引用本文： 石坤, 黃勇, 黃雷震, 王競成, 王玨翰, 豐干鈞, 劉立岷, 宋躍明. 水凝膠再生修復退變椎間盤的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(3): 275-284. doi: 10.7507/1002-1892.201907092 復制
現代社會中，下腰痛發病率逐年上升，其造成的健康生命年數下降程度顯著大于其他疾病[1]，是致殘的主要原因，也給全球帶來了極大經濟負擔[2]。下腰痛病因復雜，組織學和影像學資料提示其與腰椎間盤退變有關[3]。腰椎間盤退變的常見治療方法主要分為保守治療和手術治療。保守治療包括臥床休息、非甾體類抗炎藥物、鎮痛、物理治療，可在一定程度上緩解疼痛癥狀，但無法阻止椎間盤退變的進展，且作用效果及持續時間有限，部分甚至根本無法緩解癥狀[4-5]。保守治療無效時，手術治療成為首選。手術治療主要包括椎間盤切除、減壓、脊柱融合、椎間盤置換手術[6]。對于癥狀及體征典型、影像學改變明顯的患者，術后通常可獲得較滿意結果，但手術存在高侵入性、復發、活動度下降和鄰近節段退變的風險[7]。由于保守與手術治療的局限性以及對椎間盤退變病理生理的了解逐漸深入，基于生物材料的生物學治療方法給椎間盤退變帶來了新希望[8]。在種類繁多的生物材料中，水凝膠是一類具有三維網絡結構的聚合物，因其具有吸水溶脹、壓縮、良好的生物相容性等特征，成為目前研究椎間盤置換、修復和再生治療的熱點[9]。本文將對水凝膠在退變椎間盤髓核組織再生修復的研究現狀進行綜述。
1 椎間盤結構及椎間盤退變病理生理
椎間盤位于相鄰椎體之間，由中央髓核、外層纖維環及軟骨終板構成[10]。髓核位于相鄰軟骨終板之間，構成了椎間盤的凝膠狀核心。髓核組織主要由Ⅱ型膠原及蛋白聚糖構成，其內部結構的親水性可保證正常椎間盤內的含水量及滲透壓力，維持椎間盤的形態和靜水壓力[11]。纖維環由大量高度定向膠原纖維構成，這些膠原纖維交替形成板層狀結構。纖維環組織富含Ⅰ型膠原，可分為內、外兩層纖維環組織[12]，可抵抗由中央髓核以及脊柱屈伸及側向彎曲時產生的高強度壓力。軟骨終板由透明軟骨構成，是維持椎間盤完整性以及分隔椎間盤血管化組織與非血管化組織的關鍵。椎間盤絕大部分營養是由椎體通過軟骨終板從而進入椎間盤內。椎間盤的主要功能有[13]：承受身體質量及抵抗壓力，維持椎體活動度，連接相鄰椎體。纖維環組織和髓核組織幾乎無血供，細胞數量及代謝均較低，主要通過外層纖維環和軟骨終板毛細血管的擴散供應氧氣和其他營養[14-15]，因此椎間盤退變后難以通過自身達到再生及修復。
椎間盤退變的病理生理機制仍處于爭論中，取決于多種因素，包括年齡、機械負荷、營養供應、吸煙、代謝、激素、基因等[16-23]。椎間盤內穩態失衡作為退變的關鍵點，伴隨著髓核細胞的減少及細胞外基質組分改變。終板鈣化阻礙了髓核細胞營養供應途徑，增加了組織內代謝物積累及促炎因子如 IL-6、TNF-α 的產生，也增加了基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和聚蛋白多糖酶的表達及機械負荷，最終導致髓核細胞表型改變、衰老和凋亡，細胞外基質分解代謝增強，合成減少。同時，由于 IL-6、IL-8、前列腺素 E2 等炎癥因子表達增加，可刺激神經和血管形成，從而與椎間盤源性疼痛有關[24-26]。椎間盤退變涉及的細胞分子信號通路廣泛，包括：AKT3、PI3K、NF-κB、MAPK、ERK、Wnt、Notch 等[27-34]。臨床影像學上，椎間盤退變表現為椎間盤組織 MRI 信號減弱，椎間隙狹窄，軟骨終板不規則及硬化，椎間盤環形突出及椎體骨贅形成，導致運動功能障礙及疼痛[35]。
2 生物材料對椎間盤退變的再生及修復
由于認識到髓核組織退變對于椎間盤退變的重要性，目前針對椎間盤退變再生及修復的生物學治療研究也大多從髓核再生和修復著手開展。生物材料在椎間盤修復及再生中扮演重要角色，用于椎間盤髓核組織再生和修復的生物材料應具有以下特性：① 良好的力學性能及可塑性，可以恢復椎間隙高度，承受機械負載并維持脊柱活動度；② 良好的生物相容性，對自身組織或外源細胞無明顯毒害作用；③ 生物可降解性，可以隨組織代謝，并與組織再生速率相匹配。另外，生物材料及其可降解產物不應惡化退變椎間盤中的微環境——低氧、低營養、酸性 pH、高機械負荷、高滲透壓、復雜的蛋白酶及細胞因子網絡[35-38]。
生物材料修復髓核的主要目的是：① 支持剩余細胞或外源性細胞的存活；② 促進椎間盤細胞外基質的形成和沉積；③ 減少病理性纖維化；④ 減少炎癥；⑤ 提高脊柱穩定性[36]。水凝膠作為一種生物材料，其固有的親水性使其具有吸水膨脹及水化的特點，易于修飾，可體現出與不同生物組織相類似的機械和潤滑性質，其可注射及可交聯性質使其易于設計和操作，可具有微創修復軟骨損傷的能力；此外還可均勻包裹細胞、傳遞生物分子及藥物等優點[39]，因此被廣泛應用于椎間盤髓核組織的再生修復。
3 水凝膠的分類
