引用本文： 吳元剛, 曾羿, 李明陽, 劉淵, 楊靜, 沈彬. 不同階段骨關節炎滑膜組織中腎素、血管緊張素轉換酶及血管緊張素受體 1、2 的表達研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(3): 362-366. doi: 10.7507/1002-1892.201904065 復制
骨關節炎是臨床常見慢性關節疾病之一，研究表明炎性介質的參與是骨關節炎發生的重要因素[1-2]，例如 TNF-α、IL-6、 IL-β 可以造成軟骨進行性變性，甚至引起軟骨細胞死亡和細胞外基質的丟失[3-6]。
腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin-system，RAS）包括腎素（Renin）[7]、血管緊張素 Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）[8]、血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）[9]和血管緊張素受體 1（angiotensin receptor 1，AT1R）、AT2R[10]等，其作為激素系統調節血壓和體液內環境穩定已經被研究證實。近年來，研究發現 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 在人和動物的滑膜組織中表達，并參與骨關節炎的發生[11]。同時，在急性和慢性骨關節炎動物模型中，ACE 抑制劑喹那普利能減少關節內 TNF-α 的產生，具有抗炎特性，能夠抑制膠原酶誘導的關節炎的發生、發展[12-13]。因此，Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 是關節退變過程中重要介質。本研究旨在分析不同階段骨關節炎患者滑膜組織中 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 表達差異，為進一步闡明骨關節炎發病機制以及為該病的防治提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 研究對象及標本處理
以 2018 年 1 月—12 月因創傷行膝上截肢術、骨關節炎行人工全膝關節置換術的患者作為研究對象。骨關節炎患者均按照 1995 年美國風濕病學會（ARA）制定的診斷標準確診。排除標準：① 類風濕性關節炎、痛風性關節炎等其他關節炎性疾病；② 合并嚴重心、腦、肝、腎等重要臟器病變；③ 近 3 個月有關節腔注射史。
共 32 例患者符合選擇標準納入研究，根據 Kellgren-Lawrence（K-L）X 線分級標準[14]分為正常滑膜組（A 組，9 例）、中度骨關節炎滑膜組（B 組，11 例，K-L 3 級）及晚期骨關節炎滑膜組（C 組，12 例，K-L 4 級）。其中，A 組男 5 例，女 4 例；年齡 21～35 歲，平均 27.7 歲；B 組男 4 例，女 7 例；年齡 54～61 歲，平均 57.3 歲； C 組男 5 例，女 7 例；年齡 62～68 歲，平均 64.6 歲。術中取滑膜組織標本，無菌環境中 PBS 沖洗 3 次， 然后剪成 1 cm×1 cm 大小組織塊，備用。
1.2 主要試劑及儀器
TRIzol 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；TaqMan 反轉錄試劑盒（Biosystems 公司，美國）；SYBR Green Ⅰ PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）；BCA 蛋白定量試劑盒、化學發光試劑顯影免疫復合物 （Bio-Rad 公司，美國）。ABI 7300 熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.3 觀測指標
1.3.1 實時熒光定量 PCR 檢測
取各組滑膜組織標本用 TRIzol 溶液提取總 RNA，然后按試劑盒說明書逆轉錄成 cDNA，將目的基因進行轉錄擴增，反應條件：94℃ 預變性 2 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，總共循環 50 次。PCR 引物序列見表 1。按照 2?ΔΔCt 值計算法，以 GAPDH 為內參，計算 Renin、ACE、AT1R 及 AT2R mRNA 相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列及大小
Table1.
