引用本文： 程傲, 何鵬杰, 張俊宇, 鄭偉偉, 楊民. 缺氧條件下大鼠髓核細胞中缺氧誘導因子 1α 與自噬相關分子的表達及相關性分析. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(3): 318-322. doi: 10.7507/1002-1892.201908088 復制
椎間盤是人體最早發生退變的組織之一[1]，也是一種無血管組織，其血供主要依靠纖維環途徑和終板途徑（主要途徑）[2]。因此，椎間盤中心為低氧環境，導致髓核細胞主要通過糖酵解途徑來提供能量。脊柱退行性病變及脊柱損傷時，髓核組織因受壓或者血管損傷導致血供進一步減少，從而造成髓核細胞缺血缺氧。在缺血缺氧過程中，髓核細胞會啟動一系列分子機制來提高對缺氧環境的耐受力，其中比較重要的分子調控機制為缺氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和自噬，二者的分子通路和作用已被證實[3-4]。HIF-1α 能通過 Beclin1 信號通路啟動自噬[5]，且 HIF-1α 在大鼠髓核細胞中常規表達[6]。但是，大鼠髓核細胞在缺氧條件下是否存在自噬以及缺氧條件下 HIF-1α 與自噬的相關性，國內尚罕見相關報道。鑒于此，本實驗擬通過體外細胞實驗研究二者在缺氧條件下的表達量及其相關性，以期為髓核細胞缺血缺氧類疾病的治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，體質量 225～250 g，由皖南醫學院附屬弋磯山醫院中心實驗室提供。
DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶（Biosharp 公司，美國）；兔抗 HIF-1α 單克隆抗體、兔抗 LC3B 單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；兔抗 Beclin1 單克隆抗體、兔抗 β-actin 單克隆抗體（Abcam 公司，美國）；TRIzol（Invitrogen 公司，美國）；逆轉錄試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）。
Mannedorf 多功能酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；紫外分光光度計（Genova Nano 公司，英國）；DP70 倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；Image J 軟件（National Institutes of Health 公司，美國）；CO2 細胞培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）。
1.2 大鼠髓核細胞分離培養及鑒定
取 20 只健康成年 SD 大鼠，采用致死劑量的 CO2 處死后取其尾骨，用尖刀片剔除多余組織，暴露椎間盤，切開纖維環取出髓核組織。將髓核組織清洗干凈后置于含 1% 青-鏈霉素的 DMEM/F12 培養液的 EP 管中，移至超凈工作臺；無菌條件下，用眼科剪將髓核組織剪成大小約 1 mm×1 mm×1 mm 碎片，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清液；加入 0.1% Ⅱ型膠原酶和 2 U/mL 透明質酸酶消化 4 h，200 目無菌網過濾；將沉淀以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清液；用吸管將離心后組織種植于 25 cm2培養瓶中，2 h 后翻轉培養瓶，加入含 1×105 U/L 青霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 mg/L 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基中。待培養瓶中細胞融合達 80% 時，用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代，第 1、2 代細胞均用差速貼壁法進行分離純化；將第 3 代細胞[7]以密度 3×105個/mL 接種于 6 孔板中爬片，待細胞貼壁后行 HE 染色和Ⅱ型膠原酶免疫熒光染色鑒定。
1.3 實驗分組及方法
取第 3 代髓核細胞以每孔 2×105個/mL 密度接種至 4 塊 6 孔板培養皿中，將 4 塊 6 孔板隨機分為 A、B、C、D 組。A、B 組細胞不作處理，C 組細胞轉染 HIF-1α-小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）[8]，D 組加入自噬抑制劑 3-MA[9]。然后，將 A 組細胞置于正常氧含量培養環境（37℃、5%CO2、20%O2）培養，B、C、D 組細胞置于缺氧環境（37℃、5%CO2、1%O2）培養。培養 8 h 后取出各組細胞進行觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 Western blot 檢測 HIF-1α 與自噬相關分子蛋白表達