水凝膠的制備包括兩種交聯方式，分別是物理交聯（通過疏水作用、氫鍵、靜電力等）及化學交聯（通過共價鍵）。根據水凝膠的來源，用于椎間盤髓核再生及修復的水凝膠可分為天然、合成及復合水凝膠三大類。天然材料包括絲素蛋白[40]、纖維蛋白[41]、藻酸鹽[42]、膠原[43]、透明質酸[44]、殼聚糖[45]等，天然材料如Ⅱ型膠原及透明質酸，本身即是構成椎間盤細胞外基質的組分，故在生物相容性及低細胞毒性方面具有較大優勢，從而在髓核再生修復中被廣泛利用[46-47]。合成材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨酯、聚三亞甲基碳酸酯、聚己內酯、聚乙二醇、聚乳酸-乙醇酸共聚物等[48-50]，相比于天然材料，合成材料的優點在于可控性強、易于設計，且具有良好的機械力學性能，在纖維環的再生修復中應用也較多[51-52]，然而其缺點在于生物相容性較差。復合水凝膠即基于天然材料與合成材料的聯合，如纖維蛋白-聚氨酯水凝膠[53]、透明質酸-聚乙二醇水凝膠[54]等。復合水凝膠可保留天然和合成材料的優點，即良好的力學性能和生物相容性，是未來研究椎間盤再生修復及置換的重要方向。
4 水凝膠在椎間盤髓核組織再生修復中的應用
水凝膠可以多種形式直接或間接參與椎間盤髓核組織的再生修復及置換，主要有人工髓核假體、細胞為基礎的生物治療、非細胞治療（生物因子、藥物及基因治療）。
4.1 人工髓核假體
人工髓核假體治療退變椎間盤具有相對較長的一段歷史，其目的主要在于恢復椎間盤力學特性（如椎間隙高度及脊柱局部活動性），而對于生物學特性（如椎間盤細胞的生長、分化、信號轉導等）少有要求。在假體材料方面，早期人們嘗試使用硅橡膠、不銹鋼球體，最終由于其生物力學特性較低或金屬材料硬度過大等問題被淘汰。水凝膠由于與髓核組織具有相似的生理功能，可根據所載負荷吸收和釋放水分而被廣泛應用。根據不同特性，水凝膠人工髓核假體可分為預制型和可注射型兩類。早在 20 世紀 90 年代中期 Raymedica 公司開發了 PDN 人工髓核假體，由聚丙烯腈-聚丙烯酰胺共聚物組成的水凝膠內核及聚乙烯纖維外層構成，具有良好的力學特性，可在一定程度上恢復脊柱運動功能和緩解疼痛癥狀，作為經典的預制型人工髓核假體被應用于臨床[55]。但通過長期臨床隨訪發現，該假體術后可發生一些并發癥，如假體移位、終板破裂、下腰部疼痛等，限制了其臨床有效性[56]。其他預制型人工髓核假體還有 Aqarelle 假體[57]（由半脫水的聚乙烯醇凝膠構成），體現出良好的生物相容性，但擠壓突出事件發生率較高。可注射型人工髓核假體是指將水凝膠材料注入椎間隙，通過聚合反應而成型，與髓核間隙相匹配，如蛋白水凝膠材料 BioSic 假體[58]。可注射型人工髓核假體的優點在于可微創操作性，可與髓核空腔良好適配；但同時也存在水凝膠泄露、聚合過程中發生熱損傷等風險。因此，人工髓核假體只能從空間上替換髓核，而不能達到再生和修復作用，且一系列并發癥的發生限制了其應用。但隨著材料學的發展，人工髓核假體也將具有一定的發展前景。
4.2 以水凝膠為載體的細胞治療策略
基于對椎間盤退變病理生理的理解，以細胞為基礎的椎間盤細胞治療和組織工程再生修復方法近年來受到廣泛關注。目前可供選擇的細胞類型主要有髓核細胞[59]、脊索細胞、軟骨細胞、MSCs、誘導多功能干細胞、胚胎干細胞等，以 MSCs 應用于椎間盤再生修復最為廣泛。細胞治療的主要目的是：① 通過補充髓核樣細胞或其他細胞最終分化成髓核樣細胞，恢復已經改變的椎間盤細胞外基質；② 利用細胞補充營養或具有抗炎作用[60]；③ 恢復椎間盤的生物力學功能。而以水凝膠為載體或支架負載細胞可以降低細胞外泄，并提供一定的機械強度，不同水凝膠材料還可對負載細胞提供良好的生長環境，為細胞治療和椎間盤再生修復組織工程提供可能。
由天然材料組成的水凝膠在椎間盤髓核組織退變的再生修復中應用非常廣泛。Wang 等[61]使用藻酸鹽水凝膠分別包裹分離的 BMSCs、軟骨終板干細胞、纖維環干細胞及髓核干細胞，注入已建立的兔椎間盤退變模型，通過 MRI、X 線片及組織學觀察等檢測，發現載細胞水凝膠均不同程度地修復了退變髓核組織；有趣的是，軟骨終板干細胞卻體現出了最佳修復效果。有研究發現，透明質酸水凝膠具有抗炎、抑制免疫及促進血管生成的作用[62]。但 Henriksson 等[63]通過體內、外實驗證明，透明質酸水凝膠盡管在體外實驗中體現出最佳的促細胞增殖性質，但其可能不能作為一個良好的椎間盤再生修復細胞載體選擇。Halloran 等[64]測試了以去端肽膠原蛋白Ⅱ為基礎，并加入不同濃度聚蛋白多糖和透明質酸的水凝膠支架對牛髓核細胞的影響，結果發現這種水凝膠支架可以維持細胞活性，并促進基質蛋白多糖的合成。合成材料水凝膠也廣泛應用于椎間盤髓核組織的再生修復，有研究報道層粘連蛋白-髓核細胞間相互作用可促進細胞黏附和生物合成[65]。Francisco 等[66]將未成熟的豬髓核細胞種植于聚乙二醇-層粘連蛋白水凝膠，發現其可促進髓核細胞聚集及糖胺多糖的合成，并通過比對不同硬度的此類水凝膠，表明柔性化水凝膠可促進髓核細胞表型的維持以及特異性標記物如細胞角蛋白 8、整合素 α3 的表達。Wan 等[67]構建了一種新的自組裝肽水凝膠（self-assembling peptide hydrogel，SAPH），擁有良好的生物相容性及機械性能，在對髓核細胞的三維培養中發現，SAPH 水凝膠可促進髓核細胞Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，上調髓核特異基因（KRT8、KRT18、FOXF1）的表達。