Sequence and size of qRT-PCR primers
1.3.2 Western blot 檢測
取各組滑膜組織標本置于 RIPA 緩沖液中進行勻漿，4℃ 以離心半徑 5 cm、13 000 r/min 離心 15 min，取上清；采用 BCA 蛋白試劑盒測定總蛋白濃度。使用 12%SDS-PAGE 分離總蛋白，并在 250 mA、2 h 條件下將蛋白轉移到硝酸纖維素膜。室溫下，將膜置于含 5% 脫脂牛奶的 TBST 封閉 1.5 h； 4℃ 下與 Renin（1∶1 000）、ACE（1∶1 000）、AT1R（1∶1 000）、AT2R（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗孵育過夜；與相應的抗兔/抗鼠二抗孵育 1.5 h。將條帶與化學發光試劑顯影免疫復合物結合觀察，采用 Image J 軟件分析灰度值。以與 GAPDH 條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
B、C 組 Renin、ACE、AT1R mRNA 及蛋白相對表達量明顯高于 A 組，C 組 ACE、AT1R mRNA 及蛋白相對表達量以及 Renin 蛋白相對表達量明顯高于 B 組；B、C 組 AT2R mRNA 及蛋白相對表達量明顯低于 A 組，C 組低于 B 組。上述指標組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 1、2。
圖1
實時熒光定量 PCR 檢測 3 組滑膜組織中 Renin、ACE、 AT1R 和 AT2R mRNA 表達
Figure1.
The mRNA expressions of Renin, ACE, AT1R, and AT2R in 3 groups detected by qRT-PCR
圖2
Western blot 檢測 3 組滑膜組織中 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 蛋白表達
a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組 3：C 組；b、c. 目的蛋白相對表達量
Figure2. The protein expressions of Renin, ACE, AT1R, and AT2R in 3 groups detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B3: Group C; b, c. Target protein relative expression
3 討論
研究證實，骨關節炎病理改變主要為軟骨細胞增生肥大、軟骨基質分離降解和軟骨下骨血管增生[15]。Kawakami 等[16]的研究對骨關節炎軟骨細胞進行分離培養，經實時熒光定量 PCR 檢測證實軟骨細胞表達 RAS 中的血管緊張素受體，且在 IL-1 刺激下表達有增高趨勢，說明 RAS 成分參與了骨關節炎病理過程中的炎癥反應。Tsukamoto 等[17]報道骨關節炎軟骨細胞增生肥大與 RAS 中的血管緊張素受體有關。上述研究結果提示軟骨內局部 RAS 與骨關節炎的病理改變相關，其關鍵位點可能成為骨關節炎防治新靶點。
ACE 是 RAS 系統中的關鍵酶，可以催化 AngⅠ 轉化為 AngⅡ，參與骨關節炎病理過程[18]。本研究實時熒光定量 PCR 以及 Western blot 檢測結果顯示，中、晚期骨關節炎滑膜組織中的 ACE 表達水平明顯高于正常人群。既往研究報道骨關節炎患者滑膜組織中存在 ACE 且表達呈上調趨勢，促進血管生成，造成骨關節炎的病理發展[18]。而 ACE 抑制劑能抑制 NF-κB 和炎癥因子（如 TNF-α 和 IL-1β）能力，因此使用 ACE 抑制劑能夠延緩骨關節炎的發展[18-19]。Martin 等[19]通過臨床試驗評估了 ACE 抑制劑卡托普利治療類風濕性關節炎的效果。該研究包括 15 例活動性類風濕性關節炎患者，經隨訪 48 周，10 例患者類風濕性關節炎臨床癥狀改善，包括關節疼痛緩解和關節腫脹減輕；24、48 周時炎癥因子 C 反應蛋白水平也降低。上述研究結果說明，通過抑制 RAS 中 ACE 的關鍵靶點，可能是防治骨關節炎病理進展的新方法。
