引用本文： 張洋, 郭海, 馬莉, 朱錦宇, 郭安運, 何勇. 長鏈非編碼 RNA MALAT1 吸附微小 RNA-124 調控 MSCs 成骨分化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(2): 240-245. doi: 10.7507/1002-1892.201906025 復制
骨質疏松癥是多發于中老年人的一種骨退行性疾病，隨著我國人口老齡化進程，其發病率日趨升高，已成為治療研究的熱點[1]。BMSCs 是一種具有自我增殖和多向分化潛能的成體干細胞，可分化為神經細胞、脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞等[2]。體內成骨細胞主要來自 BMSCs 的成骨分化，促進 BMSCs 向成骨分化可作為治療骨退行性疾病的有效方法[3]。
研究發現長鏈非編碼 RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）可以直接參與 BMSCs 成骨分化，也可通過調節微小 RNA（microRNA，miRNA）表達來調節 BMSCs 成骨分化進程[4]。肺腺癌轉移相關轉錄因子 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是首次在肺腺癌中發現的一種 lncRNA，可介導多種骨腫瘤的發生與發展，通過下調磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）通路抑制成骨細胞的增殖[5]，還可介導核因子 κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/核因子 κB 受體活化因子配體（RANK ligand，RANKL）/骨保護素通路，促使破骨細胞活化[6]。
研究發現 PI3K/Akt 通路在 BMSCs 遷移及分化過程中起重要作用，下調通路活性可抑制 BMSCs 成骨分化[7]，因而推測 lncRNA MALAT1 可能通過調控 PI3K/Akt 信號介導 MSCs 成骨分化。研究發現，lncRNA MALAT1 可下調 miR-124 表達，促進乳腺癌發生發展[8]；而上調 miR-124 可介導 BMSCs 分化，還可抑制 PI3K/Akt 信號通路表達[9-10]。因而推測 lncRNA MALAT1 可能通過調節 miR-124 表達來調控 MSCs 成骨分化。本研究通過過表達或敲減體外培養的小鼠胚胎來源 MSCs C3H10T1/2 細胞株中的 lncRNA MALAT1 基因，對 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 對 MSCs 成骨分化的調控作用進行研究。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
C3H10T1/2 細胞株（上海冠導生物工程有限公司）；293T 細胞株（南京科佰生物科技有限公司）；miR-124、lncRNA MALAT1、Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、小細胞核 RNA（small?nuclear?RNA，U6）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；MALAT1 小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）、MALAT1 siRNA 陰性對照、lncRNA MALAT1 過表達質粒、lncRNA MALAT1 空載質粒、lncRNA MALAT1 模擬物和陰性對照（NC）模擬物、雙熒光素報告 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突變型（MUT）基因載體由上海吉瑪基因有限公司構建合成；H-DMEM 培養基（上海微科生物技術有限公司）；FBS、PBS 緩沖液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；Opti-MEM 培養基、LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美國）；ALP 染色試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司）；茜素紅染色液（上海聯碩生物科技有限公司）；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（Takara 公司，日本）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（上海群己生物科技有限公司）；96 孔板、25 cm2培養瓶、60 mm 培養皿等（上海碧云天生物技術有限公司）。
CKX41-F32F 光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；CFX96 Touch Deep Well qRT-PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；3900 型高通量 DNA 合成儀（美國應用生物系統公司）；Centrifuge 5424R 低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；XB-70 制冰機（GRANT 公司，美國）；恒溫水浴鍋（上海析達儀器有限公司）；雙人單面超凈工作臺、CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）。
1.2 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 對 MSCs 成骨分化的調控作用
1.2.1 細胞培養
取 C3H10T1/2 細胞株，放入 39℃ 水浴中快速融化，室溫下以離心半徑 10 cm、3 000 r/min 離心 5 min；向細胞沉淀中加入完全培養基（500 mL H-DMEM 培養基中含 10%FBS、100 U/mL 青鏈霉素）重懸，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養，當細胞融合率達 85% 左右時采用胰蛋白酶-EDTA 消化，然后以 1∶3 比例進行傳代培養。
1.2.2 實驗分組及方法