各組細胞用無菌 PBS 沖洗 3 次，然后用蛋白提取緩沖液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟提取細胞總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度。然后將蛋白置于 100℃ 金屬浴中加熱 10 min，使其充分變性，–80℃ 保存備用。每次取適量蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，轉膜，5% 脫脂牛奶封閉，加入一抗兔抗 HIF-1α 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗 LC3B 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗 Beclin1 單克隆抗體（1∶1 000）及兔抗 β-actin 單克隆抗體（1∶5 000），4℃ 過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000），室溫孵育 2 h；常規 ECL 發光液顯色。采用 Image J 軟件分析蛋白條帶，計算各蛋白相對表達量。其中自噬相關分子 LC3B 蛋白相對表達量以 LC3-Ⅱ與 LC3-Ⅰ的比值表示。
1.4.2 實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測 HIF-1α 與自噬相關分子 mRNA 表達
各組細胞用無菌 PBS 沖洗 3 次，每孔加入 200 μL 預冷 TRIzol 試劑以提取髓核細胞總 RNA，–80℃ 保存備用。取適量總 RNA，參照逆轉錄試劑盒說明進行 qRT-PCR 反應。反應條件：95℃、10 min 預變性；95℃、15 s，60℃、1 min，40 個循環；65℃、5 s；95℃、0.5 s。各引物序列由廣州銳博生物科技有限公司合成，見表 1。采用 2?ΔΔCt法檢測各目的基因相對表達量，以 β-actin 作為內參，其中 LC3B mRNA 相對表達量以 LC3-Ⅱ表示。
表1
qRT-PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR genes
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠髓核細胞形態觀察及鑒定
光鏡觀察示，培養 7 d 左右可見原代大鼠髓核細胞貼壁，細胞形態一致，呈圓形和多角形。經分離純化的第 3 代大鼠髓核細胞 HE 染色后細胞質呈淡粉色，細胞核呈藍黑色；Ⅱ型膠原酶免疫熒光染色為陽性[10]。見圖 1。
圖1
大鼠髓核細胞形態學觀察及鑒定
a. 原代髓核細胞（×100）；b. 第 3 代細胞 HE 染色觀察（×40）；c. 第 3 代細胞Ⅱ型膠原酶免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×40）
Figure1. Morphological observation and identification of rat nucleus pulposus cellsa. Primary nucleus pulposus cells (×100); b. HE staining of the 3rd generation cells (×40); c. Collagenase type Ⅱ immunofluorescence staining of the 3rd generation cells (Fluorescence microscope×40)
2.2 Western blot 檢測 HIF-1α 與自噬相關分子蛋白表達
B 組 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α、Beclin1 蛋白相對表達量均顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組各蛋白相對表達量均較 B 組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；D 組 HIF-1α 蛋白相對表達量與 B 組比較差異無統計學意義（P>0.05），Beclin1 和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量較 B 組顯著降低（P<0.05）。見圖 2 及表 2。
圖2
Western blot 檢測各組大鼠髓核細胞中 HIF-1α 與自噬相關分子蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：A 組 2：B 組3：C 組 4：D 組
Figure2. HIF-1α and autophagy related molecules expressions in rat nucleus pulposus cells of each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
表2
Western blot 檢測各組 HIF-1α 與自噬相關分子蛋白相對表達量（n=3，
）
Table2.
The relative protein expressions of HIF-1α and autophagy related molecules in each group detected by Western blot (n=3, 
)
2.3 qRT-PCR 檢測 HIF-1α 與自噬相關分子 mRNA 表達
B 組 LC3-Ⅱ、HIF-1α、Beclin1 mRNA 相對表達量均顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組 LC3-Ⅱ、HIF-1α、Beclin1 mRNA 相對表達量均較 B 組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；D 組 HIF-1α mRNA 相對表達量與 B 組比較差異無統計學意義（P>0.05），Beclin1 和 LC3-Ⅱ mRNA 相對表達量均較 B 組顯著降低（P<0.05）。見表 3。
表3
qRT-PCR 檢測各組 HIF-1α 與自噬相關分子 mRNA 相對表達量（n=3，
）
Table3.
