在運動系統中，腱-骨結合部在運動過程中起到抗拉伸、承載負荷的作用，因此其愈合效果在恢復關節功能方面起到至關重要的作用。腱-骨界面損傷修復過程多為瘢痕組織形成，從形態結構和生物力學強度方面難以達到理想效果。而組織工程方法能夠從種子細胞、生長因子、支架材料三方面來促進腱-骨愈合效果，是腱-骨愈合發展領域的新方向。
引用本文： 呂晶同, 施又興, 王云蛟, 康夏, 卞旭廷, 袁寶, 朱敏, 唐康來. 腱-骨結合部結構化界面修復的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(9): 1064-1070. doi: 10.7507/1002-1892.201811139 復制
腱-骨結合部存在天然的 4 層結構，包括肌腱組織、非鈣化的纖維軟骨組織、鈣化的纖維軟骨組織和骨組織。腱-骨愈合與多因素相關，由于軟-硬組織之間界面愈合容易形成瘢痕，以及損傷造成纖維軟骨區域缺乏血供及骨量丟失，最終導致腱-骨愈合緩慢且質量欠佳，同時結合部 4 層結構的重建也很困難。因此，尋找理想的腱-骨愈合方法，研究其分子生物學機制具有重要意義。目前，國內外研究主要著眼于“結構化界面修復”這一概念，修復總原則是功能性地連接軟-硬組織。現回顧分析促進腱-骨愈合方法的相關研究文獻，對研究進展進行歸納總結。
1 腱-骨愈合基本過程及促進愈合的原則
正常腱-骨連接位點分為非直接連接及直接連接兩類。非直接連接為致密的纖維組織將移植物包繞連接并固定于骨面，如前交叉韌帶重建術中韌帶和骨道壁的連接。直接連接的連接點為一個直接嵌入的天然轉化區域，重新建立直接連接要經歷 Sharpey 樣纖維形成過程，即新生骨小梁生成、成纖維細胞富集、軟骨樣細胞富集、膠原纖維成熟 4 個階段，最終通過 Sharpey 樣纖維的演變形成典型的 腱-骨結合部 4 層結構。
為兼顧兩種連接類型愈合方式，目前促進腱-骨結合部愈合方法的基本原則包括兩點：① 改良肌腱或韌帶重建術及固定方式，獲得最大腱-骨接觸面積、足夠的穩定接觸時間、合適的接觸程度和最小的外力影響[1]。② 選擇合適的支架材料，以更好地模擬腱-骨結合部 4 層結構，同時通過增加種子細胞、生長因子等增強材料生物學性能，更好地促進腱-骨愈合。
2 促進腱-骨愈合的常用方法
從生物力學角度分析，采用組織工程方法促進腱-骨愈合面臨 3 個挑戰[2]。首先，腱-骨界面愈合過程中必須保持穩定；第二，愈合過程中需誘導生成具有梯度結構的組織；第三，支架材料不僅能富集多種細胞，而且在富集細胞過程中能持續保持具有梯度的生物力學結構。一個成熟的促進腱-骨愈合方案需要設計梯度化結構，以滿足自然過渡界面的時空特點，以及選擇合適的種子細胞、生長因子[3]。
2.1 種子細胞
MSCs 常作為種子細胞來促進腱-骨愈合，其具有高度多向分化潛能，存在于全身器官間質和結締組織中。研究最常用的 MSCs 包括 BMSCs、脂肪來源間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、肌腱來源間充質干細胞 （tendon-derived stem cells，TDSCs）等。Zhang 等[4]研究發現，TDSCs 分泌的細胞外基質成分可促進細胞成肌腱分化。研究表明，創傷后肌腱的退行性變與 TDSCs 增殖增強以及分化被抑制、原平衡被打破有關[5]。Nourissat 等[6]將 BMSCs 注射至跟腱止點損傷模型大鼠的跟腱損傷處，45 d 后發現腱-骨界面出現了類似正常連接界面的鈣化及未鈣化的纖維軟骨典型 4 層結構。有研究對采用肩關節鏡修復肩袖損傷患者注射濃縮自體 BMSCs，經過 24 個月隨訪，超聲和 MRI 檢查顯示 BMSCs 注射組治愈率（100%）明顯高于對照組（67%）[7]。除 BMSCs 外，ADSCs 也是較常用的種子細胞，可通過微創吸脂術獲得的脂肪組織分離培養，該細胞能釋放免疫抑制因子，植入體內后不會引起強烈的免疫排斥反應。Ko 等[8]研究了 ADSCs 在兔肩袖慢性損傷模型中促進腱-骨愈合的作用，組織學觀察見 ADSCs 注射組脂肪浸潤程度明顯輕于對照組。此外，胎兒羊膜細胞因低免疫原性、良好抗菌性能和促進血管生成能力，也作為種子細胞應用于組織工程肌腱領域[9]。
2.2 支架材料
支架材料根據來源可分為生物衍生支架材料、無機物支架材料和有機合成支架材料 3 類。
2.2.1 生物衍生支架材料
