引用本文： 歐栓機, 許長鵬, 李貴濤, 孫鴻濤, 楊洋, 盧瀚宇, 李文俊, 齊勇. 脛骨橫向骨搬移對血清血管生成相關因子表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(1): 98-101. doi: 10.7507/1002-1892.201906130 復制
脛骨橫向骨搬移術可以促進糖尿病足創面愈合[1-4]，但其刺激血管生成、促進創面愈合的機制尚不清楚。創面愈合需要多種組織細胞、細胞外基質和細胞因子參與，是一個非常復雜的生物學過程。血管生成是創面愈合的一個至關重要的因素，而血管生成與血管生成相關因子（如 VEGF、bFGF、EGF、PDGF 等）密切相關。血管生長相關因子既可以刺激血管形成，又可以促進細胞增殖以及細胞間基質蛋白合成，是創面愈合的重要物質，糖尿病足創面難以愈合可能與機體血管生成相關因子分泌不足有關[5-6]。Ilizarov[7-8]發現牽拉成骨能刺激新生骨和肌肉中 VEGF 和 bFGF 高表達。本研究采用 ELISA 技術研究脛骨橫向骨搬移對患者血清中血管生成相關因子表達的影響，闡明脛骨橫向骨搬移促進創面愈合的作用機制，以期為糖尿病足創面的有效治療提供理論依據。報告如下。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① Wagner 4 期糖尿病足患者；② 患肢腘動脈條件好；③ 患者保肢意愿強烈。排除標準：① 患肢腘動脈完全阻塞，無側支循環建立；② 患者一般情況差，不能耐受手術；③ 嚴重心肺功能不全；④ 嚴重肝腎功能不全；⑤ 免疫功能不全或長期接受類固醇治療。2018 年 1 月—12 月共 10 例患者符合選擇標準納入研究。
1.2 一般資料
本組男 5 例，女 5 例；年齡 51～70 歲，平均 59.2 歲。糖尿病病程 2～60 個月，平均 24.2 個月；糖尿病足病程 30～120 d，平均 54.1 d。左足 6 例，右足 4 例；均為 Wagner 4 期糖尿病足。
1.3 治療方法
根據創面情況及時行清創術，去除壞死組織及膿液，注意探查足底深層，同時行壞死組織細菌培養，待創面感染基本控制，行脛骨橫向骨搬移術。于術后第 5 天開始往外橫向搬移脛骨骨窗（1 mm/d，每次 0.25 mm，分 4 次完成）；搬移 2 周后，停止搬移 3 d，然后再往回橫向骨搬移 2 周；固定 6～8 周，拆除外固定架。
1.4 檢測指標
1.4.1 主要試劑與儀器
人 VEGF-ELISA 試劑盒、人 FGF-basic ELISA 試劑盒、人 EGF-ELISA 試劑盒、人/鼠 PDGF-ELISA 試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）。低溫離心機（LaboGene 公司，丹麥）；?80℃ 超低溫冰箱（SANYO 公司，日本）。
1.4.2 檢測方法
分別于術前 1 d 及術后 1、4、11（往外橫向骨搬移第 7 天）、18（往外橫向骨搬移第 14 天）、28（往回橫向骨搬移第 7 天）、35 d（往回橫向骨搬移第 14 天），于早晨 7 點抽取空腹外周靜脈血 5 mL，直立放置片刻使全血凝固；以離心半徑 10 cm、2 000 r/min 離心 10 min，使血清和血細胞分離，取上清液 1.5 mL 置入離心管，?80℃ 冰箱保存。檢測時取出血清，應用人 VEGF-ELISA 試劑盒、人 FGF-basic ELISA 試劑盒、人 EGF-ELISA 試劑盒、人/鼠 PDGF-ELISA 試劑盒，按試劑盒說明書操作，采用 ELISA 法檢測 VEGF、bFGF、EGF、PDGF 表達水平。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，術后各時間點與術前比較采用重復測量方差分析；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