本研究還發現，中、晚期骨關節炎滑膜組織中 AT1R 表達水平明顯高于正常人群。研究證實[20]，AngⅡ 對各種組織和器官的調控作用主要是通過 AT1R 和 AT2R 完成的，其中 AT1R 介導大多數 AngⅡ 功能，滑膜組織產生的 AngⅡ 通過作用于滑膜 AT1R，調節滑膜灌注和生長，影響關節炎發生、發展。本研究還發現隨著 K-L 分級增加，滑膜組織中 AT1R 表達水平逐漸提高。Silveira 等[21]發現骨關節炎大鼠 AT1R 和 ACE 表達顯著增強，但是使用氯沙坦干預后局部炎癥反應降低，骨關節炎相關的組織學變化得到改善。同時，Silveira 等還觀察到氯沙坦可減少中性粒細胞的募集，減少 TNF-α 和 IL-1β 的產生，并直接抑制白細胞-內皮細胞的相互作用。以上研究均表明抑制關節炎局部的 RAS 關鍵靶點，能夠延緩骨關節炎的進展。
另外，隨著骨關節炎 K-L 分級增加，膝關節滑膜組織中 AT1R 表達逐漸增加，但是 AT2R 表達逐漸降低，分析原因為在多種組織和器官中，AngⅡ 可通過 AT1R 發揮其類似細胞因子的作用[22-23]，隨著骨關節炎嚴重程度增加，滑膜組織中 AT1R 水平提高，促進血管生成，造成軟骨破壞；阻斷 AT1R 后，增強的 Ang Ⅱ 水平可導致 AT2R 活性增加，而 AT2R 作用被認為與 AT1R 相反，因此增加 AT2R 表達能夠潛在誘導抗炎機制激活，從而延緩關節炎進展。Tang 等[24]的研究顯示，與假手術組相比，骨關節炎組大鼠脛骨近端 AT1R mRNA 和蛋白相對表達量增加，而 AT2R mRNA 和蛋白表達下降。此外，與單純骨關節炎組相比，卡托普利治療的骨關節炎組 AT2R 表達增加而 AT1R 表達減少。另外，Sagawa 等[25]報道，血管緊張素受體抑制劑奧美沙坦能抑制膠原酶誘導的骨關節炎的發展，研究發現奧美沙坦顯著抑制了小鼠淋巴細胞增殖和 IFN-γ 的產生。因此，AT2R 激動劑具有作為治療炎癥和免疫疾病藥物的潛力。
綜上述，本研究發現隨著骨關節炎加重，關節滑膜組織中 Renin、ACE、AT1R 表達量顯著高于正常人群，AT2R 表達量呈下降趨勢，說明滑膜組織中 RAS 系統相關組分與骨關節炎發展相關，為骨關節炎的早期預測以及干預提供了新思路。
作者貢獻：吳元剛負責文章撰寫及臨床標本收集，李明陽和劉淵負責數據收集整理及統計分析，楊靜負責臨床標本收集，沈彬和曾羿負責科研設計、對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經四川大學華西醫院醫學倫理委員會批準（201302007）。患者均簽署知情同意書。
骨關節炎是臨床常見慢性關節疾病之一，研究表明炎性介質的參與是骨關節炎發生的重要因素[1-2]，例如 TNF-α、IL-6、 IL-β 可以造成軟骨進行性變性，甚至引起軟骨細胞死亡和細胞外基質的丟失[3-6]。
腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin-system，RAS）包括腎素（Renin）[7]、血管緊張素 Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）[8]、血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）[9]和血管緊張素受體 1（angiotensin receptor 1，AT1R）、AT2R[10]等，其作為激素系統調節血壓和體液內環境穩定已經被研究證實。近年來，研究發現 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 在人和動物的滑膜組織中表達，并參與骨關節炎的發生[11]。同時，在急性和慢性骨關節炎動物模型中，ACE 抑制劑喹那普利能減少關節內 TNF-α 的產生，具有抗炎特性，能夠抑制膠原酶誘導的關節炎的發生、發展[12-13]。因此，Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 是關節退變過程中重要介質。本研究旨在分析不同階段骨關節炎患者滑膜組織中 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 表達差異，為進一步闡明骨關節炎發病機制以及為該病的防治提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 研究對象及標本處理
以 2018 年 1 月—12 月因創傷行膝上截肢術、骨關節炎行人工全膝關節置換術的患者作為研究對象。骨關節炎患者均按照 1995 年美國風濕病學會（ARA）制定的診斷標準確診。排除標準：① 類風濕性關節炎、痛風性關節炎等其他關節炎性疾病；② 合并嚴重心、腦、肝、腎等重要臟器病變；③ 近 3 個月有關節腔注射史。