The relative mRNA expressions of HIF-1α and autophagy related molecules in each group detected by qRT-PCR (n=3, 
)
3 討論
腰椎間盤突出癥是臨床常見病及多發病，嚴重影響患者日常生活質量，甚至致殘[11]。導致腰椎間盤突出癥的最主要原因是腰椎間盤退行性變，在退變過程中椎間盤血供會進一步減少，造成髓核細胞處于缺血缺氧狀態。缺血缺氧的髓核細胞會啟動一系列分子機制以提高對缺氧環境的耐受力，減少髓核細胞死亡。研究表明[12]，缺氧條件下腫瘤相關成纖維細胞的 HIF-1α 表達會上升，并通過 Beclin1 途徑誘導自噬，從而保護細胞。而髓核細胞中是否存在相同分子機制，以及二者是否存在相關性尚未明確。
HIF-1α 是一種廣泛存在于哺乳動物細胞內的轉錄因子，其功能包括紅細胞和血管的生成、細胞的增殖和凋亡等多個方面[13]。當組織處于缺氧狀態時，HIF-1α 能夠發揮基因調控和轉錄作用，促進血管生成，以提高組織對于缺氧環境的耐受力。因此，本研究通過檢測 HIF-1α 的表達來衡量髓核細胞的缺氧程度。
1962 年，Ashford 和 Porter 發現細胞內有“自己吃自己”的現象并提出“自噬”觀點[14]，即從粗面內質網無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分細胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解所包裹的內容物，以實現細胞代謝需要和某些細胞器的更新過程。自噬相關分子主要有 Beclin1、LC3B，其中后者常作為衡量自噬發生的關鍵性指標[15]。
本研究中，首先在常氧和缺氧狀態下分別培養正常髓核細胞 8 h，結果發現缺氧狀態下大鼠髓核細胞中的 HIF-1α、Beclin1 表達量較常氧狀態明顯上升，且 LC3B 表達量明顯增高。然后，利用 HIF-1α-siRNA 沉默大鼠髓核細胞 HIF-1α[16]，驗證其是否參與缺氧條件下的自噬。C 組細胞在缺氧條件下培養 8 h 后，HIF-1α 表達量較 B 組明顯下降，自噬相關分子 Beclin1 和 LC3B 表達量亦明顯下降，提示 HIF-1α-siRNA 能夠降低 HIF-1α 的表達，并且下調的 HIF-1α 能夠降低自噬相關分子的表達，說明 HIF-1α 參與了缺氧條件下自噬的相關調控。為了驗證自噬是否逆向參與調控 HIF-1α 的表達，進一步在正常髓核細胞中加入自噬抑制劑 3-MA，同樣在缺氧條件下培養 8 h，發現 HIF-1α 正常表達且與 B 組缺氧條件下培養正常髓核細胞相當，而自噬相關分子 Beclin1 和 LC3B 的表達量較 B 組明顯下降，可見自噬抑制劑能夠明顯降低自噬水平，且自噬相關分子表達的降低對于 HIF-1α 的表達無明顯影響。
綜上述，缺氧條件能夠誘導大鼠髓核細胞中 HIF-1α 和自噬相關分子 Beclin1 和 LC3B 的表達，且 HIF-1α 與自噬相關分子的表達具有相關性，即 HIF-1α 下調能夠降低自噬相關分子的表達。而缺氧條件下自噬水平的下調對 HIF-1α 的表達無明顯影響。研究表明[17]，HIF-1α 能夠通過促進血管新生，提高髓核細胞對缺氧環境的耐受能力；而細胞自噬是通過溶酶體分解衰老、受損或者死亡的細胞，從而為正常細胞的生存提供營養物質。結合本研究結果提示二者對缺氧狀態下髓核細胞的保護具有協同作用。本研究在細胞水平驗證了缺氧狀態下，髓核細胞中 HIF-1α 與自噬相關分子表達明顯上升，且二者具有相關性，為進一步探索二者對于髓核細胞保護中協同作用的分子機制，從而為脊髓損傷等造成髓核細胞缺血缺氧類疾病的治療提供一定理論支持[18-19]。
作者貢獻：程傲參與實驗設計及實施、數據收集、統計分析和文章撰寫；何鵬杰、張俊宇參與實驗設計及數據統計分析；鄭偉偉參與實驗數據分析、文章修改；楊民參與實驗設計、實驗數據整理，文章的思路設計及修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：實驗方案經皖南醫學院附屬弋磯山醫院實驗動物倫理委員會批準。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2018-004。
椎間盤是人體最早發生退變的組織之一[1]，也是一種無血管組織，其血供主要依靠纖維環途徑和終板途徑（主要途徑）[2]。因此，椎間盤中心為低氧環境，導致髓核細胞主要通過糖酵解途徑來提供能量。脊柱退行性病變及脊柱損傷時，髓核組織因受壓或者血管損傷導致血供進一步減少，從而造成髓核細胞缺血缺氧。在缺血缺氧過程中，髓核細胞會啟動一系列分子機制來提高對缺氧環境的耐受力，其中比較重要的分子調控機制為缺氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）和自噬，二者的分子通路和作用已被證實[3-4]。HIF-1α 能通過 Beclin1 信號通路啟動自噬[5]，且 HIF-1α 在大鼠髓核細胞中常規表達[6]。但是，大鼠髓核細胞在缺氧條件下是否存在自噬以及缺氧條件下 HIF-1α 與自噬的相關性，國內尚罕見相關報道。鑒于此，本實驗擬通過體外細胞實驗研究二者在缺氧條件下的表達量及其相關性，以期為髓核細胞缺血缺氧類疾病的治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，體質量 225～250 g，由皖南醫學院附屬弋磯山醫院中心實驗室提供。
DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶（Biosharp 公司，美國）；兔抗 HIF-1α 單克隆抗體、兔抗 LC3B 單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；兔抗 Beclin1 單克隆抗體、兔抗 β-actin 單克隆抗體（Abcam 公司，美國）；TRIzol（Invitrogen 公司，美國）；逆轉錄試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）。
Mannedorf 多功能酶標儀（Tecan 公司，瑞士）；紫外分光光度計（Genova Nano 公司，英國）；DP70 倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；Image J 軟件（National Institutes of Health 公司，美國）；CO2 細胞培養箱（Thermo Fisher 公司，美國）。
1.2 大鼠髓核細胞分離培養及鑒定
取 20 只健康成年 SD 大鼠，采用致死劑量的 CO2 處死后取其尾骨，用尖刀片剔除多余組織，暴露椎間盤，切開纖維環取出髓核組織。將髓核組織清洗干凈后置于含 1% 青-鏈霉素的 DMEM/F12 培養液的 EP 管中，移至超凈工作臺；無菌條件下，用眼科剪將髓核組織剪成大小約 1 mm×1 mm×1 mm 碎片，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清液；加入 0.1% Ⅱ型膠原酶和 2 U/mL 透明質酸酶消化 4 h，200 目無菌網過濾；將沉淀以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min，棄上清液；用吸管將離心后組織種植于 25 cm2培養瓶中，2 h 后翻轉培養瓶，加入含 1×105 U/L 青霉素、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 mg/L 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基中。待培養瓶中細胞融合達 80% 時，用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代，第 1、2 代細胞均用差速貼壁法進行分離純化；將第 3 代細胞[7]以密度 3×105個/mL 接種于 6 孔板中爬片，待細胞貼壁后行 HE 染色和Ⅱ型膠原酶免疫熒光染色鑒定。
1.3 實驗分組及方法
取第 3 代髓核細胞以每孔 2×105個/mL 密度接種至 4 塊 6 孔板培養皿中，將 4 塊 6 孔板隨機分為 A、B、C、D 組。A、B 組細胞不作處理，C 組細胞轉染 HIF-1α-小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）[8]，D 組加入自噬抑制劑 3-MA[9]。然后，將 A 組細胞置于正常氧含量培養環境（37℃、5%CO2、20%O2）培養，B、C、D 組細胞置于缺氧環境（37℃、5%CO2、1%O2）培養。培養 8 h 后取出各組細胞進行觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 Western blot 檢測 HIF-1α 與自噬相關分子蛋白表達
各組細胞用無菌 PBS 沖洗 3 次，然后用蛋白提取緩沖液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟提取細胞總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度。然后將蛋白置于 100℃ 金屬浴中加熱 10 min，使其充分變性，–80℃ 保存備用。每次取適量蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，轉膜，5% 脫脂牛奶封閉，加入一抗兔抗 HIF-1α 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗 LC3B 單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗 Beclin1 單克隆抗體（1∶1 000）及兔抗 β-actin 單克隆抗體（1∶5 000），4℃ 過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000），室溫孵育 2 h；常規 ECL 發光液顯色。采用 Image J 軟件分析蛋白條帶，計算各蛋白相對表達量。其中自噬相關分子 LC3B 蛋白相對表達量以 LC3-Ⅱ與 LC3-Ⅰ的比值表示。
