引用本文： 時利軍, 毛天立, 羅攀, 李騰奇, 高福強, 孫偉, 李子榮. 淫羊藿苷干預兔早期激素性股骨頭壞死的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(2): 206-212. doi: 10.7507/1002-1892.201905112 復制
激素應用已成為導致非創傷性股骨頭壞死的主要原因[1]，目前臨床上有多種治療方案，但總體治療效果不佳，早期診斷和干預仍是延緩病情進展、改善預后的關鍵。尋找一種能有效拮抗激素對骨組織損傷作用的治療方法，以降低該病發生率具有重要臨床意義。我們前期實驗研究表明，淫羊藿苷對高濃度激素造成的股骨頭內骨髓微血管內皮細胞損傷具有顯著保護作用[2]，臨床上也將淫羊藿苷制劑用于治療早期股骨頭壞死[3]。但是目前缺少淫羊藿苷對骨微結構影響的研究報道。為此，本次實驗以兔為研究對象，以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯合甲潑尼龍（methylprednisolone，MPS）注射制備早期激素性股骨頭壞死模型，通過 Micro-CT 掃描重建及病理學檢測，觀察淫羊藿苷對早期股骨頭壞死骨微結構的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
成年清潔級新西蘭兔 50 只，雌雄各半，體質量 2.5～3.0 kg，購于北京科宇動物養殖中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2018-0010。所有動物在中日友好醫院動物實驗室同一條件下分籠飼養，定量飼料及清潔飲用水喂食，室溫 20～25℃，濕度 50% 左右，自然光照，通風良好。
1.2 主要材料及儀器
LPS、淫羊藿苷、HE 染色試劑盒、青霉素鈉、10% 中性甲醛（北京索萊寶科技有限公司）；MPS（輝瑞制藥公司，美國）；烏拉坦（上海恒遠生物科技有限公司）。硬組織切片機、分層脫水機（Leica 公司，德國）；石蠟包埋機（北京中科亞光科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；Micro-CT（通用公司，美國）；Mimics17.0 圖像分割處理軟件（Materialise 公司，比利時）。
1.3 動物模型制備及分組
實驗動物適應性喂養 1 周，精確稱重后采用隨機數字表法分為對照組（10 只）、模型組（20 只）和實驗組（20 只）。3 組動物體質量及雌雄構成比差異均無統計學意義（P>0.05）。模型組及實驗組制備激素性股骨頭壞死模型。具體方法：經耳緣靜脈注射 1 次 LPS（5 μg/kg），正常喂養 24 h 后于雙側臀肌注射 MPS（20 mg/kg），每 24 小時注射 1 次，共注射 3 次。
實驗組首次注射 MPS 時開始灌胃給予淫羊藿苷，按照實驗動物用藥換算方法計算給藥劑量，將淫羊藿苷用蒸餾水配成 10 mL 藥液，每日灌胃 1 次，連續 6 周。對照組和模型組對應時間點灌胃 10 mL 生理鹽水。實驗動物在相同條件下普通喂養，采用懸吊法飲水迫使其下肢直立行走，每天籠外自由活動 2 h，以增加活動量和范圍，雙側臀肌每周交替注射 8 萬 U 青霉素鈉預防感染。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
觀察實驗動物存活、活動、精神狀況、飲食、排便、皮毛色澤及有無體表感染等，每周稱重。
1.4.2 大體觀察
第 1 次注射 MPS 6 周后，以 20% 烏拉坦靜脈麻醉處死 3 組實驗動物，取左側股骨頭，剔除周圍軟組織，觀察股骨頭輪廓外形、表面軟骨顏色、光滑度及軟骨剝脫情況。
1.4.3 Micro-CT 觀測
大體觀察后將股骨頭置于 10% 中性甲醛固定，Micro-CT 連續斷層掃描。掃描參數：電壓 80 kV，電流 450 μA，空間分辨率為 45 μm×45 μm×45 μm，曝光時間 2 000 ms。使用 Micro-CT 自帶軟件 CT-vox 對股骨頭進行三維重建，選擇軟骨下骨全部松質骨作為興趣區，CTan 定量分析骨小梁微結構，測量參數包括骨小梁相對體積（bone volume to total volume，BV/TV）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Tn）及骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）。
