引用本文： 張慶宇, 高福強, 程立明, 劉立華, 孫偉, 李子榮. 淫羊藿苷對骨微血管內皮細胞自噬及外泌體產生的影響. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(5): 568-577. doi: 10.7507/1002-1892.201811009 復制
骨微血管內皮細胞（bone microvascular endothelial cells，BMECs）構成附著在骨小梁上的單層結構，與血液中的成分直接接觸，為骨組織和細胞提供氧氣和營養，還具有內分泌功能，這對維持骨內正常微環境具有重要意義[1-2]。而糖皮質激素是一類臨床常用的抗炎藥和免疫抑制劑，也是引起非創傷性股骨頭壞死和繼發性骨質疏松癥最重要的危險因素[3-4]。我們前期實驗表明，淫羊藿苷對高濃度激素導致的股骨頭 BMECs 損傷有明顯保護作用，而 0.1 mg/mL 濃度以下的激素并不會引起明顯的內皮細胞凋亡[5-7]。自噬是目前生命科學研究的熱點，指細胞通過降解內部損傷的蛋白質和細胞器等來維持穩態，實現細胞的代謝和更新，然而自噬達到一定水平，又會啟動凋亡造成損傷[8]。目前淫羊藿苷對 BMECs 自噬的影響尚未見報道。外泌體則是一種直徑 30～100 nm，在細胞間通訊中起重要作用的細胞外囊泡[9-10]。這些作用是通過以自分泌或旁分泌的形式在不同細胞間轉運 mRNA、微小 RNA（micro RNA，miRNA）、蛋白質及其他活性物質實現的[9-10]。Jiang 等[11]報道缺氧能夠刺激臍靜脈內皮細胞產生外泌體，而后者又能夠抑制缺氧造成的神經細胞凋亡，激活自噬過程。本實驗中，我們擬觀察淫羊藿苷對低濃度激素誘導的股骨頭 BMECs 自噬以及外泌體產生的影響，以及后兩者之間的相互作用，進一步探索激素相關骨病的發生機制及治療方法。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
股骨頭由因股骨頸骨折、原發性髖關節骨關節炎或先天性髖關節發育不良繼發骨關節炎，而于中日友好醫院接受全髖關節置換術的患者自愿捐獻。
DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；MACS 運行緩沖液及 CD31 磁珠（Miltenyi 公司，德國）；內皮細胞培養基（ScienCell 公司，美國）；氫化可的松（輝瑞公司，美國）；FBS（HyClone 公司，美國）；Matrigel 膠、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、淫羊藿苷（Sigma 公司，美國）；CD31、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、微管相關蛋白輕鏈 3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、死骨片 1（SQSTM1/p62）、β-肌動蛋白（β-actin）一抗及對應二抗（Abcam 公司，美國）；CD9、CD81、VEGFA、TGF-β1 一抗及對應二抗（Santa Cruz 公司，美國）；5×蛋白上樣緩沖液、RIPA 裂解液、ECL 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；聚偏二氟乙烯膜（Millipore 公司，美國）；外泌體分離試劑盒（和光純藥工業株式會社，日本）。CO2 孵箱（Thermo 公司，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡及照相系統（Nikon 公司，日本）；透射電鏡（Joel 公司，日本）；Nanosight NS300 納米粒子跟蹤分析系統（Malvern 公司，英國）；低溫高速離心機（Beckman 公司，美國）。
1.2 股骨頭 BMECs 分離培養及相關觀測
1.2.1 股骨頭 BMECs 分離培養
無菌條件下將股骨頭剖開，去掉筋膜、凝血塊和其他雜質，將正常松質骨切成細小骨粒，放入 15 mL 離心管，用 DMEM 培養基洗滌 3 次。加入 5 mL 0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃ 水浴消化 25 min；再加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 5 min；最后加入 2 mL 含 10%FBS的 DMEM 培養基終止消化。將上清液通過 100 目細胞篩過濾，并以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 6 min。將含有微血管段和細胞的沉淀物用 80 μL MACS 磁珠緩沖液和 20 μL CD31 磁珠重懸。4℃ 下溫育 15 min，將細胞懸浮液與 400 μL MACS 運行緩沖液混合，通過固定在磁場中的 MACS 分選柱，500 μL 運行緩沖液沖洗 3 次。隨后移去 MACS 分選柱，用 1 mL PBS 緩沖液將 C31 磁珠結合的細胞沖洗到 Eppendorf 管中，再次以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 6 min。將離心細胞重懸于 5 mL 內皮細胞培養基并接種到培養瓶中，于 37℃、5%CO2、95% 濕度細胞培養箱中培養。24 h 后 PBS 洗滌，除去未附著的細胞。當細胞擴增至培養瓶底部 80% 以上時，進行細胞傳代，取第 3 代細胞用于后續實驗。
1.2.2 BMECs 形態觀察
細胞貼壁后，每日于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。待細胞長滿培養瓶底面積 80% 時，0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 3 min，吹打后收集細胞懸液，以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 6 min，4℃、3% 戊二醛固定，1% 鋨酸固定，梯度乙醇-丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾染色 30 min，醋酸鉛染色 15 min，透射電鏡下觀察。
1.2.3 免疫熒光染色檢測細胞純度
將分離培養 7 d 的細胞接種至防脫片載玻片上，生長 12 h 后用 PBS 洗滌 3 次，4% 多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100 穿透；用 10%FBS 封閉后，將細胞與 CD31（1∶300）和 vWF（1∶300）一抗孵育過夜；然后 PBS 洗滌，并將細胞與標記有 FITC 或 Alexa 488 的二抗以及 DAPI 在室溫下孵育 1 h。封片，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態，并隨機選取 10 個視野，統計免疫熒光染色陽性細胞數量占同一視野下所有細胞數量的比例，計算細胞純度。
1.3 糖皮質激素和淫羊藿苷對 BMECs 自噬相關蛋白的影響
