引用本文： 位付濤, 王振. 去白細胞富血小板血漿對距骨骨軟骨損傷的療效及機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(5): 555-562. doi: 10.7507/1002-1892.201811096 復制
自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是根據自體血中不同成分的離心系數不同，經過 2 次離心法獲得的富含血小板、PDGF、TGF-β1 等成分的血漿，具有促進細胞增殖、分化、遷移，支持血管生長等生物學作用，因此被廣泛用于骨、軟骨、神經、皮膚等組織的再生與修復[1-3]。PRP 可以促進成骨細胞的增殖、分化和礦化，增強Ⅰ型膠原蛋白、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白等細胞外基質的分泌，因此被用于骨折、骨壞死、骨關節炎等骨科疾病的治療[4-5]。但是，關于 PRP 的治療效果仍然存在爭議，可能與 PRP 中高濃度的白細胞以及炎性因子有關[6-8]。Xu 等[9]改良了傳統的基于交界層的 PRP 制備方法，通過基于血漿層的兩步離心法制備得到白細胞與炎性因子水平較低的去白細胞 PRP（pure PRP，P-PRP），并且發現 P-PRP 促進 BMSCs 生長與軟骨發生的能力均顯著高于富白細胞 PRP（leukocyte PRP，L-PRP），在兔軟骨缺損模型中的修復效果更為顯著。因此，本研究參照此優化方案制備得到 P-PRP，并與傳統制備方法得到的 L-PRP 進行成分比較，然后作為輔助藥物用于距骨骨軟骨損傷患者的手術治療，以探討 P-PRP 在距骨骨軟骨損傷治療中的療效，并使用小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 進行體外實驗，研究 P-PRP 的治療機制。報告如下。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① 診斷為距骨骨軟骨損傷，診斷標準：慢性持續性踝關節疼痛、反復腫脹、不能跑跳、運動后加重等，有損傷處壓痛等體征，局灶性關節軟骨損傷或缺損伴下方的骨水腫、骨折或囊腫形成等影像學表現；② Hepple 分型[10]為Ⅲ～Ⅴ型，保守治療無效，損傷面積較大，需要手術治療者。排除標準：① 血小板數量和功能異常；② 伴隨肝腎功能障礙、腫瘤、類風濕性關節炎、足踝畸形、心腦血管疾病、精神疾病等。
2014 年 1 月—2017 年 10 月共 36 例患者符合選擇標準納入研究，采用隨機數字表法隨機分為對照組（A 組）、L-PRP 組（B 組）、P-PRP 組（C 組），每組 12 例。本研究獲解放軍聯勤保障部隊第九八八醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。
1.2 一般資料
A 組：男 8 例，女 4 例；年齡 29～55 歲，平均 42.3 歲。病程 1～41 個月，平均 18 個月；其中病程<1 年 6 例，1～3 年 4 例，>3 年 2 例。Hepple 分型：Ⅲ型 5 例，Ⅳ型 5 例，Ⅴ型 2 例。
B 組：男 9 例，女 3 例；年齡 28～58 歲，平均 42.8 歲。病程 1～43 個月，平均 17 個月；其中病程<1 年 7 例，1～3 年 4 例，>3 年 1 例。Hepple 分型：Ⅲ型 6 例，Ⅳ型 4 例，Ⅴ型 2 例。
C 組：男 8 例，女 4 例；年齡 26～55 歲，平均 41.6 歲。病程 2～40 個月，平均 18 個月；其中病程<1 年 7 例，1～3 年 2 例，>3 年 2 例。Hepple 分型：Ⅲ型 5 例，Ⅳ型 4 例，Ⅴ型 3 例。
3 組患者性別、年齡、病程、Hepple 分型等一般資料比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.3 L-PRP 與 P-PRP 的制備及組分分析
1.3.1 L-PRP 與 P-PRP 的制備
使用預先含有 4 mL 枸櫞酸鈉抗凝劑的 50 mL 注射器采集所有患者靜脈血 37 mL，混勻后，吸取 1 mL 用于全血成分檢測，余 40 mL 使用 PRP 制備套裝（山東威高集團有限公司）進行后續制備。① L-PRP 制備方法：以 660×g 離心 10 min，可見全血分為 3 層，底部為紅細胞層，中間為白細胞和血小板的交界層，上層為乏血小板血漿層；使用注射器吸棄紅細胞層，以 660×g 進行第 2 次離心，共 10 min，底部的白膜樣物質為白細胞和血小板沉積層，上層為乏血小板血漿層，吸棄上層乏血小板血漿至剩余 4 mL，靜置片刻后混勻。② P-PRP 制備方法：以 160×g 離心 10 min，可見全血分為 3 層，底部為紅細胞層，中間為白細胞層，上層為 PRP 層；使用注射器吸取上層至另一離心管，以 250×g 離心 15 min，底部為血小板沉積層，上層為乏血小板血漿層，吸棄上層乏血小板血漿至剩余 4 mL，靜置片刻后混勻。L-PRP 與 P-PRP 使用前，加入 10%CaCl2 溶液進行激活。
1.3.2 全血、L-PRP 與 P-PRP 組分分析
取全血、L-PRP 與 P-PRP 各 1 mL，使用 KX-21N 全自動血液分析儀（Sysmex 公司，日本）測定血小板和白細胞濃度；使用 ELISA 試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）測定 IL-1β、TNF-α、PDGF、TGF-β1 濃度。
1.4 手術方法
患者于椎管內麻醉后，患側大腿近端上氣囊止血帶，壓力在 45～50 kPa。術中取內踝偏前緣長約 9 cm 弧形切口，逐層切開皮膚、皮下組織和筋膜，顯露內踝。于內踝尖部向脛骨遠端先打入 2 枚直徑 2.0 mm 空心釘導針，然后拔出。用微型擺鋸截斷內踝，將內踝向遠端掀起，顯露距骨內側病灶，C 臂 X 線機定位病灶中心并打入 1 枚克氏針，根據病灶大小選擇合適型號的空心鉆清除壞死骨，并使用刮勺清除周圍硬化骨組織直至病灶四周有接近正常的骨小梁組織。評估缺損體積，根據術前 MRI 及 CT 三維重建分析及術中觀察軟骨面缺損的部位大小形狀，用同型號取骨環鉆取自體同側脛骨遠端或內側髂骨帶骨膜及松質骨骨柱（在保證骨柱及骨膜完整的情況下，將同型號骨柱以松質骨在內、骨膜在外植入距骨骨缺損處），對距骨缺損處進行打壓植骨，至與軟骨面同一弧度切跡，保證所植骨柱與距骨軟骨下骨平齊；B、C 組在關節鏡下分別使用 PRP 專用注射器將 2.5 mL L-PRP 和 P-PRP 注射到所移植骨柱的周圍間隙及所帶骨膜下，A 組不注射任何藥物。復位內踝截骨端，沿原空心釘導針孔插入 1.0 mm 螺釘導針，沿導針擰入 2 枚 3.5 mm 空心加壓螺釘。C 臂 X 線機透視見位置良好后，逐層縫合切口。
