引用本文： 李菊, 郭曉東, 李明政, 肖宇, 包崇云. 蛋白質因子在調控骨改建過程中的作用機制研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(1): 115-123. doi: 10.7507/1002-1892.201808059 復制
骨是一種動態組織，隨著承載機械負荷的變化，其血鈣水平以及各種旁分泌、內分泌因素也會隨之發生變化，進而導致骨的不斷吸收和形成。兩者的平衡是維持骨正常發育的關鍵。骨改建是一個動態的循環過程，主要是由破骨細胞主導的骨吸收和成骨細胞主導的骨形成兩個方面共同組成[1]。具體來說，在接到骨刺激信號（機械負荷、激素、生長因子）后，破骨細胞先出現在骨表面，通過細胞外酸性基質吸收礦物成分，形成骨吸收陷窩；成骨細胞一旦被破骨細胞接觸，或者被破骨細胞可溶性因子刺激，將立刻在陷窩部位沉積骨樣物質，引發后續的骨形成階段。研究表明，骨改建是一個周期長且比較復雜的生理過程，受到多種因素的影響。其中，蛋白質因子作為一種主要的骨刺激因子，其特殊的結構和功能將決定上述細胞的增殖及活性，同時介導細胞之間的相互作用，最終影響骨改建過程的穩定狀態[2]。比如破骨細胞質膜上的組織蛋白酶 K（cathepsin K，CTSK）可有效降解骨有機質，對骨吸收過程有明顯的加速作用；而成骨細胞中的 BMPs 則是唯一能單獨誘導骨組織形成的局部生長因子，能夠有效提高骨形成及發育的效果。因此，蛋白質因子在調控骨改建過程中發揮著關鍵作用，深入研究其具體影響和相關機制將對于探索骨相關疾病的病理以及尋找合適的治療手段具有重要意義。本文將對骨改建過程中涉及到的主要蛋白質因子及其機制綜述如下。
1 蛋白質因子在骨吸收過程中的作用機制
骨吸收是由破骨細胞通過分泌酸性物質及蛋白酶來降解骨組織中的骨鹽和骨基質成分的過程，包括破骨細胞的附著和極化、基質脫礦和降解、細胞脫落等行為[3]。骨吸收過程中涉及到眾多蛋白因子，其中 CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）和基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）是破骨細胞的標志酶；骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/NF-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）是骨吸收的主要信號因子；此外，鳥苷三磷酸酶結合蛋白家族（Rho GTPases）影響著破骨細胞封閉區功能；白介素類蛋白（interleukines，ILs）既能刺激破骨細胞的形成與增殖，又能抑制其分化。
1.1 破骨細胞標志酶
1.1.1 CTSK
CTSK 是一種破骨細胞分泌的半胱氨酸蛋白酶，主要存在于破骨細胞溶酶體和細胞質囊泡中[4]。它是破骨細胞唯一高表達的組織蛋白酶，且 CTSK 過表達可明顯加速骨吸收進程，因此常作為破骨細胞的標志物使用[5]。
因其分子結構中具有疏水性側鏈，易于降解膠原螺旋結構域，所以 CTSK 在骨吸收過程中可以完全降解膠原蛋白和其他基質蛋白。相關研究顯示，CTSK 能在 24 h 溶解孵育的成年皮質骨膠原螺旋和端肽的 40%，72 h 溶解 80%，96 h 接近 100%[6]。其機制主要是依靠 CTSK 的聚脯氨酸區可以對Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原進行剪切，進而有效地將膠原三螺旋和肽的膠原蛋白分離出來，最終產生膠原單體。2012 年 Borel 等[7]將提取得到的骨膠原與不同濃度下的人重組 CTSK 及其抑制劑進行孵育培養，結果顯示 CTSK 能夠優先溶解成熟的膠原基質。