將采集的 CT 數據以 DICOM 格式導入 Mimics 軟件中，通過建立蒙版、閾值分割及涂抹充填等操作三維重建股骨頭骨性結構。選取橫斷面、冠狀位、矢狀位及三維視圖，多角度觀察股骨頭標本三維立體結構。
1.4.4 組織學觀察
Micro-CT 掃描結束后用硬組織切片機沿股骨頭標本冠狀面縱行剖開，重新置于 10% 中性甲醛固定 7 d，5% 硝酸溶液浸泡脫鈣 3 d。脫鈣滿意后分層脫水機梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，切片機切割、磨平、拋光，制備 20 μm 厚切片，脫蠟后 HE 染色，光鏡下觀察骨小梁結構、骨細胞及骨髓脂肪形態變化。
按照病理學診斷標準[4]檢測股骨頭壞死模型造模是否成功。診斷標準：骨小梁出現彌漫性空骨陷窩，骨細胞核固縮，周圍組織可見骨髓細胞壞死。高倍鏡下分析模型組、實驗組中診斷為股骨頭壞死的標本切片及對照組全部標本切片，每個標本選取 1 張，隨機選取 10 個視野統計 50 個骨細胞中空骨陷窩數量，計算各組空骨陷窩率（空骨陷窩數量/50）×100%。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；骨壞死發生率組間比較采用 Fisher 確切概率法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗期間共 7 只實驗動物死亡。其中，對照組 1 只因呼吸道感染死亡；模型組 1 只因急性腹瀉死亡、3 只靜脈注射 LPS 后死亡；實驗組 2 只于第 1 次注射 MPS 后拒絕進食并出現腹瀉癥狀，最終死亡。最終 43 只動物存活至實驗完成，其中對照組 9 只、模型組 16 只、實驗組 18 只。
除死亡動物外，模型組及實驗組靜脈注射 LPS 后共 9 只動物表現不同程度反應遲鈍、精神萎靡、呼吸加快以及眼瞼充血，3 只出現腹瀉、食欲不振，24 h 后癥狀逐漸緩解。連續 3 次注射 MPS 后，10 只動物活動減少、反應遲緩、飲食及體質量下降，4 周后進食恢復正常；股骨頭壞死動物皮毛失去光澤。對照組動物未見明顯異常，活動自如，正常飲食，體質量逐漸增加，皮毛光滑。
2.2 大體觀察
大體觀察各組全部股骨頭標本。對照組股骨頭外形輪廓正常、軟骨面光滑完整無塌陷，外觀潔白明亮；模型組大部分股骨頭軟骨下壞死范圍較大且較嚴重，關節面塌陷明顯，軟骨顏色灰暗，易于剖開，骨質松脆；實驗組大部分股骨頭仍保持圓形，軟骨面輕微凹陷，壞死區域呈現皺褶，軟骨無剝脫，軟骨面顏色基本正常。見圖 1。
圖1
股骨頭大體觀察
a. 對照組；b. 模型組；c. 實驗組
Figure1. General observation of the femoral heada. Control group; b. Model group; c. Experimental group
2.3 Micro-CT 觀測
Micro-CT 連續斷層掃描所有股骨頭標本。與對照組相比，模型組股骨頭壞死區域骨皮質明顯塌陷，軟骨面骨皮質變薄，軟骨下出現囊性變，骨小梁嚴重疏松、變細、結構紊亂、間隙顯著變寬，部分骨小梁斷裂甚至壞死；實驗組股骨頭壞死區域局限，骨皮質出現皺褶，壞死區軟骨面骨皮質輕度變薄，骨小梁結構尚可，只有部分骨小梁出現排列不規則，連續性中斷，骨小梁變細，間隙增大，密度輕度改變，有局限性修復。見圖 2。
圖2
股骨頭 Micro-CT 觀察
從左至右依次為 Micro-CT 三維重建圖像、Mimics 三維重建立體顯示圖像和冠狀位圖像 a. 對照組；b. 模型組；c. 實驗組
Figure2. Micro-CT observation of the femoral headFrom left to right for Micro-CT three-dimensional reconstruction，steric display and coronal display three-dimensional reconstructions by Mimics software a. Control group; b. Model group; c. Experimental group
與對照組相比，模型組和實驗組 Tb.N、Tb.Tn、BV/TV 下降、Tb.Sp 升高；與模型組相比，實驗組 Tb.N、Tb.Tn、BV/TV 升高、Tb.Sp 降低；組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
各組股骨頭骨微結構參數比較（
）
Table1.