生物衍生支架材料按來源可分為自體、同種異體和異種支架。生物衍生支架材料的天然來源決定了其具有良好生物學特性，對細胞降解、組織重塑和信息傳遞敏感；但因后期加工困難、存在免疫原性以及生物力學性能欠佳，逐漸被新型材料取代。Breidenbach 等[10]根據組織工程技術原理，設計了模仿正常肌腱生物學參數且具有適當機械性能的支架材料，他們將細胞表觀遺傳學、細胞外基質組成及組織超微結構作為參考依據，最終制成可釋放潛在成骨蛋白的支架材料用于促進腱-骨愈合。Kili?o?lu 等[11]的研究選取脫細胞去礦物質骨基質作為支架材料，利用其可釋放潛在成骨蛋白的功能促進腱-骨愈合。Chen 等[12]的研究表明，采用絲素蛋白復合膠原纖維制成的支架材料，能夠提高 MSCs 中 Epha4 和 Scleraxis 基因的表達，從而促進細胞在支架材料上的黏附，達到更好修復跟腱損傷的效果。脫細胞肌腱是與正常肌腱組織結構最相似的支架材料，作為肌腱替代物已廣泛用于臨床治療和基礎研究。Wang 等[13]總結了脫細胞肌腱的不同處理方式，作為支架材料其免疫原性是需要解決的最大問題；另外，脫細胞降解過程中所產生的抗體將隨著血液循環分布到身體各處，產生的影響有待進一步評估。
2.2.2 無機物支架材料
無機物支架材料以磷酸鈣或磷酸鎂類為主，主要作用為促進腱-骨愈合過程中的骨化。研究表明[14]，磷酸鈣有促進骨長入肌腱表面的作用，目前已廣泛用于促進腱-骨愈合及組織工程其他成骨相關領域。 Weimin 等[15]制備了可注射的磷酸鈣骨水泥，該材料具有良好的孔隙結構，可更好地促進成骨，從而促進前交叉韌帶重建術后腱-骨愈合。Zhao 等[16]比較了磷酸鈣黏合材料及羥基磷灰石材料，發現兩種材料均可促進細胞黏附、增殖以及新骨生成，但磷酸鈣黏合材料促進生長因子分泌的作用更明顯，從而可更大程度促進腱-骨愈合。同時，Weimin 等[15]研究了可注射型磷酸鈣黏合材料復合 BMP-2 促進兔前交叉韌帶愈合效果，結果顯示該材料具有更好的骨整合效果，重建的前交叉韌帶抗牽拉強度也更大。無機物支架材料有容易合成和塑形的優點，但也存在免疫原性大，可能引起免疫排斥反應，以及不能達到理想的生物力學強度等不足。
2.2.3 有機合成支架材料
有機合成支架材料包括不可降解高分子聚合物材料及生物可降解材料。前者如聚氨基甲酸乙酯、聚碳酸酯和聚四氟乙烯等，該材料優點是具有良好的可塑性及抗牽拉強度，可保持長時間不降解；缺點是易碎裂，而且碎片作為代謝物在組織中持續存在，常影響組織的愈合并成為持續的感染源。而生物可降解材料能在降解時維持一定程度生物力學強度，從而為組織細胞提供生物相容性良好的支架。該類材料包括聚乳酸-羥基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）、左旋聚乳酸、聚乙酸內酯（polycaprolactone，PCL）等[17]。研究表明[18-19]有機合成支架材料來源廣，植入較容易，能增加細胞黏附性，促進細胞外基質產生，但往往生物力學性能欠佳且生產成本也較高。
Liu 等[20]采用靜電紡絲技術將 PLGA 和 PCL 制成具有梯度濃度的支架材料，研究表明該支架材料能很好地創建腱-骨界面微環境并重建腱-骨界面。靜電紡絲技術為構建有機合成材料的超微結構提供了技術支持。Naghashzargar 等[21]制作了一種新型支架材料，該材料以蠶絲蛋白為內核，采用靜電紡絲技術將 P3HB 和 PCL 纖維包繞在蠶絲蛋白表面。結果表明該材料抗拉伸性能強，其生物力學強度能滿足前交叉韌帶重建的力學性能要求。Yokoya 等[22]將聚乙醇酸薄片用于治療兔肩袖損傷模型，結果顯示可產生重建纖維軟骨層界面愈合的類似效果。綜上，這類有機合成支架材料作為移植物和骨之間的媒介，可促進細胞遷移和增殖，從而在腱-骨愈合處形成一個富含種子細胞及自體功能細胞的活性區域，最終達到促進腱-骨愈合效果。
2.2.4 梯度仿生材料
傳統支架材料均有一定局限性，需要對其結構、表型等方面進行改進，以更好地促進腱-骨愈合。骨組織堅硬，而肌腱組織堅韌且可延展性強，因此腱-骨界面壓力必須通過兩種剛度不同的材料來進行傳導，這樣的結構特性增加了不愈合發生風險[23-24]。要解決此問題，需要在結構和組分兩方面模擬梯度濃度進行改進，以更好地模擬過渡區域的機械性能以及分散集中的應力[25]。理想的支架材料必須能支持細胞表型表達，同時在成分組成和微觀結構方面能模擬正常界面形態[26-27]。既往研究顯示，增加礦物質能使界面處材料呈近似指數增長過程，能夠更好地促進腱-骨愈合[20-31]。目前，微系統的出現為解決濃度梯度難題提供了支持。微系統是一項以細胞或組織為對象的微操作技術，它將高通量便于分析的結構集成于小體積芯片材料上，從而制造一個穩定、局部、可復制的分子濃度梯度微環境。而細胞的遷移、分化很大程度上依賴于生長因子分布和濃度梯度形成，因此在芯片上形成的微系統模仿器官功能可達到參數可調節性，可進行組織、器官整體模擬[28]，被廣泛應用于支架材料制作與修飾過程。
