引用本文： 王福科, 張紅, 李彥林, 劉流, 何川, 蔡國鋒, 宋恩. 聯合培養血管內皮細胞與脂肪干細胞構建組織工程骨異位成骨. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(10): 1310-1319. doi: 10.7507/1002-1892.201808111 復制
組織工程骨的成骨活性除了依靠支架材料的骨誘導作用、骨傳導作用，和種子細胞的成骨誘導作用、分泌作用外，還有各種生長因子的成骨和成血管作用，它們可以刺激成骨細胞的作用，調節局部成骨，如 BMP、bFGF、TGF-β、PDGF、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ等。當形成骨缺損時，損傷刺激周圍組織和血液細胞分泌各種成骨因子，促進周圍成骨細胞和骨髓、血液的 MSCs 增生，以達到成骨作用。但使用組織工程骨原位修復骨缺損時，會受到這些干細胞和組織生長因子的影響，不能完全體現植入的組織工程骨真正的成骨能力。異位成骨時，因為去除了局部的成骨因素，可以完全體現組織工程骨的成骨能力，所以異位成骨的能力可作為驗證組織工程骨成骨能力的主要指標[1]。詹健峰等[2]也通過把組織工程骨植入 SD 大鼠豎脊肌肌袋，來驗證載 BMP-2 多肽 P24 的巰基化殼聚糖水凝膠的異位成骨能力。
本研究組前期研究表明，聯合培養血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）能促進脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）增殖[3]，而且能促進 ADSCs 成骨分化[4]。骨組織工程支架材料中部分脫蛋白骨（partially deproteinised bone，PDPB）具有正常骨的三維立體結構，孔隙率、鈣磷比和正常骨相似，組織相容性好、無致瘤性，是一種較為理想的骨移植材料[5-6]。本實驗擬將聯合培養的 ADSCs 和 VECs 與部分脫蛋白生物骨（partially deproteinised biologic bone，PDPBB）體外構建組織工程骨異位肌袋移植，排除原位骨床干擾，旨在確定將聯合培養細胞作為種子細胞的生物工程骨成骨作用的有效性和異位建造骨組織的可能性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
18 周齡 SD 大鼠 50 只，雌雄不限，體質量（200±10）g；足月妊娠 SD 大鼠 2 只，體質量約 400 g；均由昆明醫學院動物科提供。
低糖 DMEM 培養基、新生牛血清（GIBCO 公司，美國）；胰蛋白酶、EDTA、DAPI（Sigma 公司，美國）；FBS（JRS 公司，美國；HyClone 公司，美國）；纖維粘連蛋白（fibronectin，FN；R&D 公司，美國）；BrdU（Upstate 公司，美國）；BrdU 小鼠單克隆抗體（Thermo Scientific 公司，美國）；FITC 標記的山羊抗小鼠 IgG（KPL 公司，美國）。超凈工作臺、恒溫 CO2 培養箱（Thermo Scientific 公司，美國）；低溫自動平衡離心機（北京醫用離心機廠）；倒置相差顯微鏡、PM-20 型熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；酶標板自動讀數儀（Bio-Rad 公司，美國）；SP2500 型硬組織切片機（Leica 公司，德國）；XL 型流式細胞儀（Beckman Coulter 公司，美國）。
1.2 體外組織工程骨構建及相關觀測
1.2.1 PDPBB 的制備
取新鮮市售豬腰椎骨制成橫截面積為 0.5 cm2 的骨條，蒸餾水反復沖洗干凈，按文獻［7］方法處理制得 PDPB；用蒸餾水充分浸洗 PDPB，并將浸泡液 pH 值調至 7.0～7.2，于干燥箱風干；將制得的 PDPB 分別磨制成大小為 0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm 的骨塊和 0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 的骨片，于 150 μg/mL FN 浸泡 12 h，制成 PDPBB[8]，生理鹽水超聲漂洗，干燥箱風干，60Co 放射滅菌備用。
1.2.2 VECs 誘導分化培養及鑒定
取足月妊娠 SD 大鼠 2 只，3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后，于 75% 乙醇中浸泡 10 min，按文獻［9］方法分離臍血單個核細胞。加入 5 mL VECs 誘導培養液（含 10%FBS、1% 青霉素、1% 鏈霉素、20 μg/L VEGF、2 μg/L IGF-1、2 μg/L bFGF、20 μg/L EGF 的 L-DMEM 培養基），誘導培養 6 周[10]，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
鑒定：將誘導培養 6 周的 VECs 接種于 24 孔板上，分別行 CD34、CD133、血管內皮生長因子受體 1（fetal liver kinase 1，Flk-1）免疫熒光染色（每個指標各檢測 3 孔），另分別取 1 孔為陰性對照。具體方法：貼壁細胞 PBS 沖洗 2 遍，4% 多聚甲醛固定 30 min，干燥 10 min，3% 牛血清白蛋白孵育標本 20 min；分別加入相應一抗室溫孵育 60 min（陰性對照不加一抗），PBS 洗 3 次，每次 5 min；分別滴加適量山羊抗兔或抗小鼠 Cy3 熒光素標記二抗，置 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中孵育 30 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；DAPI 浸染 1 min，50% 緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.2.3 ADSCs 分離培養及鑒定
取 18 周齡 SD 大鼠 2 只，3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后脫頸處死，按照文獻［8］方法分離大鼠 ADSCs，以含 10% 新生牛血清的 DMEM 培養基[11]，于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養細胞，并傳至第 3 代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
鑒定：取第 3 代 ADSCs 按 5×104 個/mL 密度接種至 6 孔板，加入成骨誘導培養基（含 1×10?8 mol/L 地塞米松、10 mol/L β-甘油磷酸、50 mg/L 維生素 C 的低糖 DMEM 培養基），14 d 時各取 1 孔進行下列染色：① 茜素紅染色：細胞染色前用 PBS 沖洗 2 次，濾紙吸去多余水分，95% 乙醇固定 30 min，2% 茜素紅染色 5 min，流水沖洗，倒置相差顯微鏡下觀察；②ALP 染色：細胞染色前用 PBS 沖洗 2 次，濾紙吸去多余水分，4% 多聚甲醛固定 30 min，NBT/BCIP 避光染色 1 h，流水沖洗，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.2.4 體外構建組織工程骨