1.5 術后處理及療效觀察指標
術后給予消腫治療，對患肢功能位石膏固定4周；然后改用免負重支具靴固定3個月，逐漸負重行走；并進行患肢無負重狀態下功能鍛煉，半年內避免患肢劇烈負重活動。
術前和術后 3、6、12 個月采用美國矯形足踝協會（AOFAS）踝-后足評分和疼痛視覺模擬評分（VAS）評價療效。
1.6 P-PRP 治療機制研究
1.6.1 主要試劑及儀器
MC3T3-E1 細胞購于中國科學院上海細胞庫。α-MEM 培養液（HyClone 公司，美國）；細胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、ALP 檢測試劑盒、ECL 顯色液（上海碧云天生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒（Qiagen 公司，德國）；熒光定量試劑盒（Takara 公司，日本）；抗基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）抗體、抗磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抗體、抗磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）抗體、抗磷酸化 c-Jun（phosphorylated c-Jun，p-c-Jun）抗體、抗 GAPDH 抗體（Abcam 公司，英國）；過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。酶標儀（PerkinElmer 公司，美國）；qRT-PCR 儀、凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.6.2 MC3T3-E1 細胞的培養與分組
將 MC3T3-E1 細胞使用含 10%FBS 的 α-MEM 培養液培養于 37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱，匯合度達 75% 左右時使用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代。將第 3 代 MC3T3-E1 細胞隨機分為 3 組，即對照組（A 組）、L-PRP 組（B 組）、P-PRP 組（C 組）。B、C 組分別使用含 5% L-PRP 或 P-PRP 的細胞培養液進行培養，A 組使用含 5%PBS 的細胞培養液培養。
1.6.3 MTT 檢測各組細胞增殖
取第 3 代 MC3T3-E1 細胞，以 5×103個/孔密度接種于 96 孔板，24 h 后更換新鮮細胞培養液，同上述分組方法相應處理，每組設 6 個復孔。培養 3 d 后，每孔加入 10 μL MTT，繼續培養 4 h，吸棄上清后，每孔加入 150 μL DMSO，搖床低速振蕩 10 min，使用酶標儀于 490 nm 處測定各孔的吸光度（A）值。
1.6.4 ALP 活性測定
取第 3 代 MC3T3-E1 細胞，以 5×105個/孔密度接種于 6 孔板，24 h 后更換新鮮細胞培養液，同上述分組方法相應處理，每組設 6 個復孔。吸取上清液，使用 ELISA 試劑盒測定上清液 MMP-9 蛋白含量。PBS 洗滌細胞 3 次，加入 100 μL 細胞裂解液，充分裂解后，12 000×g 離心 5 min，使用 BCA 蛋白定量試劑盒測定上清液的蛋白濃度，使用 ALP 檢測試劑盒測定 ALP 活性。
1.6.5 實時熒光定量 PCR（real-time quantitative fluorescence PCR，qRT-PCR）檢測
取第 3 代 MC3T3-E1 細胞，按 1.6.2 分組方法處理細胞后，使用 qRT-PCR 檢測細胞中 OPN、Ⅰ型膠原和 MMP-9 mRNA 的表達。具體方法：Trizol 法提取總 RNA，逆轉錄試劑盒合成 cDNA，熒光定量試劑盒進行 PCR 反應，反應條件：95℃ 預變性 30 s；95℃ 變性 5 s，60℃ 退火 30 s，30 個循環。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。將 A 組各基因 mRNA 表達量設為 1，計算 B、C 組與 A 組相比各基因 mRNA 表達量的倍數。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR
1.6.6 Western blot 檢測
取第 3 代 MC3T3-E1 細胞，按 1.6.2 分組方法處理細胞后，使用 Western blot 檢測上清液 MMP-9 蛋白的分泌和細胞中 PI3K、pAKT、p-c-Jun 蛋白的表達。具體方法：取 40 μg 蛋白質進行 SDS-PAGE 電泳，藍色染料至膠底部時停止電泳，冰水浴中將目的蛋白電轉（100 mA、2 h）至聚偏二氟乙烯膜，5% 脫脂奶粉封閉 2 h，使用抗 MMP-9 抗體（1∶1 000）、抗 PI3K 抗體（1∶1 000）、抗 pAKT 抗體（1∶1 000）、抗 p-c-Jun 抗體（1∶1 000）、抗 GAPDH 抗體（1∶2 000）4℃ 過夜孵育。洗滌 3 次，使用過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育 1 h，洗滌 3 次，ECL 顯色液顯色，凝膠成像儀下曝光和拍照。用 Image Pro Plus 6.0 軟件進行灰度值定量，將 A 組的灰度值設置為 1。
1.7 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗；組內各時間點間比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 檢驗。計數資料組間比較采用 χ2 檢驗，等級資料組間比較采用 Kruskal-Wallis H 非參數檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 全血、L-PRP、P-PRP 組分分析