2.3 生長因子
生長因子是一類能夠調節生物體內細胞生長活動的多肽類物質。目前研究集中在誘導成骨類生長因子，主要包括 BMP、TGF、bFGF、PDGF、FGF、IGF、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMP）、VEGF 等。這些生長因子通過成骨誘導作用，在早期血管生長過程中起促進作用。因此在腱-骨愈合不同階段，針對性地加入特定生長因子，可以對腱-骨愈合起到積極作用。
諸多研究已證實重組人 BMP 在新骨形成過程中發揮重要作用[32]。Kabuto 等[33]制作了可持續釋放 BMP-7 的明膠水凝膠薄膜，用于修復 SD 大鼠肩袖損傷模型。結果發現其能促進腱-骨結合部形成良好的軟骨基質及肌腱，修復后的肩袖生物力學及組織學成熟程度，包括腱-骨成熟度評分和最大負荷拉力，均較對照組有所改善。Wang 等[34]發現外源性 MMP-2 可激活下游 NF-κB 信號通路，從而顯著提高離體培養前交叉韌帶成纖維細胞愈合能力[35]。bFGF 能刺激 MSCs 向肌腱方向的增殖和分化，從而增加了細胞外基質蛋白和膠原的表達[36]。TGF-β 能維持肌腱祖細胞在損傷過程中的生物力學活性[37]；能增強Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，參與組織瘢痕形成，而且和肌腱愈合過程中的黏附性能相關[35]。
在腱-骨愈合交界處，生長因子在空間分布上的變化間接影響了組織在空間上的組成和結構。Wang 等[38]在含有逐漸遞增濃度的 Runx-2 支架材料上接種成纖維細胞，以達到隨 Runx-2 濃度增加，成骨效能逐漸增強的效果。所以，利用生化成分濃度梯度的材料來控制細胞分化，是一個很有潛力的方向，有望模擬生成類似天然結合界面的結構。
通常情況下，如果單一細胞因子作用效果不滿意，可考慮聯合應用細胞因子發揮協同作用，達到增加效應并且減少不良反應的效果。車偉[39]用 BMP-2 和 VEGF165 共表達修飾的 BMSCs 來修復兔前交叉韌帶，結果顯示應用該方法能促進重建韌帶血管生成和腱-骨界面骨軟骨生成，從組織形態和生物力學角度達到促進腱-骨愈合的效果。杜慶鈞等[40]研究了聯合應用 bFGF 和 PDGF 對兔膝前交叉韌帶重建術后早期腱-骨愈合的影響，結果表明 PDGF 和 bFGF 能在腱-骨愈合早期通過增加兔腱-骨間的 MSCs 及新生血管數量，并提高腱-骨界面的最大剛度及負荷來增強腱-骨界面強度，從而促進腱-骨愈合。
2.4 組織復合體或復合物
骨膜是一種可在骨形成和骨折愈合過程中起關鍵作用的組織復合體，在促進腱-骨愈合方面的臨床應用較為廣泛[41-42]。它由內外兩部分組成，外部纖維層細胞含量少，可起到支撐和連接作用，含有成纖維細胞、膠原和彈性纖維；而內部生發層為骨膜發揮功能活性部分，其中 MSCs 可向軟骨細胞、骨細胞等分化，從而促進纖維軟骨和骨形成，促進骨整合[2]。同時，骨膜中的生長因子，如 BMP-2、TGF-β1、IGF-1 等，可誘導軟骨生成，從而促進血管生長和骨再吸收。Li 等[43]研究了自體骨膜包裹移植物修復前交叉韌帶的療效，術后 4、12 周觀察發現，新生骨組織通過纖維軟骨組織與鄰近骨組織相交連，形成腱-骨愈合特征性的愈合界面。力學試驗也發現實驗組抗拉力數值明顯高于對照組，證明自體骨膜對腱-骨愈合具有積極作用。
富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是一種全血衍生的組織復合物，為超生理濃度的血小板，內含的生長因子主要有 IGF-1、PDGF、FGF、VEGF 等，多種生長因子聯合作用避免了單一生長因子只有一種生理效應的局限性[44]。體外實驗和動物實驗研究發現，PRP 的可注射形式為干細胞增殖、分化、遷移和生長提供了三維微環境基礎，且 PRP 激活后可以形成大量負載成纖維細胞和成骨細胞的纖維蛋白支架，可激活細胞內源性蛋白信號通路，從而增加細胞外基質形成所需要的膠原蛋白的合成，促進腱-骨愈合[45-46]。馬震勝等[46]將自體肌腱聯合 PRP 用于比格犬的前交叉韌帶重建，實驗組添加 PRP 后 4 周腱-骨界面纖維血管密集、排列有序，并有Ⅱ型膠原沉積的軟骨樣細胞從骨向肌腱生長。雖然體外實驗及動物實驗研究已證實 PRP 可促進腱-骨愈合，但臨床研究得出的結論卻不一致。Malavolta 等[47]的研究比較了應用 PRP 與否對肩袖修補手術療效的影響，結果顯示除 12 個月時 PRP 組美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）評分略高于未使用 PRP 組外，兩組術后 MRI、Constant 評分、疼痛評分及術后再損傷率差異均無統計學意義，說明 PRP 并非為腱-骨愈合效果的決定性因素。故針對 PRP 效果的研究還有待進一步開展。