共 32 例患者符合選擇標準納入研究，根據 Kellgren-Lawrence（K-L）X 線分級標準[14]分為正常滑膜組（A 組，9 例）、中度骨關節炎滑膜組（B 組，11 例，K-L 3 級）及晚期骨關節炎滑膜組（C 組，12 例，K-L 4 級）。其中，A 組男 5 例，女 4 例；年齡 21～35 歲，平均 27.7 歲；B 組男 4 例，女 7 例；年齡 54～61 歲，平均 57.3 歲； C 組男 5 例，女 7 例；年齡 62～68 歲，平均 64.6 歲。術中取滑膜組織標本，無菌環境中 PBS 沖洗 3 次， 然后剪成 1 cm×1 cm 大小組織塊，備用。
1.2 主要試劑及儀器
TRIzol 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；TaqMan 反轉錄試劑盒（Biosystems 公司，美國）；SYBR Green Ⅰ PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）；BCA 蛋白定量試劑盒、化學發光試劑顯影免疫復合物 （Bio-Rad 公司，美國）。ABI 7300 熒光定量 PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.3 觀測指標
1.3.1 實時熒光定量 PCR 檢測
取各組滑膜組織標本用 TRIzol 溶液提取總 RNA，然后按試劑盒說明書逆轉錄成 cDNA，將目的基因進行轉錄擴增，反應條件：94℃ 預變性 2 min，94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，總共循環 50 次。PCR 引物序列見表 1。按照 2?ΔΔCt 值計算法，以 GAPDH 為內參，計算 Renin、ACE、AT1R 及 AT2R mRNA 相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列及大小
Table1.
Sequence and size of qRT-PCR primers
1.3.2 Western blot 檢測
取各組滑膜組織標本置于 RIPA 緩沖液中進行勻漿，4℃ 以離心半徑 5 cm、13 000 r/min 離心 15 min，取上清；采用 BCA 蛋白試劑盒測定總蛋白濃度。使用 12%SDS-PAGE 分離總蛋白，并在 250 mA、2 h 條件下將蛋白轉移到硝酸纖維素膜。室溫下，將膜置于含 5% 脫脂牛奶的 TBST 封閉 1.5 h； 4℃ 下與 Renin（1∶1 000）、ACE（1∶1 000）、AT1R（1∶1 000）、AT2R（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗孵育過夜；與相應的抗兔/抗鼠二抗孵育 1.5 h。將條帶與化學發光試劑顯影免疫復合物結合觀察，采用 Image J 軟件分析灰度值。以與 GAPDH 條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
B、C 組 Renin、ACE、AT1R mRNA 及蛋白相對表達量明顯高于 A 組，C 組 ACE、AT1R mRNA 及蛋白相對表達量以及 Renin 蛋白相對表達量明顯高于 B 組；B、C 組 AT2R mRNA 及蛋白相對表達量明顯低于 A 組，C 組低于 B 組。上述指標組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 1、2。
圖1
實時熒光定量 PCR 檢測 3 組滑膜組織中 Renin、ACE、 AT1R 和 AT2R mRNA 表達
Figure1.
The mRNA expressions of Renin, ACE, AT1R, and AT2R in 3 groups detected by qRT-PCR
圖2
Western blot 檢測 3 組滑膜組織中 Renin、ACE、AT1R 和 AT2R 蛋白表達
a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組 3：C 組；b、c. 目的蛋白相對表達量