術后 1、4 d 患者血清 VEGF、bFGF 及 EGF 呈低水平表達，均在術后 11 d 突然升高，11、18、28、35 d 各因子表達水平均顯著高于術前，差異有統計學意義（P<0.05）。PDGF 表達水平在術后 1、4、11 d 均呈低水平表達，于術后 18 d 突然升高，18、28、35 d PDGF 表達水平顯著高于術前，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
手術前后各時間點患者血清中各血管生成相關因子表達水平（0 d 表示術前 1 d）
a. VEGF；b. bFGF；c. EGF；d. PDGF
Figure1. The expression level of angiogenesis-related growth factors in serum of patients before and after operation (0 day indicated for preoperative at 1 day)a. VEGF; b. bFGF; c. EGF; d. PDGF
3 討論
糖尿病足創面愈合延遲甚至長期不愈合是常見的臨床現象，也是創面治療的重點和難點。有效的創面修復需要新鮮的肉芽組織填充，肉芽組織的形成不僅需要足夠數量的血管和內皮細胞，還涉及大量的細胞因子。糖尿病足遷延不愈的機制可能與細胞因子的異常表達有關[9]。
VEGF 是一種高度特異性的有絲分裂原、能刺激血管內皮細胞生長的細胞因子，誘導血管內皮細胞增殖、遷移，使血管通透性增強，可調控創面血管化，在誘導形成新生血管中起重要作用，能維持血管的正常狀態和完整性[10]。本研究結果顯示，術后 1、4 d VEGF 處于低表達水平，提示在骨搬移之前患者血清 VEGF 表達水平無明顯變化；而在骨搬移期間（術后 11、18、28、35 d），血清 VEGF 處于高表達水平且有上升趨勢，均高于術前（P<0.05），提示脛骨橫向骨搬移術通過往返搬移脛骨截骨塊，可促進 VEGF 表達。但在此后延長搬移時間，反復的牽拉應力刺激并未引起 VEGF 表達水平持續上升，而是維持一相對恒定的水平。因此，我們認為以“手風琴”的方式進行骨搬移，有較長時間進行持續性緩慢的力學刺激，這種刺激可以促進并維持 VEGF 的表達，在骨搬移期間 VEGF 始終處于高表達，可以發揮其促進血管新生，重建、恢復血流的作用，新生血管可提供用于修復受損組織的營養物質，起到促進糖尿病足創面愈合的作用。
bFGF 是創面愈合過程中重要的細胞因子，是調控創面愈合所必需的生長因子和細胞外基質[11]。bFGF 作為內皮細胞增殖的趨化因子，能直接促進內皮細胞增殖，并能調控內皮細胞分泌 VEGF，誘導新生血管生成[12]。本研究結果顯示，在骨搬移期間，血清 bFGF 也處于高表達水平，與 VEGF 的結果類似。
EGF 主要由血小板和單核細胞分泌，促進各種組織細胞的分裂，促進糖酵解，刺激表皮細胞的 DNA、RNA 復制、轉錄和蛋白質合成，參與細胞增殖、遷移和分化的調控[13]。在創傷修復中，EGF 刺激表皮細胞和成纖維細胞遷移至受損部位，促進成纖維細胞產生膠原，同時上調 EGF 受體，并與 EGF 受體結合，對細胞生長起調節作用，促進蛋白質合成、DNA 和 RNA 修復，改善創面微循環，促進肉芽組織形成[14]。本研究結果顯示，在骨搬移期間，血清 EGF 處于高表達水平，與 VEGF 的結果類似。