取 0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm 的 PDPBB 材料 144 塊，L-DMEM 預濕，隨機分為 4 組，A 組為 PDPBB+VECs，B 組為 PDPBB+ADSCs，C 組為 PDPBB+聯合培養細胞（VECs∶ADSCs 為 1∶1）[3-4]，D 組為單純 PDPBB，每組 36 塊，置入 2 塊 6 孔板中，每組 2 孔。取第 4 代 ADSCs 和誘導 6 周后的 VECs，以 5.0×106 個/mL 濃度[12]按上述分組接種于預濕后的 PDPBB，100 μL/孔，置 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 4 h 后，加入 4 mL 含 15% 新生牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、0.01 mol/L HEPES 緩沖液的 L-DMEM 培養基，隔日換液。
1.2.5 掃描電鏡觀察
細胞移植后 10 d[13]每組各取 2 塊材料，3.5% 戊二醛固定 6 h，二蒸水清洗 3 次、每次 15 min；4% 單寧酸+3.5% 戊二醛導電染色 48 h，二蒸水清洗 3 次、每次 30 min；1% 鋨酸固定 4 h，二蒸水清洗 4 次、每次 20 min；30%～100% 乙醇梯度脫水，叔丁醇置換，冰凍干燥，噴鍍鉑鈀合金，掃描電鏡觀察細胞在支架材料上附著情況。同時采用掃描電鏡觀察單純 PDPB 形貌。
1.3 組織工程骨移植及異位成骨檢測
1.3.1 實驗分組及方法
取 18 周齡 SD 大鼠 48 只，隨機分為 A、B、C、D 4 組，每組 12 只。3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）肌肉注射麻醉后脫毛，0.5% 聚維酮碘溶液消毒手術區域，分層切開雙側股部皮膚、皮下，鈍性分離肌肉，造成肌袋。分別將 1.2.4 中制備的 3 種組織工程骨或單純 PDPBB 置于 A、B、C、D 組 SD 大鼠兩側股部肌袋處。術畢肌肉注射青霉素 0.5 萬U預防切口感染。術后各組動物于相同條件下分籠飼養。
1.3.2 一般觀察
術后觀察各組動物的活動、進食、傷口愈合情況。
1.3.3 異位成骨標本大體觀察
術后 2、4、8、12 周每組分別脫頸處死 3 只大鼠，大體觀察植入材料的外觀形態變化。
1.3.4 組織學觀測
術后各時間點取各組植入材料，10% 甲醛固定，樹脂包埋，硬組織切片機連續切片，片厚 5 μm，常規行 HE、Masson 染色，倒置相差顯微鏡下觀察。每組于 Masson 染色放大 100 倍鏡下選取 6 張切片，使用 Adobe Photoshop 7.0 軟件的魔棒工具和直方圖（histogram）功能，進行膠原組織形態計量分析，以像素值代表骨面積計算骨膠原量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS11.5 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 組織工程骨相關觀測
2.1.1 VECs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，臍血單個核細胞原代培養 7 d，貼壁單個核細胞形態單一，呈梭形集落樣生長，無重疊現象；誘導后 6 周細胞形態呈多樣化，有梭形和多角形混合生長。免疫熒光染色示，誘導后 6 周細胞 CD34、CD133、Flk-1 染色均為陽性，細胞核被 DAPI 染為藍色，細胞質內存在大量紅色顆粒；陰性對照未發現陽性細胞。見圖 1。
圖1
VECs 形態學觀察及誘導后 6 周免疫熒光染色鑒定
a. 臍血單個核細胞原代培養 7 d 形態（倒置相差顯微鏡×40）；b. 臍血單個核細胞誘導后 6 周形態（倒置相差顯微鏡×100）；c. CD34 染色（熒光顯微鏡×630）；d. Flk-1 染色（熒光顯微鏡×630）；e. CD133 染色（熒光顯微鏡×630）；f. 陰性對照（熒光顯微鏡×630）
Figure1. Morphological observation of VECs and identification by immunofluorescence staining at 6 weeks after inductiona. Primary culture of cord blood mononuclear cells for 7 days (Inverted phase contrast microscope×40); b. At 6 weeks after induction of cord blood mononuclear cells (Inverted phase contrast microscope×100); c. CD34 staining (Fluorescence microscope×630); d. Flk-1 staining (Fluorescence microscope×630); e. CD133 staining (Fluorescence microscope×630); f. Negative control (Fluorescence microscope×630)
2.1.2 ADSCs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，第 3 代 ADSCs 貼壁單個核細胞形態單一，呈梭形生長，無重疊現象。成骨誘導 14 d 時，ALP 染色示細胞多數呈陽性，細胞失去漩渦狀生長方式，融合成團，ALP 陽性的藍黑色顆粒狀影像相互融合成網狀；茜素紅染色示細胞均可見大量紅色鈣結節影，部分互相融合，形成片狀鈣化影。見圖 2。
圖2
ADSCs 形態學觀察及成骨誘導鑒定
a. 第 3 代 ADSCs 形態（倒置相差顯微鏡×40）；b. ALP 染色（倒置相差顯微鏡×200）；c. 茜素紅染色（倒置相差顯微鏡×200）
Figure2. Morphological observation and osteogenesis identification of ADSCsa. Morphology of the 3rd generation ADSCs (Inverted phase contrast microscope×40); b. ALP staining (Inverted phase contrast microscope×200); c. Alizarin red staining (Inverted phase contrast microscope×200)
2.1.3 支架材料大體觀察
PDPB 呈白色，正常骨質的血管、細胞、蛋白質等完全去除，表面有大量孔隙相互連通呈蜂窩狀，較正常骨質柔軟，容易切割成形，不易碎；骨小梁分布均勻，表面光滑。見圖 3。
圖3
PDPB 外觀
Figure3.
