖原合成激酶 3β（GSK3β）、LEF1 及核內 β-catenin 增加，并發現 FGF-23 中和抗體療法能夠部分改善軟骨下骨中的 OA 病理改變，并減少關節中軟骨降解和肥大性軟骨形成標志物的表達。Chan 等[44]在手術誘導的綿羊和小鼠 OA 模型研究中，發現 Wnt 信號通路抑制劑 SOST 在軟骨損傷區域中表達增加，而在與軟骨損傷相對應的軟骨下骨中表達減少，軟骨中 MMP 和 ADAMTS 的表達降低，表明 SOST 通過抑制 Wnt 信號通路抑制了軟骨降解，并同時促進了軟骨下骨硬化。Martineau 等[45]的研究發現，人 OA 軟骨下骨成骨細胞較正常成骨細胞 Wnt5a、骨鈣素及 ALP 表達增加，表明 OA 成骨細胞的變化與非經典 Wnt 信號通路的轉導有關。Weng 等[46]應用前交叉韌帶橫斷術及膠原酶誘導大鼠膝關節 OA 模型，并用 DKK1 反義寡核苷酸（DKK1-AS）干預，研究結果顯示 OA 組與對照組相比軟骨下骨骨密度明顯下降，軟骨出現裂隙及炎癥細胞浸潤，應用 DKK1-AS 可減輕 OA 相關的軟骨及軟骨下骨丟失。Funck-Brentano 等[18]對骨組織特異性過表達 DKK 的轉基因小鼠行內側半月板切除術（destabilization of medial meniscus model，DMM）誘導膝關節 OA，發現 OA 狀態中的 Wnt 信號活化影響整個關節的穩態，尤其是軟骨下骨，結果表明通過過表達 DKK 可使關節國際骨關節炎研究會（OARSI）評分降低及骨贅形成減少，從而延緩 OA 發展。Frzb 和 Sfrp1 是內源性 Wnt 信號調節劑，Thysen 等[47]通過對 Frzb-/- 和 Sfrp1-/- 轉基因小鼠行 DMM 術誘導 OA，發現 Frzb-/- 小鼠的脛骨平臺 OARSI 評分與同窩野生型小鼠相比顯著增高，而 Sfrp1-/- 小鼠與同窩野生型小鼠比較無明顯變化；Frzb-/- 小鼠、Sfrp1-/- 小鼠及野生型小鼠與各自假手術組相比，DMM 模型導致軟骨下骨厚度明顯增加，但在 DMM 模型下，Frzb-/- 小鼠的軟骨下骨厚度和同窩野生型小鼠相比無顯著差異，相反，Sfrp1-/- 小鼠的軟骨下骨厚度與野生型小鼠相比顯著降低。結果表明 Frzb 可以調控軟骨發育及代謝，Sfrp1 對軟骨下骨發育及代謝有調控作用，并為內源性 Wnt 調節劑在 OA 中的關鍵作用提供了進一步證據。
上述結果表明在 OA 狀態下，軟骨下骨中 Wnt 信號通過 Frizzled 受體被激活，Wnt 信號激活增加了 β-catenin 活性并進一步促進 MMP 和 ADAMTS 等因子的表達，最終導致軟骨基質的降解及軟骨下骨硬化。應用內源性或外源性 Wnt 信號通路抑制劑抑制 Wnt 信號通路活性及相關蛋白表達，可以減輕 OA 的病理表現及臨床癥狀。
3.3 Wnt 信號通路調控軟骨及軟骨下骨間信息交流的分子機制
OA 軟骨退變是一種類似于生長板的軟骨內骨化過程，關節軟骨從靜息狀態轉變為軟骨的高轉換狀態，繼而發生軟骨不斷鈣化和鈣化軟骨不斷骨化重塑，可能是導致 OA 發生發展的中心環節[48]。這一環節可能通過 Wnt 信號通路同時影響軟骨和軟骨下骨的病理改變，從而促進 OA 的進展。經典 Wnt 信號促進成骨細胞分化，這一過程由 Wnt 及其受體拮抗劑 SOST 相互調控，形成一個對機械負荷變化敏感的反饋回路，并依賴于成骨細胞和破骨細胞的活性調節骨重建周期[49]。
Carpintero-Fernandez 等[50]通過共培養體系培養軟骨細胞、骨細胞和滑膜細胞，發現這些細胞通過建立縫隙連接直接交換有效的信號分子和代謝產物進行細胞間通訊。Prasadam 等[51]發現用 OA 軟骨下骨的成骨細胞與正常軟骨細胞共培養，可導致正常軟骨細胞內 ADAMTS 及 MMP 表達增加，為軟骨下骨及軟骨間存在信息交流提供了間接證據。Chen 等[52]通過研究透明質酸鈉與海藻酸鈉支架聯合小檗堿互穿聚合物網絡系統對骨軟骨修復的影響，發現通過激活 Wnt 信號通路可使軟骨下骨得到部分修復，并通過自噬的增強防止軟骨退化。Funck-Brentano 等[18]應用骨組織特異性過表達 DKK 的轉基因小鼠行 DMM 造成小鼠膝關節 OA，體外實驗表明過表達 DKK 小鼠的成骨細胞中 VEGF 表達降低，并且軟骨細胞中 MMP 的 mRNA 表達降低，提示成骨細胞通過過表達 DKK 抑制 Wnt 信號通路活性，進而降低 VEGF 表達，最終對軟骨細胞起保護作用，表明軟骨下骨的成骨細胞可通過調控 Wnt 信號調控軟骨細胞功能。Li 等[53]在手術誘導的 OA 小鼠模型中發現，破骨細胞活性與 OARSI 評分成正相關，應用動態膝關節負荷可顯著降低 OARSI 評分，并且通過對膝關節進行動態負荷治療，可完全抑制軟骨下骨破骨細胞的骨吸收及骨髓來源的破骨細胞分化，并通過 Wnt 信號轉導抑制破骨細胞生成，調節軟骨下骨的重塑及軟骨基質的降解，從而發揮對軟骨的保護作用。
通過對共培養體系培養細胞、特異性過表達 Wnt 信號通路相關分子的轉基因動物模型的研究，發現軟骨與軟骨下骨間存在直接或間接的信息交流，并且在 OA 狀態下互相影響。
4 小結與展望
Wnt 信號在生理條件下通過調控軟骨細胞、成骨細胞、骨細胞以及破骨細胞的分化與代謝，影響軟骨及軟骨下骨的發育。同時，OA 的發生發展及病理改變受到 Wnt 信號通路及其相關配體的調控，也可與其他信號通路及其他關鍵分子發生關聯，聯合調控 OA 的發病機制及病理過程。但是，OA 的發生及發展是一個復雜的病理過程，Wnt 信號過度激活和抑制均可影響軟骨及軟骨下骨穩態，導致 OA 發生。并且在 OA 的不同病理階段，Wnt 信號的活性及具體作用機制尚未明確，還需更進一步研究。更重要的是，近年研究表明，軟骨及軟骨下骨間的分子信息交流在 OA 發生發展中可能起到重要作用，為未來的 OA 發病機制研究提供了新思路和方向。因此，基于 Wnt 信號通路活性調控、軟骨及軟骨下骨間的分子信息交流研究，尤其是明確上述過程中的關鍵靶點和信號分子，是未來研究中應該著力解決的關鍵問題。
作者貢獻：連強強、遲博婧負責文章撰寫；張柳、田發明負責整體文章的觀點形成及修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點。