2.5 物理學方法
2.5.1 低頻超聲
低頻超聲是頻率為 1.5 MHz、聲強為 1～50 mW/cm2的超聲。低頻超聲可促進骨折愈合，有文獻報道，每天固定的低頻超聲治療有利于骨折愈合、軟骨缺損和韌帶損傷修復[48]。Walsh 等[49]對綿羊膝關節腱-骨結合部損傷模型采用低頻超聲治療，術后 26 周低頻超聲組較對照組具有更大的最大拉力和剛度，術后 3、6、12 周組織學觀察顯示低頻超聲組有更好的血管化程度，其機制可能與低頻超聲促進了腱-骨愈合過程中成骨細胞和成纖維細胞的增殖有關，而這兩種細胞在骨組織重建和膠原生成中起主要作用。
2.5.2 體外沖擊波
體外沖擊波是一種通過物理學機制介質（空氣或氣體）傳導的機械性脈沖壓強波，該設備將氣動產生的脈沖聲波轉換成精確的彈道式沖擊波，通過治療探頭的定位和移動，對疼痛發生較廣泛的組織產生良好治療效果。有研究表明[50]體外沖擊波能改變腱-骨界面周圍的力學環境和生物學微環境，上調 VEGF、BMP、TGF-β 等生長因子的表達，這些生長因子具有增加界面血供、促進骨和膠原生長等作用，從而最終達到促進腱-骨愈合的效果。
2.5.3 應力刺激
肌肉產生的牽拉應力能影響膠原蛋白和其他細胞外基質的合成，促進腱-骨結合部的祖細胞分化成軟骨，促進其偶聯，調節其發育成熟，是發育過程中形成腱-骨連接正常結構的重要因素[51]。王蕾等[52]通過跑臺訓練修復大鼠肩袖損傷，發現一定程度的應力刺激有利于腱-骨界面內血管生長及界面軟骨再生，而無應力刺激的對照組骨組織則出現了骨質疏松表現，提示腱-骨界面愈合效果不佳。Thomopoulos 等[53]研究了不同應力負荷對腱-骨愈合的影響，發現低負荷應力組軟骨基質成分糖胺聚糖和Ⅰ型膠原的表達更高，抗拉強度更大，愈合更接近正常的組織形態。另有研究表明，機械牽伸增加了Ⅲ型膠原 mRNA 的表達，從而增加了細胞增殖、分化和細胞外基質的形成[54-55]。在壓力下，很多因素影響著細胞的生物學行為，其中包括機械刺激引發的細胞分化、形態學和內環境穩態方面的變化[2]。
2.6 相關機制研究
既往研究表明[25]，TGF-β 信號通路在肌腱形成過程中十分必要，它參與了肌腱與纖維軟骨層結合部形成過程，是參與腱-骨結合部功能單元構建的重要因子。SOX-9 是介導前體細胞轉變為軟骨細胞的關鍵因子，Scleraxis（SCX）則介導了前體細胞向肌腱組織的分化。而在未鈣化的纖維軟骨祖細胞研究中，SOX-5–/–、SOX-6–/–細胞在成軟骨分化過程中被抑制，而 SCX 的表達則促進了成肌腱過程[56]。另有研究表明，SCX/BMP-4 信號通路在骨形成和腱-骨結合部發育過程中有顯著促進作用[57]，而其他骨蛋白家族，如 BMP-2、BMP-7 也參與該過程[58]。
進一步研究將集中在分子生物學方面，探究機械載荷對骨形成和肌腱形成的作用，包括對 TGF-β、BMP、FGF、hedgehog 家族成員的深入研究。此外，關于肌腱自然鈣化機制的研究還在進行，其中兩個因素可能起到關鍵作用，即胎球蛋白和 Na2HPO4 的相關抗體。但這兩個因素還未被作為一個整體進行系統研究，且體內鈣化的相關機制遠較體外實驗復雜[59]。
3 展望
腱-骨愈合領域將朝著結構化、功能性組織工程的方向發展。真正的功能性組織工程研究不應只考慮其生物力學等功能指標，還應包括細胞、支架、生長因子等方面的功能指標。
目前尚未定論何種細胞（TDSCs、ADSCs、BMSCs 等）是最合適的種子細胞，何種支架（膠原衍生物、多糖、碳纖維、蠶絲蛋白等）是最合適的功能性支架材料。一方面，功能性支架材料主要優勢在于貯存內源性或外源性生長因子，用來模擬腱止點末端的正常結構[60]；另一方面，研究熱點集中在包裹于支架材料中的微球和納米球的結構，這種結構能夠很好地平衡支架材料降解速率和生物活性因子釋放速率之間的關系，但目前仍然難以模擬正常腱-骨結合部的濃度梯度，且生成的濃度梯度難以長期維持[61]。從組織工程整體角度講，既往研究表明，在結構和化學成分上，濃度梯度的變化能更好地模擬天然過渡結構，能導致種子細胞相關蛋白的不同表達，從而產生理想的微環境條件。既往采用的手段主要有毛細效應、微流控技術、角度的傾斜及離心分離技術等[62]。天然生長因子發揮作用的機制、通過緩釋技術如何控制組織工程肌腱復合物的修復[63]、多種生長因子協同作用時其有序性如何解決等問題，均需要進一步深入研究。
因此在未來還需要不斷研究腱-骨愈合的發育生物學原理和更多生物學機制，尋求更理想的支架材料，并充分利用細胞治療領域研究成果，協同多種策略，從而使結構性、功能性組織工程的研究成為一種可行的臨床治療選擇。