將 BMECs 以 5.0×105個/孔密度接種至 6 孔板，分為 8 組，每組設 3 個平行孔。A、B、C、D 組每孔分別加入含 0、0.03、0.06、0.10 mg/mL 氫化可的松的 DMEM 培養基；A1、B1、C1、D1 組分別加入含 0、0.03、0.06、0.10 mg/mL 氫化可的松的 DMEM 培養基后，再每孔給予 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷干預。培養 24 h 后 4℃ PBS 洗滌，收集細胞，加入蛋白裂解液，于冰上裂解 30 min，然后以離心半徑 55 cm、12 000 r/min 離心 5 min，分離蛋白質，采用 Western blot 法檢測各組 LC3B 和 p62 蛋白表達水平。具體操作：將蛋白樣品與 5×蛋白凝膠電泳上樣緩沖液混合，95℃ 變性 10 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳使染料至分離膠適當位置，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5% 脫脂牛奶封閉 1 h；與特異性一抗 LC3B（1∶2 000）、p62（1∶2 000）和 β-actin（1∶3 000）孵育過夜后，與辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶5 000）孵育 50 min；使用 ECL 試劑盒處理印跡，暗室中曝光、顯影并定影；條帶灰度值采用 Quantity One v.4.6.2 軟件分析。以 β-actin 蛋白作為內參，蛋白相對表達量以目標蛋白與 β-actin 蛋白灰度值的比值表示。其中 LC3B 包括 LC3B -Ⅰ和 LC3B-Ⅱ，自噬過程中，非激活型 LC3B-Ⅰ經過水解和脂質化后會轉變為激活的自噬小體膜結合 LC3B-Ⅱ[12]，因此以 LC3B-Ⅱ的蛋白相對表達量來表示 LC3B 的蛋白相對表達量。
1.4 外泌體分離及相關觀測
1.4.1 外泌體分離及其直徑、濃度檢測
將 BMECs 以 5.0×105個/mL 密度接種至 25 cm2培養瓶（5 mL 培養基），分別在含和不含 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷的無外泌體培養基（內皮細胞培養基中的 FBS 預先經 0.22 μm 濾膜過濾，以 100 000×g 離心 18 h，從而去除其中的外泌體）中培養 24 h（分別設為干預組和未干預組），收集上清液，應用外泌體分離試劑盒提取外泌體；將外泌體重懸于 PBS 中，通過納米顆粒跟蹤分析技術分析其直徑分布和濃度。
1.4.2 BCA 法檢測外泌體總蛋白質含量
將 BSA 作為標準品，按一系列濃度（25、125、250、500、750、1 000、1 500、2 000 μg/ mL）稀釋，依次加入 10 μL 96 孔板中；取兩組外泌體，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸，4℃ 下以離心半徑 55 cm、12 000 r/min 離心 5 min，分離蛋白，將 10 μL 蛋白質樣品加入 96 孔板。每孔加入 200 μL BCA 工作溶液，并在黑暗環境中于 37℃ 孵育 30 min。于 750 nm 波長下測量吸光度（A）值，按照 BSA 濃度繪制標準曲線，并根據標準曲線讀取外泌體總蛋白質濃度。
1.4.3 Western blot 檢測外泌體攜帶蛋白表達
取兩組外泌體，按照 1.4.2 方法分離蛋白，按 1.3 方法檢測 CD9、CD81、TGF-β1 和 VEGFA 蛋白相對表達量。
1.5 外泌體對 BMECs 自噬及功能的影響
1.5.1 Western blot 檢測自噬相關蛋白表達
將 BMECs 以 5.0×105個/孔密度接種至 6 孔板，分為 3 組：實驗組分離經 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷處理的 BMECs 分泌的外泌體（濃度為 200 ng/μL），與 BMECs 共培養；對照組分離未經淫羊藿苷處理的 BMECs 分泌的外泌體（濃度為 200 ng/μL），與 BMECs 共培養；空白對照組為單純 BMECs。培養 24 h 后，3 組均加入 0.06 mg/mL 氫化可的松處理 24 h 后，按 1.3 方法檢測細胞中 LC3BⅡ和 p62 蛋白相對表達量。每組設 3 個平行孔。
1.5.2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力
用記號筆在 6 孔板背后均勻劃橫線，橫穿過孔；取處于對數生長期、生長狀態良好的第 3 代 BMCEs，以 1×106個/孔密度接種至上述 6 孔板，37℃、5%CO2 培養箱中培養過夜；待細胞鋪滿 6 孔板底部，用 10 μL 槍頭垂至于背后的橫線劃痕。PBS 洗細胞 3 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，實驗組加入經 5×10?5 mol/L 淫羊藿苷處理的 BMECs 分泌的外泌體（濃度為 200 ng/μL），對照組加入未經淫羊藿苷處理的 BMECs 分泌的外泌體（濃度為 200 ng/μL），空白對照組不加入外泌體；培養 24 h 后以 0.06 mg/ mL 氫化可的松處理，分別于氫化可的松處理 0、12、 24 h 時進行拍照，按以下公式計算劃痕閉合率：（a—b）/a×100%，其中 a 為整張照片寬度，b 為無細胞的空白部位寬度。
1.5.3 血管生成能力檢測
向預冷的 24 孔板中按照 150 μL/孔濃度加入 Matrigel 膠，置于 37℃、5%CO2 培養箱中放置 30 min 使其凝固成膠，備用。取 BMECs 按 1.5.1 分組方法分別培養 24 h 后，胰蛋白酶消化，用無血清 DMEM 重懸細胞，以 2.5×105個/孔密度接種于涂有 Matrigel 膠的 24 孔板中；加入 0.06 mg/mL 氫化可的松，于 37℃、5%CO2、95% 濕度細胞培養箱內培養 4、8 h 后倒置相差顯微鏡 100 倍鏡下拍照，隨機取 3 個視野，計數管腔數、出芽數和小管分支長度。
1.6 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMECs 形態觀察和純度檢測
培養 2～3 d 可觀察到貼壁細胞均勻分布于培養瓶中；分離細胞培養 7 d 倒置相差顯微鏡觀察示，細胞生長趨于融合，呈紡錘形或多邊形，鏡下呈“鋪路石”樣（圖 1a）。透射電鏡觀察示，分離細胞培養 14 d 時呈多邊形，表面被細胞質凸起形成的微絨毛覆蓋，細胞核較大，具有明顯核仁；細胞質富含線粒體、粗面內質網、高爾基復合體和其他細胞器（圖 1b）。免疫熒光染色示 vWF 和 CD31 陽性率接近 100%（圖 1c、d）。
圖1
BMECs 形態觀察和純度檢測
a. 培養 7 d 倒置相差顯微鏡觀察（×40）；b. 培養 14 d 透射電鏡觀察（×12 k）；c. 免疫熒光染色觀察示 CD31 高表達（熒光顯微鏡×100）；d. 免疫熒光染色示 vWF 高表達（熒光顯微鏡×100）
Figure1. Morphology observation and purity identification of BMECsa. Inverted phase contrast microscope observation after 7 days of culture (×40); b. Transmission electron microscope observation after 14 days of culture (×12 k); c. Immunofluorescence staining showed high expression of CD31 (Fluorescence microscope×100); d. Immunofluorescence staining showed high expression of vWF (Fluorescence microscope×100)