Appearance of PDPB
2.1.4 掃描電鏡觀察
PDPB 孔隙內部相互連通，正常骨組織上的血管、細胞等結構消失；骨小梁光滑，無附著物，表面可見大量微孔結構。單純 PDPBB（D 組）可見大量片狀蛋白結晶松散附著于支架表面。與細胞復合培養后 10 d，A 組僅有少量 VECs 附著于支架上，形狀呈多角形；B 組 ADSCs 黏附于 PDPBB 支架表面，細胞呈梭形，伸出足突連接于 PDPBB 表面的微孔中；C 組大量細胞與 PDPBB 附著，呈巢狀分布，細胞相互堆積形成細胞團，細胞形態多樣，多角形細胞和梭形細胞混合分布，部分細胞團細胞之間分界不清，有大量大小不等顆粒狀物質；細胞沿骨小梁生長，形成細胞層。見圖 4。
圖4
掃描電鏡觀察
a. PDPB（×35）；b. PDPBB（D 組）（×120）；c. A 組（×600）；d. B 組（×800）；e. C 組（×500）
Figure4. Scanning electron microscope observationa. PDPB (×35); b. PDPBB (group D) (×120); c. Group A (×600); d. Group B (×800); e. Group C (×500)
2.2 組織工程骨移植及異位成骨檢測
2.2.1 一般觀察
術后各組均無動物死亡，術后第 1 天動物開始進食，飲食、活動正常。第 1 周內切口腫脹，2 周后完全愈合。
2.2.2 異位成骨標本大體觀察
A 組：術后 2 周，材料表面形成薄層結締組織包膜，包膜內形成新生血管網，肉芽組織開始長入材料孔隙，孔隙清晰可見。術后 4、8、12 周，包膜內纖維組織填塞孔隙，取出較難，孔隙逐漸縮小；12 周時材料表面血管量增多，材料呈實變，孔隙很難看見。術后 4、8、12 周組織工程骨外周呈現白色軟骨樣組織。B 組：術后 2、4 周，肉芽組織開始長入材料孔隙，材料很少吸收，棱角分明；術后 8、12 周，材料棱角變鈍，表面出現少許白色軟骨樣物質，血管量較 A 組減少，材料孔隙未見明顯減小。C 組：術后 2 周，材料表面形成薄層結締組織包膜，材料表面平整；術后 4、8、12 周，材料表面逐漸產生大量白色軟骨樣物質，表面高低不平，較 A、B 組明顯增多。D 組：術后 2、4、8 周，材料表面平整，棱角未見變鈍，表面未見白色軟骨樣物質；8 周時大量纖維組織長入材料孔隙內，孔隙大小未見明顯減小；術后 12 周，材料表面出現少許白色軟骨樣物質，較 A、C 組明顯減少。見圖 5。
圖5
術后各時間點各組異位成骨標本大體觀察
從左至右依次為術后 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Gross observation of ectopic osteogenesis specimens at different time points after operationFrom left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.3 HE 染色
術后 2 周，A、B、C 組可見大量纖維組織長入組織工程骨孔隙內，D 組間隙內有少量纖維組織長入，但仍可見大量孔隙，各組未見明顯淋巴細胞浸潤。術后 4 周，各組骨支架開始降解，大量多核巨大破骨細胞位于支架材料周圍長入材料內部，破壞、吸收支架材料。A、B 組大量細胞長入孔隙組織，未見類骨物質出現；C 組支架材料邊緣開始出現均質、無細胞的類骨物質，孔隙內大量滋養血管形成；D 組部分支架材料老化深染、斷裂。術后 8 周，A、B、D 組部分支架材料已被破壞、碎裂；C 組大量骨支架降解，周圍分布大量多核破骨細胞。術后 12 周，各組支架材料部分吸收，邊緣模糊，易碎裂；各組邊緣均可見均質的類骨物質出現，D 組較少，C 組最多。見圖 6。
圖6
術后各時間點各組 HE 染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
從左至右依次為術后 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure6. HE staining observation in each group at different time points after operation (Inverted phase contrast microscope×200)From left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.4 Masson 染色
術后 2 周，A、B、C、D 組支架材料孔隙內出現少量膠原組織，D 組較少。術后 4 周，A、B 組骨支架孔隙內部出現膠原組織，排列整齊；C 組支架孔隙產生大量骨膠原；D 組軟組織內部分泌少量膠原，部分支架材料老化深染、斷裂。術后 8 周，A、B、D 組破骨細胞侵入支架材料內部，降解、破壞支架材料，周圍有膠原形成；C 組外圍平行排列大量梭形成纖維細胞，分泌大量膠原編織在一起形成新的骨小梁雛形。術后 12 周，各組支架材料均有骨膠原生成，D 組較少。C 組支架材料部分降解完畢，取代為新的成骨中心，周圍存在大量巨噬細胞和新生血管網材料；支架材料周圍膠原組織堆積形成新的骨小梁結構，骨細胞包埋進膠原內部，大量骨支架被降解取代。見圖 7。
圖7
術后各時間點各組 Masson 染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
從左至右依次為術后 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. Masson staining observation in each group at different time points after operation (Inverted phase contrast microscope×200)From left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
定量檢測示，術后隨時間延長各組骨膠原量均呈逐漸上升趨勢，其中 C 組呈直線上升，B 組曲線呈 S 形；A、D 組第 4 周骨膠原量較 2 周時略有下降，8、12 周逐漸上升。術后 2 周，各組間骨膠原量比較差異無統計學意義（F=2.551，P=0.088）；術后 4、8、12 周，C 組骨膠原量顯著高于其余 3 組，B 組高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A 組與 B、D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
術后各時間點各組骨膠原量比較
Figure8.