作者貢獻：呂晶同負責查閱文獻，文章撰寫；施又興、王云蛟、康夏、卞旭廷、袁寶、朱敏負責文章內各部分相關內容撰寫；唐康來負責文章審核。
利益沖突：所有作者在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點。
腱-骨結合部存在天然的 4 層結構，包括肌腱組織、非鈣化的纖維軟骨組織、鈣化的纖維軟骨組織和骨組織。腱-骨愈合與多因素相關，由于軟-硬組織之間界面愈合容易形成瘢痕，以及損傷造成纖維軟骨區域缺乏血供及骨量丟失，最終導致腱-骨愈合緩慢且質量欠佳，同時結合部 4 層結構的重建也很困難。因此，尋找理想的腱-骨愈合方法，研究其分子生物學機制具有重要意義。目前，國內外研究主要著眼于“結構化界面修復”這一概念，修復總原則是功能性地連接軟-硬組織。現回顧分析促進腱-骨愈合方法的相關研究文獻，對研究進展進行歸納總結。
1 腱-骨愈合基本過程及促進愈合的原則
正常腱-骨連接位點分為非直接連接及直接連接兩類。非直接連接為致密的纖維組織將移植物包繞連接并固定于骨面，如前交叉韌帶重建術中韌帶和骨道壁的連接。直接連接的連接點為一個直接嵌入的天然轉化區域，重新建立直接連接要經歷 Sharpey 樣纖維形成過程，即新生骨小梁生成、成纖維細胞富集、軟骨樣細胞富集、膠原纖維成熟 4 個階段，最終通過 Sharpey 樣纖維的演變形成典型的 腱-骨結合部 4 層結構。
為兼顧兩種連接類型愈合方式，目前促進腱-骨結合部愈合方法的基本原則包括兩點：① 改良肌腱或韌帶重建術及固定方式，獲得最大腱-骨接觸面積、足夠的穩定接觸時間、合適的接觸程度和最小的外力影響[1]。② 選擇合適的支架材料，以更好地模擬腱-骨結合部 4 層結構，同時通過增加種子細胞、生長因子等增強材料生物學性能，更好地促進腱-骨愈合。
2 促進腱-骨愈合的常用方法
從生物力學角度分析，采用組織工程方法促進腱-骨愈合面臨 3 個挑戰[2]。首先，腱-骨界面愈合過程中必須保持穩定；第二，愈合過程中需誘導生成具有梯度結構的組織；第三，支架材料不僅能富集多種細胞，而且在富集細胞過程中能持續保持具有梯度的生物力學結構。一個成熟的促進腱-骨愈合方案需要設計梯度化結構，以滿足自然過渡界面的時空特點，以及選擇合適的種子細胞、生長因子[3]。
2.1 種子細胞
MSCs 常作為種子細胞來促進腱-骨愈合，其具有高度多向分化潛能，存在于全身器官間質和結締組織中。研究最常用的 MSCs 包括 BMSCs、脂肪來源間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、肌腱來源間充質干細胞 （tendon-derived stem cells，TDSCs）等。Zhang 等[4]研究發現，TDSCs 分泌的細胞外基質成分可促進細胞成肌腱分化。研究表明，創傷后肌腱的退行性變與 TDSCs 增殖增強以及分化被抑制、原平衡被打破有關[5]。Nourissat 等[6]將 BMSCs 注射至跟腱止點損傷模型大鼠的跟腱損傷處，45 d 后發現腱-骨界面出現了類似正常連接界面的鈣化及未鈣化的纖維軟骨典型 4 層結構。有研究對采用肩關節鏡修復肩袖損傷患者注射濃縮自體 BMSCs，經過 24 個月隨訪，超聲和 MRI 檢查顯示 BMSCs 注射組治愈率（100%）明顯高于對照組（67%）[7]。除 BMSCs 外，ADSCs 也是較常用的種子細胞，可通過微創吸脂術獲得的脂肪組織分離培養，該細胞能釋放免疫抑制因子，植入體內后不會引起強烈的免疫排斥反應。Ko 等[8]研究了 ADSCs 在兔肩袖慢性損傷模型中促進腱-骨愈合的作用，組織學觀察見 ADSCs 注射組脂肪浸潤程度明顯輕于對照組。此外，胎兒羊膜細胞因低免疫原性、良好抗菌性能和促進血管生成能力，也作為種子細胞應用于組織工程肌腱領域[9]。
2.2 支架材料
支架材料根據來源可分為生物衍生支架材料、無機物支架材料和有機合成支架材料 3 類。
2.2.1 生物衍生支架材料
生物衍生支架材料按來源可分為自體、同種異體和異種支架。生物衍生支架材料的天然來源決定了其具有良好生物學特性，對細胞降解、組織重塑和信息傳遞敏感；但因后期加工困難、存在免疫原性以及生物力學性能欠佳，逐漸被新型材料取代。Breidenbach 等[10]根據組織工程技術原理，設計了模仿正常肌腱生物學參數且具有適當機械性能的支架材料，他們將細胞表觀遺傳學、細胞外基質組成及組織超微結構作為參考依據，最終制成可釋放潛在成骨蛋白的支架材料用于促進腱-骨愈合。Kili?o?lu 等[11]的研究選取脫細胞去礦物質骨基質作為支架材料，利用其可釋放潛在成骨蛋白的功能促進腱-骨愈合。Chen 等[12]的研究表明，采用絲素蛋白復合膠原纖維制成的支架材料，能夠提高 MSCs 中 Epha4 和 Scleraxis 基因的表達，從而促進細胞在支架材料上的黏附，達到更好修復跟腱損傷的效果。脫細胞肌腱是與正常肌腱組織結構最相似的支架材料，作為肌腱替代物已廣泛用于臨床治療和基礎研究。Wang 等[13]總結了脫細胞肌腱的不同處理方式，作為支架材料其免疫原性是需要解決的最大問題；另外，脫細胞降解過程中所產生的抗體將隨著血液循環分布到身體各處，產生的影響有待進一步評估。