Comparison of bone microstructure parameters of the femoral heads between groups (
)
2.4 組織學觀察
對照組：股骨頭軟骨較厚，骨小梁飽滿、排列規則整齊，骨小梁間充滿骨髓造血組織，脂肪細胞少、形態正常，橢圓形骨細胞沿骨小梁成串排列、核大居中，偶見散在的空骨陷窩。模型組：壞死灶主要位于松質骨及軟骨下區，軟骨層變薄缺損，軟骨下骨小梁結構紊亂、排列稀疏松散，可見骨小梁斷裂碎片，骨小梁中骨細胞減少，骨陷窩變大，空骨陷窩增多，骨細胞排列無序，骨小梁間脂肪細胞堆積、數目增多，部分肥大呈囊狀融合。實驗組：壞死區骨小梁形態及結構較模型組完整，骨小梁排列相對致密規則，骨小梁輕度變薄、間隙無明顯增大，部分骨細胞凋亡，空骨陷窩少，脂肪細胞無明顯肥大。見圖 3。
圖3
股骨頭 HE 染色觀察
從左至右為放大 40、200、400 倍，箭頭示空骨陷窩 a. 對照組；b. 模型組；c. 實驗組
Figure3. HE staining of the femoral headFrom left to right for magnifications of 40, 200, and 400, respectively; arrow indicated the empty lacunae a. Control group; b. Model group; c. Experimental group
按照股骨頭壞死病理學診斷標準，對照組無骨壞死發生；模型組骨壞死發生率為 81.3%（13/16），實驗組為 66.7%（12/18），組間比較差異無統計學意義（P=0.448）。模型組和實驗組發生壞死的股骨頭標本其空骨陷窩率分別為 33.1%±1.4% （n=13）及 18.9%±0.8% （n=12），均高于對照組 12.7%±1.5% （n=9），且模型組明顯高于實驗組，組間差異均有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
激素在多種疾病治療中起著不可替代的作用，然而在給患者帶來滿意治療效果的同時也會產生嚴重并發癥，如股骨頭壞死[4]。我們前期臨床研究結果表明，激素累計使用量超過 2 000 mg（折合成 MPS）或者每日劑量超過 30 mg 以及靜脈沖擊使用激素的患者，其骨壞死發生風險顯著增高，發病率約為 33%[5]。另一項日本學者的研究中，由于激素應用導致的股骨頭壞死患者占非創傷性股骨頭壞死患者的 47.4%[6]。如果不進行有效干預，80% 患者將在 1～5 年內進展至股骨頭塌陷[7]，進而影響髖關節功能，晚期只能進行人工髖關節置換[8]。早期診斷和有效干預依然是延緩股骨頭壞死病情進展，推遲人工關節置換時間的關鍵。人體股骨頭標本研究表明，激素導致的股骨頭壞死以多發灶性溶骨性骨質破壞為主要特點[9]。激素性股骨頭壞死發生機制尚未完全明確，可能是通過直接損傷骨細胞及骨髓微血管內皮細胞導致骨細胞及骨組織壞死[10-11]。因此，如果能找到一種可以有效拮抗激素這種毒副作用的藥物，將有可能從源頭上降低該病的發生率。
淫羊藿苷是小檗科淫羊藿屬植物莖葉提取物的主要化學成分，屬于黃酮類化合物，具有多種生物活性。現代藥理學認為淫羊藿苷具有性激素樣作用，可以促進骨組織蛋白合成及成骨細胞生長，從而有益于骨再生和骨修復[3, 12]。動物研究表明，淫羊藿苷具有成骨作用，可促進骨缺損再生，加速骨修復[13-14]。我們牽頭開展的一項多中心隨機雙盲對照試驗發現，長期服用激素的患者同時服用由淫羊藿苷組成的復方制劑 6 個月后，股骨頭壞死發生率（6.98%，9/129）顯著低于未服用復方制劑患者（14.4%，21/146）[3]。此外，有研究表明淫羊藿苷在抑制骨量丟失、改善骨質疏松方面也具有顯著效果[12, 15-16]。