與全血比較，L-PRP 血小板、白細胞、IL-1β、TNF-α、PDGF、TGF-β1 濃度均顯著增加，P-PRP 血小板、PDGF、TGF-β1 濃度顯著增加，白細胞、IL-1β、TNF-α 濃度顯著減少，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 L-PRP 比較，P-PRP 血小板、PDGF、TGF-β1 濃度差異無統計學意義（P>0.05），但白細胞、IL-1β、TNF-α 濃度顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
全血、L-PRP、P-PRP 組分濃度比較
a. 白細胞；b. 血小板；c. IL-1β；d. TNF-α；e. PDGF；f. TGF-β1
Figure1. Comparison of the components in whole blood, L-PRP, and P-PRPa. Leukocyte; b. Platelet; c. IL-1β; d. TNF-α; e. PDGF; f. TGF-β1
2.2 臨床療效分析
各組患者均獲隨訪，隨訪時間 13～25 個月，平均 18 個月。無傷口感染、內固定失效等并發癥發生。植骨處均愈合，透明軟骨修復良好，愈合時間 4～8 個月，平均 6 個月。MRI 檢查示，各組術前損傷程度相似；術后 6 個月 C 組可見距骨頂軟骨完整，軟骨與距骨體緊密結合，無水腫、分離以及硬化帶形成，優于 A、B 組。見圖 2～4。與術前相比，術后各組 AOFAS 評分均逐漸升高，VAS 評分均逐漸降低，術后各時間點與術前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。術后 3、6、12 個月 C 組 AOFAS 評分均顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05），A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；VAS 評分 A、B、C 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖2
A 組患者，女，52 歲，距骨骨軟骨損傷（HeppleⅤ型）MRI
a. 術前矢狀位；b. 術前冠狀位；c. 術后 6 個月矢狀位；d. 術后 6 個月冠狀位
Figure2. MRI of a 52-year-old female patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅴ) in group Aa. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation
圖4
C 組患者，男，34歲，距骨骨軟骨損傷（Hepple Ⅳ型）MRI
a. 術前矢狀位；b. 術前冠狀位；c. 術后 6 個月矢狀位；d. 術后 6 個月冠狀位
Figure4. MRI of a 34-year-old male patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅳ) in group Ca. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation
圖5
各組患者手術前后各時間點 AOFAS 評分和 VAS 評分比較
a. AOFAS 評分；b. VAS 評分
Figure5. Comparison of AOFAS scores and VAS scores among 3 groups at pre- and post-operationa. AOFAS score; b. VAS score
2.3 P-PRP 治療機制研究
2.3.1 各組細胞增殖和分化能力比較
MTT 檢測示，A、B、C 組細胞 A 值分別為 0.91±0.12、1.01±0.15、1.14±0.19，ALP 活性分別為（5.09±0.97）、（5.93±1.05）、（7.58±1.10）U/g，OPN mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.16、1.46±0.31、2.29±0.44，Ⅰ型膠原 mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.18、1.22±0.26、1.54±0.33。以上指標 C 組顯著大于 A、B 組，B 組大于 A 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3.2 各組細胞間 MMP-9 表達比較
Western blot 檢測示 A、B、C 組 MMP-9 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.14、1.53±0.29、0.91±0.22，ELISA 檢測 MMP-9 蛋白含量分別為（6.58±0.96）、（7.54±1.41）、（6.07±1.09）μg/L，qRT-PCR 檢測 MMP-9 mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.17、1.57±0.35、0.83±0.25，以上指標 B 組顯著大于 A、C 組，C 組小于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測各組細胞 MMP-9 蛋白表達
1：A 組2：B 組 3：C 組
Figure6. MMP-9 protein expressions of each group detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C
2.3.3 Western blot 檢測各組細胞 PI3K/AKT/AP-1 信號通路表達
A、B、C 組 PI3K 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.15、1.87±0.48、1.14±0.29，pAKT 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.23、2.07±0.44、0.90±0.31，p-c-Jun 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.18、1.69±0.41、1.07±0.24。以上指標 B 組顯著大于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7。