2.2 糖皮質激素和淫羊藿苷對 BMECs 自噬相關蛋白的影響
隨著氫化可的松濃度升高，各組 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量逐漸增加，p62 蛋白相對表達量逐漸減少，A、B、C、D 組間及 A1、B1、C1、D1 組間差異均有統計學意義（P<0.01）。與相同濃度激素組相比，給予淫羊藿苷干預后，LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量減少，p62 蛋白表達量增加，差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測糖皮質激素和淫羊藿苷對 BMECs 自噬相關蛋白的影響
a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 5：A1 組 6：B1 組 7：C1 組 8：D1 組；b. 各組 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量比較；c. 各組 p62 蛋白相對表達量比較
Figure2. Effect of glucocorticoid and icariin on autophagy-related proteins in BMECs detected by Western blot analysisa. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group A1 6: Group B1 7: Group C1 8: Group D1; b. Comparison of protein expression of LC3B-Ⅱ in each group; c. Comparison of protein expression of p62 in each group
2.3 外泌體相關觀測
2.3.1 外泌體直徑和濃度檢測
未干預組和干預組外泌體直徑分別為（86.68±1.97）、（85.35±1.65）nm，差異無統計學意義（t=0.896，P=0.421）；濃度分別為（9.85±0.47）×106個/mL 和（1.54±0.08）×107個/mL，干預組顯著高于未干預組，差異有統計學意義（t=?10.191，P=0.001）。
2.3.2 外泌體總蛋白質含量檢測
未干預組和干預組外泌體總蛋白質含量分別為（132.63±3.33）μg/mL 和（138.56±9.58）μg/mL，比較差異無統計學意義（t=?1.102，P=0.369）。
2.3.3 Western blot 法檢測外泌體攜帶蛋白表達
未干預組和干預組細胞中提取的外泌體中 CD9 和 CD81 均高度表達，干預組的 VEGFA/CD9 和 TGF-β1/CD9 蛋白相對表達量比值均顯著高于未干預組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖 3。
圖3
Western blot 法檢測外泌體攜帶蛋白表達
a. 電泳圖 1：未干預組 2：干預組；b. 兩組 VEGFA/CD9 蛋白相對表達量比較；c. 兩組 TGF-β1/CD9 蛋白相對表達量比較
Figure3. Expression of exosome-carried proteins detected by Western blot analysisa. Electropherogram 1: Non-intervention group 2: Intervention group; b. Comparison of protein expression ratio of VEGFA/CD9 in two groups; c. Comparison of protein expression ratio of TGF-β1/CD9 in two groups
2.4 外泌體對 BMECs 自噬及功能的影響
2.4.1 Western blot 檢測自噬相關蛋白表達
在空白對照組、對照組和實驗組中，p62 蛋白相對表達量呈遞增趨勢，LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量呈遞減趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測外泌體對 BMECs 自噬相關蛋白表達的影響
a. 電泳圖 1：空白對照組 2：對照組 3：實驗組；b. 各組 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量比較；c. 各組 p62 蛋白相對表達量比較
Figure4. Effect of exosomes on the expression level of autophagy-related protein of BMECs detected by Western blot analysisa. Electropherogram 1: Blank control group 2: Control group 3: Experimental group; b. Comparison of protein expression of LC3B-Ⅱ in each group; c. Comparison of protein expression of p62 in each group
2.4.2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力
氫化可的松處理 0 h 時，鏡下各組均顯示清晰劃痕，各組劃痕閉合率比較差異無統計學意義（P>0.05）；12、24 h 時，對照組和實驗組細胞遷移能力明顯高于空白對照組，實驗組明顯高于對照組，各組劃痕閉合率比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、表 1。
圖5
劃痕實驗檢測外泌體對內皮細胞遷移的影響（倒置相差顯微鏡×100）
從左至右依次為氫化可的松處理 0、12、24 h 時 a. 空白對照組；b. 對照組；c. 實驗組
Figure5. Scratch test to detect the effect of exosomes on endothelial cell migration (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for hydrocortisone treatment lasted 0, 12, and 24 hours, respectively a. Blank control group; b. Control group; c. Experimental group
表1
氫化可的松處理后各時間點各組細胞劃痕閉合率比較（n=3，%，
）
Table1.
Comparison of scratch closure rates of BMECs in each group at each time point after hydrocortisone treatment (n=3, %, 
)
2.4.3 血管生成能力檢測
倒置相差顯微鏡觀察可見各組在氫化可的松處理 4 h 后即有內皮細胞形成管狀結構，見圖 6。氫化可的松處理 4、8 h 時，實驗組和對照組管腔數、出芽數和小管分支長度均顯著大于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組小管分支長度和管腔數顯著大于對照組（P<0.05），但出芽數與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