Figure2. The protein expressions of Renin, ACE, AT1R, and AT2R in 3 groups detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B3: Group C; b, c. Target protein relative expression
3 討論
研究證實，骨關節炎病理改變主要為軟骨細胞增生肥大、軟骨基質分離降解和軟骨下骨血管增生[15]。Kawakami 等[16]的研究對骨關節炎軟骨細胞進行分離培養，經實時熒光定量 PCR 檢測證實軟骨細胞表達 RAS 中的血管緊張素受體，且在 IL-1 刺激下表達有增高趨勢，說明 RAS 成分參與了骨關節炎病理過程中的炎癥反應。Tsukamoto 等[17]報道骨關節炎軟骨細胞增生肥大與 RAS 中的血管緊張素受體有關。上述研究結果提示軟骨內局部 RAS 與骨關節炎的病理改變相關，其關鍵位點可能成為骨關節炎防治新靶點。
ACE 是 RAS 系統中的關鍵酶，可以催化 AngⅠ 轉化為 AngⅡ，參與骨關節炎病理過程[18]。本研究實時熒光定量 PCR 以及 Western blot 檢測結果顯示，中、晚期骨關節炎滑膜組織中的 ACE 表達水平明顯高于正常人群。既往研究報道骨關節炎患者滑膜組織中存在 ACE 且表達呈上調趨勢，促進血管生成，造成骨關節炎的病理發展[18]。而 ACE 抑制劑能抑制 NF-κB 和炎癥因子（如 TNF-α 和 IL-1β）能力，因此使用 ACE 抑制劑能夠延緩骨關節炎的發展[18-19]。Martin 等[19]通過臨床試驗評估了 ACE 抑制劑卡托普利治療類風濕性關節炎的效果。該研究包括 15 例活動性類風濕性關節炎患者，經隨訪 48 周，10 例患者類風濕性關節炎臨床癥狀改善，包括關節疼痛緩解和關節腫脹減輕；24、48 周時炎癥因子 C 反應蛋白水平也降低。上述研究結果說明，通過抑制 RAS 中 ACE 的關鍵靶點，可能是防治骨關節炎病理進展的新方法。
本研究還發現，中、晚期骨關節炎滑膜組織中 AT1R 表達水平明顯高于正常人群。研究證實[20]，AngⅡ 對各種組織和器官的調控作用主要是通過 AT1R 和 AT2R 完成的，其中 AT1R 介導大多數 AngⅡ 功能，滑膜組織產生的 AngⅡ 通過作用于滑膜 AT1R，調節滑膜灌注和生長，影響關節炎發生、發展。本研究還發現隨著 K-L 分級增加，滑膜組織中 AT1R 表達水平逐漸提高。Silveira 等[21]發現骨關節炎大鼠 AT1R 和 ACE 表達顯著增強，但是使用氯沙坦干預后局部炎癥反應降低，骨關節炎相關的組織學變化得到改善。同時，Silveira 等還觀察到氯沙坦可減少中性粒細胞的募集，減少 TNF-α 和 IL-1β 的產生，并直接抑制白細胞-內皮細胞的相互作用。以上研究均表明抑制關節炎局部的 RAS 關鍵靶點，能夠延緩骨關節炎的進展。
另外，隨著骨關節炎 K-L 分級增加，膝關節滑膜組織中 AT1R 表達逐漸增加，但是 AT2R 表達逐漸降低，分析原因為在多種組織和器官中，AngⅡ 可通過 AT1R 發揮其類似細胞因子的作用[22-23]，隨著骨關節炎嚴重程度增加，滑膜組織中 AT1R 水平提高，促進血管生成，造成軟骨破壞；阻斷 AT1R 后，增強的 Ang Ⅱ 水平可導致 AT2R 活性增加，而 AT2R 作用被認為與 AT1R 相反，因此增加 AT2R 表達能夠潛在誘導抗炎機制激活，從而延緩關節炎進展。Tang 等[24]的研究顯示，與假手術組相比，骨關節炎組大鼠脛骨近端 AT1R mRNA 和蛋白相對表達量增加，而 AT2R mRNA 和蛋白表達下降。此外，與單純骨關節炎組相比，卡托普利治療的骨關節炎組 AT2R 表達增加而 AT1R 表達減少。另外，Sagawa 等[25]報道，血管緊張素受體抑制劑奧美沙坦能抑制膠原酶誘導的骨關節炎的發展，研究發現奧美沙坦顯著抑制了小鼠淋巴細胞增殖和 IFN-γ 的產生。因此，AT2R 激動劑具有作為治療炎癥和免疫疾病藥物的潛力。
綜上述，本研究發現隨著骨關節炎加重，關節滑膜組織中 Renin、ACE、AT1R 表達量顯著高于正常人群，AT2R 表達量呈下降趨勢，說明滑膜組織中 RAS 系統相關組分與骨關節炎發展相關，為骨關節炎的早期預測以及干預提供了新思路。
作者貢獻：吳元剛負責文章撰寫及臨床標本收集，李明陽和劉淵負責數據收集整理及統計分析，楊靜負責臨床標本收集，沈彬和曾羿負責科研設計、對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經四川大學華西醫院醫學倫理委員會批準（201302007）。患者均簽署知情同意書。