當細胞融合率達 85% 左右時采用胰蛋白酶-EDTA 消化，室溫下以離心半徑 10 cm、3 000 r/min 離心 5 min；向細胞沉淀中加入完全培養基重懸，混勻后計數，以 5×105個/mL 密度接種于 3 個 24 孔板中。每板分別分組為對照組（A 組）、lncRNA MALAT1 空載質粒組（B 組）、lncRNA MALAT1 過表達質粒組（C 組）、lncRNA MALAT1 siRNA 組（D 組）和 lncRNA MALAT1 siRNA 陰性對照組（E 組）并做好標記，每組 4 孔。24 h 后更換為 Opti-MEM 減血清培養基培養。
參照 LipofectamineTM2000 說明書步驟轉染質粒及 siRNA。將 1 μL LipofectamineTM2000、質粒（ lncRNA MALAT1 空載質粒和 lncRNA MALAT1 過表達質粒）、siRNA（ MALAT1 siRNA 和 MALAT1 siRNA 陰性對照）分別溶于 50 μL Opti-MEM 減血清培養基中并輕輕混勻，靜置 20 min 后，將加有 1 μL LipofectamineTM 2000 的 50 μL Opti-MEM 減血清培養基分別與加有質粒或 siRNA 的 50 μL Opti-MEM 減血清培養基混勻，分別加入 B、C、D、E 組培養孔中處理細胞，A 組細胞加入 1 μL LipofectamineTM2000。6 h 后將培養基更換為成骨誘導分化培養基[11]（500 mL 完全培養基中加入 10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 維生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉），誘導 1 周后收集細胞進行以下觀測。
1.2.3 ALP 染色觀察
取 1 個培養板，棄培養基，PBS 漂洗 2 次，4% 多聚甲醛溶液固定 2 h，各組細胞行 ALP 染色，光鏡下觀察。于 200 倍鏡下隨機取 5 個視野計數 ALP 陽性細胞，按以下公式計算 ALP 陽性細胞相對含量：實驗組 ALP 陽性細胞數/對照組 ALP 陽性細胞數×100%。
1.2.4 茜素紅染色觀察
取 1 個培養板，棄培養基，PBS 漂洗 2 次，4% 多聚甲醛溶液固定 2 h，加入茜素紅染色液室溫孵育 30 min；棄染色液，PBS 漂洗 2 次，光鏡下觀察礦化結節染色情況。200 倍鏡下隨機取 5 個視野計數礦化結節，按以下公式計算細胞礦化結節相對含量：實驗組礦化結節個數/對照組礦化結節個數×100%。
1.2.5 qRT-PCR 檢測 miR-124、lncRNA MALAT1 及成骨分化相關基因表達
取 1 個培養板，加入 RNAiso Plus，參照說明書步驟提取總 RNA，以逆轉錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒將其逆轉錄成 cDNA 后進行定量 PCR 反應。lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN 以 GAPDH 為內參基因，miR-124 以 U6 為內參基因；反應條件的設定、反應體系的配制按照說明書進行，qRT-PCR 引物序列見表 1。采用 2?ΔΔCt 法分析各目的基因相對表達量。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence of qRT-PCR
1.3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗
以 mirTargets 1.2 靶基因預測軟件預測 lncRNA MALAT1 與 miR-124 的結合位點，并構建 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突變型（MUT）熒光素酶報告載體。體外培養 293T 細胞，胰蛋白酶-EDTA 消化后以 5×105 個/mL 密度接種于 24 孔板中；將 lncRNA MALAT1 模擬物和陰性對照（NC）模擬物分別和 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突變型（MUT）熒光素酶報告載體共轉染至 293T 細胞中，以螢火蟲熒光素酶報告基因為內參，24 h 后采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細胞中雙熒光素酶的相對活性，具體步驟參照說明書。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 對 MSCs 成骨分化的調控作用
2.1.1 ALP 染色觀察
A、B、C、D、E 組 ALP 陽性細胞相對含量分別為 100.00%±0.00%、98.90%±14.30%、152.90%±17.80%、28.30%±6.30%、97.90%±14.60%，C 組顯著高于其余各組，D 組顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
各組細胞 ALP 染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure1. ALP staining of cells in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.1.2 茜素紅染色觀察
A、B、C、D、E 組細胞礦化結節相對含量分別為 100.00%±0.00%、99.23%±14.01%、169.31%±19.20%、45.20%±8.10%、101.58%±15.20%，C 組顯著高于其余各組，D 組顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
各組細胞茜素紅染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure2. Alizarin red staining of cells in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.1.3 qRT-PCR 檢測 miR-124、lncRNA MALAT1 及成骨分化相關基因表達
C 組細胞 lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN mRNA 相對表達量顯著高于其余各組，D 組顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C 組細胞 miR-124 相對表達量顯著低于其余各組，D 組顯著高于其余各組，差異亦有統計學意義（P<0.05）；A、B、E 組間各基因相對表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
qRT-PCR 檢測各組細胞 miR-124、lncRNA MALAT1 及 成骨分化相關基因的表達
Figure3.