近年來，國內外對淫羊藿苷的成骨作用研究較多，其成骨機制也是研究熱點。BMSCs 是骨髓內多能干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞等。Fan 等[17]體外實驗發現淫羊藿苷可以增強 BMSCs 自我復制及向成骨細胞定向分化的能力，并且與劑量成正相關。還有研究表明，淫羊藿苷在促進 BMSCs 成骨分化、增加成骨細胞數量的同時，還會抑制其向脂肪細胞分化[18-19]。此外，淫羊藿苷一方面增強成骨細胞的活性、促進成骨[20-22]，另一方面抑制破骨細胞活動、降低骨吸收[23]，對透明軟骨、鈣化軟骨及軟骨下骨也有保護作用[24]。研究還表明淫羊藿苷具有拮抗激素對血管內皮細胞損傷的作用，促進內皮細胞在體內遷移、增殖、成管，從而誘導新生血管形成[2, 25-26]，增加局部血流，改善微循環，共同促進骨修復，對延緩骨壞死病情進展有重要作用。
目前，股骨頭壞死動物模型制備方法有很多種，其中 MPS 聯合 LPS 更符合人激素性股骨頭壞死病理改變[27]，因此本實驗采用該方法建立兔激素性股骨頭壞死模型，觀察淫羊藿苷對早期股骨頭壞死的干預作用。Micro-CT 可清楚顯示標本每一層面骨小梁結構，在觀察骨微結構方面具有特殊優勢，同時本實驗還創新性將標本用 Mimics 軟件進行三維重建。經淫羊藿苷干預后的股骨頭壞死標本軟骨輕度變薄、骨小梁結構尚可，破壞不明顯，三維重建顯示軟骨下松質骨仍呈均勻、致密的立體網狀結構。而無淫羊藿苷干預的模型組股骨頭軟骨塌陷明顯，骨小梁破壞嚴重，骨小梁之間的連接斷裂，與骨微結構參數比較結果一致。組織學研究顯示經淫羊藿苷干預后兔股骨頭壞死造模成功率降低，股骨頭壞死標本的空骨陷窩率也低于模型組，骨細胞凋亡及脂肪細胞無明顯增多。
綜上述，激素對兔股骨頭微結構具有顯著破壞作用，造成骨細胞凋亡及骨髓脂肪細胞增生，而淫羊藿苷可以有效降低這種損傷作用，減少骨細胞凋亡，促進局部骨修復，延緩病情進展。
作者貢獻：時利軍參與實驗設計及實施、數據收集整理及統計分析、文章起草；毛天立參與實驗實施、數據收集整理及統計分析；羅攀參與實驗實施及數據收集；李騰奇參與實驗實施及統計分析；高福強參與實驗設計；孫偉參與實驗設計，對文章知識性內容作批評性審閱；李子榮對文章知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中日友好醫院實驗動物福利倫理委員會批準（180110），動物使用許可證號：SYXK（京）2018-0036。實驗過程中動物處置均符合 2006 年科學技術部發布的《實驗動物保健與使用指導意見》要求。
激素應用已成為導致非創傷性股骨頭壞死的主要原因[1]，目前臨床上有多種治療方案，但總體治療效果不佳，早期診斷和干預仍是延緩病情進展、改善預后的關鍵。尋找一種能有效拮抗激素對骨組織損傷作用的治療方法，以降低該病發生率具有重要臨床意義。我們前期實驗研究表明，淫羊藿苷對高濃度激素造成的股骨頭內骨髓微血管內皮細胞損傷具有顯著保護作用[2]，臨床上也將淫羊藿苷制劑用于治療早期股骨頭壞死[3]。但是目前缺少淫羊藿苷對骨微結構影響的研究報道。為此，本次實驗以兔為研究對象，以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）聯合甲潑尼龍（methylprednisolone，MPS）注射制備早期激素性股骨頭壞死模型，通過 Micro-CT 掃描重建及病理學檢測，觀察淫羊藿苷對早期股骨頭壞死骨微結構的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