Tao 等[68]設計了一種包含 BMP-7 短基序的功能自組裝肽水凝膠（RADA16-Ⅰ-KPSS peptide），其包含 KPSS（來源于 BMP-7 中一段生物活性序列）和 RADA16-Ⅰ短肽，實驗證明其在用于培養人退變髓核細胞中體現了良好的黏附性、低細胞毒性及促細胞增殖遷移能力，促進了髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白、Sox-9、蛋白聚糖的生成。Kumar 等[69]研究了一種包含氨丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羥乙酯及聚丙烯酸的可注射型紫外光固化水凝膠培養人 BMSCs，在低氧及機械刺激條件下，可促進人 BMSCs 向髓核細胞表型分化，以及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的合成。還有其他各種水凝膠材料包裹髓核細胞，達到了促進細胞外基質生成、維持髓核細胞表型、恢復椎間隙高度的良好結果[65, 70-71]。
由于普通水凝膠大部分面臨著強度較低的問題，如何在保證水凝膠生物相容性的情況下提高其強度顯得尤為重要。目前可引入拓撲結構、納米結構、互穿網絡結構來提高水凝膠強度。Gan 等[72]評估了一種用于髓核再生的互穿網絡水凝膠（interpenetrating network hydrogel，IPN），以葡聚糖和明膠為主要網絡，聚乙二醇為次要網絡，在兩者比例為 4∶1 情況下，該水凝膠展現出極高的韌性，而包裹于其中的髓核細胞增殖、聚集及基質沉積明顯增加。在動物實驗中，該水凝膠可以維持大鼠椎間盤細胞長期存活，也促進了豬退變髓核組織的水化和再生。Nair 等[73]驗證了一種復合水凝膠，由殼聚糖-聚羥基丁酸酯與硫酸軟骨素納米顆粒組成，其吸水性及黏彈性均與原生組織相似，可在動態條件下承受與日常活動（如躺、坐、站）相對應的不同應力；還能促進大鼠脂肪來源干細胞的存活和黏附，在硫酸軟骨素納米顆粒的存在下，BMSCs 的存活能力和軟骨分化能力也顯著增強。因此，納米結構水凝膠也為髓核組織工程提供了巨大潛力。Ligorio 等[74]使用氧化石墨烯作為納米填充物強化 β-折疊自組裝肽形成自組裝多肽水凝膠，具有與髓核相似的機械性能，在髓核細胞培養過程中發現其可促進細胞的存活和保持細胞的 3D 代謝活性，作為一種可注射型水凝膠支架具有在體內傳遞髓核細胞的巨大潛力。
4.3 以水凝膠為載體的非細胞治療
除細胞治療外，水凝膠生物材料作為載體還廣泛參與椎間盤髓核組織的非細胞再生修復治療，如藥物、生長因子和基因治療等。
Bertolo 等[75]使用藻酸鹽水凝膠微球測試了 3 種藥物（地塞米松、甲狀腺素、胰島素）及 TGF-β1 對椎間盤細胞的影響，結果顯示地塞米松及 TGF-β1 可增加椎間盤細胞糖胺聚糖的合成，地塞米松還顯示出了促細胞增殖的作用。Su 等[76]研究發現一種可注射的氧化透明質酸/己二酸二酰肼水凝膠可修復退變髓核，促進髓核Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，體現出良好的生物相容性。阿魏酸目前被證實具有良好的抗氧化性能。Cheng 等[77]構建了一種可注射熱敏殼聚糖/明膠/磷酸甘油水凝膠，作為阿魏酸的可持續釋放體系。在用其處理 H2O2 誘導的氧化應激髓核細胞后，蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達上調，MMP-3 表達下調。揭示了該水凝膠可作為椎間盤退變的早期治療手段。Pan 等[78]研究發現一種可持續釋放吉非替尼的控釋注射熱敏水凝膠，在小鼠退變椎間盤內可以發揮促進髓核細胞細胞外基質產生，而減少 MMP-13 表達的作用。近年研究發現了一種擁有極強促軟骨分化能力的新的小分子化合物 KGN（kartogenin），能有效促進 MSCs 向軟骨細胞分化[79]。Zhu 等[80]設計了一種 KGN 偶聯殼聚糖-透明質酸水凝膠，可在水凝膠中持續釋放 KGN，具有良好的力學性能，以及較好的促進脂肪來源干細胞增殖和向髓核細胞分化的作用。提示這種水凝膠可能是一種簡單、有效的修復微創手術后退行性髓核組織的候選材料。