The relative mRNA expressions of miR-124, lncRNA MALAT1, and osteogenic differentiation related genes detected by qRT-PCR
2.2 雙熒光素酶報告基因檢測
靶基因預測軟件預測顯示，MALAT1 和 miR-124 之間有相似的結合位點，提示 MALAT1 可靶向調控 miR-124 表達。雙熒光素酶報告基因檢測示，與共轉染 NC 模擬物的 293T 細胞相比，共轉染 lncRNA MALAT1 模擬物的 293T 細胞，miR-124 WT 報告基因的熒光素酶相對活性顯著降低（0.99±0.01 & 0.47±0.01，t=82.219，P=0.000），miR-124 MUT 報告基因的熒光素酶相對活性無明顯變化（1.00±0.01 & 0.99±0.01，t=1.581，P=0.153）。見圖 4、5。
圖4
靶基因預測軟件預測結果
Figure4.
Prediction results of target gene prediction software
圖5
雙熒光素酶報告基因檢測報告基因的熒光素酶相對活性
Figure5.
Relative activity of luciferase detected by double luci ferase reporter gene
3 討論
骨質疏松癥是骨骼內骨代謝動態平衡失衡，導致單位結構內骨量下降、骨微結構被破壞的一種慢性疾病，患者骨生物力學減弱，易引起骨折，給患者造成極大痛苦[12]。骨代謝動態平衡是由成骨細胞主導的骨形成和破骨細胞主導的骨吸收之間的動態平衡，當破骨細胞活性大于成骨細胞活性時，就會導致骨質疏松癥等骨退行性疾病[13]。BMSCs 作為具有多向分化潛能的干細胞，促進其向成骨細胞分化可促進骨形成，修正骨代謝失衡，對治療骨退行性疾病有重要作用[14]。MALAT1 是一種 lncRNA，沒有蛋白編碼功能，但可介導轉錄調控及蛋白翻譯后修飾等過程，表達缺乏將會導致蛋白質編碼能力缺失[15]，可調控多種基因影響骨代謝，比如上調 Osterix 蛋白表達促進成骨細胞增殖及分化，亦下調 RANKL 抑制破骨細胞活化[16-17]，由此可推測 MALAT1 可能促進 BMSCs 成骨分化。本研究采用 MALAT1 過表達質粒及 MALAT1 siRNA 調節 BMSCs 細胞株 C3H10T1/2 中 lncRNA MALAT1 的表達，結果顯示，lncRNA MALAT1 過表達質粒組細胞 lncRNA MALAT 基因表達高于對照組，lncRNA MALAT1 siRNA 組低于對照組，表明以 MALAT1 過表達質粒及 MALAT1 siRNA 處理 BMSCs 可調控 lncRNA MALAT 表達，為后續研究奠定了良好基礎。實驗結果顯示，與對照組比較，lncRNA MALAT1 過表達質粒組細胞 lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN 基因表達及 ALP 陽性細胞相對含量、礦化結節相對含量均明顯升高，lncRNA MALAT1 siRNA 組均明顯降低，lncRNA MALAT1 空載質粒組、lncRNA MALAT1 siRNA 陰性對照組各指標無明顯變化。表明上調 lncRNA MALAT1，可上調成骨相關基因表達，促進 BMSCs 向成骨細胞分化；下調 lncRNA MALAT1，可下調成骨相關基因表達，抑制 BMSCs 向成骨細胞分化。提示 lncRNA MALAT1 可調控 BMSCs 成骨分化。
研究表明，MALAT1 可結合并下調 miR-124 的表達，促進舌癌的發展[18]；miR-124 表達降低可激活 PI3K/Akt 通路，而激活 PI3K/Akt 通路可促進 BMSCs 成骨分化[19-20]。因此，調節 miR-124 表達可能是 lncRNA MALAT1 調控 MSCs 成骨分化的作用機制。本研究結果顯示，與對照組比較，lncRNA MALAT1 過表達質粒組細胞 miR-124 基因表達明顯降低，lncRNA MALAT1 siRNA 組細胞 miR-124 基因表達明顯升高，lncRNA MALAT1 空載質粒組、lncRNA MALAT1 siRNA 陰性對照組無明顯變化。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示 lncRNA MALAT1 靶向下調 miR-124 表達，表明 lncRNA MALAT1 靶向結合并下調 miR-124 表達，可能是 lncRNA MALAT1 調控 MSCs 成骨分化的作用機制。
綜上述，lncRNA MALAT1 可能通過靶向結合并下調 miR-124 表達來調控 BMSCs 成骨分化。上調 lncRNA MALAT1 可促進 BMSCs 成骨分化，下調 lncRNA MALAT1 則對 BMSCs 成骨分化有抑制作用，提示 lncRNA MALAT1 是治療骨質疏松癥的一個新靶點，這為臨床治療提供了新思路。但 lncRNA MALAT1 靶向下調 miR-124 表達后，具體通過下游什么信號通路介導 BMSCs 成骨分化尚不清楚，還需進一步深入研究。