成年清潔級新西蘭兔 50 只，雌雄各半，體質量 2.5～3.0 kg，購于北京科宇動物養殖中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2018-0010。所有動物在中日友好醫院動物實驗室同一條件下分籠飼養，定量飼料及清潔飲用水喂食，室溫 20～25℃，濕度 50% 左右，自然光照，通風良好。
1.2 主要材料及儀器
LPS、淫羊藿苷、HE 染色試劑盒、青霉素鈉、10% 中性甲醛（北京索萊寶科技有限公司）；MPS（輝瑞制藥公司，美國）；烏拉坦（上海恒遠生物科技有限公司）。硬組織切片機、分層脫水機（Leica 公司，德國）；石蠟包埋機（北京中科亞光科技有限公司）；倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；Micro-CT（通用公司，美國）；Mimics17.0 圖像分割處理軟件（Materialise 公司，比利時）。
1.3 動物模型制備及分組
實驗動物適應性喂養 1 周，精確稱重后采用隨機數字表法分為對照組（10 只）、模型組（20 只）和實驗組（20 只）。3 組動物體質量及雌雄構成比差異均無統計學意義（P>0.05）。模型組及實驗組制備激素性股骨頭壞死模型。具體方法：經耳緣靜脈注射 1 次 LPS（5 μg/kg），正常喂養 24 h 后于雙側臀肌注射 MPS（20 mg/kg），每 24 小時注射 1 次，共注射 3 次。
實驗組首次注射 MPS 時開始灌胃給予淫羊藿苷，按照實驗動物用藥換算方法計算給藥劑量，將淫羊藿苷用蒸餾水配成 10 mL 藥液，每日灌胃 1 次，連續 6 周。對照組和模型組對應時間點灌胃 10 mL 生理鹽水。實驗動物在相同條件下普通喂養，采用懸吊法飲水迫使其下肢直立行走，每天籠外自由活動 2 h，以增加活動量和范圍，雙側臀肌每周交替注射 8 萬 U 青霉素鈉預防感染。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
觀察實驗動物存活、活動、精神狀況、飲食、排便、皮毛色澤及有無體表感染等，每周稱重。
1.4.2 大體觀察
第 1 次注射 MPS 6 周后，以 20% 烏拉坦靜脈麻醉處死 3 組實驗動物，取左側股骨頭，剔除周圍軟組織，觀察股骨頭輪廓外形、表面軟骨顏色、光滑度及軟骨剝脫情況。
1.4.3 Micro-CT 觀測
大體觀察后將股骨頭置于 10% 中性甲醛固定，Micro-CT 連續斷層掃描。掃描參數：電壓 80 kV，電流 450 μA，空間分辨率為 45 μm×45 μm×45 μm，曝光時間 2 000 ms。使用 Micro-CT 自帶軟件 CT-vox 對股骨頭進行三維重建，選擇軟骨下骨全部松質骨作為興趣區，CTan 定量分析骨小梁微結構，測量參數包括骨小梁相對體積（bone volume to total volume，BV/TV）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Tn）及骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）。
將采集的 CT 數據以 DICOM 格式導入 Mimics 軟件中，通過建立蒙版、閾值分割及涂抹充填等操作三維重建股骨頭骨性結構。選取橫斷面、冠狀位、矢狀位及三維視圖，多角度觀察股骨頭標本三維立體結構。
1.4.4 組織學觀察
Micro-CT 掃描結束后用硬組織切片機沿股骨頭標本冠狀面縱行剖開，重新置于 10% 中性甲醛固定 7 d，5% 硝酸溶液浸泡脫鈣 3 d。脫鈣滿意后分層脫水機梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，切片機切割、磨平、拋光，制備 20 μm 厚切片，脫蠟后 HE 染色，光鏡下觀察骨小梁結構、骨細胞及骨髓脂肪形態變化。