生物活性因子可通過旁分泌或自分泌等方式促進椎間盤細胞外基質分泌和細胞代謝，可改善椎間盤微環境并維持細胞的正常生理過程[81]。常用于椎間盤退變再生修復治療的生物活性因子有生長分化因子（growth differentiation factor，GDF）、BMP、TGF-β、FGF、IGF、富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）、PGDF 等，且在不同研究中顯示了其促進椎間盤細胞增殖和基質合成，恢復椎間隙高度的作用[82]。Henry 等[83]建立了一種新的雙相可注射水凝膠系統，由支鏈淀粉微球（pullulan microbeads，PMBs）和硅烷化羥丙基甲基纖維素水凝膠（silanized hydroxypropyl methylcellulose，Si-HPMC）聯合制成（PMBs/Si-HPMC），可作為持續釋放 TGF-β1 和 GDF-5 的載體，兩種因子在被釋放后仍可保持其生物活性，該 PMBs/Si-HPMC 雙相系統有望成為椎間盤再生醫學生物活性傳遞系統的發展方向。Gan 等[72]構建了以聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒作為 TGF-β3 控釋載體的右旋糖酐/明膠水凝膠，表現出良好的細胞相容性，可誘導 MSCs 向髓核樣細胞分化，同時促進細胞外基質的合成。Peeters 等[84]發現包含了 BMP-2、7 異質二聚體的纖維素-透明質酸水凝膠，可上調髓核細胞蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因的表達及糖胺聚糖的合成。Ehlicke 等[85]利用水凝膠載體探討了各種生長因子誘導人 MSCs 向髓核細胞分化的潛力，結果表明 IGF-1、FGF-2 和 PDGF-BB 可負載于水凝膠中，并促進人 BMSCs 向髓核細胞分化，保持增殖能力及活性。PRP/透明質酸/巴曲酶水凝膠也可提高 MSCs 的存活和增殖能力，并促進向軟骨細胞樣細胞的分化[86]。
隨著基因測序技術的不斷發展，通過對退變髓核組織的差異基因表達分析，不斷發現了與椎間盤退變和再生修復相關的基因，由此為基因治療拉開了序幕。Bucher 等[87]在一項研究中以藻酸鹽水凝膠作為載體，將 GDF-5 mRNA 轉染入 MSCs，發現經轉染的 MSCs 在藻酸鹽水凝膠培養中上調了蛋白多糖、SOX-9、角蛋白 19 表達，表明了水凝膠在基因治療中的輔助作用。微小 RNA-29（microRNA-29，miR-29）家族具有較強的纖維化抑制能力，但由于缺乏合適的局部遞送系統，限制了它們在治療椎間盤退變方面的應用。我們課題組[88]前期采用聚乙二醇和聚 N-異丙基丙烯酰胺制備熱反應性多相冠狀聚離子膠束水凝膠，通過該體系遞送亞鐵血紅素加氧酶基因，可以減輕白介素引起的炎癥反應，促進蛋白多糖表達，促進椎間盤再生。該載體可以作為一種安全高效的非病毒載體，用于椎間盤退變的基因治療。在前期工作基礎上，我們對水凝膠遞送基因條件進行了進一步改進，可自動感受環境中的 MMP 濃度，并根據 MMP 濃度智能按需釋放 miR-29，從而抑制 MMP-2 的表達，抑制椎間盤纖維化過程，為椎間盤退變的治療提供了新方法[89]。Zhu 等[90]利用編碼 4 個轉錄因子的仙臺病毒載體，使得原始髓核細胞重新編程成為人類誘導性多能干細胞，將其在培養板和水凝膠中培養進行比較，發現髓核來源的人類誘導性多能干細胞在水凝膠中比在培養板中能更好地分化成髓核樣細胞。近年來，一些環狀 RNA（circular RNA，circRNA） 被證實富含 miRNA 的結合位點，并作為競爭性內源性 RNA 與 miRNA 相互作用，從而影響靶 mRNA 的表達，最終調控病理生理過程[91-93]。circRNA 在椎間盤退變髓核組織的差異性表達也逐漸受到人們關注。多個研究顯示，circRNA 能作為 miRNA 的分子海綿，抑制其表達或功能，最終促進或減緩椎間盤組織的退變過程[94-96]。水凝膠包裹轉錄相關 circRNA 也將為椎間盤退變及修復再生提供新方向。
4.4 基于水凝膠的組織工程修復策略
由于椎間盤組織由髓核和纖維環兩部分構成，集髓核、纖維環為一體的水凝膠組織工程修復更符合椎間盤生理結構，也正廣泛處于研究和嘗試中。
Du 等[97]構建了一種以負載兔髓核細胞的海藻酸鹽水凝膠為內核、負載兔纖維環細胞的環向聚己內酯（polycaprolactone，PCL）微纖維支架為外環的仿生復合支架，髓核細胞和纖維環細胞可在支架內均勻擴散和定植，與天然椎間盤組織類似，移植入小鼠體內后，該支架可展現細胞外基質的沉積，體現了良好的力學性能。Bowles 等[98]建立了藻酸鹽水凝膠-膠原纖維復合支架，并將其植入大鼠尾椎，展示出良好的生物相容性和類似天然椎間盤的動態力學性能，還可維持椎間隙高度，為退行性椎間盤疾病的生物療法提供重要方向。Park 等[99]設計了纖維蛋白/透明質酸水凝膠-蠶絲蛋白雙相支架，包裹豬纖維細胞及軟骨細胞，通過體外組織細胞共培養，最終可有效形成完整的椎間盤組織。Gloria 等[100]設計了一種聚 2-羥乙基甲基丙烯酸酯/聚甲基丙烯酸甲酯半互穿網絡復合水凝膠，以聚對苯二甲酸乙二酯纖維作為纖維環的替代物，體現了良好的力學特性。Martin 等[101]構建的復合生物支架其髓核區域由透明質酸水凝膠構成，纖維環區域由 PCL 層及可吸收的聚乳酸-羥基乙酸層組成，移植入大鼠尾椎后，體現出與運動節段相匹配的抗壓力學性能。目前髓核-纖維環復合支架仍無法達到與天然椎間盤組織一致的機械力學特性和生物學特性，而且移植入動物體內后，也將面臨誘導椎間融合的風險，是未來椎間盤組織工程的發展方向。
水凝膠再生修復退變椎間盤的應用類型見表 1。
表1
水凝膠再生修復退變椎間盤的應用
Table1.