作者貢獻：張洋、郭海負責實驗設計及實施；馬莉、郭安運負責數據收集整理；何勇負責統計分析；張洋負責文章撰寫；朱錦宇負責對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
骨質疏松癥是多發于中老年人的一種骨退行性疾病，隨著我國人口老齡化進程，其發病率日趨升高，已成為治療研究的熱點[1]。BMSCs 是一種具有自我增殖和多向分化潛能的成體干細胞，可分化為神經細胞、脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞等[2]。體內成骨細胞主要來自 BMSCs 的成骨分化，促進 BMSCs 向成骨分化可作為治療骨退行性疾病的有效方法[3]。
研究發現長鏈非編碼 RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）可以直接參與 BMSCs 成骨分化，也可通過調節微小 RNA（microRNA，miRNA）表達來調節 BMSCs 成骨分化進程[4]。肺腺癌轉移相關轉錄因子 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是首次在肺腺癌中發現的一種 lncRNA，可介導多種骨腫瘤的發生與發展，通過下調磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）通路抑制成骨細胞的增殖[5]，還可介導核因子 κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/核因子 κB 受體活化因子配體（RANK ligand，RANKL）/骨保護素通路，促使破骨細胞活化[6]。
研究發現 PI3K/Akt 通路在 BMSCs 遷移及分化過程中起重要作用，下調通路活性可抑制 BMSCs 成骨分化[7]，因而推測 lncRNA MALAT1 可能通過調控 PI3K/Akt 信號介導 MSCs 成骨分化。研究發現，lncRNA MALAT1 可下調 miR-124 表達，促進乳腺癌發生發展[8]；而上調 miR-124 可介導 BMSCs 分化，還可抑制 PI3K/Akt 信號通路表達[9-10]。因而推測 lncRNA MALAT1 可能通過調節 miR-124 表達來調控 MSCs 成骨分化。本研究通過過表達或敲減體外培養的小鼠胚胎來源 MSCs C3H10T1/2 細胞株中的 lncRNA MALAT1 基因，對 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 對 MSCs 成骨分化的調控作用進行研究。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
C3H10T1/2 細胞株（上海冠導生物工程有限公司）；293T 細胞株（南京科佰生物科技有限公司）；miR-124、lncRNA MALAT1、Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、小細胞核 RNA（small?nuclear?RNA，U6）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；MALAT1 小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）、MALAT1 siRNA 陰性對照、lncRNA MALAT1 過表達質粒、lncRNA MALAT1 空載質粒、lncRNA MALAT1 模擬物和陰性對照（NC）模擬物、雙熒光素報告 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突變型（MUT）基因載體由上海吉瑪基因有限公司構建合成；H-DMEM 培養基（上海微科生物技術有限公司）；FBS、PBS 緩沖液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；Opti-MEM 培養基、LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美國）；ALP 染色試劑盒（上海士鋒生物科技有限公司）；茜素紅染色液（上海聯碩生物科技有限公司）；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）試劑盒（Takara 公司，日本）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（上海群己生物科技有限公司）；96 孔板、25 cm2培養瓶、60 mm 培養皿等（上海碧云天生物技術有限公司）。