2.2.2 無機物支架材料
無機物支架材料以磷酸鈣或磷酸鎂類為主，主要作用為促進腱-骨愈合過程中的骨化。研究表明[14]，磷酸鈣有促進骨長入肌腱表面的作用，目前已廣泛用于促進腱-骨愈合及組織工程其他成骨相關領域。 Weimin 等[15]制備了可注射的磷酸鈣骨水泥，該材料具有良好的孔隙結構，可更好地促進成骨，從而促進前交叉韌帶重建術后腱-骨愈合。Zhao 等[16]比較了磷酸鈣黏合材料及羥基磷灰石材料，發現兩種材料均可促進細胞黏附、增殖以及新骨生成，但磷酸鈣黏合材料促進生長因子分泌的作用更明顯，從而可更大程度促進腱-骨愈合。同時，Weimin 等[15]研究了可注射型磷酸鈣黏合材料復合 BMP-2 促進兔前交叉韌帶愈合效果，結果顯示該材料具有更好的骨整合效果，重建的前交叉韌帶抗牽拉強度也更大。無機物支架材料有容易合成和塑形的優點，但也存在免疫原性大，可能引起免疫排斥反應，以及不能達到理想的生物力學強度等不足。
2.2.3 有機合成支架材料
有機合成支架材料包括不可降解高分子聚合物材料及生物可降解材料。前者如聚氨基甲酸乙酯、聚碳酸酯和聚四氟乙烯等，該材料優點是具有良好的可塑性及抗牽拉強度，可保持長時間不降解；缺點是易碎裂，而且碎片作為代謝物在組織中持續存在，常影響組織的愈合并成為持續的感染源。而生物可降解材料能在降解時維持一定程度生物力學強度，從而為組織細胞提供生物相容性良好的支架。該類材料包括聚乳酸-羥基乙酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）、左旋聚乳酸、聚乙酸內酯（polycaprolactone，PCL）等[17]。研究表明[18-19]有機合成支架材料來源廣，植入較容易，能增加細胞黏附性，促進細胞外基質產生，但往往生物力學性能欠佳且生產成本也較高。
Liu 等[20]采用靜電紡絲技術將 PLGA 和 PCL 制成具有梯度濃度的支架材料，研究表明該支架材料能很好地創建腱-骨界面微環境并重建腱-骨界面。靜電紡絲技術為構建有機合成材料的超微結構提供了技術支持。Naghashzargar 等[21]制作了一種新型支架材料，該材料以蠶絲蛋白為內核，采用靜電紡絲技術將 P3HB 和 PCL 纖維包繞在蠶絲蛋白表面。結果表明該材料抗拉伸性能強，其生物力學強度能滿足前交叉韌帶重建的力學性能要求。Yokoya 等[22]將聚乙醇酸薄片用于治療兔肩袖損傷模型，結果顯示可產生重建纖維軟骨層界面愈合的類似效果。綜上，這類有機合成支架材料作為移植物和骨之間的媒介，可促進細胞遷移和增殖，從而在腱-骨愈合處形成一個富含種子細胞及自體功能細胞的活性區域，最終達到促進腱-骨愈合效果。
2.2.4 梯度仿生材料
傳統支架材料均有一定局限性，需要對其結構、表型等方面進行改進，以更好地促進腱-骨愈合。骨組織堅硬，而肌腱組織堅韌且可延展性強，因此腱-骨界面壓力必須通過兩種剛度不同的材料來進行傳導，這樣的結構特性增加了不愈合發生風險[23-24]。要解決此問題，需要在結構和組分兩方面模擬梯度濃度進行改進，以更好地模擬過渡區域的機械性能以及分散集中的應力[25]。理想的支架材料必須能支持細胞表型表達，同時在成分組成和微觀結構方面能模擬正常界面形態[26-27]。既往研究顯示，增加礦物質能使界面處材料呈近似指數增長過程，能夠更好地促進腱-骨愈合[20-31]。目前，微系統的出現為解決濃度梯度難題提供了支持。微系統是一項以細胞或組織為對象的微操作技術，它將高通量便于分析的結構集成于小體積芯片材料上，從而制造一個穩定、局部、可復制的分子濃度梯度微環境。而細胞的遷移、分化很大程度上依賴于生長因子分布和濃度梯度形成，因此在芯片上形成的微系統模仿器官功能可達到參數可調節性，可進行組織、器官整體模擬[28]，被廣泛應用于支架材料制作與修飾過程。
2.3 生長因子
生長因子是一類能夠調節生物體內細胞生長活動的多肽類物質。目前研究集中在誘導成骨類生長因子，主要包括 BMP、TGF、bFGF、PDGF、FGF、IGF、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMP）、VEGF 等。這些生長因子通過成骨誘導作用，在早期血管生長過程中起促進作用。因此在腱-骨愈合不同階段，針對性地加入特定生長因子，可以對腱-骨愈合起到積極作用。