Application of hydrogel in regeneration of nucleus pulposus in intervertebral disc degeneration
5 問題與展望
水凝膠生物材料在椎間盤髓核再生、修復和置換中扮演了重要角色。盡管目前水凝膠在椎間盤退變細胞治療及組織工程治療方面已取得較大進展，但仍主要停留在細胞及動物實驗階段，對于應用于臨床還存在一段距離。水凝膠作為髓核再生修復的生物材料，理想要求是既擁有良好的機械特性，可以恢復椎間隙高度及承受身體負荷，又對椎間盤細胞的增殖、分化、信號傳導具有積極作用，與周圍組織良好嵌合且無毒害作用。所以，與正常髓核組織相似的良好生物相容性及機械特性，仍然是未來水凝膠材料發展的方向。可注射水凝膠在穿刺進入椎間盤組織內時，不可避免會造成纖維環組織完整性受損，可能引起椎間盤退變。因此，如何安全準確地遞送水凝膠生物材料也成為待解決的問題。如前所述，椎間盤組織具有復雜的微環境，如低氧、酸性及不同應力環境等，未來針對退變椎間盤組織的微環境刺激響應性水凝膠也具有良好的發展前景。最后，目前研究生物材料對椎間盤退變的再生修復作用很少與疼痛緩解建立聯系，但在臨床中疼痛緩解才是患者最關注的問題。所以，建立椎間盤源性疼痛動物模型以及良好的評判標準，對今后應用于臨床也非常重要。
作者貢獻：石坤負責綜述題目構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改；豐干鈞及宋躍明負責綜述立題、構思建議，文章初稿的全篇修改；劉立岷負責綜述構思建議；黃勇、黃雷震、王競成、王玨翰協助題目構思及觀點形成。
利益沖突：所有作者均聲明，本課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點。
現代社會中，下腰痛發病率逐年上升，其造成的健康生命年數下降程度顯著大于其他疾病[1]，是致殘的主要原因，也給全球帶來了極大經濟負擔[2]。下腰痛病因復雜，組織學和影像學資料提示其與腰椎間盤退變有關[3]。腰椎間盤退變的常見治療方法主要分為保守治療和手術治療。保守治療包括臥床休息、非甾體類抗炎藥物、鎮痛、物理治療，可在一定程度上緩解疼痛癥狀，但無法阻止椎間盤退變的進展，且作用效果及持續時間有限，部分甚至根本無法緩解癥狀[4-5]。保守治療無效時，手術治療成為首選。手術治療主要包括椎間盤切除、減壓、脊柱融合、椎間盤置換手術[6]。對于癥狀及體征典型、影像學改變明顯的患者，術后通常可獲得較滿意結果，但手術存在高侵入性、復發、活動度下降和鄰近節段退變的風險[7]。由于保守與手術治療的局限性以及對椎間盤退變病理生理的了解逐漸深入，基于生物材料的生物學治療方法給椎間盤退變帶來了新希望[8]。在種類繁多的生物材料中，水凝膠是一類具有三維網絡結構的聚合物，因其具有吸水溶脹、壓縮、良好的生物相容性等特征，成為目前研究椎間盤置換、修復和再生治療的熱點[9]。本文將對水凝膠在退變椎間盤髓核組織再生修復的研究現狀進行綜述。
1 椎間盤結構及椎間盤退變病理生理
椎間盤位于相鄰椎體之間，由中央髓核、外層纖維環及軟骨終板構成[10]。髓核位于相鄰軟骨終板之間，構成了椎間盤的凝膠狀核心。髓核組織主要由Ⅱ型膠原及蛋白聚糖構成，其內部結構的親水性可保證正常椎間盤內的含水量及滲透壓力，維持椎間盤的形態和靜水壓力[11]。纖維環由大量高度定向膠原纖維構成，這些膠原纖維交替形成板層狀結構。纖維環組織富含Ⅰ型膠原，可分為內、外兩層纖維環組織[12]，可抵抗由中央髓核以及脊柱屈伸及側向彎曲時產生的高強度壓力。軟骨終板由透明軟骨構成，是維持椎間盤完整性以及分隔椎間盤血管化組織與非血管化組織的關鍵。椎間盤絕大部分營養是由椎體通過軟骨終板從而進入椎間盤內。椎間盤的主要功能有[13]：承受身體質量及抵抗壓力，維持椎體活動度，連接相鄰椎體。纖維環組織和髓核組織幾乎無血供，細胞數量及代謝均較低，主要通過外層纖維環和軟骨終板毛細血管的擴散供應氧氣和其他營養[14-15]，因此椎間盤退變后難以通過自身達到再生及修復。
椎間盤退變的病理生理機制仍處于爭論中，取決于多種因素，包括年齡、機械負荷、營養供應、吸煙、代謝、激素、基因等[16-23]。椎間盤內穩態失衡作為退變的關鍵點，伴隨著髓核細胞的減少及細胞外基質組分改變。終板鈣化阻礙了髓核細胞營養供應途徑，增加了組織內代謝物積累及促炎因子如 IL-6、TNF-α 的產生，也增加了基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和聚蛋白多糖酶的表達及機械負荷，最終導致髓核細胞表型改變、衰老和凋亡，細胞外基質分解代謝增強，合成減少。同時，由于 IL-6、IL-8、前列腺素 E2 等炎癥因子表達增加，可刺激神經和血管形成，從而與椎間盤源性疼痛有關[24-26]。椎間盤退變涉及的細胞分子信號通路廣泛，包括：AKT3、PI3K、NF-κB、MAPK、ERK、Wnt、Notch 等[27-34]。臨床影像學上，椎間盤退變表現為椎間盤組織 MRI 信號減弱，椎間隙狹窄，軟骨終板不規則及硬化，椎間盤環形突出及椎體骨贅形成，導致運動功能障礙及疼痛[35]。
2 生物材料對椎間盤退變的再生及修復
由于認識到髓核組織退變對于椎間盤退變的重要性，目前針對椎間盤退變再生及修復的生物學治療研究也大多從髓核再生和修復著手開展。生物材料在椎間盤修復及再生中扮演重要角色，用于椎間盤髓核組織再生和修復的生物材料應具有以下特性：① 良好的力學性能及可塑性，可以恢復椎間隙高度，承受機械負載并維持脊柱活動度；② 良好的生物相容性，對自身組織或外源細胞無明顯毒害作用；③ 生物可降解性，可以隨組織代謝，并與組織再生速率相匹配。另外，生物材料及其可降解產物不應惡化退變椎間盤中的微環境——低氧、低營養、酸性 pH、高機械負荷、高滲透壓、復雜的蛋白酶及細胞因子網絡[35-38]。