CKX41-F32F 光學顯微鏡（Olympus 公司，日本）；CFX96 Touch Deep Well qRT-PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；3900 型高通量 DNA 合成儀（美國應用生物系統公司）；Centrifuge 5424R 低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；XB-70 制冰機（GRANT 公司，美國）；恒溫水浴鍋（上海析達儀器有限公司）；雙人單面超凈工作臺、CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）。
1.2 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 對 MSCs 成骨分化的調控作用
1.2.1 細胞培養
取 C3H10T1/2 細胞株，放入 39℃ 水浴中快速融化，室溫下以離心半徑 10 cm、3 000 r/min 離心 5 min；向細胞沉淀中加入完全培養基（500 mL H-DMEM 培養基中含 10%FBS、100 U/mL 青鏈霉素）重懸，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱中培養，當細胞融合率達 85% 左右時采用胰蛋白酶-EDTA 消化，然后以 1∶3 比例進行傳代培養。
1.2.2 實驗分組及方法
當細胞融合率達 85% 左右時采用胰蛋白酶-EDTA 消化，室溫下以離心半徑 10 cm、3 000 r/min 離心 5 min；向細胞沉淀中加入完全培養基重懸，混勻后計數，以 5×105個/mL 密度接種于 3 個 24 孔板中。每板分別分組為對照組（A 組）、lncRNA MALAT1 空載質粒組（B 組）、lncRNA MALAT1 過表達質粒組（C 組）、lncRNA MALAT1 siRNA 組（D 組）和 lncRNA MALAT1 siRNA 陰性對照組（E 組）并做好標記，每組 4 孔。24 h 后更換為 Opti-MEM 減血清培養基培養。
參照 LipofectamineTM2000 說明書步驟轉染質粒及 siRNA。將 1 μL LipofectamineTM2000、質粒（ lncRNA MALAT1 空載質粒和 lncRNA MALAT1 過表達質粒）、siRNA（ MALAT1 siRNA 和 MALAT1 siRNA 陰性對照）分別溶于 50 μL Opti-MEM 減血清培養基中并輕輕混勻，靜置 20 min 后，將加有 1 μL LipofectamineTM 2000 的 50 μL Opti-MEM 減血清培養基分別與加有質粒或 siRNA 的 50 μL Opti-MEM 減血清培養基混勻，分別加入 B、C、D、E 組培養孔中處理細胞，A 組細胞加入 1 μL LipofectamineTM2000。6 h 后將培養基更換為成骨誘導分化培養基[11]（500 mL 完全培養基中加入 10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 維生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉），誘導 1 周后收集細胞進行以下觀測。
1.2.3 ALP 染色觀察
取 1 個培養板，棄培養基，PBS 漂洗 2 次，4% 多聚甲醛溶液固定 2 h，各組細胞行 ALP 染色，光鏡下觀察。于 200 倍鏡下隨機取 5 個視野計數 ALP 陽性細胞，按以下公式計算 ALP 陽性細胞相對含量：實驗組 ALP 陽性細胞數/對照組 ALP 陽性細胞數×100%。
1.2.4 茜素紅染色觀察
取 1 個培養板，棄培養基，PBS 漂洗 2 次，4% 多聚甲醛溶液固定 2 h，加入茜素紅染色液室溫孵育 30 min；棄染色液，PBS 漂洗 2 次，光鏡下觀察礦化結節染色情況。200 倍鏡下隨機取 5 個視野計數礦化結節，按以下公式計算細胞礦化結節相對含量：實驗組礦化結節個數/對照組礦化結節個數×100%。
1.2.5 qRT-PCR 檢測 miR-124、lncRNA MALAT1 及成骨分化相關基因表達
取 1 個培養板，加入 RNAiso Plus，參照說明書步驟提取總 RNA，以逆轉錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒將其逆轉錄成 cDNA 后進行定量 PCR 反應。lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN 以 GAPDH 為內參基因，miR-124 以 U6 為內參基因；反應條件的設定、反應體系的配制按照說明書進行，qRT-PCR 引物序列見表 1。采用 2?ΔΔCt 法分析各目的基因相對表達量。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence of qRT-PCR