按照病理學診斷標準[4]檢測股骨頭壞死模型造模是否成功。診斷標準：骨小梁出現彌漫性空骨陷窩，骨細胞核固縮，周圍組織可見骨髓細胞壞死。高倍鏡下分析模型組、實驗組中診斷為股骨頭壞死的標本切片及對照組全部標本切片，每個標本選取 1 張，隨機選取 10 個視野統計 50 個骨細胞中空骨陷窩數量，計算各組空骨陷窩率（空骨陷窩數量/50）×100%。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；骨壞死發生率組間比較采用 Fisher 確切概率法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗期間共 7 只實驗動物死亡。其中，對照組 1 只因呼吸道感染死亡；模型組 1 只因急性腹瀉死亡、3 只靜脈注射 LPS 后死亡；實驗組 2 只于第 1 次注射 MPS 后拒絕進食并出現腹瀉癥狀，最終死亡。最終 43 只動物存活至實驗完成，其中對照組 9 只、模型組 16 只、實驗組 18 只。
除死亡動物外，模型組及實驗組靜脈注射 LPS 后共 9 只動物表現不同程度反應遲鈍、精神萎靡、呼吸加快以及眼瞼充血，3 只出現腹瀉、食欲不振，24 h 后癥狀逐漸緩解。連續 3 次注射 MPS 后，10 只動物活動減少、反應遲緩、飲食及體質量下降，4 周后進食恢復正常；股骨頭壞死動物皮毛失去光澤。對照組動物未見明顯異常，活動自如，正常飲食，體質量逐漸增加，皮毛光滑。
2.2 大體觀察
大體觀察各組全部股骨頭標本。對照組股骨頭外形輪廓正常、軟骨面光滑完整無塌陷，外觀潔白明亮；模型組大部分股骨頭軟骨下壞死范圍較大且較嚴重，關節面塌陷明顯，軟骨顏色灰暗，易于剖開，骨質松脆；實驗組大部分股骨頭仍保持圓形，軟骨面輕微凹陷，壞死區域呈現皺褶，軟骨無剝脫，軟骨面顏色基本正常。見圖 1。
圖1
股骨頭大體觀察
a. 對照組；b. 模型組；c. 實驗組
Figure1. General observation of the femoral heada. Control group; b. Model group; c. Experimental group
2.3 Micro-CT 觀測
Micro-CT 連續斷層掃描所有股骨頭標本。與對照組相比，模型組股骨頭壞死區域骨皮質明顯塌陷，軟骨面骨皮質變薄，軟骨下出現囊性變，骨小梁嚴重疏松、變細、結構紊亂、間隙顯著變寬，部分骨小梁斷裂甚至壞死；實驗組股骨頭壞死區域局限，骨皮質出現皺褶，壞死區軟骨面骨皮質輕度變薄，骨小梁結構尚可，只有部分骨小梁出現排列不規則，連續性中斷，骨小梁變細，間隙增大，密度輕度改變，有局限性修復。見圖 2。
圖2
股骨頭 Micro-CT 觀察
從左至右依次為 Micro-CT 三維重建圖像、Mimics 三維重建立體顯示圖像和冠狀位圖像 a. 對照組；b. 模型組；c. 實驗組
Figure2. Micro-CT observation of the femoral headFrom left to right for Micro-CT three-dimensional reconstruction，steric display and coronal display three-dimensional reconstructions by Mimics software a. Control group; b. Model group; c. Experimental group
與對照組相比，模型組和實驗組 Tb.N、Tb.Tn、BV/TV 下降、Tb.Sp 升高；與模型組相比，實驗組 Tb.N、Tb.Tn、BV/TV 升高、Tb.Sp 降低；組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
各組股骨頭骨微結構參數比較（）
Table1.