1.4.2 實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）檢測 HIF-1α 與自噬相關分子 mRNA 表達
各組細胞用無菌 PBS 沖洗 3 次，每孔加入 200 μL 預冷 TRIzol 試劑以提取髓核細胞總 RNA，–80℃ 保存備用。取適量總 RNA，參照逆轉錄試劑盒說明進行 qRT-PCR 反應。反應條件：95℃、10 min 預變性；95℃、15 s，60℃、1 min，40 個循環；65℃、5 s；95℃、0.5 s。各引物序列由廣州銳博生物科技有限公司合成，見表 1。采用 2?ΔΔCt法檢測各目的基因相對表達量，以 β-actin 作為內參，其中 LC3B mRNA 相對表達量以 LC3-Ⅱ表示。
表1
qRT-PCR 各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR genes
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠髓核細胞形態觀察及鑒定
光鏡觀察示，培養 7 d 左右可見原代大鼠髓核細胞貼壁，細胞形態一致，呈圓形和多角形。經分離純化的第 3 代大鼠髓核細胞 HE 染色后細胞質呈淡粉色，細胞核呈藍黑色；Ⅱ型膠原酶免疫熒光染色為陽性[10]。見圖 1。
圖1
大鼠髓核細胞形態學觀察及鑒定
a. 原代髓核細胞（×100）；b. 第 3 代細胞 HE 染色觀察（×40）；c. 第 3 代細胞Ⅱ型膠原酶免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×40）
Figure1. Morphological observation and identification of rat nucleus pulposus cellsa. Primary nucleus pulposus cells (×100); b. HE staining of the 3rd generation cells (×40); c. Collagenase type Ⅱ immunofluorescence staining of the 3rd generation cells (Fluorescence microscope×40)
2.2 Western blot 檢測 HIF-1α 與自噬相關分子蛋白表達
B 組 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α、Beclin1 蛋白相對表達量均顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組各蛋白相對表達量均較 B 組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；D 組 HIF-1α 蛋白相對表達量與 B 組比較差異無統計學意義（P>0.05），Beclin1 和 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量較 B 組顯著降低（P<0.05）。見圖 2 及表 2。
圖2
Western blot 檢測各組大鼠髓核細胞中 HIF-1α 與自噬相關分子蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：A 組 2：B 組3：C 組 4：D 組
Figure2. HIF-1α and autophagy related molecules expressions in rat nucleus pulposus cells of each group detected by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
表2
Western blot 檢測各組 HIF-1α 與自噬相關分子蛋白相對表達量（n=3，）
Table2.
The relative protein expressions of HIF-1α and autophagy related molecules in each group detected by Western blot (n=3, )
2.3 qRT-PCR 檢測 HIF-1α 與自噬相關分子 mRNA 表達
B 組 LC3-Ⅱ、HIF-1α、Beclin1 mRNA 相對表達量均顯著高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）。C 組 LC3-Ⅱ、HIF-1α、Beclin1 mRNA 相對表達量均較 B 組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）；D 組 HIF-1α mRNA 相對表達量與 B 組比較差異無統計學意義（P>0.05），Beclin1 和 LC3-Ⅱ mRNA 相對表達量均較 B 組顯著降低（P<0.05）。見表 3。
表3
qRT-PCR 檢測各組 HIF-1α 與自噬相關分子 mRNA 相對表達量（n=3，）
Table3.