氫化可的松處理后各時間點各組細胞血管生成能力比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of angiogenic ability of BMECs in each group at each time point after hydrocortisone treatment (n=3, 
)
圖6
氫化可的松處理 4、8 h 各組細胞血管生成能力觀察（倒置相差顯微鏡×100）
從左至右依次為空白對照組、對照組和實驗組a. 4 h；b. 8 h
Figure6. Observation of angiogenic ability of cells in each group treated with hydrocortisone for 4 and 8 hours (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for blank control group, control group, and experimental group, respectively a. At 4 hours; b. At 8 hours
3 討論
通過靶向激活人體組織中的相應受體（NR3C1、GR），糖皮質激素在機體的抗炎和其他生理功能調節中發揮了重要作用[13]。一系列研究表明，大劑量糖皮質激素對血管內皮細胞和心血管會產生有害作用，導致暫時性高血壓、血脂異常、血栓形成甚至心肌梗死[14-15]。既往研究表明激素能夠引起骨細胞的凋亡和自噬，其效果與激素的劑量有關，即高濃度激素引起細胞凋亡，而低濃度激素則引起細胞自噬[16]。
自噬廣泛存在于哺乳動物的各種組織內，是一種對細胞增殖、分化以及狀態和活力的維持都至關重要的過程[8]，也在股骨頭壞死、骨質疏松等疾病的發病過程中起到重要作用[17-19]。自噬過程中，細胞質中會形成一種被稱為“自噬體”的杯狀結構，自噬體吞噬細胞質成分并與溶酶體融合，進而通過溶酶體水解酶降解吞噬的蛋白和細胞器[8]。血管內皮細胞損傷是激素性股骨頭壞死和骨質疏松發生過程中的重要環節，而在發病早期，細胞可以通過自噬降解有害物質和受損細胞器來避免細胞損傷。然而，一旦自噬超過了細胞正常的防御能力，就會發生凋亡[17-19]。我們在前期實驗中證明 0.1 mg/mL 濃度以下的激素并不會明顯引起細胞凋亡[20]，本實驗擬探究低濃度激素能否影響內皮細胞的自噬水平。由于股骨頭是糖皮質激素相關性骨壞死最常見的發生部位，因此本實驗中，我們分離了股骨頭的 BMECs 進行研究。
目前有多種方法來檢測細胞的自噬水平，例如 Western blot 法檢測 LC3B 的切割、p62 的降解、Beclin 的表達水平，檢測組織蛋白酶 Cathepsin 的活力以及透射電鏡下觀察自噬體形成等[5, 7, 21]。在自噬過程中，非激活型 LC3B -Ⅰ經過水解和脂質化后轉變為激活的自噬小體膜結合 LC3B-Ⅱ[21]，而 p62 在自噬清除多泛素化蛋白時會優先被降解[22]。本實驗中，隨著激素濃度的升高，股骨頭 BMECs 內 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量逐漸增高，而 p62 蛋白相對表達量則逐漸下降，表明細胞的自噬水平逐步增高，這是一種細胞的自我保護機制。前期有研究表明，用地塞米松處理內皮祖細胞能夠增加其自噬水平，但隨著暴露時間的延長，這一效果逐漸減低，同時細胞活性也逐漸減弱[12]。該研究表明自噬能夠對抗激素引起的細胞毒作用，但這一效果是有限的。
淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，以“強骨補腎”而聞名[23]。淫羊藿苷可以改善 BMSCs 成脂肪分化和成骨分化之間的平衡，促進成骨細胞的增殖和礦化，并降低破骨細胞的活性[24-26]。Hu 等[27]揭示淫羊藿苷可以通過調節 Caspase-3 和 Bcl2 來預防人臍靜脈內皮細胞因氧化低密度脂蛋白引起的損傷和凋亡。我們前期實驗表明，淫羊藿苷能夠阻止高濃度激素引起的股骨頭 BMECs 凋亡[28]。但淫羊藿苷對自噬將產生何種影響仍然存在爭議。Mi 等[29]研究表明淫羊藿苷能夠通過抑制 NF-κB，從而激活軟骨細胞自噬，抑制炎性反應和凋亡的發生。Jiang 等[30]則指出淫羊藿苷可以通過激活卵巢癌細胞 mTOR 信號通路，抑制自噬，促進凋亡，從而抑制腫瘤生成。既往的體外實驗中，使用的淫羊藿苷劑量多為 5×10-6～5×10-5 mol/L，且具有劑量依賴性和劑量飽和性[31-32]。我們前期研究表明[29]，淫羊藿苷可以顯著增強股骨頭 BMECs 的活力。本實驗結果表明 5×10-5 mol/L 濃度的淫羊藿苷能夠抑制低濃度激素引起的 BMECs 自噬過程，且淫羊藿苷處理不會顯著改變源自股骨頭 BMECs 的外泌體的直徑，但可以增加外泌體的數量。
外泌體是一種直徑 30～100 nm，攜帶各種 mRNA、miRNA 和蛋白質的膜封閉的細胞外囊泡。被其他細胞攝取后，這些外泌體可以實現不同細胞間的通訊，影響受體細胞的信號通路，改變其周圍的微環境[9-10]。此外，外泌體的供體細胞也可以重新攝取其分泌的外泌體[33]。受到外界刺激后，內皮細胞可釋放外泌體到血液或細胞外液中并發揮多種作用：一方面，它們可以促進內皮細胞的存活；另一方面，它可能導致心血管疾病的發生[10]。有研究指出脂肪干細胞來源的外泌體可以可促進臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移及管樣結構形成[34]。因此，外泌體在未來可能用于治療一系列相關疾病。
內皮細胞分泌的外泌體對各種細胞應激的反應明顯不同。Zhao 等[35]研究表明，缺氧和脂多糖均增加了肺動脈內皮細胞釋放的外泌體蛋白總量。de Jong 等[9]發現缺氧和 TNF-α 不會影響內皮細胞分泌的外泌體濃度和大小，但可能會改變外泌體攜帶的蛋白和 miRNA 組成。本研究中，我們應用外泌體分離提取試劑盒提取股骨頭 BMECs 分泌的外泌體。CD9 和 CD81 是兩種外泌體表面的標志蛋白[36]；同時，外泌體內參不同于常用的細胞內參（如 β-actin），外泌體中攜帶蛋白的相對表達量可用 CD9 含量進行歸一化處理[36]。納米粒子示蹤分析技術和 Western blot 結果表明，雖然淫羊藿苷并不會明顯改變股骨頭 BMECs 分泌的外泌體的大小和所攜帶的蛋白總量，但可以明顯增加外泌體的數量以及 VEGFA 和 TGF-β1 的含量，從而可能對受體細胞的生理功能起到調節作用。VEGF 是一個家族，包括 VEGFA、VEGFB、VEGFC 和 VEGFD 等，其中 VEGFA 是最常用的一種，可促進新生血管生成[37]。既往研究表明，VEGF 可以抑制慢性腦缺血誘導的過度自噬，從而對認知功能起到保護作用[38]；Domigan 等[39]則表明耗竭內皮細胞自分泌的 VEGF 會導致線粒體斷裂、葡萄糖代謝抑制、自噬增強，并最終導致細胞死亡。而 TGF-β1 一般被認為與細胞自噬形成正反饋回路[40-41]。
為了進一步闡明內皮細胞來源的外泌體在自噬發生中的作用，我們分離股骨頭 BMECs 分泌的外泌體，與 BMECs 共培養，并使用低濃度激素進行干預。結果顯示，與空白對照組和對照組相比，實驗組的細胞自噬水平明顯降低；進一步研究表明外泌體干預還能夠促進內皮細胞的遷移和血管生成過程。這些結果均表明外泌體能夠對其起到一定的保護作用。然而，關于淫羊藿苷和外泌體是通過何種通路抑制自噬的發生，外泌體又能否被骨微血管內皮攝取，尚需要進一步研究。