圖3
B 組患者，男，31 歲，距骨骨軟骨損傷（Hepple Ⅳ型）MRI
a. 術前矢狀位；b. 術前冠狀位；c. 術后 6 個月矢狀位；d. 術后 6 個月冠狀位
Figure3. MRI of a 31-year-old male patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅳ) in group Ba. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation
圖7
Western blot 檢測各組細胞 PI3K/AKT/AP-1 信號通路表達
1：A 組 2：B 組 3：C 組
Figure7. PI3K/AKT/AP-1 signaling pathway expression of each group detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C
3 討論
炎癥可以抑制成骨細胞的分化和礦化，降低細胞外基質的分泌，同時激活破骨細胞的生成和活性，促進 MMP 的分泌，使骨形成與骨吸收的平衡紊亂，導致骨密度降低和骨質流失，因此炎性細胞的趨化以及炎性因子的釋放等病理過程是類風濕性關節炎、骨關節炎、骨折、骨壞死、骨質疏松等一系列疾病的關鍵機制[11-12]。炎性因子對骨質的破壞效應以 IL-1β 和 TNF-α 最為明顯，對 IL-1β 和 TNF-α 基因敲除小鼠進行雌性去勢造模發現，未出現正常小鼠的造模后骨質疏松，說明抑制 IL-1β 或 TNF-α 在臨床上具有骨保護作用，作為 IL-1β 和 TNF-α 阻滯劑的阿那白滯素和依那西普也是骨破壞疾病的常用臨床藥物[13]。因此如何減輕以白細胞、IL-1β 和 TNF-α 為代表的炎癥影響，是提高骨再生療效的關鍵因素。
PRP 因具有較高含量的血小板、PDGF、TGF-β1 等有效成分而被用于骨再生領域，但是目前 PRP 的臨床制備以基于交界層的兩步離心法為主，在有效成分富集的同時，大量炎性細胞及炎性因子也得到濃縮，可能會影響 PRP 的治療效果[14-15]。因此，部分學者致力于降低 PRP 中白細胞及相關炎性因子的濃度，以獲得 P-PRP，在骨、關節軟骨、肌腱等組織的再生中顯示出更好的療效[16-19]。如 Yin 等[6]發現 P-PRP 促進 BMSCs 和臍靜脈血管內皮細胞增殖、遷移和成骨分化的能力均高于 L-PRP，并在大鼠顱骨缺損模型中證實 P-PRP 促進骨再生效果優于 L-PRP。本研究參照 Yin 等的優化方案，將第 1 次離心力參數調整為 160×g，使血小板主要分布于上層，盡量避免中層白細胞的污染，結果顯示與 L-PRP 比較，P-PRP 在血小板、PDGF、TGF-β1 含量方面無統計學差異，但白細胞、IL-1β、TNF-α 含量卻顯著低于 L-PRP。白細胞數量的降低主要與基于血漿層的離心法有關，而炎性因子 IL-1β 和 TNF-α 具有相對分子質量小、沉降系數低的性質，因此其數量的降低可能與離心步驟的改良關系不大，而更多應歸功于白細胞的有效清除，使其無法大量分泌與釋放炎性因子。
目前 P-PRP 的研究主要停留于細胞和動物實驗，但是其臨床療效卻尚不清楚。因此，本研究將 P-PRP 作為輔助藥物用于距骨骨軟骨損傷患者的手術治療，以探討 P-PRP 在距骨骨軟骨損傷治療中的療效。結果顯示，C 組患者的 AOFAS 評分在術后逐漸升高，而且 3、6、12 個月的 AOFAS 評分均高于 B 組，表明 P-PRP 可以促進距骨骨軟骨損傷的臨床恢復，而且效果優于 L-PRP。此外，C 組患者的 VAS 評分雖然在術后逐漸降低，但與 B 組比較差異卻無統計學意義，可能與本次研究樣本量選入較少有關。
為了進一步研究 P-PRP 的治療機制，本研究使用小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 進行體外實驗，結果顯示 C 組細胞的增殖、ALP 活性、OPN mRNA 表達和Ⅰ型膠原 mRNA 表達均高于 B 組，表明 P-PRP 在促進成骨細胞增殖、分化、基質分泌方面均優于 L-PRP。研究發現，炎癥導致的Ⅰ型膠原蛋白、OPN、骨涎蛋白等細胞外基質的降解，與 MMP 的過量分泌密切相關[20]。本研究結果也發現 B 組細胞的 MMP-9 mRNA 表達與蛋白分泌均高于 C 組，表明 P-PRP 提高骨再生療效的機制可能與降低 MMP-9 的分泌有關。MMP-9 的高表達與 AP-1 的激活密切相關，AP-1 是一種由 c-Jun、c-Fos 和 ATF2 等蛋白質形成的二聚體復合物，可由 PI3K/AKT 信號通路激活，轉運至 MMP-9 啟動子上游 533 bp 和 79 bp 處進行結合，從而促進 MMP-9 的表達[21-22]。本研究通過 Western blot 檢測顯示，C 組細胞中 PI3K、pAKT 和 p-c-Jun 蛋白表達均低于 B 組，表明 P-PRP 降低 MMP-9 的分泌可能與抑制成骨細胞中 PI3K/AKT/AP-1 信號通路的激活有關。
盡管本研究初步探討了 P-PRP 在距骨骨軟骨損傷中的臨床療效和相關機制，但是仍有許多問題亟待解決：① 本研究將 P-PRP 作為輔助藥物用于距骨骨軟骨損傷的手術治療，存在干擾因素較多、樣本量較少、評價指標不足等問題，因此 P-PRP 在距骨骨軟骨損傷中的療效仍需要進一步研究。② P-PRP 對股骨、橈骨、牙槽骨等其他部位骨組織的壞死以及骨折、骨關節炎、類風濕性關節炎等其他骨科疾病是否仍存在較優的臨床治療效應，是否具有普遍適用性，仍不明確。③ 骨代謝的平衡依賴骨形成與骨吸收相互的調節，而成骨細胞和破骨細胞是這兩個方面的關鍵效應細胞。研究發現炎癥不僅可以抑制成骨細胞的增殖、分化、礦化和分泌，還在破骨細胞的活化中發揮重要作用[23]。但本研究僅從成骨細胞的角度進行研究，P-PRP 對破骨細胞生物學作用的影響仍不清楚。④ 炎性因子也可以激活 NF-κB 信號通路，使 NF-κB 由細胞質轉移至細胞核，從而增強包括炎癥、凋亡、MMP 等一系列基因的表達[24]，但本研究未對 NF-κB 信號通路在 P-PRP 治療效應中的作用進行探討。
綜上述，P-PRP 對距骨骨軟骨損傷的療效優于 L-PRP，可能與抑制成骨細胞中 PI3K/AKT/AP-1 信號通路的激活，從而降低 MMP-9 的分泌有關。我們下一步將繼續納入病例以擴大樣本量，并開展 P-PRP 在骨折、骨關節炎、類風濕性關節炎等其他骨科疾病中的治療研究，對 P-PRP 在破骨細胞中的生物學作用及 NF-κB 信號通路等機制進行深入探討。