Comparison of the amount of collagen in each group at different time points after operation
3 討論
3.1 FN 對 PDPB 的表面修飾作用
理想的骨修復支架材料應具有以下特點：可塑性、良好的生物相容性、適當的降解速率、一定力學強度、合適的孔隙率、促成骨性等。單一材料很難滿足上述要求。尋找新的材料用于組織工程骨，是目前研究的熱點和急需解決的關鍵科學問題[14]。
PDPB 是應用仿生原理設計研制的支架材料，是天然骨經物理化學方法處理后制得的天然生物衍生骨支架材料，它保持原骨組織的天然網狀孔隙結構，去除了骨組織上細胞和大部分蛋白質，蛋白質含量 22.4%±0.83%，鈣磷比為 1.74，其主要成分為羥基磷灰石，具有良好的組織相容性和成骨效果，植入機體內未引起嚴重免疫排斥反應，是一種良好的骨支架材料[5-7]。但 PDPB 制作過程中不僅去除了可以引起免疫排斥反應的細胞和細胞外基質，而且也除去了細胞在支架材料黏附生長所必需的環境。本課題組之前研究中也發現，PDPB 與細胞體外復合后超過 20 d，細胞活性會逐漸降低，老化脫落，可見 PDPB 的細胞和組織相容性還需要進一步改善[8]。FN 存在于正常骨基質中，由成骨細胞分泌，是骨細胞存活、增殖、成骨發生過程中不可缺少的蛋白。很多學者對 FN 的作用進行了廣泛研究，有報道認為 FN 不僅能夠促進傷口愈合，而且在 FGF 的協同作用下，還能夠提高成骨細胞在生物衍生骨支架上的黏附[15]。在細胞黏附過程中，細胞通過表面蛋白與周圍基質蛋白的特異性結合，一方面介導細胞黏附，另一方面產生細胞信號傳導，引起一系列相應細胞生物學活動[16]。本研究通過掃描電鏡發現采用 FN 修飾制備的 PDPBB，可以明顯促進細胞在 PDPB 支架材料上的黏附、增殖。
3.2 評價組織工程骨成骨的實驗方法
肌袋包埋實驗是評價骨誘導活性的常用方法，骨骼肌中富含具有成骨細胞轉化潛能的 MSCs，在一定的誘導條件下可分化為成骨細胞，進而形成一定數量的骨組織[17]。因此，在骨骼肌中形成骨組織不僅是檢測一些促進骨形成的生長因子活性的方法，也為獲取新的供骨來源提供了新的研究方向[18]。本研究觀察顯示，PDPBB 及其復合種子細胞的組織工程骨在大鼠股部肌袋中具有成骨活性，主要為膜內成骨。早期主要為類骨質形成，隨著骨髓腔的形成及基質分泌的增加，類骨質逐漸鈣化為成熟骨組織。其機制可能是 PDPBB 上含有的羥基磷灰石能大量吸附創區滲血滲液中的原始造血細胞、血漿蛋白、纖維結合素、血小板以及其他骨誘導物質，如骨骼生長因子、骨衍生性生長因子、TGF-β 等；再加上植入的 ADSCs 在羥基磷灰石或 VECs 的影響下向成骨方向誘導，為異位新生骨形成提供了細胞保障。
本研究中聯合培養細胞組的組織工程骨成骨效能最佳，說明聯合培養系統中的 VECs 能促進 ADSCs 向成骨方向誘導，增加成骨效能。在未復合細胞的 PDPBB 材料上也可見新骨形成，說明 PDPBB 不僅只有骨傳導作用，還有部分骨誘導作用，其機制還有待進一步研究。
3.3 聯合培養 VECs 對 MSCs 的影響
正常骨組織中存在成骨細胞、破骨細胞、VECs、成纖維細胞和 BMSCs。骨組織的功能是由多種細胞、細胞外基質以及各種細胞因子共同作用完成，只采用一種干細胞顯然無法完成構建復雜骨組織的重任。近年學者們越來越認識到聯合培養細胞體系的優越性[19]，國內外研究重點逐漸由單一細胞培養轉向多種細胞共同培養，來完成組織工程骨的構建。
在細胞聯合培養方面，越來越多學者認為 VECs 對 MSCs 的成骨分化具有促進作用。Wang 等[20]發現將人成骨細胞和幾乎不表達 ALP 活性的人臍靜脈內皮細胞共培養時，其 ALP 活性升高并伴隨細胞數量增多，而這種作用是內皮細胞通過分泌具有促成骨作用的因子如 IGF-Ⅰ和內皮素 1 來實現的，而成骨細胞可以通過 VEGF 來增強這一作用。Inglis 等[21]在研究共同培養 VECs 和胎兒股骨來源 MSCs 體系中發現，VECs 能提高 MSCs 的 ALP 和Ⅰ型膠原表達，同時得出在成骨與血管生成過程中，VECs 和 MSCs 之間存在重要的、錯綜復雜的協同作用。Kusumbe 等[22]認為在骨折修復過程中成骨細胞及其前體細胞與 VECs 之間存在相互作用，在骨缺損局部，血管發生和骨形成具有某種偶聯關系。該研究證明兩種細胞之間關系密切，但未對體外聯合培養下兩種細胞的增殖和分化影響進行系統研究。Liang 等[23]將內皮祖細胞和 BMSCs 復合于磷酸三鈣支架上進行聯合培養，結果顯示聯合培養能夠促進組織工程骨的血管化和新骨形成。Verseijden 等[24]分別將 BMSCs 和 ADSCs 與人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）混合培養，結果顯示兩種來源細胞均能促進 HUVECs 增殖形成血管樣結構，其機制可能與細胞之間的接觸和信號傳遞有關。這些研究表明 VECs 能促進 MSCs 的成骨分化和骨組織的血管化。國內學者孫源等[25]也認為聯合培養 VECs 對自體 BMSCs 具有促進成骨的作用。
本課題組前期研究中，用大鼠臍血來源的 VECs 和 ADSCs 建立聯合培養體系，發現 VECs 不僅能促進 ADSCs 的增殖[4]，也可促進 ADSCs 成骨分化[3，26]；同時，在沒有成骨誘導液作用下，也可使 ADSCs 的 ALP 活性提高和骨鈣素分泌增加，表明聯合培養體系中 VECs 既能促進 MSCs 的增殖，又能促進 MSCs 的成骨分化，這兩種聯合細胞在 PDPBB 上的增殖能力明顯優于單種細胞[13]。董苑等[27]研究發現聯合培養 VECs 和 BMSCs 體系中，VECs 分泌的 BMP-2 對 BMSCs 增殖和成骨誘導分化起著重要作用。楊瑞年等[28-29]研究證實，VECs 可以通過影響 BMSCs 的 Bmi-1 基因促進 BMSCs 增殖，通過促進 Runx-2 基因的表達來影響 BMSCs 的成骨分化。這就可以解釋本研究發現的 PDPBB 及其復合 VECs 和 ADSCs 種子細胞的組織工程骨，在大鼠股部肌袋中具有一定成骨活性的結論。
綜上述，本研究表明聯合培養 VECs 與 ADSCs 作為種子細胞構建的組織工程骨異位成骨能力最強。但 VECs 與 ADSCs 之間的相互作用機制還不太明確，下一步需要進行兩種細胞相互影響的基因因素的研究。
作者貢獻：王福科負責研究設計、實施及文章撰寫；張紅負責研究實施及數據收集整理；李彥林、劉流負責研究設計；何川負責數據的統計分析；蔡國鋒、宋恩負責研究實施。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持并沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經昆明醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定，實驗動物生產許可證號：SCXK（滇）2005-0008，實驗動物使用許可證號：SYXK（滇）K2015-0002。