綜上述，5×10-5 mol/L 淫羊藿苷能顯著抑制低濃度激素誘導的股骨頭 BMECs 自噬，從而對內皮細胞起到保護作用。淫羊藿苷干預雖然不能改變內皮細胞分泌的外泌體直徑，但能增加外泌體中 VEGFA 和 TGF-β1 等蛋白的表達水平。由淫羊藿苷處理的股骨頭 BMECs 產生的外泌體可以通過自分泌途徑改善低濃度糖皮質激素誘導的內皮細胞自噬，促進內皮細胞遷移和血管生成。
骨微血管內皮細胞（bone microvascular endothelial cells，BMECs）構成附著在骨小梁上的單層結構，與血液中的成分直接接觸，為骨組織和細胞提供氧氣和營養，還具有內分泌功能，這對維持骨內正常微環境具有重要意義[1-2]。而糖皮質激素是一類臨床常用的抗炎藥和免疫抑制劑，也是引起非創傷性股骨頭壞死和繼發性骨質疏松癥最重要的危險因素[3-4]。我們前期實驗表明，淫羊藿苷對高濃度激素導致的股骨頭 BMECs 損傷有明顯保護作用，而 0.1 mg/mL 濃度以下的激素并不會引起明顯的內皮細胞凋亡[5-7]。自噬是目前生命科學研究的熱點，指細胞通過降解內部損傷的蛋白質和細胞器等來維持穩態，實現細胞的代謝和更新，然而自噬達到一定水平，又會啟動凋亡造成損傷[8]。目前淫羊藿苷對 BMECs 自噬的影響尚未見報道。外泌體則是一種直徑 30～100 nm，在細胞間通訊中起重要作用的細胞外囊泡[9-10]。這些作用是通過以自分泌或旁分泌的形式在不同細胞間轉運 mRNA、微小 RNA（micro RNA，miRNA）、蛋白質及其他活性物質實現的[9-10]。Jiang 等[11]報道缺氧能夠刺激臍靜脈內皮細胞產生外泌體，而后者又能夠抑制缺氧造成的神經細胞凋亡，激活自噬過程。本實驗中，我們擬觀察淫羊藿苷對低濃度激素誘導的股骨頭 BMECs 自噬以及外泌體產生的影響，以及后兩者之間的相互作用，進一步探索激素相關骨病的發生機制及治療方法。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
股骨頭由因股骨頸骨折、原發性髖關節骨關節炎或先天性髖關節發育不良繼發骨關節炎，而于中日友好醫院接受全髖關節置換術的患者自愿捐獻。
DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；MACS 運行緩沖液及 CD31 磁珠（Miltenyi 公司，德國）；內皮細胞培養基（ScienCell 公司，美國）；氫化可的松（輝瑞公司，美國）；FBS（HyClone 公司，美國）；Matrigel 膠、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、淫羊藿苷（Sigma 公司，美國）；CD31、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、微管相關蛋白輕鏈 3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、死骨片 1（SQSTM1/p62）、β-肌動蛋白（β-actin）一抗及對應二抗（Abcam 公司，美國）；CD9、CD81、VEGFA、TGF-β1 一抗及對應二抗（Santa Cruz 公司，美國）；5×蛋白上樣緩沖液、RIPA 裂解液、ECL 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；聚偏二氟乙烯膜（Millipore 公司，美國）；外泌體分離試劑盒（和光純藥工業株式會社，日本）。CO2 孵箱（Thermo 公司，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡及照相系統（Nikon 公司，日本）；透射電鏡（Joel 公司，日本）；Nanosight NS300 納米粒子跟蹤分析系統（Malvern 公司，英國）；低溫高速離心機（Beckman 公司，美國）。
1.2 股骨頭 BMECs 分離培養及相關觀測
1.2.1 股骨頭 BMECs 分離培養
無菌條件下將股骨頭剖開，去掉筋膜、凝血塊和其他雜質，將正常松質骨切成細小骨粒，放入 15 mL 離心管，用 DMEM 培養基洗滌 3 次。加入 5 mL 0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃ 水浴消化 25 min；再加入 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 5 min；最后加入 2 mL 含 10%FBS的 DMEM 培養基終止消化。將上清液通過 100 目細胞篩過濾，并以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 6 min。將含有微血管段和細胞的沉淀物用 80 μL MACS 磁珠緩沖液和 20 μL CD31 磁珠重懸。4℃ 下溫育 15 min，將細胞懸浮液與 400 μL MACS 運行緩沖液混合，通過固定在磁場中的 MACS 分選柱，500 μL 運行緩沖液沖洗 3 次。隨后移去 MACS 分選柱，用 1 mL PBS 緩沖液將 C31 磁珠結合的細胞沖洗到 Eppendorf 管中，再次以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 6 min。將離心細胞重懸于 5 mL 內皮細胞培養基并接種到培養瓶中，于 37℃、5%CO2、95% 濕度細胞培養箱中培養。24 h 后 PBS 洗滌，除去未附著的細胞。當細胞擴增至培養瓶底部 80% 以上時，進行細胞傳代，取第 3 代細胞用于后續實驗。
1.2.2 BMECs 形態觀察
細胞貼壁后，每日于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。待細胞長滿培養瓶底面積 80% 時，0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化 3 min，吹打后收集細胞懸液，以離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 6 min，4℃、3% 戊二醛固定，1% 鋨酸固定，梯度乙醇-丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾染色 30 min，醋酸鉛染色 15 min，透射電鏡下觀察。
1.2.3 免疫熒光染色檢測細胞純度
將分離培養 7 d 的細胞接種至防脫片載玻片上，生長 12 h 后用 PBS 洗滌 3 次，4% 多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100 穿透；用 10%FBS 封閉后，將細胞與 CD31（1∶300）和 vWF（1∶300）一抗孵育過夜；然后 PBS 洗滌，并將細胞與標記有 FITC 或 Alexa 488 的二抗以及 DAPI 在室溫下孵育 1 h。封片，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態，并隨機選取 10 個視野，統計免疫熒光染色陽性細胞數量占同一視野下所有細胞數量的比例，計算細胞純度。
1.3 糖皮質激素和淫羊藿苷對 BMECs 自噬相關蛋白的影響