Comparison of bone microstructure parameters of the femoral heads between groups ()
2.4 組織學觀察
對照組：股骨頭軟骨較厚，骨小梁飽滿、排列規則整齊，骨小梁間充滿骨髓造血組織，脂肪細胞少、形態正常，橢圓形骨細胞沿骨小梁成串排列、核大居中，偶見散在的空骨陷窩。模型組：壞死灶主要位于松質骨及軟骨下區，軟骨層變薄缺損，軟骨下骨小梁結構紊亂、排列稀疏松散，可見骨小梁斷裂碎片，骨小梁中骨細胞減少，骨陷窩變大，空骨陷窩增多，骨細胞排列無序，骨小梁間脂肪細胞堆積、數目增多，部分肥大呈囊狀融合。實驗組：壞死區骨小梁形態及結構較模型組完整，骨小梁排列相對致密規則，骨小梁輕度變薄、間隙無明顯增大，部分骨細胞凋亡，空骨陷窩少，脂肪細胞無明顯肥大。見圖 3。
圖3
股骨頭 HE 染色觀察
從左至右為放大 40、200、400 倍，箭頭示空骨陷窩 a. 對照組；b. 模型組；c. 實驗組
Figure3. HE staining of the femoral headFrom left to right for magnifications of 40, 200, and 400, respectively; arrow indicated the empty lacunae a. Control group; b. Model group; c. Experimental group
按照股骨頭壞死病理學診斷標準，對照組無骨壞死發生；模型組骨壞死發生率為 81.3%（13/16），實驗組為 66.7%（12/18），組間比較差異無統計學意義（P=0.448）。模型組和實驗組發生壞死的股骨頭標本其空骨陷窩率分別為 33.1%±1.4% （n=13）及 18.9%±0.8% （n=12），均高于對照組 12.7%±1.5% （n=9），且模型組明顯高于實驗組，組間差異均有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
激素在多種疾病治療中起著不可替代的作用，然而在給患者帶來滿意治療效果的同時也會產生嚴重并發癥，如股骨頭壞死[4]。我們前期臨床研究結果表明，激素累計使用量超過 2 000 mg（折合成 MPS）或者每日劑量超過 30 mg 以及靜脈沖擊使用激素的患者，其骨壞死發生風險顯著增高，發病率約為 33%[5]。另一項日本學者的研究中，由于激素應用導致的股骨頭壞死患者占非創傷性股骨頭壞死患者的 47.4%[6]。如果不進行有效干預，80% 患者將在 1～5 年內進展至股骨頭塌陷[7]，進而影響髖關節功能，晚期只能進行人工髖關節置換[8]。早期診斷和有效干預依然是延緩股骨頭壞死病情進展，推遲人工關節置換時間的關鍵。人體股骨頭標本研究表明，激素導致的股骨頭壞死以多發灶性溶骨性骨質破壞為主要特點[9]。激素性股骨頭壞死發生機制尚未完全明確，可能是通過直接損傷骨細胞及骨髓微血管內皮細胞導致骨細胞及骨組織壞死[10-11]。因此，如果能找到一種可以有效拮抗激素這種毒副作用的藥物，將有可能從源頭上降低該病的發生率。