生物材料修復髓核的主要目的是：① 支持剩余細胞或外源性細胞的存活；② 促進椎間盤細胞外基質的形成和沉積；③ 減少病理性纖維化；④ 減少炎癥；⑤ 提高脊柱穩定性[36]。水凝膠作為一種生物材料，其固有的親水性使其具有吸水膨脹及水化的特點，易于修飾，可體現出與不同生物組織相類似的機械和潤滑性質，其可注射及可交聯性質使其易于設計和操作，可具有微創修復軟骨損傷的能力；此外還可均勻包裹細胞、傳遞生物分子及藥物等優點[39]，因此被廣泛應用于椎間盤髓核組織的再生修復。
3 水凝膠的分類
水凝膠的制備包括兩種交聯方式，分別是物理交聯（通過疏水作用、氫鍵、靜電力等）及化學交聯（通過共價鍵）。根據水凝膠的來源，用于椎間盤髓核再生及修復的水凝膠可分為天然、合成及復合水凝膠三大類。天然材料包括絲素蛋白[40]、纖維蛋白[41]、藻酸鹽[42]、膠原[43]、透明質酸[44]、殼聚糖[45]等，天然材料如Ⅱ型膠原及透明質酸，本身即是構成椎間盤細胞外基質的組分，故在生物相容性及低細胞毒性方面具有較大優勢，從而在髓核再生修復中被廣泛利用[46-47]。合成材料包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨酯、聚三亞甲基碳酸酯、聚己內酯、聚乙二醇、聚乳酸-乙醇酸共聚物等[48-50]，相比于天然材料，合成材料的優點在于可控性強、易于設計，且具有良好的機械力學性能，在纖維環的再生修復中應用也較多[51-52]，然而其缺點在于生物相容性較差。復合水凝膠即基于天然材料與合成材料的聯合，如纖維蛋白-聚氨酯水凝膠[53]、透明質酸-聚乙二醇水凝膠[54]等。復合水凝膠可保留天然和合成材料的優點，即良好的力學性能和生物相容性，是未來研究椎間盤再生修復及置換的重要方向。
4 水凝膠在椎間盤髓核組織再生修復中的應用
水凝膠可以多種形式直接或間接參與椎間盤髓核組織的再生修復及置換，主要有人工髓核假體、細胞為基礎的生物治療、非細胞治療（生物因子、藥物及基因治療）。
4.1 人工髓核假體
人工髓核假體治療退變椎間盤具有相對較長的一段歷史，其目的主要在于恢復椎間盤力學特性（如椎間隙高度及脊柱局部活動性），而對于生物學特性（如椎間盤細胞的生長、分化、信號轉導等）少有要求。在假體材料方面，早期人們嘗試使用硅橡膠、不銹鋼球體，最終由于其生物力學特性較低或金屬材料硬度過大等問題被淘汰。水凝膠由于與髓核組織具有相似的生理功能，可根據所載負荷吸收和釋放水分而被廣泛應用。根據不同特性，水凝膠人工髓核假體可分為預制型和可注射型兩類。早在 20 世紀 90 年代中期 Raymedica 公司開發了 PDN 人工髓核假體，由聚丙烯腈-聚丙烯酰胺共聚物組成的水凝膠內核及聚乙烯纖維外層構成，具有良好的力學特性，可在一定程度上恢復脊柱運動功能和緩解疼痛癥狀，作為經典的預制型人工髓核假體被應用于臨床[55]。但通過長期臨床隨訪發現，該假體術后可發生一些并發癥，如假體移位、終板破裂、下腰部疼痛等，限制了其臨床有效性[56]。其他預制型人工髓核假體還有 Aqarelle 假體[57]（由半脫水的聚乙烯醇凝膠構成），體現出良好的生物相容性，但擠壓突出事件發生率較高。可注射型人工髓核假體是指將水凝膠材料注入椎間隙，通過聚合反應而成型，與髓核間隙相匹配，如蛋白水凝膠材料 BioSic 假體[58]。可注射型人工髓核假體的優點在于可微創操作性，可與髓核空腔良好適配；但同時也存在水凝膠泄露、聚合過程中發生熱損傷等風險。因此，人工髓核假體只能從空間上替換髓核，而不能達到再生和修復作用，且一系列并發癥的發生限制了其應用。但隨著材料學的發展，人工髓核假體也將具有一定的發展前景。
4.2 以水凝膠為載體的細胞治療策略
基于對椎間盤退變病理生理的理解，以細胞為基礎的椎間盤細胞治療和組織工程再生修復方法近年來受到廣泛關注。目前可供選擇的細胞類型主要有髓核細胞[59]、脊索細胞、軟骨細胞、MSCs、誘導多功能干細胞、胚胎干細胞等，以 MSCs 應用于椎間盤再生修復最為廣泛。細胞治療的主要目的是：① 通過補充髓核樣細胞或其他細胞最終分化成髓核樣細胞，恢復已經改變的椎間盤細胞外基質；② 利用細胞補充營養或具有抗炎作用[60]；③ 恢復椎間盤的生物力學功能。而以水凝膠為載體或支架負載細胞可以降低細胞外泄，并提供一定的機械強度，不同水凝膠材料還可對負載細胞提供良好的生長環境，為細胞治療和椎間盤再生修復組織工程提供可能。
由天然材料組成的水凝膠在椎間盤髓核組織退變的再生修復中應用非常廣泛。Wang 等[61]使用藻酸鹽水凝膠分別包裹分離的 BMSCs、軟骨終板干細胞、纖維環干細胞及髓核干細胞，注入已建立的兔椎間盤退變模型，通過 MRI、X 線片及組織學觀察等檢測，發現載細胞水凝膠均不同程度地修復了退變髓核組織；有趣的是，軟骨終板干細胞卻體現出了最佳修復效果。有研究發現，透明質酸水凝膠具有抗炎、抑制免疫及促進血管生成的作用[62]。但 Henriksson 等[63]通過體內、外實驗證明，透明質酸水凝膠盡管在體外實驗中體現出最佳的促細胞增殖性質，但其可能不能作為一個良好的椎間盤再生修復細胞載體選擇。Halloran 等[64]測試了以去端肽膠原蛋白Ⅱ為基礎，并加入不同濃度聚蛋白多糖和透明質酸的水凝膠支架對牛髓核細胞的影響，結果發現這種水凝膠支架可以維持細胞活性，并促進基質蛋白多糖的合成。合成材料水凝膠也廣泛應用于椎間盤髓核組織的再生修復，有研究報道層粘連蛋白-髓核細胞間相互作用可促進細胞黏附和生物合成[65]。Francisco 等[66]將未成熟的豬髓核細胞種植于聚乙二醇-層粘連蛋白水凝膠，發現其可促進髓核細胞聚集及糖胺多糖的合成，并通過比對不同硬度的此類水凝膠，表明柔性化水凝膠可促進髓核細胞表型的維持以及特異性標記物如細胞角蛋白 8、整合素 α3 的表達。Wan 等[67]構建了一種新的自組裝肽水凝膠（self-assembling peptide hydrogel，SAPH），擁有良好的生物相容性及機械性能，在對髓核細胞的三維培養中發現，SAPH 水凝膠可促進髓核細胞Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，上調髓核特異基因（KRT8、KRT18、FOXF1）的表達。