將 BMECs 以 5.0×105個/孔密度接種至 6 孔板，分為 8 組，每組設 3 個平行孔。A、B、C、D 組每孔分別加入含 0、0.03、0.06、0.10 mg/mL 氫化可的松的 DMEM 培養基；A1、B1、C1、D1 組分別加入含 0、0.03、0.06、0.10 mg/mL 氫化可的松的 DMEM 培養基后，再每孔給予 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷干預。培養 24 h 后 4℃ PBS 洗滌，收集細胞，加入蛋白裂解液，于冰上裂解 30 min，然后以離心半徑 55 cm、12 000 r/min 離心 5 min，分離蛋白質，采用 Western blot 法檢測各組 LC3B 和 p62 蛋白表達水平。具體操作：將蛋白樣品與 5×蛋白凝膠電泳上樣緩沖液混合，95℃ 變性 10 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳使染料至分離膠適當位置，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5% 脫脂牛奶封閉 1 h；與特異性一抗 LC3B（1∶2 000）、p62（1∶2 000）和 β-actin（1∶3 000）孵育過夜后，與辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶5 000）孵育 50 min；使用 ECL 試劑盒處理印跡，暗室中曝光、顯影并定影；條帶灰度值采用 Quantity One v.4.6.2 軟件分析。以 β-actin 蛋白作為內參，蛋白相對表達量以目標蛋白與 β-actin 蛋白灰度值的比值表示。其中 LC3B 包括 LC3B -Ⅰ和 LC3B-Ⅱ，自噬過程中，非激活型 LC3B-Ⅰ經過水解和脂質化后會轉變為激活的自噬小體膜結合 LC3B-Ⅱ[12]，因此以 LC3B-Ⅱ的蛋白相對表達量來表示 LC3B 的蛋白相對表達量。
1.4 外泌體分離及相關觀測
1.4.1 外泌體分離及其直徑、濃度檢測
將 BMECs 以 5.0×105個/mL 密度接種至 25 cm2培養瓶（5 mL 培養基），分別在含和不含 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷的無外泌體培養基（內皮細胞培養基中的 FBS 預先經 0.22 μm 濾膜過濾，以 100 000×g 離心 18 h，從而去除其中的外泌體）中培養 24 h（分別設為干預組和未干預組），收集上清液，應用外泌體分離試劑盒提取外泌體；將外泌體重懸于 PBS 中，通過納米顆粒跟蹤分析技術分析其直徑分布和濃度。
1.4.2 BCA 法檢測外泌體總蛋白質含量
將 BSA 作為標準品，按一系列濃度（25、125、250、500、750、1 000、1 500、2 000 μg/ mL）稀釋，依次加入 10 μL 96 孔板中；取兩組外泌體，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸，4℃ 下以離心半徑 55 cm、12 000 r/min 離心 5 min，分離蛋白，將 10 μL 蛋白質樣品加入 96 孔板。每孔加入 200 μL BCA 工作溶液，并在黑暗環境中于 37℃ 孵育 30 min。于 750 nm 波長下測量吸光度（A）值，按照 BSA 濃度繪制標準曲線，并根據標準曲線讀取外泌體總蛋白質濃度。
1.4.3 Western blot 檢測外泌體攜帶蛋白表達
取兩組外泌體，按照 1.4.2 方法分離蛋白，按 1.3 方法檢測 CD9、CD81、TGF-β1 和 VEGFA 蛋白相對表達量。
1.5 外泌體對 BMECs 自噬及功能的影響
1.5.1 Western blot 檢測自噬相關蛋白表達
將 BMECs 以 5.0×105個/孔密度接種至 6 孔板，分為 3 組：實驗組分離經 5×10-5 mol/L 淫羊藿苷處理的 BMECs 分泌的外泌體（濃度為 200 ng/μL），與 BMECs 共培養；對照組分離未經淫羊藿苷處理的 BMECs 分泌的外泌體（濃度為 200 ng/μL），與 BMECs 共培養；空白對照組為單純 BMECs。培養 24 h 后，3 組均加入 0.06 mg/mL 氫化可的松處理 24 h 后，按 1.3 方法檢測細胞中 LC3BⅡ和 p62 蛋白相對表達量。每組設 3 個平行孔。
1.5.2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力
用記號筆在 6 孔板背后均勻劃橫線，橫穿過孔；取處于對數生長期、生長狀態良好的第 3 代 BMCEs，以 1×106個/孔密度接種至上述 6 孔板，37℃、5%CO2 培養箱中培養過夜；待細胞鋪滿 6 孔板底部，用 10 μL 槍頭垂至于背后的橫線劃痕。PBS 洗細胞 3 次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基，實驗組加入經 5×10?5 mol/L 淫羊藿苷處理的 BMECs 分泌的外泌體（濃度為 200 ng/μL），對照組加入未經淫羊藿苷處理的 BMECs 分泌的外泌體（濃度為 200 ng/μL），空白對照組不加入外泌體；培養 24 h 后以 0.06 mg/ mL 氫化可的松處理，分別于氫化可的松處理 0、12、 24 h 時進行拍照，按以下公式計算劃痕閉合率：（a—b）/a×100%，其中 a 為整張照片寬度，b 為無細胞的空白部位寬度。
1.5.3 血管生成能力檢測
向預冷的 24 孔板中按照 150 μL/孔濃度加入 Matrigel 膠，置于 37℃、5%CO2 培養箱中放置 30 min 使其凝固成膠，備用。取 BMECs 按 1.5.1 分組方法分別培養 24 h 后，胰蛋白酶消化，用無血清 DMEM 重懸細胞，以 2.5×105個/孔密度接種于涂有 Matrigel 膠的 24 孔板中；加入 0.06 mg/mL 氫化可的松，于 37℃、5%CO2、95% 濕度細胞培養箱內培養 4、8 h 后倒置相差顯微鏡 100 倍鏡下拍照，隨機取 3 個視野，計數管腔數、出芽數和小管分支長度。
1.6 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMECs 形態觀察和純度檢測
培養 2～3 d 可觀察到貼壁細胞均勻分布于培養瓶中；分離細胞培養 7 d 倒置相差顯微鏡觀察示，細胞生長趨于融合，呈紡錘形或多邊形，鏡下呈“鋪路石”樣（圖 1a）。透射電鏡觀察示，分離細胞培養 14 d 時呈多邊形，表面被細胞質凸起形成的微絨毛覆蓋，細胞核較大，具有明顯核仁；細胞質富含線粒體、粗面內質網、高爾基復合體和其他細胞器（圖 1b）。免疫熒光染色示 vWF 和 CD31 陽性率接近 100%（圖 1c、d）。
圖1
BMECs 形態觀察和純度檢測
a. 培養 7 d 倒置相差顯微鏡觀察（×40）；b. 培養 14 d 透射電鏡觀察（×12 k）；c. 免疫熒光染色觀察示 CD31 高表達（熒光顯微鏡×100）；d. 免疫熒光染色示 vWF 高表達（熒光顯微鏡×100）
Figure1. Morphology observation and purity identification of BMECsa. Inverted phase contrast microscope observation after 7 days of culture (×40); b. Transmission electron microscope observation after 14 days of culture (×12 k); c. Immunofluorescence staining showed high expression of CD31 (Fluorescence microscope×100); d. Immunofluorescence staining showed high expression of vWF (Fluorescence microscope×100)