PDGF 能促進中性粒細胞、巨噬細胞浸潤至受損部位發揮清創作用，促進成纖維細胞分泌新的細胞外基質和 IGF-1 介導再上皮化[15]。有研究表明，微血管細胞產生的 PDGF 能誘導 VEGF 表達，提示 PDGF 在血管生成中起重要作用[16]。本研究中我們發現，術后 1、4、11 d PDGF 均呈低表達；術后 18 d 才明顯升高，術后 28、35 d 也處于高表達狀態，與術前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。提示脛骨橫向骨搬移需牽拉到足夠長的時間才可促使 PDGF 表達；隨著搬移時間延長，PDGF 到達峰值后，便會繼續保持高水平表達狀態，可認為是橫向骨搬移這種壓應力刺激促進并保持了 PDGF 表達，從而發揮其刺激創面修復細胞增殖與分化的功能，促進創面愈合。
在創面愈合過程中，血管生成相關因子能改變靶細胞的分化、生長和代謝，在血管生成和創面愈合中互相影響、互相促進。bFGF、EGF、PDGF 以旁分泌的形式增強 VEGF 表達[17]。Quinn 等[18]報道 VEGF 能促進新生血管形成，但在上皮化的成熟過程中并不起作用。而 bFGF、EGF 能刺激上皮細胞的遷移和增殖，可以促進創面肉芽組織的上皮化[19]。bFGF、PDGF 可相互促進成纖維細胞遷移，并改變細胞表型，使其轉化為成肌纖維細胞[20]。
綜上述，本研究發現脛骨橫向骨搬移術治療糖尿病足，早期可顯著增加血清血管生成相關因子的表達，可能是其促進糖尿病足創面愈合的作用機制。本研究還存在以下不足，如納入病例數較少，缺乏合適的對照，今后還需開展多中心、大樣本、高質量的研究；另外，本研究所檢測的細胞因子有限，許多其他細胞因子在血管生成中也起著重要作用，如 TGF-β、血管生成素 2、IGF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等，脛骨橫向骨搬移的治療是否可促進上述細胞因子表達，有待進一步研究探討。
作者貢獻：歐栓機負責研究實施及文章撰寫；齊勇負責研究設計及實施；許長鵬、孫鴻濤負責實驗評估；楊洋、盧瀚宇負責數據收集整理；李文俊負責統計分析；李貴濤負責文章審校。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經廣東省第二人民醫院醫學科學研究倫理委員會批準（GDZH-IRB-SC-KY-07-01.0）。
脛骨橫向骨搬移術可以促進糖尿病足創面愈合[1-4]，但其刺激血管生成、促進創面愈合的機制尚不清楚。創面愈合需要多種組織細胞、細胞外基質和細胞因子參與，是一個非常復雜的生物學過程。血管生成是創面愈合的一個至關重要的因素，而血管生成與血管生成相關因子（如 VEGF、bFGF、EGF、PDGF 等）密切相關。血管生長相關因子既可以刺激血管形成，又可以促進細胞增殖以及細胞間基質蛋白合成，是創面愈合的重要物質，糖尿病足創面難以愈合可能與機體血管生成相關因子分泌不足有關[5-6]。Ilizarov[7-8]發現牽拉成骨能刺激新生骨和肌肉中 VEGF 和 bFGF 高表達。本研究采用 ELISA 技術研究脛骨橫向骨搬移對患者血清中血管生成相關因子表達的影響，闡明脛骨橫向骨搬移促進創面愈合的作用機制，以期為糖尿病足創面的有效治療提供理論依據。報告如下。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① Wagner 4 期糖尿病足患者；② 患肢腘動脈條件好；③ 患者保肢意愿強烈。排除標準：① 患肢腘動脈完全阻塞，無側支循環建立；② 患者一般情況差，不能耐受手術；③ 嚴重心肺功能不全；④ 嚴重肝腎功能不全；⑤ 免疫功能不全或長期接受類固醇治療。2018 年 1 月—12 月共 10 例患者符合選擇標準納入研究。
1.2 一般資料
本組男 5 例，女 5 例；年齡 51～70 歲，平均 59.2 歲。糖尿病病程 2～60 個月，平均 24.2 個月；糖尿病足病程 30～120 d，平均 54.1 d。左足 6 例，右足 4 例；均為 Wagner 4 期糖尿病足。
1.3 治療方法