Tao 等[68]設計了一種包含 BMP-7 短基序的功能自組裝肽水凝膠（RADA16-Ⅰ-KPSS peptide），其包含 KPSS（來源于 BMP-7 中一段生物活性序列）和 RADA16-Ⅰ短肽，實驗證明其在用于培養人退變髓核細胞中體現了良好的黏附性、低細胞毒性及促細胞增殖遷移能力，促進了髓核細胞Ⅱ型膠原蛋白、Sox-9、蛋白聚糖的生成。Kumar 等[69]研究了一種包含氨丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羥乙酯及聚丙烯酸的可注射型紫外光固化水凝膠培養人 BMSCs，在低氧及機械刺激條件下，可促進人 BMSCs 向髓核細胞表型分化，以及蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的合成。還有其他各種水凝膠材料包裹髓核細胞，達到了促進細胞外基質生成、維持髓核細胞表型、恢復椎間隙高度的良好結果[65, 70-71]。
由于普通水凝膠大部分面臨著強度較低的問題，如何在保證水凝膠生物相容性的情況下提高其強度顯得尤為重要。目前可引入拓撲結構、納米結構、互穿網絡結構來提高水凝膠強度。Gan 等[72]評估了一種用于髓核再生的互穿網絡水凝膠（interpenetrating network hydrogel，IPN），以葡聚糖和明膠為主要網絡，聚乙二醇為次要網絡，在兩者比例為 4∶1 情況下，該水凝膠展現出極高的韌性，而包裹于其中的髓核細胞增殖、聚集及基質沉積明顯增加。在動物實驗中，該水凝膠可以維持大鼠椎間盤細胞長期存活，也促進了豬退變髓核組織的水化和再生。Nair 等[73]驗證了一種復合水凝膠，由殼聚糖-聚羥基丁酸酯與硫酸軟骨素納米顆粒組成，其吸水性及黏彈性均與原生組織相似，可在動態條件下承受與日常活動（如躺、坐、站）相對應的不同應力；還能促進大鼠脂肪來源干細胞的存活和黏附，在硫酸軟骨素納米顆粒的存在下，BMSCs 的存活能力和軟骨分化能力也顯著增強。因此，納米結構水凝膠也為髓核組織工程提供了巨大潛力。Ligorio 等[74]使用氧化石墨烯作為納米填充物強化 β-折疊自組裝肽形成自組裝多肽水凝膠，具有與髓核相似的機械性能，在髓核細胞培養過程中發現其可促進細胞的存活和保持細胞的 3D 代謝活性，作為一種可注射型水凝膠支架具有在體內傳遞髓核細胞的巨大潛力。
4.3 以水凝膠為載體的非細胞治療
除細胞治療外，水凝膠生物材料作為載體還廣泛參與椎間盤髓核組織的非細胞再生修復治療，如藥物、生長因子和基因治療等。
Bertolo 等[75]使用藻酸鹽水凝膠微球測試了 3 種藥物（地塞米松、甲狀腺素、胰島素）及 TGF-β1 對椎間盤細胞的影響，結果顯示地塞米松及 TGF-β1 可增加椎間盤細胞糖胺聚糖的合成，地塞米松還顯示出了促細胞增殖的作用。Su 等[76]研究發現一種可注射的氧化透明質酸/己二酸二酰肼水凝膠可修復退變髓核，促進髓核Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成，體現出良好的生物相容性。阿魏酸目前被證實具有良好的抗氧化性能。Cheng 等[77]構建了一種可注射熱敏殼聚糖/明膠/磷酸甘油水凝膠，作為阿魏酸的可持續釋放體系。在用其處理 H2O2 誘導的氧化應激髓核細胞后，蛋白聚糖和Ⅱ型膠原表達上調，MMP-3 表達下調。揭示了該水凝膠可作為椎間盤退變的早期治療手段。Pan 等[78]研究發現一種可持續釋放吉非替尼的控釋注射熱敏水凝膠，在小鼠退變椎間盤內可以發揮促進髓核細胞細胞外基質產生，而減少 MMP-13 表達的作用。近年研究發現了一種擁有極強促軟骨分化能力的新的小分子化合物 KGN（kartogenin），能有效促進 MSCs 向軟骨細胞分化[79]。Zhu 等[80]設計了一種 KGN 偶聯殼聚糖-透明質酸水凝膠，可在水凝膠中持續釋放 KGN，具有良好的力學性能，以及較好的促進脂肪來源干細胞增殖和向髓核細胞分化的作用。提示這種水凝膠可能是一種簡單、有效的修復微創手術后退行性髓核組織的候選材料。
生物活性因子可通過旁分泌或自分泌等方式促進椎間盤細胞外基質分泌和細胞代謝，可改善椎間盤微環境并維持細胞的正常生理過程[81]。常用于椎間盤退變再生修復治療的生物活性因子有生長分化因子（growth differentiation factor，GDF）、BMP、TGF-β、FGF、IGF、富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）、PGDF 等，且在不同研究中顯示了其促進椎間盤細胞增殖和基質合成，恢復椎間隙高度的作用[82]。Henry 等[83]建立了一種新的雙相可注射水凝膠系統，由支鏈淀粉微球（pullulan microbeads，PMBs）和硅烷化羥丙基甲基纖維素水凝膠（silanized hydroxypropyl methylcellulose，Si-HPMC）聯合制成（PMBs/Si-HPMC），可作為持續釋放 TGF-β1 和 GDF-5 的載體，兩種因子在被釋放后仍可保持其生物活性，該 PMBs/Si-HPMC 雙相系統有望成為椎間盤再生醫學生物活性傳遞系統的發展方向。Gan 等[72]構建了以聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒作為 TGF-β3 控釋載體的右旋糖酐/明膠水凝膠，表現出良好的細胞相容性，可誘導 MSCs 向髓核樣細胞分化，同時促進細胞外基質的合成。Peeters 等[84]發現包含了 BMP-2、7 異質二聚體的纖維素-透明質酸水凝膠，可上調髓核細胞蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因的表達及糖胺聚糖的合成。Ehlicke 等[85]利用水凝膠載體探討了各種生長因子誘導人 MSCs 向髓核細胞分化的潛力，結果表明 IGF-1、FGF-2 和 PDGF-BB 可負載于水凝膠中，并促進人 BMSCs 向髓核細胞分化，保持增殖能力及活性。PRP/透明質酸/巴曲酶水凝膠也可提高 MSCs 的存活和增殖能力，并促進向軟骨細胞樣細胞的分化[86]。