組織工程骨的成骨活性除了依靠支架材料的骨誘導作用、骨傳導作用，和種子細胞的成骨誘導作用、分泌作用外，還有各種生長因子的成骨和成血管作用，它們可以刺激成骨細胞的作用，調節局部成骨，如 BMP、bFGF、TGF-β、PDGF、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ等。當形成骨缺損時，損傷刺激周圍組織和血液細胞分泌各種成骨因子，促進周圍成骨細胞和骨髓、血液的 MSCs 增生，以達到成骨作用。但使用組織工程骨原位修復骨缺損時，會受到這些干細胞和組織生長因子的影響，不能完全體現植入的組織工程骨真正的成骨能力。異位成骨時，因為去除了局部的成骨因素，可以完全體現組織工程骨的成骨能力，所以異位成骨的能力可作為驗證組織工程骨成骨能力的主要指標[1]。詹健峰等[2]也通過把組織工程骨植入 SD 大鼠豎脊肌肌袋，來驗證載 BMP-2 多肽 P24 的巰基化殼聚糖水凝膠的異位成骨能力。
本研究組前期研究表明，聯合培養血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VECs）能促進脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）增殖[3]，而且能促進 ADSCs 成骨分化[4]。骨組織工程支架材料中部分脫蛋白骨（partially deproteinised bone，PDPB）具有正常骨的三維立體結構，孔隙率、鈣磷比和正常骨相似，組織相容性好、無致瘤性，是一種較為理想的骨移植材料[5-6]。本實驗擬將聯合培養的 ADSCs 和 VECs 與部分脫蛋白生物骨（partially deproteinised biologic bone，PDPBB）體外構建組織工程骨異位肌袋移植，排除原位骨床干擾，旨在確定將聯合培養細胞作為種子細胞的生物工程骨成骨作用的有效性和異位建造骨組織的可能性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
18 周齡 SD 大鼠 50 只，雌雄不限，體質量（200±10）g；足月妊娠 SD 大鼠 2 只，體質量約 400 g；均由昆明醫學院動物科提供。
低糖 DMEM 培養基、新生牛血清（GIBCO 公司，美國）；胰蛋白酶、EDTA、DAPI（Sigma 公司，美國）；FBS（JRS 公司，美國；HyClone 公司，美國）；纖維粘連蛋白（fibronectin，FN；R&D 公司，美國）；BrdU（Upstate 公司，美國）；BrdU 小鼠單克隆抗體（Thermo Scientific 公司，美國）；FITC 標記的山羊抗小鼠 IgG（KPL 公司，美國）。超凈工作臺、恒溫 CO2 培養箱（Thermo Scientific 公司，美國）；低溫自動平衡離心機（北京醫用離心機廠）；倒置相差顯微鏡、PM-20 型熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；酶標板自動讀數儀（Bio-Rad 公司，美國）；SP2500 型硬組織切片機（Leica 公司，德國）；XL 型流式細胞儀（Beckman Coulter 公司，美國）。
1.2 體外組織工程骨構建及相關觀測
1.2.1 PDPBB 的制備
取新鮮市售豬腰椎骨制成橫截面積為 0.5 cm2 的骨條，蒸餾水反復沖洗干凈，按文獻［7］方法處理制得 PDPB；用蒸餾水充分浸洗 PDPB，并將浸泡液 pH 值調至 7.0～7.2，于干燥箱風干；將制得的 PDPB 分別磨制成大小為 0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm 的骨塊和 0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 的骨片，于 150 μg/mL FN 浸泡 12 h，制成 PDPBB[8]，生理鹽水超聲漂洗，干燥箱風干，60Co 放射滅菌備用。
1.2.2 VECs 誘導分化培養及鑒定
取足月妊娠 SD 大鼠 2 只，3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后，于 75% 乙醇中浸泡 10 min，按文獻［9］方法分離臍血單個核細胞。加入 5 mL VECs 誘導培養液（含 10%FBS、1% 青霉素、1% 鏈霉素、20 μg/L VEGF、2 μg/L IGF-1、2 μg/L bFGF、20 μg/L EGF 的 L-DMEM 培養基），誘導培養 6 周[10]，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
鑒定：將誘導培養 6 周的 VECs 接種于 24 孔板上，分別行 CD34、CD133、血管內皮生長因子受體 1（fetal liver kinase 1，Flk-1）免疫熒光染色（每個指標各檢測 3 孔），另分別取 1 孔為陰性對照。具體方法：貼壁細胞 PBS 沖洗 2 遍，4% 多聚甲醛固定 30 min，干燥 10 min，3% 牛血清白蛋白孵育標本 20 min；分別加入相應一抗室溫孵育 60 min（陰性對照不加一抗），PBS 洗 3 次，每次 5 min；分別滴加適量山羊抗兔或抗小鼠 Cy3 熒光素標記二抗，置 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中孵育 30 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；DAPI 浸染 1 min，50% 緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.2.3 ADSCs 分離培養及鑒定
取 18 周齡 SD 大鼠 2 只，3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后脫頸處死，按照文獻［8］方法分離大鼠 ADSCs，以含 10% 新生牛血清的 DMEM 培養基[11]，于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養細胞，并傳至第 3 代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
鑒定：取第 3 代 ADSCs 按 5×104 個/mL 密度接種至 6 孔板，加入成骨誘導培養基（含 1×10?8 mol/L 地塞米松、10 mol/L β-甘油磷酸、50 mg/L 維生素 C 的低糖 DMEM 培養基），14 d 時各取 1 孔進行下列染色：① 茜素紅染色：細胞染色前用 PBS 沖洗 2 次，濾紙吸去多余水分，95% 乙醇固定 30 min，2% 茜素紅染色 5 min，流水沖洗，倒置相差顯微鏡下觀察；②ALP 染色：細胞染色前用 PBS 沖洗 2 次，濾紙吸去多余水分，4% 多聚甲醛固定 30 min，NBT/BCIP 避光染色 1 h，流水沖洗，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.2.4 體外構建組織工程骨