根據創面情況及時行清創術，去除壞死組織及膿液，注意探查足底深層，同時行壞死組織細菌培養，待創面感染基本控制，行脛骨橫向骨搬移術。于術后第 5 天開始往外橫向搬移脛骨骨窗（1 mm/d，每次 0.25 mm，分 4 次完成）；搬移 2 周后，停止搬移 3 d，然后再往回橫向骨搬移 2 周；固定 6～8 周，拆除外固定架。
1.4 檢測指標
1.4.1 主要試劑與儀器
人 VEGF-ELISA 試劑盒、人 FGF-basic ELISA 試劑盒、人 EGF-ELISA 試劑盒、人/鼠 PDGF-ELISA 試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）。低溫離心機（LaboGene 公司，丹麥）；?80℃ 超低溫冰箱（SANYO 公司，日本）。
1.4.2 檢測方法
分別于術前 1 d 及術后 1、4、11（往外橫向骨搬移第 7 天）、18（往外橫向骨搬移第 14 天）、28（往回橫向骨搬移第 7 天）、35 d（往回橫向骨搬移第 14 天），于早晨 7 點抽取空腹外周靜脈血 5 mL，直立放置片刻使全血凝固；以離心半徑 10 cm、2 000 r/min 離心 10 min，使血清和血細胞分離，取上清液 1.5 mL 置入離心管，?80℃ 冰箱保存。檢測時取出血清，應用人 VEGF-ELISA 試劑盒、人 FGF-basic ELISA 試劑盒、人 EGF-ELISA 試劑盒、人/鼠 PDGF-ELISA 試劑盒，按試劑盒說明書操作，采用 ELISA 法檢測 VEGF、bFGF、EGF、PDGF 表達水平。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，術后各時間點與術前比較采用重復測量方差分析；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
術后 1、4 d 患者血清 VEGF、bFGF 及 EGF 呈低水平表達，均在術后 11 d 突然升高，11、18、28、35 d 各因子表達水平均顯著高于術前，差異有統計學意義（P<0.05）。PDGF 表達水平在術后 1、4、11 d 均呈低水平表達，于術后 18 d 突然升高，18、28、35 d PDGF 表達水平顯著高于術前，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
手術前后各時間點患者血清中各血管生成相關因子表達水平（0 d 表示術前 1 d）
a. VEGF；b. bFGF；c. EGF；d. PDGF
Figure1. The expression level of angiogenesis-related growth factors in serum of patients before and after operation (0 day indicated for preoperative at 1 day)a. VEGF; b. bFGF; c. EGF; d. PDGF
3 討論
糖尿病足創面愈合延遲甚至長期不愈合是常見的臨床現象，也是創面治療的重點和難點。有效的創面修復需要新鮮的肉芽組織填充，肉芽組織的形成不僅需要足夠數量的血管和內皮細胞，還涉及大量的細胞因子。糖尿病足遷延不愈的機制可能與細胞因子的異常表達有關[9]。
VEGF 是一種高度特異性的有絲分裂原、能刺激血管內皮細胞生長的細胞因子，誘導血管內皮細胞增殖、遷移，使血管通透性增強，可調控創面血管化，在誘導形成新生血管中起重要作用，能維持血管的正常狀態和完整性[10]。本研究結果顯示，術后 1、4 d VEGF 處于低表達水平，提示在骨搬移之前患者血清 VEGF 表達水平無明顯變化；而在骨搬移期間（術后 11、18、28、35 d），血清 VEGF 處于高表達水平且有上升趨勢，均高于術前（P<0.05），提示脛骨橫向骨搬移術通過往返搬移脛骨截骨塊，可促進 VEGF 表達。但在此后延長搬移時間，反復的牽拉應力刺激并未引起 VEGF 表達水平持續上升，而是維持一相對恒定的水平。因此，我們認為以“手風琴”的方式進行骨搬移，有較長時間進行持續性緩慢的力學刺激，這種刺激可以促進并維持 VEGF 的表達，在骨搬移期間 VEGF 始終處于高表達，可以發揮其促進血管新生，重建、恢復血流的作用，新生血管可提供用于修復受損組織的營養物質，起到促進糖尿病足創面愈合的作用。