自體富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是根據自體血中不同成分的離心系數不同，經過 2 次離心法獲得的富含血小板、PDGF、TGF-β1 等成分的血漿，具有促進細胞增殖、分化、遷移，支持血管生長等生物學作用，因此被廣泛用于骨、軟骨、神經、皮膚等組織的再生與修復[1-3]。PRP 可以促進成骨細胞的增殖、分化和礦化，增強Ⅰ型膠原蛋白、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白等細胞外基質的分泌，因此被用于骨折、骨壞死、骨關節炎等骨科疾病的治療[4-5]。但是，關于 PRP 的治療效果仍然存在爭議，可能與 PRP 中高濃度的白細胞以及炎性因子有關[6-8]。Xu 等[9]改良了傳統的基于交界層的 PRP 制備方法，通過基于血漿層的兩步離心法制備得到白細胞與炎性因子水平較低的去白細胞 PRP（pure PRP，P-PRP），并且發現 P-PRP 促進 BMSCs 生長與軟骨發生的能力均顯著高于富白細胞 PRP（leukocyte PRP，L-PRP），在兔軟骨缺損模型中的修復效果更為顯著。因此，本研究參照此優化方案制備得到 P-PRP，并與傳統制備方法得到的 L-PRP 進行成分比較，然后作為輔助藥物用于距骨骨軟骨損傷患者的手術治療，以探討 P-PRP 在距骨骨軟骨損傷治療中的療效，并使用小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 進行體外實驗，研究 P-PRP 的治療機制。報告如下。
1 臨床資料
1.1 患者選擇標準
納入標準：① 診斷為距骨骨軟骨損傷，診斷標準：慢性持續性踝關節疼痛、反復腫脹、不能跑跳、運動后加重等，有損傷處壓痛等體征，局灶性關節軟骨損傷或缺損伴下方的骨水腫、骨折或囊腫形成等影像學表現；② Hepple 分型[10]為Ⅲ～Ⅴ型，保守治療無效，損傷面積較大，需要手術治療者。排除標準：① 血小板數量和功能異常；② 伴隨肝腎功能障礙、腫瘤、類風濕性關節炎、足踝畸形、心腦血管疾病、精神疾病等。
2014 年 1 月—2017 年 10 月共 36 例患者符合選擇標準納入研究，采用隨機數字表法隨機分為對照組（A 組）、L-PRP 組（B 組）、P-PRP 組（C 組），每組 12 例。本研究獲解放軍聯勤保障部隊第九八八醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。
1.2 一般資料
A 組：男 8 例，女 4 例；年齡 29～55 歲，平均 42.3 歲。病程 1～41 個月，平均 18 個月；其中病程<1 年 6 例，1～3 年 4 例，>3 年 2 例。Hepple 分型：Ⅲ型 5 例，Ⅳ型 5 例，Ⅴ型 2 例。
B 組：男 9 例，女 3 例；年齡 28～58 歲，平均 42.8 歲。病程 1～43 個月，平均 17 個月；其中病程<1 年 7 例，1～3 年 4 例，>3 年 1 例。Hepple 分型：Ⅲ型 6 例，Ⅳ型 4 例，Ⅴ型 2 例。
C 組：男 8 例，女 4 例；年齡 26～55 歲，平均 41.6 歲。病程 2～40 個月，平均 18 個月；其中病程<1 年 7 例，1～3 年 2 例，>3 年 2 例。Hepple 分型：Ⅲ型 5 例，Ⅳ型 4 例，Ⅴ型 3 例。
3 組患者性別、年齡、病程、Hepple 分型等一般資料比較差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。
1.3 L-PRP 與 P-PRP 的制備及組分分析
1.3.1 L-PRP 與 P-PRP 的制備
使用預先含有 4 mL 枸櫞酸鈉抗凝劑的 50 mL 注射器采集所有患者靜脈血 37 mL，混勻后，吸取 1 mL 用于全血成分檢測，余 40 mL 使用 PRP 制備套裝（山東威高集團有限公司）進行后續制備。① L-PRP 制備方法：以 660×g 離心 10 min，可見全血分為 3 層，底部為紅細胞層，中間為白細胞和血小板的交界層，上層為乏血小板血漿層；使用注射器吸棄紅細胞層，以 660×g 進行第 2 次離心，共 10 min，底部的白膜樣物質為白細胞和血小板沉積層，上層為乏血小板血漿層，吸棄上層乏血小板血漿至剩余 4 mL，靜置片刻后混勻。② P-PRP 制備方法：以 160×g 離心 10 min，可見全血分為 3 層，底部為紅細胞層，中間為白細胞層，上層為 PRP 層；使用注射器吸取上層至另一離心管，以 250×g 離心 15 min，底部為血小板沉積層，上層為乏血小板血漿層，吸棄上層乏血小板血漿至剩余 4 mL，靜置片刻后混勻。L-PRP 與 P-PRP 使用前，加入 10%CaCl2 溶液進行激活。
1.3.2 全血、L-PRP 與 P-PRP 組分分析
取全血、L-PRP 與 P-PRP 各 1 mL，使用 KX-21N 全自動血液分析儀（Sysmex 公司，日本）測定血小板和白細胞濃度；使用 ELISA 試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）測定 IL-1β、TNF-α、PDGF、TGF-β1 濃度。
1.4 手術方法
患者于椎管內麻醉后，患側大腿近端上氣囊止血帶，壓力在 45～50 kPa。術中取內踝偏前緣長約 9 cm 弧形切口，逐層切開皮膚、皮下組織和筋膜，顯露內踝。于內踝尖部向脛骨遠端先打入 2 枚直徑 2.0 mm 空心釘導針，然后拔出。用微型擺鋸截斷內踝，將內踝向遠端掀起，顯露距骨內側病灶，C 臂 X 線機定位病灶中心并打入 1 枚克氏針，根據病灶大小選擇合適型號的空心鉆清除壞死骨，并使用刮勺清除周圍硬化骨組織直至病灶四周有接近正常的骨小梁組織。評估缺損體積，根據術前 MRI 及 CT 三維重建分析及術中觀察軟骨面缺損的部位大小形狀，用同型號取骨環鉆取自體同側脛骨遠端或內側髂骨帶骨膜及松質骨骨柱（在保證骨柱及骨膜完整的情況下，將同型號骨柱以松質骨在內、骨膜在外植入距骨骨缺損處），對距骨缺損處進行打壓植骨，至與軟骨面同一弧度切跡，保證所植骨柱與距骨軟骨下骨平齊；B、C 組在關節鏡下分別使用 PRP 專用注射器將 2.5 mL L-PRP 和 P-PRP 注射到所移植骨柱的周圍間隙及所帶骨膜下，A 組不注射任何藥物。復位內踝截骨端，沿原空心釘導針孔插入 1.0 mm 螺釘導針，沿導針擰入 2 枚 3.5 mm 空心加壓螺釘。C 臂 X 線機透視見位置良好后，逐層縫合切口。