1.3 雙熒光素酶報告基因檢測實驗
以 mirTargets 1.2 靶基因預測軟件預測 lncRNA MALAT1 與 miR-124 的結合位點，并構建 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突變型（MUT）熒光素酶報告載體。體外培養 293T 細胞，胰蛋白酶-EDTA 消化后以 5×105 個/mL 密度接種于 24 孔板中；將 lncRNA MALAT1 模擬物和陰性對照（NC）模擬物分別和 miR-124 野生型（WT）和 miR-124 突變型（MUT）熒光素酶報告載體共轉染至 293T 細胞中，以螢火蟲熒光素酶報告基因為內參，24 h 后采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組細胞中雙熒光素酶的相對活性，具體步驟參照說明書。
1.4 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 lncRNA MALAT1 吸附 miR-124 對 MSCs 成骨分化的調控作用
2.1.1 ALP 染色觀察
A、B、C、D、E 組 ALP 陽性細胞相對含量分別為 100.00%±0.00%、98.90%±14.30%、152.90%±17.80%、28.30%±6.30%、97.90%±14.60%，C 組顯著高于其余各組，D 組顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
各組細胞 ALP 染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure1. ALP staining of cells in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.1.2 茜素紅染色觀察
A、B、C、D、E 組細胞礦化結節相對含量分別為 100.00%±0.00%、99.23%±14.01%、169.31%±19.20%、45.20%±8.10%、101.58%±15.20%，C 組顯著高于其余各組，D 組顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、B、E 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
各組細胞茜素紅染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組；e. E 組
Figure2. Alizarin red staining of cells in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.1.3 qRT-PCR 檢測 miR-124、lncRNA MALAT1 及成骨分化相關基因表達
C 組細胞 lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN mRNA 相對表達量顯著高于其余各組，D 組顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C 組細胞 miR-124 相對表達量顯著低于其余各組，D 組顯著高于其余各組，差異亦有統計學意義（P<0.05）；A、B、E 組間各基因相對表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
qRT-PCR 檢測各組細胞 miR-124、lncRNA MALAT1 及 成骨分化相關基因的表達
Figure3.
The relative mRNA expressions of miR-124, lncRNA MALAT1, and osteogenic differentiation related genes detected by qRT-PCR
2.2 雙熒光素酶報告基因檢測
靶基因預測軟件預測顯示，MALAT1 和 miR-124 之間有相似的結合位點，提示 MALAT1 可靶向調控 miR-124 表達。雙熒光素酶報告基因檢測示，與共轉染 NC 模擬物的 293T 細胞相比，共轉染 lncRNA MALAT1 模擬物的 293T 細胞，miR-124 WT 報告基因的熒光素酶相對活性顯著降低（0.99±0.01 & 0.47±0.01，t=82.219，P=0.000），miR-124 MUT 報告基因的熒光素酶相對活性無明顯變化（1.00±0.01 & 0.99±0.01，t=1.581，P=0.153）。見圖 4、5。
圖4
靶基因預測軟件預測結果
Figure4.
Prediction results of target gene prediction software
圖5
雙熒光素酶報告基因檢測報告基因的熒光素酶相對活性
Figure5.