bFGF 是創面愈合過程中重要的細胞因子，是調控創面愈合所必需的生長因子和細胞外基質[11]。bFGF 作為內皮細胞增殖的趨化因子，能直接促進內皮細胞增殖，并能調控內皮細胞分泌 VEGF，誘導新生血管生成[12]。本研究結果顯示，在骨搬移期間，血清 bFGF 也處于高表達水平，與 VEGF 的結果類似。
EGF 主要由血小板和單核細胞分泌，促進各種組織細胞的分裂，促進糖酵解，刺激表皮細胞的 DNA、RNA 復制、轉錄和蛋白質合成，參與細胞增殖、遷移和分化的調控[13]。在創傷修復中，EGF 刺激表皮細胞和成纖維細胞遷移至受損部位，促進成纖維細胞產生膠原，同時上調 EGF 受體，并與 EGF 受體結合，對細胞生長起調節作用，促進蛋白質合成、DNA 和 RNA 修復，改善創面微循環，促進肉芽組織形成[14]。本研究結果顯示，在骨搬移期間，血清 EGF 處于高表達水平，與 VEGF 的結果類似。
PDGF 能促進中性粒細胞、巨噬細胞浸潤至受損部位發揮清創作用，促進成纖維細胞分泌新的細胞外基質和 IGF-1 介導再上皮化[15]。有研究表明，微血管細胞產生的 PDGF 能誘導 VEGF 表達，提示 PDGF 在血管生成中起重要作用[16]。本研究中我們發現，術后 1、4、11 d PDGF 均呈低表達；術后 18 d 才明顯升高，術后 28、35 d 也處于高表達狀態，與術前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。提示脛骨橫向骨搬移需牽拉到足夠長的時間才可促使 PDGF 表達；隨著搬移時間延長，PDGF 到達峰值后，便會繼續保持高水平表達狀態，可認為是橫向骨搬移這種壓應力刺激促進并保持了 PDGF 表達，從而發揮其刺激創面修復細胞增殖與分化的功能，促進創面愈合。
在創面愈合過程中，血管生成相關因子能改變靶細胞的分化、生長和代謝，在血管生成和創面愈合中互相影響、互相促進。bFGF、EGF、PDGF 以旁分泌的形式增強 VEGF 表達[17]。Quinn 等[18]報道 VEGF 能促進新生血管形成，但在上皮化的成熟過程中并不起作用。而 bFGF、EGF 能刺激上皮細胞的遷移和增殖，可以促進創面肉芽組織的上皮化[19]。bFGF、PDGF 可相互促進成纖維細胞遷移，并改變細胞表型，使其轉化為成肌纖維細胞[20]。
綜上述，本研究發現脛骨橫向骨搬移術治療糖尿病足，早期可顯著增加血清血管生成相關因子的表達，可能是其促進糖尿病足創面愈合的作用機制。本研究還存在以下不足，如納入病例數較少，缺乏合適的對照，今后還需開展多中心、大樣本、高質量的研究；另外，本研究所檢測的細胞因子有限，許多其他細胞因子在血管生成中也起著重要作用，如 TGF-β、血管生成素 2、IGF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等，脛骨橫向骨搬移的治療是否可促進上述細胞因子表達，有待進一步研究探討。
作者貢獻：歐栓機負責研究實施及文章撰寫；齊勇負責研究設計及實施；許長鵬、孫鴻濤負責實驗評估；楊洋、盧瀚宇負責數據收集整理；李文俊負責統計分析；李貴濤負責文章審校。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經廣東省第二人民醫院醫學科學研究倫理委員會批準（GDZH-IRB-SC-KY-07-01.0）。