諸多研究已證實重組人 BMP 在新骨形成過程中發揮重要作用[32]。Kabuto 等[33]制作了可持續釋放 BMP-7 的明膠水凝膠薄膜，用于修復 SD 大鼠肩袖損傷模型。結果發現其能促進腱-骨結合部形成良好的軟骨基質及肌腱，修復后的肩袖生物力學及組織學成熟程度，包括腱-骨成熟度評分和最大負荷拉力，均較對照組有所改善。Wang 等[34]發現外源性 MMP-2 可激活下游 NF-κB 信號通路，從而顯著提高離體培養前交叉韌帶成纖維細胞愈合能力[35]。bFGF 能刺激 MSCs 向肌腱方向的增殖和分化，從而增加了細胞外基質蛋白和膠原的表達[36]。TGF-β 能維持肌腱祖細胞在損傷過程中的生物力學活性[37]；能增強Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達，參與組織瘢痕形成，而且和肌腱愈合過程中的黏附性能相關[35]。
在腱-骨愈合交界處，生長因子在空間分布上的變化間接影響了組織在空間上的組成和結構。Wang 等[38]在含有逐漸遞增濃度的 Runx-2 支架材料上接種成纖維細胞，以達到隨 Runx-2 濃度增加，成骨效能逐漸增強的效果。所以，利用生化成分濃度梯度的材料來控制細胞分化，是一個很有潛力的方向，有望模擬生成類似天然結合界面的結構。
通常情況下，如果單一細胞因子作用效果不滿意，可考慮聯合應用細胞因子發揮協同作用，達到增加效應并且減少不良反應的效果。車偉[39]用 BMP-2 和 VEGF165 共表達修飾的 BMSCs 來修復兔前交叉韌帶，結果顯示應用該方法能促進重建韌帶血管生成和腱-骨界面骨軟骨生成，從組織形態和生物力學角度達到促進腱-骨愈合的效果。杜慶鈞等[40]研究了聯合應用 bFGF 和 PDGF 對兔膝前交叉韌帶重建術后早期腱-骨愈合的影響，結果表明 PDGF 和 bFGF 能在腱-骨愈合早期通過增加兔腱-骨間的 MSCs 及新生血管數量，并提高腱-骨界面的最大剛度及負荷來增強腱-骨界面強度，從而促進腱-骨愈合。
2.4 組織復合體或復合物
骨膜是一種可在骨形成和骨折愈合過程中起關鍵作用的組織復合體，在促進腱-骨愈合方面的臨床應用較為廣泛[41-42]。它由內外兩部分組成，外部纖維層細胞含量少，可起到支撐和連接作用，含有成纖維細胞、膠原和彈性纖維；而內部生發層為骨膜發揮功能活性部分，其中 MSCs 可向軟骨細胞、骨細胞等分化，從而促進纖維軟骨和骨形成，促進骨整合[2]。同時，骨膜中的生長因子，如 BMP-2、TGF-β1、IGF-1 等，可誘導軟骨生成，從而促進血管生長和骨再吸收。Li 等[43]研究了自體骨膜包裹移植物修復前交叉韌帶的療效，術后 4、12 周觀察發現，新生骨組織通過纖維軟骨組織與鄰近骨組織相交連，形成腱-骨愈合特征性的愈合界面。力學試驗也發現實驗組抗拉力數值明顯高于對照組，證明自體骨膜對腱-骨愈合具有積極作用。
富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是一種全血衍生的組織復合物，為超生理濃度的血小板，內含的生長因子主要有 IGF-1、PDGF、FGF、VEGF 等，多種生長因子聯合作用避免了單一生長因子只有一種生理效應的局限性[44]。體外實驗和動物實驗研究發現，PRP 的可注射形式為干細胞增殖、分化、遷移和生長提供了三維微環境基礎，且 PRP 激活后可以形成大量負載成纖維細胞和成骨細胞的纖維蛋白支架，可激活細胞內源性蛋白信號通路，從而增加細胞外基質形成所需要的膠原蛋白的合成，促進腱-骨愈合[45-46]。馬震勝等[46]將自體肌腱聯合 PRP 用于比格犬的前交叉韌帶重建，實驗組添加 PRP 后 4 周腱-骨界面纖維血管密集、排列有序，并有Ⅱ型膠原沉積的軟骨樣細胞從骨向肌腱生長。雖然體外實驗及動物實驗研究已證實 PRP 可促進腱-骨愈合，但臨床研究得出的結論卻不一致。Malavolta 等[47]的研究比較了應用 PRP 與否對肩袖修補手術療效的影響，結果顯示除 12 個月時 PRP 組美國加州大學洛杉磯分校（UCLA）評分略高于未使用 PRP 組外，兩組術后 MRI、Constant 評分、疼痛評分及術后再損傷率差異均無統計學意義，說明 PRP 并非為腱-骨愈合效果的決定性因素。故針對 PRP 效果的研究還有待進一步開展。
2.5 物理學方法
2.5.1 低頻超聲