取 0.5 cm×0.4 cm×0.3 cm 的 PDPBB 材料 144 塊，L-DMEM 預濕，隨機分為 4 組，A 組為 PDPBB+VECs，B 組為 PDPBB+ADSCs，C 組為 PDPBB+聯合培養細胞（VECs∶ADSCs 為 1∶1）[3-4]，D 組為單純 PDPBB，每組 36 塊，置入 2 塊 6 孔板中，每組 2 孔。取第 4 代 ADSCs 和誘導 6 周后的 VECs，以 5.0×106 個/mL 濃度[12]按上述分組接種于預濕后的 PDPBB，100 μL/孔，置 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 4 h 后，加入 4 mL 含 15% 新生牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、0.01 mol/L HEPES 緩沖液的 L-DMEM 培養基，隔日換液。
1.2.5 掃描電鏡觀察
細胞移植后 10 d[13]每組各取 2 塊材料，3.5% 戊二醛固定 6 h，二蒸水清洗 3 次、每次 15 min；4% 單寧酸+3.5% 戊二醛導電染色 48 h，二蒸水清洗 3 次、每次 30 min；1% 鋨酸固定 4 h，二蒸水清洗 4 次、每次 20 min；30%～100% 乙醇梯度脫水，叔丁醇置換，冰凍干燥，噴鍍鉑鈀合金，掃描電鏡觀察細胞在支架材料上附著情況。同時采用掃描電鏡觀察單純 PDPB 形貌。
1.3 組織工程骨移植及異位成骨檢測
1.3.1 實驗分組及方法
取 18 周齡 SD 大鼠 48 只，隨機分為 A、B、C、D 4 組，每組 12 只。3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）肌肉注射麻醉后脫毛，0.5% 聚維酮碘溶液消毒手術區域，分層切開雙側股部皮膚、皮下，鈍性分離肌肉，造成肌袋。分別將 1.2.4 中制備的 3 種組織工程骨或單純 PDPBB 置于 A、B、C、D 組 SD 大鼠兩側股部肌袋處。術畢肌肉注射青霉素 0.5 萬U預防切口感染。術后各組動物于相同條件下分籠飼養。
1.3.2 一般觀察
術后觀察各組動物的活動、進食、傷口愈合情況。
1.3.3 異位成骨標本大體觀察
術后 2、4、8、12 周每組分別脫頸處死 3 只大鼠，大體觀察植入材料的外觀形態變化。
1.3.4 組織學觀測
術后各時間點取各組植入材料，10% 甲醛固定，樹脂包埋，硬組織切片機連續切片，片厚 5 μm，常規行 HE、Masson 染色，倒置相差顯微鏡下觀察。每組于 Masson 染色放大 100 倍鏡下選取 6 張切片，使用 Adobe Photoshop 7.0 軟件的魔棒工具和直方圖（histogram）功能，進行膠原組織形態計量分析，以像素值代表骨面積計算骨膠原量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS11.5 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 組織工程骨相關觀測
2.1.1 VECs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，臍血單個核細胞原代培養 7 d，貼壁單個核細胞形態單一，呈梭形集落樣生長，無重疊現象；誘導后 6 周細胞形態呈多樣化，有梭形和多角形混合生長。免疫熒光染色示，誘導后 6 周細胞 CD34、CD133、Flk-1 染色均為陽性，細胞核被 DAPI 染為藍色，細胞質內存在大量紅色顆粒；陰性對照未發現陽性細胞。見圖 1。
圖1
VECs 形態學觀察及誘導后 6 周免疫熒光染色鑒定
a. 臍血單個核細胞原代培養 7 d 形態（倒置相差顯微鏡×40）；b. 臍血單個核細胞誘導后 6 周形態（倒置相差顯微鏡×100）；c. CD34 染色（熒光顯微鏡×630）；d. Flk-1 染色（熒光顯微鏡×630）；e. CD133 染色（熒光顯微鏡×630）；f. 陰性對照（熒光顯微鏡×630）
Figure1. Morphological observation of VECs and identification by immunofluorescence staining at 6 weeks after inductiona. Primary culture of cord blood mononuclear cells for 7 days (Inverted phase contrast microscope×40); b. At 6 weeks after induction of cord blood mononuclear cells (Inverted phase contrast microscope×100); c. CD34 staining (Fluorescence microscope×630); d. Flk-1 staining (Fluorescence microscope×630); e. CD133 staining (Fluorescence microscope×630); f. Negative control (Fluorescence microscope×630)
2.1.2 ADSCs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，第 3 代 ADSCs 貼壁單個核細胞形態單一，呈梭形生長，無重疊現象。成骨誘導 14 d 時，ALP 染色示細胞多數呈陽性，細胞失去漩渦狀生長方式，融合成團，ALP 陽性的藍黑色顆粒狀影像相互融合成網狀；茜素紅染色示細胞均可見大量紅色鈣結節影，部分互相融合，形成片狀鈣化影。見圖 2。
圖2
ADSCs 形態學觀察及成骨誘導鑒定
a. 第 3 代 ADSCs 形態（倒置相差顯微鏡×40）；b. ALP 染色（倒置相差顯微鏡×200）；c. 茜素紅染色（倒置相差顯微鏡×200）
Figure2. Morphological observation and osteogenesis identification of ADSCsa. Morphology of the 3rd generation ADSCs (Inverted phase contrast microscope×40); b. ALP staining (Inverted phase contrast microscope×200); c. Alizarin red staining (Inverted phase contrast microscope×200)
2.1.3 支架材料大體觀察
PDPB 呈白色，正常骨質的血管、細胞、蛋白質等完全去除，表面有大量孔隙相互連通呈蜂窩狀，較正常骨質柔軟，容易切割成形，不易碎；骨小梁分布均勻，表面光滑。見圖 3。
圖3
PDPB 外觀
Figure3.