Relative activity of luciferase detected by double luci ferase reporter gene
3 討論
骨質疏松癥是骨骼內骨代謝動態平衡失衡，導致單位結構內骨量下降、骨微結構被破壞的一種慢性疾病，患者骨生物力學減弱，易引起骨折，給患者造成極大痛苦[12]。骨代謝動態平衡是由成骨細胞主導的骨形成和破骨細胞主導的骨吸收之間的動態平衡，當破骨細胞活性大于成骨細胞活性時，就會導致骨質疏松癥等骨退行性疾病[13]。BMSCs 作為具有多向分化潛能的干細胞，促進其向成骨細胞分化可促進骨形成，修正骨代謝失衡，對治療骨退行性疾病有重要作用[14]。MALAT1 是一種 lncRNA，沒有蛋白編碼功能，但可介導轉錄調控及蛋白翻譯后修飾等過程，表達缺乏將會導致蛋白質編碼能力缺失[15]，可調控多種基因影響骨代謝，比如上調 Osterix 蛋白表達促進成骨細胞增殖及分化，亦下調 RANKL 抑制破骨細胞活化[16-17]，由此可推測 MALAT1 可能促進 BMSCs 成骨分化。本研究采用 MALAT1 過表達質粒及 MALAT1 siRNA 調節 BMSCs 細胞株 C3H10T1/2 中 lncRNA MALAT1 的表達，結果顯示，lncRNA MALAT1 過表達質粒組細胞 lncRNA MALAT 基因表達高于對照組，lncRNA MALAT1 siRNA 組低于對照組，表明以 MALAT1 過表達質粒及 MALAT1 siRNA 處理 BMSCs 可調控 lncRNA MALAT 表達，為后續研究奠定了良好基礎。實驗結果顯示，與對照組比較，lncRNA MALAT1 過表達質粒組細胞 lncRNA MALAT1、Runx2、OPN、OCN 基因表達及 ALP 陽性細胞相對含量、礦化結節相對含量均明顯升高，lncRNA MALAT1 siRNA 組均明顯降低，lncRNA MALAT1 空載質粒組、lncRNA MALAT1 siRNA 陰性對照組各指標無明顯變化。表明上調 lncRNA MALAT1，可上調成骨相關基因表達，促進 BMSCs 向成骨細胞分化；下調 lncRNA MALAT1，可下調成骨相關基因表達，抑制 BMSCs 向成骨細胞分化。提示 lncRNA MALAT1 可調控 BMSCs 成骨分化。
研究表明，MALAT1 可結合并下調 miR-124 的表達，促進舌癌的發展[18]；miR-124 表達降低可激活 PI3K/Akt 通路，而激活 PI3K/Akt 通路可促進 BMSCs 成骨分化[19-20]。因此，調節 miR-124 表達可能是 lncRNA MALAT1 調控 MSCs 成骨分化的作用機制。本研究結果顯示，與對照組比較，lncRNA MALAT1 過表達質粒組細胞 miR-124 基因表達明顯降低，lncRNA MALAT1 siRNA 組細胞 miR-124 基因表達明顯升高，lncRNA MALAT1 空載質粒組、lncRNA MALAT1 siRNA 陰性對照組無明顯變化。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示 lncRNA MALAT1 靶向下調 miR-124 表達，表明 lncRNA MALAT1 靶向結合并下調 miR-124 表達，可能是 lncRNA MALAT1 調控 MSCs 成骨分化的作用機制。
綜上述，lncRNA MALAT1 可能通過靶向結合并下調 miR-124 表達來調控 BMSCs 成骨分化。上調 lncRNA MALAT1 可促進 BMSCs 成骨分化，下調 lncRNA MALAT1 則對 BMSCs 成骨分化有抑制作用，提示 lncRNA MALAT1 是治療骨質疏松癥的一個新靶點，這為臨床治療提供了新思路。但 lncRNA MALAT1 靶向下調 miR-124 表達后，具體通過下游什么信號通路介導 BMSCs 成骨分化尚不清楚，還需進一步深入研究。
作者貢獻：張洋、郭海負責實驗設計及實施；馬莉、郭安運負責數據收集整理；何勇負責統計分析；張洋負責文章撰寫；朱錦宇負責對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