The relative mRNA expressions of HIF-1α and autophagy related molecules in each group detected by qRT-PCR (n=3, )
3 討論
腰椎間盤突出癥是臨床常見病及多發病，嚴重影響患者日常生活質量，甚至致殘[11]。導致腰椎間盤突出癥的最主要原因是腰椎間盤退行性變，在退變過程中椎間盤血供會進一步減少，造成髓核細胞處于缺血缺氧狀態。缺血缺氧的髓核細胞會啟動一系列分子機制以提高對缺氧環境的耐受力，減少髓核細胞死亡。研究表明[12]，缺氧條件下腫瘤相關成纖維細胞的 HIF-1α 表達會上升，并通過 Beclin1 途徑誘導自噬，從而保護細胞。而髓核細胞中是否存在相同分子機制，以及二者是否存在相關性尚未明確。
HIF-1α 是一種廣泛存在于哺乳動物細胞內的轉錄因子，其功能包括紅細胞和血管的生成、細胞的增殖和凋亡等多個方面[13]。當組織處于缺氧狀態時，HIF-1α 能夠發揮基因調控和轉錄作用，促進血管生成，以提高組織對于缺氧環境的耐受力。因此，本研究通過檢測 HIF-1α 的表達來衡量髓核細胞的缺氧程度。
1962 年，Ashford 和 Porter 發現細胞內有“自己吃自己”的現象并提出“自噬”觀點[14]，即從粗面內質網無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分細胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解所包裹的內容物，以實現細胞代謝需要和某些細胞器的更新過程。自噬相關分子主要有 Beclin1、LC3B，其中后者常作為衡量自噬發生的關鍵性指標[15]。
本研究中，首先在常氧和缺氧狀態下分別培養正常髓核細胞 8 h，結果發現缺氧狀態下大鼠髓核細胞中的 HIF-1α、Beclin1 表達量較常氧狀態明顯上升，且 LC3B 表達量明顯增高。然后，利用 HIF-1α-siRNA 沉默大鼠髓核細胞 HIF-1α[16]，驗證其是否參與缺氧條件下的自噬。C 組細胞在缺氧條件下培養 8 h 后，HIF-1α 表達量較 B 組明顯下降，自噬相關分子 Beclin1 和 LC3B 表達量亦明顯下降，提示 HIF-1α-siRNA 能夠降低 HIF-1α 的表達，并且下調的 HIF-1α 能夠降低自噬相關分子的表達，說明 HIF-1α 參與了缺氧條件下自噬的相關調控。為了驗證自噬是否逆向參與調控 HIF-1α 的表達，進一步在正常髓核細胞中加入自噬抑制劑 3-MA，同樣在缺氧條件下培養 8 h，發現 HIF-1α 正常表達且與 B 組缺氧條件下培養正常髓核細胞相當，而自噬相關分子 Beclin1 和 LC3B 的表達量較 B 組明顯下降，可見自噬抑制劑能夠明顯降低自噬水平，且自噬相關分子表達的降低對于 HIF-1α 的表達無明顯影響。
綜上述，缺氧條件能夠誘導大鼠髓核細胞中 HIF-1α 和自噬相關分子 Beclin1 和 LC3B 的表達，且 HIF-1α 與自噬相關分子的表達具有相關性，即 HIF-1α 下調能夠降低自噬相關分子的表達。而缺氧條件下自噬水平的下調對 HIF-1α 的表達無明顯影響。研究表明[17]，HIF-1α 能夠通過促進血管新生，提高髓核細胞對缺氧環境的耐受能力；而細胞自噬是通過溶酶體分解衰老、受損或者死亡的細胞，從而為正常細胞的生存提供營養物質。結合本研究結果提示二者對缺氧狀態下髓核細胞的保護具有協同作用。本研究在細胞水平驗證了缺氧狀態下，髓核細胞中 HIF-1α 與自噬相關分子表達明顯上升，且二者具有相關性，為進一步探索二者對于髓核細胞保護中協同作用的分子機制，從而為脊髓損傷等造成髓核細胞缺血缺氧類疾病的治療提供一定理論支持[18-19]。
作者貢獻：程傲參與實驗設計及實施、數據收集、統計分析和文章撰寫；何鵬杰、張俊宇參與實驗設計及數據統計分析；鄭偉偉參與實驗數據分析、文章修改；楊民參與實驗設計、實驗數據整理，文章的思路設計及修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：實驗方案經皖南醫學院附屬弋磯山醫院實驗動物倫理委員會批準。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2017-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2018-004。