2.2 糖皮質激素和淫羊藿苷對 BMECs 自噬相關蛋白的影響
隨著氫化可的松濃度升高，各組 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量逐漸增加，p62 蛋白相對表達量逐漸減少，A、B、C、D 組間及 A1、B1、C1、D1 組間差異均有統計學意義（P<0.01）。與相同濃度激素組相比，給予淫羊藿苷干預后，LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量減少，p62 蛋白表達量增加，差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測糖皮質激素和淫羊藿苷對 BMECs 自噬相關蛋白的影響
a. 電泳圖 1：A 組 2：B 組 3：C 組 4：D 組 5：A1 組 6：B1 組 7：C1 組 8：D1 組；b. 各組 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量比較；c. 各組 p62 蛋白相對表達量比較
Figure2. Effect of glucocorticoid and icariin on autophagy-related proteins in BMECs detected by Western blot analysisa. Electrophoretogram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group A1 6: Group B1 7: Group C1 8: Group D1; b. Comparison of protein expression of LC3B-Ⅱ in each group; c. Comparison of protein expression of p62 in each group
2.3 外泌體相關觀測
2.3.1 外泌體直徑和濃度檢測
未干預組和干預組外泌體直徑分別為（86.68±1.97）、（85.35±1.65）nm，差異無統計學意義（t=0.896，P=0.421）；濃度分別為（9.85±0.47）×106個/mL 和（1.54±0.08）×107個/mL，干預組顯著高于未干預組，差異有統計學意義（t=?10.191，P=0.001）。
2.3.2 外泌體總蛋白質含量檢測
未干預組和干預組外泌體總蛋白質含量分別為（132.63±3.33）μg/mL 和（138.56±9.58）μg/mL，比較差異無統計學意義（t=?1.102，P=0.369）。
2.3.3 Western blot 法檢測外泌體攜帶蛋白表達
未干預組和干預組細胞中提取的外泌體中 CD9 和 CD81 均高度表達，干預組的 VEGFA/CD9 和 TGF-β1/CD9 蛋白相對表達量比值均顯著高于未干預組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖 3。
圖3
Western blot 法檢測外泌體攜帶蛋白表達
a. 電泳圖 1：未干預組 2：干預組；b. 兩組 VEGFA/CD9 蛋白相對表達量比較；c. 兩組 TGF-β1/CD9 蛋白相對表達量比較
Figure3. Expression of exosome-carried proteins detected by Western blot analysisa. Electropherogram 1: Non-intervention group 2: Intervention group; b. Comparison of protein expression ratio of VEGFA/CD9 in two groups; c. Comparison of protein expression ratio of TGF-β1/CD9 in two groups
2.4 外泌體對 BMECs 自噬及功能的影響
2.4.1 Western blot 檢測自噬相關蛋白表達
在空白對照組、對照組和實驗組中，p62 蛋白相對表達量呈遞增趨勢，LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量呈遞減趨勢，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測外泌體對 BMECs 自噬相關蛋白表達的影響
a. 電泳圖 1：空白對照組 2：對照組 3：實驗組；b. 各組 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量比較；c. 各組 p62 蛋白相對表達量比較
Figure4. Effect of exosomes on the expression level of autophagy-related protein of BMECs detected by Western blot analysisa. Electropherogram 1: Blank control group 2: Control group 3: Experimental group; b. Comparison of protein expression of LC3B-Ⅱ in each group; c. Comparison of protein expression of p62 in each group
2.4.2 劃痕實驗檢測細胞遷移能力
氫化可的松處理 0 h 時，鏡下各組均顯示清晰劃痕，各組劃痕閉合率比較差異無統計學意義（P>0.05）；12、24 h 時，對照組和實驗組細胞遷移能力明顯高于空白對照組，實驗組明顯高于對照組，各組劃痕閉合率比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、表 1。
圖5
劃痕實驗檢測外泌體對內皮細胞遷移的影響（倒置相差顯微鏡×100）
從左至右依次為氫化可的松處理 0、12、24 h 時 a. 空白對照組；b. 對照組；c. 實驗組
Figure5. Scratch test to detect the effect of exosomes on endothelial cell migration (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for hydrocortisone treatment lasted 0, 12, and 24 hours, respectively a. Blank control group; b. Control group; c. Experimental group
表1
氫化可的松處理后各時間點各組細胞劃痕閉合率比較（n=3，%，）
Table1.
Comparison of scratch closure rates of BMECs in each group at each time point after hydrocortisone treatment (n=3, %, )
2.4.3 血管生成能力檢測
倒置相差顯微鏡觀察可見各組在氫化可的松處理 4 h 后即有內皮細胞形成管狀結構，見圖 6。氫化可的松處理 4、8 h 時，實驗組和對照組管腔數、出芽數和小管分支長度均顯著大于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；實驗組小管分支長度和管腔數顯著大于對照組（P<0.05），但出芽數與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
氫化可的松處理后各時間點各組細胞血管生成能力比較（n=3，）
Table2.