1.5 術后處理及療效觀察指標
術后給予消腫治療，對患肢功能位石膏固定4周；然后改用免負重支具靴固定3個月，逐漸負重行走；并進行患肢無負重狀態下功能鍛煉，半年內避免患肢劇烈負重活動。
術前和術后 3、6、12 個月采用美國矯形足踝協會（AOFAS）踝-后足評分和疼痛視覺模擬評分（VAS）評價療效。
1.6 P-PRP 治療機制研究
1.6.1 主要試劑及儀器
MC3T3-E1 細胞購于中國科學院上海細胞庫。α-MEM 培養液（HyClone 公司，美國）；細胞裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒、ALP 檢測試劑盒、ECL 顯色液（上海碧云天生物技術有限公司）；逆轉錄試劑盒（Qiagen 公司，德國）；熒光定量試劑盒（Takara 公司，日本）；抗基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）抗體、抗磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抗體、抗磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）抗體、抗磷酸化 c-Jun（phosphorylated c-Jun，p-c-Jun）抗體、抗 GAPDH 抗體（Abcam 公司，英國）；過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。酶標儀（PerkinElmer 公司，美國）；qRT-PCR 儀、凝膠成像儀（Bio-Rad 公司，美國）。
1.6.2 MC3T3-E1 細胞的培養與分組
將 MC3T3-E1 細胞使用含 10%FBS 的 α-MEM 培養液培養于 37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱，匯合度達 75% 左右時使用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代。將第 3 代 MC3T3-E1 細胞隨機分為 3 組，即對照組（A 組）、L-PRP 組（B 組）、P-PRP 組（C 組）。B、C 組分別使用含 5% L-PRP 或 P-PRP 的細胞培養液進行培養，A 組使用含 5%PBS 的細胞培養液培養。
1.6.3 MTT 檢測各組細胞增殖
取第 3 代 MC3T3-E1 細胞，以 5×103個/孔密度接種于 96 孔板，24 h 后更換新鮮細胞培養液，同上述分組方法相應處理，每組設 6 個復孔。培養 3 d 后，每孔加入 10 μL MTT，繼續培養 4 h，吸棄上清后，每孔加入 150 μL DMSO，搖床低速振蕩 10 min，使用酶標儀于 490 nm 處測定各孔的吸光度（A）值。
1.6.4 ALP 活性測定
取第 3 代 MC3T3-E1 細胞，以 5×105個/孔密度接種于 6 孔板，24 h 后更換新鮮細胞培養液，同上述分組方法相應處理，每組設 6 個復孔。吸取上清液，使用 ELISA 試劑盒測定上清液 MMP-9 蛋白含量。PBS 洗滌細胞 3 次，加入 100 μL 細胞裂解液，充分裂解后，12 000×g 離心 5 min，使用 BCA 蛋白定量試劑盒測定上清液的蛋白濃度，使用 ALP 檢測試劑盒測定 ALP 活性。
1.6.5 實時熒光定量 PCR（real-time quantitative fluorescence PCR，qRT-PCR）檢測
取第 3 代 MC3T3-E1 細胞，按 1.6.2 分組方法處理細胞后，使用 qRT-PCR 檢測細胞中 OPN、Ⅰ型膠原和 MMP-9 mRNA 的表達。具體方法：Trizol 法提取總 RNA，逆轉錄試劑盒合成 cDNA，熒光定量試劑盒進行 PCR 反應，反應條件：95℃ 預變性 30 s；95℃ 變性 5 s，60℃ 退火 30 s，30 個循環。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表 1。將 A 組各基因 mRNA 表達量設為 1，計算 B、C 組與 A 組相比各基因 mRNA 表達量的倍數。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequences of qRT-PCR
1.6.6 Western blot 檢測
取第 3 代 MC3T3-E1 細胞，按 1.6.2 分組方法處理細胞后，使用 Western blot 檢測上清液 MMP-9 蛋白的分泌和細胞中 PI3K、pAKT、p-c-Jun 蛋白的表達。具體方法：取 40 μg 蛋白質進行 SDS-PAGE 電泳，藍色染料至膠底部時停止電泳，冰水浴中將目的蛋白電轉（100 mA、2 h）至聚偏二氟乙烯膜，5% 脫脂奶粉封閉 2 h，使用抗 MMP-9 抗體（1∶1 000）、抗 PI3K 抗體（1∶1 000）、抗 pAKT 抗體（1∶1 000）、抗 p-c-Jun 抗體（1∶1 000）、抗 GAPDH 抗體（1∶2 000）4℃ 過夜孵育。洗滌 3 次，使用過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育 1 h，洗滌 3 次，ECL 顯色液顯色，凝膠成像儀下曝光和拍照。用 Image Pro Plus 6.0 軟件進行灰度值定量，將 A 組的灰度值設置為 1。
1.7 統計學方法
采用 SPSS13.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗；組內各時間點間比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用 Bonferroni 檢驗。計數資料組間比較采用 χ2 檢驗，等級資料組間比較采用 Kruskal-Wallis H 非參數檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 全血、L-PRP、P-PRP 組分分析