Appearance of PDPB
2.1.4 掃描電鏡觀察
PDPB 孔隙內部相互連通，正常骨組織上的血管、細胞等結構消失；骨小梁光滑，無附著物，表面可見大量微孔結構。單純 PDPBB（D 組）可見大量片狀蛋白結晶松散附著于支架表面。與細胞復合培養后 10 d，A 組僅有少量 VECs 附著于支架上，形狀呈多角形；B 組 ADSCs 黏附于 PDPBB 支架表面，細胞呈梭形，伸出足突連接于 PDPBB 表面的微孔中；C 組大量細胞與 PDPBB 附著，呈巢狀分布，細胞相互堆積形成細胞團，細胞形態多樣，多角形細胞和梭形細胞混合分布，部分細胞團細胞之間分界不清，有大量大小不等顆粒狀物質；細胞沿骨小梁生長，形成細胞層。見圖 4。
圖4
掃描電鏡觀察
a. PDPB（×35）；b. PDPBB（D 組）（×120）；c. A 組（×600）；d. B 組（×800）；e. C 組（×500）
Figure4. Scanning electron microscope observationa. PDPB (×35); b. PDPBB (group D) (×120); c. Group A (×600); d. Group B (×800); e. Group C (×500)
2.2 組織工程骨移植及異位成骨檢測
2.2.1 一般觀察
術后各組均無動物死亡，術后第 1 天動物開始進食，飲食、活動正常。第 1 周內切口腫脹，2 周后完全愈合。
2.2.2 異位成骨標本大體觀察
A 組：術后 2 周，材料表面形成薄層結締組織包膜，包膜內形成新生血管網，肉芽組織開始長入材料孔隙，孔隙清晰可見。術后 4、8、12 周，包膜內纖維組織填塞孔隙，取出較難，孔隙逐漸縮小；12 周時材料表面血管量增多，材料呈實變，孔隙很難看見。術后 4、8、12 周組織工程骨外周呈現白色軟骨樣組織。B 組：術后 2、4 周，肉芽組織開始長入材料孔隙，材料很少吸收，棱角分明；術后 8、12 周，材料棱角變鈍，表面出現少許白色軟骨樣物質，血管量較 A 組減少，材料孔隙未見明顯減小。C 組：術后 2 周，材料表面形成薄層結締組織包膜，材料表面平整；術后 4、8、12 周，材料表面逐漸產生大量白色軟骨樣物質，表面高低不平，較 A、B 組明顯增多。D 組：術后 2、4、8 周，材料表面平整，棱角未見變鈍，表面未見白色軟骨樣物質；8 周時大量纖維組織長入材料孔隙內，孔隙大小未見明顯減小；術后 12 周，材料表面出現少許白色軟骨樣物質，較 A、C 組明顯減少。見圖 5。
圖5
術后各時間點各組異位成骨標本大體觀察
從左至右依次為術后 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure5. Gross observation of ectopic osteogenesis specimens at different time points after operationFrom left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.3 HE 染色
術后 2 周，A、B、C 組可見大量纖維組織長入組織工程骨孔隙內，D 組間隙內有少量纖維組織長入，但仍可見大量孔隙，各組未見明顯淋巴細胞浸潤。術后 4 周，各組骨支架開始降解，大量多核巨大破骨細胞位于支架材料周圍長入材料內部，破壞、吸收支架材料。A、B 組大量細胞長入孔隙組織，未見類骨物質出現；C 組支架材料邊緣開始出現均質、無細胞的類骨物質，孔隙內大量滋養血管形成；D 組部分支架材料老化深染、斷裂。術后 8 周，A、B、D 組部分支架材料已被破壞、碎裂；C 組大量骨支架降解，周圍分布大量多核破骨細胞。術后 12 周，各組支架材料部分吸收，邊緣模糊，易碎裂；各組邊緣均可見均質的類骨物質出現，D 組較少，C 組最多。見圖 6。
圖6
術后各時間點各組 HE 染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
從左至右依次為術后 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure6. HE staining observation in each group at different time points after operation (Inverted phase contrast microscope×200)From left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.4 Masson 染色
術后 2 周，A、B、C、D 組支架材料孔隙內出現少量膠原組織，D 組較少。術后 4 周，A、B 組骨支架孔隙內部出現膠原組織，排列整齊；C 組支架孔隙產生大量骨膠原；D 組軟組織內部分泌少量膠原，部分支架材料老化深染、斷裂。術后 8 周，A、B、D 組破骨細胞侵入支架材料內部，降解、破壞支架材料，周圍有膠原形成；C 組外圍平行排列大量梭形成纖維細胞，分泌大量膠原編織在一起形成新的骨小梁雛形。術后 12 周，各組支架材料均有骨膠原生成，D 組較少。C 組支架材料部分降解完畢，取代為新的成骨中心，周圍存在大量巨噬細胞和新生血管網材料；支架材料周圍膠原組織堆積形成新的骨小梁結構，骨細胞包埋進膠原內部，大量骨支架被降解取代。見圖 7。
圖7
術后各時間點各組 Masson 染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
從左至右依次為術后 2、4、8、12 周 a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. Masson staining observation in each group at different time points after operation (Inverted phase contrast microscope×200)From left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
定量檢測示，術后隨時間延長各組骨膠原量均呈逐漸上升趨勢，其中 C 組呈直線上升，B 組曲線呈 S 形；A、D 組第 4 周骨膠原量較 2 周時略有下降，8、12 周逐漸上升。術后 2 周，各組間骨膠原量比較差異無統計學意義（F=2.551，P=0.088）；術后 4、8、12 周，C 組骨膠原量顯著高于其余 3 組，B 組高于 D 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A 組與 B、D 組比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
術后各時間點各組骨膠原量比較
Figure8.