淫羊藿苷是小檗科淫羊藿屬植物莖葉提取物的主要化學成分，屬于黃酮類化合物，具有多種生物活性。現代藥理學認為淫羊藿苷具有性激素樣作用，可以促進骨組織蛋白合成及成骨細胞生長，從而有益于骨再生和骨修復[3, 12]。動物研究表明，淫羊藿苷具有成骨作用，可促進骨缺損再生，加速骨修復[13-14]。我們牽頭開展的一項多中心隨機雙盲對照試驗發現，長期服用激素的患者同時服用由淫羊藿苷組成的復方制劑 6 個月后，股骨頭壞死發生率（6.98%，9/129）顯著低于未服用復方制劑患者（14.4%，21/146）[3]。此外，有研究表明淫羊藿苷在抑制骨量丟失、改善骨質疏松方面也具有顯著效果[12, 15-16]。
近年來，國內外對淫羊藿苷的成骨作用研究較多，其成骨機制也是研究熱點。BMSCs 是骨髓內多能干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，可以分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、內皮細胞等。Fan 等[17]體外實驗發現淫羊藿苷可以增強 BMSCs 自我復制及向成骨細胞定向分化的能力，并且與劑量成正相關。還有研究表明，淫羊藿苷在促進 BMSCs 成骨分化、增加成骨細胞數量的同時，還會抑制其向脂肪細胞分化[18-19]。此外，淫羊藿苷一方面增強成骨細胞的活性、促進成骨[20-22]，另一方面抑制破骨細胞活動、降低骨吸收[23]，對透明軟骨、鈣化軟骨及軟骨下骨也有保護作用[24]。研究還表明淫羊藿苷具有拮抗激素對血管內皮細胞損傷的作用，促進內皮細胞在體內遷移、增殖、成管，從而誘導新生血管形成[2, 25-26]，增加局部血流，改善微循環，共同促進骨修復，對延緩骨壞死病情進展有重要作用。
目前，股骨頭壞死動物模型制備方法有很多種，其中 MPS 聯合 LPS 更符合人激素性股骨頭壞死病理改變[27]，因此本實驗采用該方法建立兔激素性股骨頭壞死模型，觀察淫羊藿苷對早期股骨頭壞死的干預作用。Micro-CT 可清楚顯示標本每一層面骨小梁結構，在觀察骨微結構方面具有特殊優勢，同時本實驗還創新性將標本用 Mimics 軟件進行三維重建。經淫羊藿苷干預后的股骨頭壞死標本軟骨輕度變薄、骨小梁結構尚可，破壞不明顯，三維重建顯示軟骨下松質骨仍呈均勻、致密的立體網狀結構。而無淫羊藿苷干預的模型組股骨頭軟骨塌陷明顯，骨小梁破壞嚴重，骨小梁之間的連接斷裂，與骨微結構參數比較結果一致。組織學研究顯示經淫羊藿苷干預后兔股骨頭壞死造模成功率降低，股骨頭壞死標本的空骨陷窩率也低于模型組，骨細胞凋亡及脂肪細胞無明顯增多。
綜上述，激素對兔股骨頭微結構具有顯著破壞作用，造成骨細胞凋亡及骨髓脂肪細胞增生，而淫羊藿苷可以有效降低這種損傷作用，減少骨細胞凋亡，促進局部骨修復，延緩病情進展。
作者貢獻：時利軍參與實驗設計及實施、數據收集整理及統計分析、文章起草；毛天立參與實驗實施、數據收集整理及統計分析；羅攀參與實驗實施及數據收集；李騰奇參與實驗實施及統計分析；高福強參與實驗設計；孫偉參與實驗設計，對文章知識性內容作批評性審閱；李子榮對文章知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中日友好醫院實驗動物福利倫理委員會批準（180110），動物使用許可證號：SYXK（京）2018-0036。實驗過程中動物處置均符合 2006 年科學技術部發布的《實驗動物保健與使用指導意見》要求。