Comparison of angiogenic ability of BMECs in each group at each time point after hydrocortisone treatment (n=3, )
圖6
氫化可的松處理 4、8 h 各組細胞血管生成能力觀察（倒置相差顯微鏡×100）
從左至右依次為空白對照組、對照組和實驗組a. 4 h；b. 8 h
Figure6. Observation of angiogenic ability of cells in each group treated with hydrocortisone for 4 and 8 hours (Inverted phase contrast microscope×100)From left to right for blank control group, control group, and experimental group, respectively a. At 4 hours; b. At 8 hours
3 討論
通過靶向激活人體組織中的相應受體（NR3C1、GR），糖皮質激素在機體的抗炎和其他生理功能調節中發揮了重要作用[13]。一系列研究表明，大劑量糖皮質激素對血管內皮細胞和心血管會產生有害作用，導致暫時性高血壓、血脂異常、血栓形成甚至心肌梗死[14-15]。既往研究表明激素能夠引起骨細胞的凋亡和自噬，其效果與激素的劑量有關，即高濃度激素引起細胞凋亡，而低濃度激素則引起細胞自噬[16]。
自噬廣泛存在于哺乳動物的各種組織內，是一種對細胞增殖、分化以及狀態和活力的維持都至關重要的過程[8]，也在股骨頭壞死、骨質疏松等疾病的發病過程中起到重要作用[17-19]。自噬過程中，細胞質中會形成一種被稱為“自噬體”的杯狀結構，自噬體吞噬細胞質成分并與溶酶體融合，進而通過溶酶體水解酶降解吞噬的蛋白和細胞器[8]。血管內皮細胞損傷是激素性股骨頭壞死和骨質疏松發生過程中的重要環節，而在發病早期，細胞可以通過自噬降解有害物質和受損細胞器來避免細胞損傷。然而，一旦自噬超過了細胞正常的防御能力，就會發生凋亡[17-19]。我們在前期實驗中證明 0.1 mg/mL 濃度以下的激素并不會明顯引起細胞凋亡[20]，本實驗擬探究低濃度激素能否影響內皮細胞的自噬水平。由于股骨頭是糖皮質激素相關性骨壞死最常見的發生部位，因此本實驗中，我們分離了股骨頭的 BMECs 進行研究。
目前有多種方法來檢測細胞的自噬水平，例如 Western blot 法檢測 LC3B 的切割、p62 的降解、Beclin 的表達水平，檢測組織蛋白酶 Cathepsin 的活力以及透射電鏡下觀察自噬體形成等[5, 7, 21]。在自噬過程中，非激活型 LC3B -Ⅰ經過水解和脂質化后轉變為激活的自噬小體膜結合 LC3B-Ⅱ[21]，而 p62 在自噬清除多泛素化蛋白時會優先被降解[22]。本實驗中，隨著激素濃度的升高，股骨頭 BMECs 內 LC3B-Ⅱ蛋白相對表達量逐漸增高，而 p62 蛋白相對表達量則逐漸下降，表明細胞的自噬水平逐步增高，這是一種細胞的自我保護機制。前期有研究表明，用地塞米松處理內皮祖細胞能夠增加其自噬水平，但隨著暴露時間的延長，這一效果逐漸減低，同時細胞活性也逐漸減弱[12]。該研究表明自噬能夠對抗激素引起的細胞毒作用，但這一效果是有限的。
淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，以“強骨補腎”而聞名[23]。淫羊藿苷可以改善 BMSCs 成脂肪分化和成骨分化之間的平衡，促進成骨細胞的增殖和礦化，并降低破骨細胞的活性[24-26]。Hu 等[27]揭示淫羊藿苷可以通過調節 Caspase-3 和 Bcl2 來預防人臍靜脈內皮細胞因氧化低密度脂蛋白引起的損傷和凋亡。我們前期實驗表明，淫羊藿苷能夠阻止高濃度激素引起的股骨頭 BMECs 凋亡[28]。但淫羊藿苷對自噬將產生何種影響仍然存在爭議。Mi 等[29]研究表明淫羊藿苷能夠通過抑制 NF-κB，從而激活軟骨細胞自噬，抑制炎性反應和凋亡的發生。Jiang 等[30]則指出淫羊藿苷可以通過激活卵巢癌細胞 mTOR 信號通路，抑制自噬，促進凋亡，從而抑制腫瘤生成。既往的體外實驗中，使用的淫羊藿苷劑量多為 5×10-6～5×10-5 mol/L，且具有劑量依賴性和劑量飽和性[31-32]。我們前期研究表明[29]，淫羊藿苷可以顯著增強股骨頭 BMECs 的活力。本實驗結果表明 5×10-5 mol/L 濃度的淫羊藿苷能夠抑制低濃度激素引起的 BMECs 自噬過程，且淫羊藿苷處理不會顯著改變源自股骨頭 BMECs 的外泌體的直徑，但可以增加外泌體的數量。
外泌體是一種直徑 30～100 nm，攜帶各種 mRNA、miRNA 和蛋白質的膜封閉的細胞外囊泡。被其他細胞攝取后，這些外泌體可以實現不同細胞間的通訊，影響受體細胞的信號通路，改變其周圍的微環境[9-10]。此外，外泌體的供體細胞也可以重新攝取其分泌的外泌體[33]。受到外界刺激后，內皮細胞可釋放外泌體到血液或細胞外液中并發揮多種作用：一方面，它們可以促進內皮細胞的存活；另一方面，它可能導致心血管疾病的發生[10]。有研究指出脂肪干細胞來源的外泌體可以可促進臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移及管樣結構形成[34]。因此，外泌體在未來可能用于治療一系列相關疾病。
內皮細胞分泌的外泌體對各種細胞應激的反應明顯不同。Zhao 等[35]研究表明，缺氧和脂多糖均增加了肺動脈內皮細胞釋放的外泌體蛋白總量。de Jong 等[9]發現缺氧和 TNF-α 不會影響內皮細胞分泌的外泌體濃度和大小，但可能會改變外泌體攜帶的蛋白和 miRNA 組成。本研究中，我們應用外泌體分離提取試劑盒提取股骨頭 BMECs 分泌的外泌體。CD9 和 CD81 是兩種外泌體表面的標志蛋白[36]；同時，外泌體內參不同于常用的細胞內參（如 β-actin），外泌體中攜帶蛋白的相對表達量可用 CD9 含量進行歸一化處理[36]。納米粒子示蹤分析技術和 Western blot 結果表明，雖然淫羊藿苷并不會明顯改變股骨頭 BMECs 分泌的外泌體的大小和所攜帶的蛋白總量，但可以明顯增加外泌體的數量以及 VEGFA 和 TGF-β1 的含量，從而可能對受體細胞的生理功能起到調節作用。VEGF 是一個家族，包括 VEGFA、VEGFB、VEGFC 和 VEGFD 等，其中 VEGFA 是最常用的一種，可促進新生血管生成[37]。既往研究表明，VEGF 可以抑制慢性腦缺血誘導的過度自噬，從而對認知功能起到保護作用[38]；Domigan 等[39]則表明耗竭內皮細胞自分泌的 VEGF 會導致線粒體斷裂、葡萄糖代謝抑制、自噬增強，并最終導致細胞死亡。而 TGF-β1 一般被認為與細胞自噬形成正反饋回路[40-41]。
為了進一步闡明內皮細胞來源的外泌體在自噬發生中的作用，我們分離股骨頭 BMECs 分泌的外泌體，與 BMECs 共培養，并使用低濃度激素進行干預。結果顯示，與空白對照組和對照組相比，實驗組的細胞自噬水平明顯降低；進一步研究表明外泌體干預還能夠促進內皮細胞的遷移和血管生成過程。這些結果均表明外泌體能夠對其起到一定的保護作用。然而，關于淫羊藿苷和外泌體是通過何種通路抑制自噬的發生，外泌體又能否被骨微血管內皮攝取，尚需要進一步研究。
綜上述，5×10-5 mol/L 淫羊藿苷能顯著抑制低濃度激素誘導的股骨頭 BMECs 自噬，從而對內皮細胞起到保護作用。淫羊藿苷干預雖然不能改變內皮細胞分泌的外泌體直徑，但能增加外泌體中 VEGFA 和 TGF-β1 等蛋白的表達水平。由淫羊藿苷處理的股骨頭 BMECs 產生的外泌體可以通過自分泌途徑改善低濃度糖皮質激素誘導的內皮細胞自噬，促進內皮細胞遷移和血管生成。