隨著基因測序技術的不斷發展，通過對退變髓核組織的差異基因表達分析，不斷發現了與椎間盤退變和再生修復相關的基因，由此為基因治療拉開了序幕。Bucher 等[87]在一項研究中以藻酸鹽水凝膠作為載體，將 GDF-5 mRNA 轉染入 MSCs，發現經轉染的 MSCs 在藻酸鹽水凝膠培養中上調了蛋白多糖、SOX-9、角蛋白 19 表達，表明了水凝膠在基因治療中的輔助作用。微小 RNA-29（microRNA-29，miR-29）家族具有較強的纖維化抑制能力，但由于缺乏合適的局部遞送系統，限制了它們在治療椎間盤退變方面的應用。我們課題組[88]前期采用聚乙二醇和聚 N-異丙基丙烯酰胺制備熱反應性多相冠狀聚離子膠束水凝膠，通過該體系遞送亞鐵血紅素加氧酶基因，可以減輕白介素引起的炎癥反應，促進蛋白多糖表達，促進椎間盤再生。該載體可以作為一種安全高效的非病毒載體，用于椎間盤退變的基因治療。在前期工作基礎上，我們對水凝膠遞送基因條件進行了進一步改進，可自動感受環境中的 MMP 濃度，并根據 MMP 濃度智能按需釋放 miR-29，從而抑制 MMP-2 的表達，抑制椎間盤纖維化過程，為椎間盤退變的治療提供了新方法[89]。Zhu 等[90]利用編碼 4 個轉錄因子的仙臺病毒載體，使得原始髓核細胞重新編程成為人類誘導性多能干細胞，將其在培養板和水凝膠中培養進行比較，發現髓核來源的人類誘導性多能干細胞在水凝膠中比在培養板中能更好地分化成髓核樣細胞。近年來，一些環狀 RNA（circular RNA，circRNA） 被證實富含 miRNA 的結合位點，并作為競爭性內源性 RNA 與 miRNA 相互作用，從而影響靶 mRNA 的表達，最終調控病理生理過程[91-93]。circRNA 在椎間盤退變髓核組織的差異性表達也逐漸受到人們關注。多個研究顯示，circRNA 能作為 miRNA 的分子海綿，抑制其表達或功能，最終促進或減緩椎間盤組織的退變過程[94-96]。水凝膠包裹轉錄相關 circRNA 也將為椎間盤退變及修復再生提供新方向。
4.4 基于水凝膠的組織工程修復策略
由于椎間盤組織由髓核和纖維環兩部分構成，集髓核、纖維環為一體的水凝膠組織工程修復更符合椎間盤生理結構，也正廣泛處于研究和嘗試中。
Du 等[97]構建了一種以負載兔髓核細胞的海藻酸鹽水凝膠為內核、負載兔纖維環細胞的環向聚己內酯（polycaprolactone，PCL）微纖維支架為外環的仿生復合支架，髓核細胞和纖維環細胞可在支架內均勻擴散和定植，與天然椎間盤組織類似，移植入小鼠體內后，該支架可展現細胞外基質的沉積，體現了良好的力學性能。Bowles 等[98]建立了藻酸鹽水凝膠-膠原纖維復合支架，并將其植入大鼠尾椎，展示出良好的生物相容性和類似天然椎間盤的動態力學性能，還可維持椎間隙高度，為退行性椎間盤疾病的生物療法提供重要方向。Park 等[99]設計了纖維蛋白/透明質酸水凝膠-蠶絲蛋白雙相支架，包裹豬纖維細胞及軟骨細胞，通過體外組織細胞共培養，最終可有效形成完整的椎間盤組織。Gloria 等[100]設計了一種聚 2-羥乙基甲基丙烯酸酯/聚甲基丙烯酸甲酯半互穿網絡復合水凝膠，以聚對苯二甲酸乙二酯纖維作為纖維環的替代物，體現了良好的力學特性。Martin 等[101]構建的復合生物支架其髓核區域由透明質酸水凝膠構成，纖維環區域由 PCL 層及可吸收的聚乳酸-羥基乙酸層組成，移植入大鼠尾椎后，體現出與運動節段相匹配的抗壓力學性能。目前髓核-纖維環復合支架仍無法達到與天然椎間盤組織一致的機械力學特性和生物學特性，而且移植入動物體內后，也將面臨誘導椎間融合的風險，是未來椎間盤組織工程的發展方向。
水凝膠再生修復退變椎間盤的應用類型見表 1。
表1
水凝膠再生修復退變椎間盤的應用
Table1.
Application of hydrogel in regeneration of nucleus pulposus in intervertebral disc degeneration
5 問題與展望
水凝膠生物材料在椎間盤髓核再生、修復和置換中扮演了重要角色。盡管目前水凝膠在椎間盤退變細胞治療及組織工程治療方面已取得較大進展，但仍主要停留在細胞及動物實驗階段，對于應用于臨床還存在一段距離。水凝膠作為髓核再生修復的生物材料，理想要求是既擁有良好的機械特性，可以恢復椎間隙高度及承受身體負荷，又對椎間盤細胞的增殖、分化、信號傳導具有積極作用，與周圍組織良好嵌合且無毒害作用。所以，與正常髓核組織相似的良好生物相容性及機械特性，仍然是未來水凝膠材料發展的方向。可注射水凝膠在穿刺進入椎間盤組織內時，不可避免會造成纖維環組織完整性受損，可能引起椎間盤退變。因此，如何安全準確地遞送水凝膠生物材料也成為待解決的問題。如前所述，椎間盤組織具有復雜的微環境，如低氧、酸性及不同應力環境等，未來針對退變椎間盤組織的微環境刺激響應性水凝膠也具有良好的發展前景。最后，目前研究生物材料對椎間盤退變的再生修復作用很少與疼痛緩解建立聯系，但在臨床中疼痛緩解才是患者最關注的問題。所以，建立椎間盤源性疼痛動物模型以及良好的評判標準，對今后應用于臨床也非常重要。
作者貢獻：石坤負責綜述題目構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改；豐干鈞及宋躍明負責綜述立題、構思建議，文章初稿的全篇修改；劉立岷負責綜述構思建議；黃勇、黃雷震、王競成、王玨翰協助題目構思及觀點形成。
利益沖突：所有作者均聲明，本課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點。