與全血比較，L-PRP 血小板、白細胞、IL-1β、TNF-α、PDGF、TGF-β1 濃度均顯著增加，P-PRP 血小板、PDGF、TGF-β1 濃度顯著增加，白細胞、IL-1β、TNF-α 濃度顯著減少，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 L-PRP 比較，P-PRP 血小板、PDGF、TGF-β1 濃度差異無統計學意義（P>0.05），但白細胞、IL-1β、TNF-α 濃度顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 1。
圖1
全血、L-PRP、P-PRP 組分濃度比較
a. 白細胞；b. 血小板；c. IL-1β；d. TNF-α；e. PDGF；f. TGF-β1
Figure1. Comparison of the components in whole blood, L-PRP, and P-PRPa. Leukocyte; b. Platelet; c. IL-1β; d. TNF-α; e. PDGF; f. TGF-β1
2.2 臨床療效分析
各組患者均獲隨訪，隨訪時間 13～25 個月，平均 18 個月。無傷口感染、內固定失效等并發癥發生。植骨處均愈合，透明軟骨修復良好，愈合時間 4～8 個月，平均 6 個月。MRI 檢查示，各組術前損傷程度相似；術后 6 個月 C 組可見距骨頂軟骨完整，軟骨與距骨體緊密結合，無水腫、分離以及硬化帶形成，優于 A、B 組。見圖 2～4。與術前相比，術后各組 AOFAS 評分均逐漸升高，VAS 評分均逐漸降低，術后各時間點與術前比較差異均有統計學意義（P<0.05）。術后 3、6、12 個月 C 組 AOFAS 評分均顯著高于 A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05），A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；VAS 評分 A、B、C 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖2
A 組患者，女，52 歲，距骨骨軟骨損傷（HeppleⅤ型）MRI
a. 術前矢狀位；b. 術前冠狀位；c. 術后 6 個月矢狀位；d. 術后 6 個月冠狀位
Figure2. MRI of a 52-year-old female patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅴ) in group Aa. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation
圖4
C 組患者，男，34歲，距骨骨軟骨損傷（Hepple Ⅳ型）MRI
a. 術前矢狀位；b. 術前冠狀位；c. 術后 6 個月矢狀位；d. 術后 6 個月冠狀位
Figure4. MRI of a 34-year-old male patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅳ) in group Ca. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation
圖5
各組患者手術前后各時間點 AOFAS 評分和 VAS 評分比較
a. AOFAS 評分；b. VAS 評分
Figure5. Comparison of AOFAS scores and VAS scores among 3 groups at pre- and post-operationa. AOFAS score; b. VAS score
2.3 P-PRP 治療機制研究
2.3.1 各組細胞增殖和分化能力比較
MTT 檢測示，A、B、C 組細胞 A 值分別為 0.91±0.12、1.01±0.15、1.14±0.19，ALP 活性分別為（5.09±0.97）、（5.93±1.05）、（7.58±1.10）U/g，OPN mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.16、1.46±0.31、2.29±0.44，Ⅰ型膠原 mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.18、1.22±0.26、1.54±0.33。以上指標 C 組顯著大于 A、B 組，B 組大于 A 組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3.2 各組細胞間 MMP-9 表達比較
Western blot 檢測示 A、B、C 組 MMP-9 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.14、1.53±0.29、0.91±0.22，ELISA 檢測 MMP-9 蛋白含量分別為（6.58±0.96）、（7.54±1.41）、（6.07±1.09）μg/L，qRT-PCR 檢測 MMP-9 mRNA 相對表達量分別為 1.00±0.17、1.57±0.35、0.83±0.25，以上指標 B 組顯著大于 A、C 組，C 組小于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測各組細胞 MMP-9 蛋白表達
1：A 組2：B 組 3：C 組
Figure6. MMP-9 protein expressions of each group detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C
2.3.3 Western blot 檢測各組細胞 PI3K/AKT/AP-1 信號通路表達
A、B、C 組 PI3K 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.15、1.87±0.48、1.14±0.29，pAKT 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.23、2.07±0.44、0.90±0.31，p-c-Jun 蛋白相對表達量分別為 1.00±0.18、1.69±0.41、1.07±0.24。以上指標 B 組顯著大于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7。
圖3
B 組患者，男，31 歲，距骨骨軟骨損傷（Hepple Ⅳ型）MRI
a. 術前矢狀位；b. 術前冠狀位；c. 術后 6 個月矢狀位；d. 術后 6 個月冠狀位