Comparison of the amount of collagen in each group at different time points after operation
3 討論
3.1 FN 對 PDPB 的表面修飾作用
理想的骨修復支架材料應具有以下特點：可塑性、良好的生物相容性、適當的降解速率、一定力學強度、合適的孔隙率、促成骨性等。單一材料很難滿足上述要求。尋找新的材料用于組織工程骨，是目前研究的熱點和急需解決的關鍵科學問題[14]。
PDPB 是應用仿生原理設計研制的支架材料，是天然骨經物理化學方法處理后制得的天然生物衍生骨支架材料，它保持原骨組織的天然網狀孔隙結構，去除了骨組織上細胞和大部分蛋白質，蛋白質含量 22.4%±0.83%，鈣磷比為 1.74，其主要成分為羥基磷灰石，具有良好的組織相容性和成骨效果，植入機體內未引起嚴重免疫排斥反應，是一種良好的骨支架材料[5-7]。但 PDPB 制作過程中不僅去除了可以引起免疫排斥反應的細胞和細胞外基質，而且也除去了細胞在支架材料黏附生長所必需的環境。本課題組之前研究中也發現，PDPB 與細胞體外復合后超過 20 d，細胞活性會逐漸降低，老化脫落，可見 PDPB 的細胞和組織相容性還需要進一步改善[8]。FN 存在于正常骨基質中，由成骨細胞分泌，是骨細胞存活、增殖、成骨發生過程中不可缺少的蛋白。很多學者對 FN 的作用進行了廣泛研究，有報道認為 FN 不僅能夠促進傷口愈合，而且在 FGF 的協同作用下，還能夠提高成骨細胞在生物衍生骨支架上的黏附[15]。在細胞黏附過程中，細胞通過表面蛋白與周圍基質蛋白的特異性結合，一方面介導細胞黏附，另一方面產生細胞信號傳導，引起一系列相應細胞生物學活動[16]。本研究通過掃描電鏡發現采用 FN 修飾制備的 PDPBB，可以明顯促進細胞在 PDPB 支架材料上的黏附、增殖。
3.2 評價組織工程骨成骨的實驗方法
肌袋包埋實驗是評價骨誘導活性的常用方法，骨骼肌中富含具有成骨細胞轉化潛能的 MSCs，在一定的誘導條件下可分化為成骨細胞，進而形成一定數量的骨組織[17]。因此，在骨骼肌中形成骨組織不僅是檢測一些促進骨形成的生長因子活性的方法，也為獲取新的供骨來源提供了新的研究方向[18]。本研究觀察顯示，PDPBB 及其復合種子細胞的組織工程骨在大鼠股部肌袋中具有成骨活性，主要為膜內成骨。早期主要為類骨質形成，隨著骨髓腔的形成及基質分泌的增加，類骨質逐漸鈣化為成熟骨組織。其機制可能是 PDPBB 上含有的羥基磷灰石能大量吸附創區滲血滲液中的原始造血細胞、血漿蛋白、纖維結合素、血小板以及其他骨誘導物質，如骨骼生長因子、骨衍生性生長因子、TGF-β 等；再加上植入的 ADSCs 在羥基磷灰石或 VECs 的影響下向成骨方向誘導，為異位新生骨形成提供了細胞保障。
本研究中聯合培養細胞組的組織工程骨成骨效能最佳，說明聯合培養系統中的 VECs 能促進 ADSCs 向成骨方向誘導，增加成骨效能。在未復合細胞的 PDPBB 材料上也可見新骨形成，說明 PDPBB 不僅只有骨傳導作用，還有部分骨誘導作用，其機制還有待進一步研究。
3.3 聯合培養 VECs 對 MSCs 的影響
正常骨組織中存在成骨細胞、破骨細胞、VECs、成纖維細胞和 BMSCs。骨組織的功能是由多種細胞、細胞外基質以及各種細胞因子共同作用完成，只采用一種干細胞顯然無法完成構建復雜骨組織的重任。近年學者們越來越認識到聯合培養細胞體系的優越性[19]，國內外研究重點逐漸由單一細胞培養轉向多種細胞共同培養，來完成組織工程骨的構建。
在細胞聯合培養方面，越來越多學者認為 VECs 對 MSCs 的成骨分化具有促進作用。Wang 等[20]發現將人成骨細胞和幾乎不表達 ALP 活性的人臍靜脈內皮細胞共培養時，其 ALP 活性升高并伴隨細胞數量增多，而這種作用是內皮細胞通過分泌具有促成骨作用的因子如 IGF-Ⅰ和內皮素 1 來實現的，而成骨細胞可以通過 VEGF 來增強這一作用。Inglis 等[21]在研究共同培養 VECs 和胎兒股骨來源 MSCs 體系中發現，VECs 能提高 MSCs 的 ALP 和Ⅰ型膠原表達，同時得出在成骨與血管生成過程中，VECs 和 MSCs 之間存在重要的、錯綜復雜的協同作用。Kusumbe 等[22]認為在骨折修復過程中成骨細胞及其前體細胞與 VECs 之間存在相互作用，在骨缺損局部，血管發生和骨形成具有某種偶聯關系。該研究證明兩種細胞之間關系密切，但未對體外聯合培養下兩種細胞的增殖和分化影響進行系統研究。Liang 等[23]將內皮祖細胞和 BMSCs 復合于磷酸三鈣支架上進行聯合培養，結果顯示聯合培養能夠促進組織工程骨的血管化和新骨形成。Verseijden 等[24]分別將 BMSCs 和 ADSCs 與人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）混合培養，結果顯示兩種來源細胞均能促進 HUVECs 增殖形成血管樣結構，其機制可能與細胞之間的接觸和信號傳遞有關。這些研究表明 VECs 能促進 MSCs 的成骨分化和骨組織的血管化。國內學者孫源等[25]也認為聯合培養 VECs 對自體 BMSCs 具有促進成骨的作用。
本課題組前期研究中，用大鼠臍血來源的 VECs 和 ADSCs 建立聯合培養體系，發現 VECs 不僅能促進 ADSCs 的增殖[4]，也可促進 ADSCs 成骨分化[3，26]；同時，在沒有成骨誘導液作用下，也可使 ADSCs 的 ALP 活性提高和骨鈣素分泌增加，表明聯合培養體系中 VECs 既能促進 MSCs 的增殖，又能促進 MSCs 的成骨分化，這兩種聯合細胞在 PDPBB 上的增殖能力明顯優于單種細胞[13]。董苑等[27]研究發現聯合培養 VECs 和 BMSCs 體系中，VECs 分泌的 BMP-2 對 BMSCs 增殖和成骨誘導分化起著重要作用。楊瑞年等[28-29]研究證實，VECs 可以通過影響 BMSCs 的 Bmi-1 基因促進 BMSCs 增殖，通過促進 Runx-2 基因的表達來影響 BMSCs 的成骨分化。這就可以解釋本研究發現的 PDPBB 及其復合 VECs 和 ADSCs 種子細胞的組織工程骨，在大鼠股部肌袋中具有一定成骨活性的結論。
綜上述，本研究表明聯合培養 VECs 與 ADSCs 作為種子細胞構建的組織工程骨異位成骨能力最強。但 VECs 與 ADSCs 之間的相互作用機制還不太明確，下一步需要進行兩種細胞相互影響的基因因素的研究。
作者貢獻：王福科負責研究設計、實施及文章撰寫；張紅負責研究實施及數據收集整理；李彥林、劉流負責研究設計；何川負責數據的統計分析；蔡國鋒、宋恩負責研究實施。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持并沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經昆明醫科大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定，實驗動物生產許可證號：SCXK（滇）2005-0008，實驗動物使用許可證號：SYXK（滇）K2015-0002。