低頻超聲是頻率為 1.5 MHz、聲強為 1～50 mW/cm2的超聲。低頻超聲可促進骨折愈合，有文獻報道，每天固定的低頻超聲治療有利于骨折愈合、軟骨缺損和韌帶損傷修復[48]。Walsh 等[49]對綿羊膝關節腱-骨結合部損傷模型采用低頻超聲治療，術后 26 周低頻超聲組較對照組具有更大的最大拉力和剛度，術后 3、6、12 周組織學觀察顯示低頻超聲組有更好的血管化程度，其機制可能與低頻超聲促進了腱-骨愈合過程中成骨細胞和成纖維細胞的增殖有關，而這兩種細胞在骨組織重建和膠原生成中起主要作用。
2.5.2 體外沖擊波
體外沖擊波是一種通過物理學機制介質（空氣或氣體）傳導的機械性脈沖壓強波，該設備將氣動產生的脈沖聲波轉換成精確的彈道式沖擊波，通過治療探頭的定位和移動，對疼痛發生較廣泛的組織產生良好治療效果。有研究表明[50]體外沖擊波能改變腱-骨界面周圍的力學環境和生物學微環境，上調 VEGF、BMP、TGF-β 等生長因子的表達，這些生長因子具有增加界面血供、促進骨和膠原生長等作用，從而最終達到促進腱-骨愈合的效果。
2.5.3 應力刺激
肌肉產生的牽拉應力能影響膠原蛋白和其他細胞外基質的合成，促進腱-骨結合部的祖細胞分化成軟骨，促進其偶聯，調節其發育成熟，是發育過程中形成腱-骨連接正常結構的重要因素[51]。王蕾等[52]通過跑臺訓練修復大鼠肩袖損傷，發現一定程度的應力刺激有利于腱-骨界面內血管生長及界面軟骨再生，而無應力刺激的對照組骨組織則出現了骨質疏松表現，提示腱-骨界面愈合效果不佳。Thomopoulos 等[53]研究了不同應力負荷對腱-骨愈合的影響，發現低負荷應力組軟骨基質成分糖胺聚糖和Ⅰ型膠原的表達更高，抗拉強度更大，愈合更接近正常的組織形態。另有研究表明，機械牽伸增加了Ⅲ型膠原 mRNA 的表達，從而增加了細胞增殖、分化和細胞外基質的形成[54-55]。在壓力下，很多因素影響著細胞的生物學行為，其中包括機械刺激引發的細胞分化、形態學和內環境穩態方面的變化[2]。
2.6 相關機制研究
既往研究表明[25]，TGF-β 信號通路在肌腱形成過程中十分必要，它參與了肌腱與纖維軟骨層結合部形成過程，是參與腱-骨結合部功能單元構建的重要因子。SOX-9 是介導前體細胞轉變為軟骨細胞的關鍵因子，Scleraxis（SCX）則介導了前體細胞向肌腱組織的分化。而在未鈣化的纖維軟骨祖細胞研究中，SOX-5–/–、SOX-6–/–細胞在成軟骨分化過程中被抑制，而 SCX 的表達則促進了成肌腱過程[56]。另有研究表明，SCX/BMP-4 信號通路在骨形成和腱-骨結合部發育過程中有顯著促進作用[57]，而其他骨蛋白家族，如 BMP-2、BMP-7 也參與該過程[58]。
進一步研究將集中在分子生物學方面，探究機械載荷對骨形成和肌腱形成的作用，包括對 TGF-β、BMP、FGF、hedgehog 家族成員的深入研究。此外，關于肌腱自然鈣化機制的研究還在進行，其中兩個因素可能起到關鍵作用，即胎球蛋白和 Na2HPO4 的相關抗體。但這兩個因素還未被作為一個整體進行系統研究，且體內鈣化的相關機制遠較體外實驗復雜[59]。
3 展望
腱-骨愈合領域將朝著結構化、功能性組織工程的方向發展。真正的功能性組織工程研究不應只考慮其生物力學等功能指標，還應包括細胞、支架、生長因子等方面的功能指標。
目前尚未定論何種細胞（TDSCs、ADSCs、BMSCs 等）是最合適的種子細胞，何種支架（膠原衍生物、多糖、碳纖維、蠶絲蛋白等）是最合適的功能性支架材料。一方面，功能性支架材料主要優勢在于貯存內源性或外源性生長因子，用來模擬腱止點末端的正常結構[60]；另一方面，研究熱點集中在包裹于支架材料中的微球和納米球的結構，這種結構能夠很好地平衡支架材料降解速率和生物活性因子釋放速率之間的關系，但目前仍然難以模擬正常腱-骨結合部的濃度梯度，且生成的濃度梯度難以長期維持[61]。從組織工程整體角度講，既往研究表明，在結構和化學成分上，濃度梯度的變化能更好地模擬天然過渡結構，能導致種子細胞相關蛋白的不同表達，從而產生理想的微環境條件。既往采用的手段主要有毛細效應、微流控技術、角度的傾斜及離心分離技術等[62]。天然生長因子發揮作用的機制、通過緩釋技術如何控制組織工程肌腱復合物的修復[63]、多種生長因子協同作用時其有序性如何解決等問題，均需要進一步深入研究。
因此在未來還需要不斷研究腱-骨愈合的發育生物學原理和更多生物學機制，尋求更理想的支架材料，并充分利用細胞治療領域研究成果，協同多種策略，從而使結構性、功能性組織工程的研究成為一種可行的臨床治療選擇。
作者貢獻：呂晶同負責查閱文獻，文章撰寫；施又興、王云蛟、康夏、卞旭廷、袁寶、朱敏負責文章內各部分相關內容撰寫；唐康來負責文章審核。
利益沖突：所有作者在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點。