Figure3. MRI of a 31-year-old male patient with osteochondral injury of talus (Hepple type Ⅳ) in group Ba. Preoperative sagittal position; b. Preoperative coronal position; c. Sagittal position at 6 months after operation; d. Coronal position at 6 months after operation
圖7
Western blot 檢測各組細胞 PI3K/AKT/AP-1 信號通路表達
1：A 組 2：B 組 3：C 組
Figure7. PI3K/AKT/AP-1 signaling pathway expression of each group detected by Western blot1: Group A 2: Group B 3: Group C
3 討論
炎癥可以抑制成骨細胞的分化和礦化，降低細胞外基質的分泌，同時激活破骨細胞的生成和活性，促進 MMP 的分泌，使骨形成與骨吸收的平衡紊亂，導致骨密度降低和骨質流失，因此炎性細胞的趨化以及炎性因子的釋放等病理過程是類風濕性關節炎、骨關節炎、骨折、骨壞死、骨質疏松等一系列疾病的關鍵機制[11-12]。炎性因子對骨質的破壞效應以 IL-1β 和 TNF-α 最為明顯，對 IL-1β 和 TNF-α 基因敲除小鼠進行雌性去勢造模發現，未出現正常小鼠的造模后骨質疏松，說明抑制 IL-1β 或 TNF-α 在臨床上具有骨保護作用，作為 IL-1β 和 TNF-α 阻滯劑的阿那白滯素和依那西普也是骨破壞疾病的常用臨床藥物[13]。因此如何減輕以白細胞、IL-1β 和 TNF-α 為代表的炎癥影響，是提高骨再生療效的關鍵因素。
PRP 因具有較高含量的血小板、PDGF、TGF-β1 等有效成分而被用于骨再生領域，但是目前 PRP 的臨床制備以基于交界層的兩步離心法為主，在有效成分富集的同時，大量炎性細胞及炎性因子也得到濃縮，可能會影響 PRP 的治療效果[14-15]。因此，部分學者致力于降低 PRP 中白細胞及相關炎性因子的濃度，以獲得 P-PRP，在骨、關節軟骨、肌腱等組織的再生中顯示出更好的療效[16-19]。如 Yin 等[6]發現 P-PRP 促進 BMSCs 和臍靜脈血管內皮細胞增殖、遷移和成骨分化的能力均高于 L-PRP，并在大鼠顱骨缺損模型中證實 P-PRP 促進骨再生效果優于 L-PRP。本研究參照 Yin 等的優化方案，將第 1 次離心力參數調整為 160×g，使血小板主要分布于上層，盡量避免中層白細胞的污染，結果顯示與 L-PRP 比較，P-PRP 在血小板、PDGF、TGF-β1 含量方面無統計學差異，但白細胞、IL-1β、TNF-α 含量卻顯著低于 L-PRP。白細胞數量的降低主要與基于血漿層的離心法有關，而炎性因子 IL-1β 和 TNF-α 具有相對分子質量小、沉降系數低的性質，因此其數量的降低可能與離心步驟的改良關系不大，而更多應歸功于白細胞的有效清除，使其無法大量分泌與釋放炎性因子。
目前 P-PRP 的研究主要停留于細胞和動物實驗，但是其臨床療效卻尚不清楚。因此，本研究將 P-PRP 作為輔助藥物用于距骨骨軟骨損傷患者的手術治療，以探討 P-PRP 在距骨骨軟骨損傷治療中的療效。結果顯示，C 組患者的 AOFAS 評分在術后逐漸升高，而且 3、6、12 個月的 AOFAS 評分均高于 B 組，表明 P-PRP 可以促進距骨骨軟骨損傷的臨床恢復，而且效果優于 L-PRP。此外，C 組患者的 VAS 評分雖然在術后逐漸降低，但與 B 組比較差異卻無統計學意義，可能與本次研究樣本量選入較少有關。
為了進一步研究 P-PRP 的治療機制，本研究使用小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 進行體外實驗，結果顯示 C 組細胞的增殖、ALP 活性、OPN mRNA 表達和Ⅰ型膠原 mRNA 表達均高于 B 組，表明 P-PRP 在促進成骨細胞增殖、分化、基質分泌方面均優于 L-PRP。研究發現，炎癥導致的Ⅰ型膠原蛋白、OPN、骨涎蛋白等細胞外基質的降解，與 MMP 的過量分泌密切相關[20]。本研究結果也發現 B 組細胞的 MMP-9 mRNA 表達與蛋白分泌均高于 C 組，表明 P-PRP 提高骨再生療效的機制可能與降低 MMP-9 的分泌有關。MMP-9 的高表達與 AP-1 的激活密切相關，AP-1 是一種由 c-Jun、c-Fos 和 ATF2 等蛋白質形成的二聚體復合物，可由 PI3K/AKT 信號通路激活，轉運至 MMP-9 啟動子上游 533 bp 和 79 bp 處進行結合，從而促進 MMP-9 的表達[21-22]。本研究通過 Western blot 檢測顯示，C 組細胞中 PI3K、pAKT 和 p-c-Jun 蛋白表達均低于 B 組，表明 P-PRP 降低 MMP-9 的分泌可能與抑制成骨細胞中 PI3K/AKT/AP-1 信號通路的激活有關。
盡管本研究初步探討了 P-PRP 在距骨骨軟骨損傷中的臨床療效和相關機制，但是仍有許多問題亟待解決：① 本研究將 P-PRP 作為輔助藥物用于距骨骨軟骨損傷的手術治療，存在干擾因素較多、樣本量較少、評價指標不足等問題，因此 P-PRP 在距骨骨軟骨損傷中的療效仍需要進一步研究。② P-PRP 對股骨、橈骨、牙槽骨等其他部位骨組織的壞死以及骨折、骨關節炎、類風濕性關節炎等其他骨科疾病是否仍存在較優的臨床治療效應，是否具有普遍適用性，仍不明確。③ 骨代謝的平衡依賴骨形成與骨吸收相互的調節，而成骨細胞和破骨細胞是這兩個方面的關鍵效應細胞。研究發現炎癥不僅可以抑制成骨細胞的增殖、分化、礦化和分泌，還在破骨細胞的活化中發揮重要作用[23]。但本研究僅從成骨細胞的角度進行研究，P-PRP 對破骨細胞生物學作用的影響仍不清楚。④ 炎性因子也可以激活 NF-κB 信號通路，使 NF-κB 由細胞質轉移至細胞核，從而增強包括炎癥、凋亡、MMP 等一系列基因的表達[24]，但本研究未對 NF-κB 信號通路在 P-PRP 治療效應中的作用進行探討。
綜上述，P-PRP 對距骨骨軟骨損傷的療效優于 L-PRP，可能與抑制成骨細胞中 PI3K/AKT/AP-1 信號通路的激活，從而降低 MMP-9 的分泌有關。我們下一步將繼續納入病例以擴大樣本量，并開展 P-PRP 在骨折、骨關節炎、類風濕性關節炎等其他骨科疾病中的治療研究，對 P-PRP 在破骨細胞中的生物學作用及 NF-κB 信號通路等機制進行深入探討。