在骨代謝疾病研究方面 ，CTSK 基因敲除小鼠表現出骨質疏松癥狀，且這種癥狀是基質降解而非脫礦導致的，此結論完全符合 CTSK 的基質降解功能[8]。缺乏 CTSK 將導致小鼠骨吸收能力受損，并且進一步引發骨硬化疾病[9]。由此可見，CTSK 與某些骨代謝疾病的發生與發展密切相關。
目前，隨著對 CTSK 的結構、作用以及致病機制有了更為清晰的理解，許多研究開始致力于開發 CTSK 的有效抑制劑來治療某些相關骨代謝疾病。與其他抗吸收劑相比，CTSK 抑制劑對降低骨吸收生化指標同樣有效，但同時會減少骨形成標志物的活性，具有一定的致病風險。如奧當卡替可有效降低多個部位的骨折幾率，但同時它也可能引起腦血管的意外疾病。因此，只有通過對 CTSK 抑制劑生物學特性及臨床效果進行不斷優化，徹底排除對其他疾病的致病風險后，才有望成為一種治療骨質疏松癥的新方法[10]。
1.1.2 TRACP 5b
TRACP 是酸性磷酸酶的第 5 型同工酶，為一種高度保守的金屬蛋白酶，根據其糖基化形式的不同可分為 5a 和 5b 兩種類型。其中 TRACP 5b 的活性與骨代謝標志物的表達變化顯著相關，同時與骨礦物質密度成負相關，其功能與 CTSK 類似，也具有降解骨有機質的作用。TRACP 5b 產生于 CTSK 降解有機質的過程中，當最初的降解產物連同 CTSK 被吞噬進入破骨細胞并通過細胞膜轉囊泡進行運輸后[11-12]，含有 TRACP 的囊泡被融合到這些囊泡中，進而產生具有高度特異性的 TRACP 5b[13-14]。當囊泡移開吸收旋渦時，其 pH 值變為中性，為 TRACP 的活性氧（reactive oxygen species，ROS）發揮功能提供最佳環境，然后 ROS 在其胞吞作用下會進一步促進有機基質的降解[15]。
由于 TRACP 5b 與破骨細胞的數量以及反映破骨活性的膠原蛋白密切相關，因此多數研究把它作為破骨細胞數量的準確標志物，可用于測定動物模型中破骨細胞的數量，或者用于體外骨細胞培養中對破骨細胞的微觀計數等功能[16]。2000 年 Alatalo 等[16]研究了小鼠體外破骨細胞分化過程中 TRACP 5b 的釋放，發現 TRACP 5b 的活性與破骨細胞數量有顯著相關性（P<0.000 1）；2008 年 Rissanen 等[17]探討了阻斷雌激素對去勢大鼠模型中破骨細胞數量和活性的影響，進一步證明 TRACP 5b 是檢測破骨細胞數量的一個可靠指標。臨床試驗結果也同樣證實 TRACP 5b 可以作為骨吸收速率的量化指標[18]。此外，TRACP 5b 還受甲狀旁腺激素和降鈣素的調節，甲狀旁腺激素刺激破骨細胞分泌 TRACP，而降鈣素則能抑制其分泌。
1.1.3 MMP-9
MMP-9 又稱明膠酶 B，是主要骨吸收蛋白酶之一，屬于 MMPs 的成員。由于它是破骨細胞中含量最豐富的 MMP，且通過降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原，加速細胞外基質的降解，所以常作為破骨細胞的標志物使用。
MMP-9 作為骨吸收過程中的關鍵酶，通過影響破骨細胞的遷移、破骨細胞的招募和細胞外基質中生長因子的釋放，調控骨吸收進程。在遷移和骨吸收過程中，破骨細胞會分泌 CD44 和 MMP-9 進入再吸收區，兩者在細胞表面結合后產生的復合物，能直接加速Ⅳ型膠原蛋白的降解。因此，可通過加入 MMP-9 化學抑制劑弱化破骨細胞的遷移能力，減緩骨吸收進程[19-20]。2007 年 Samanna 等[21]利用雙膦酸阿侖膦酸鹽和細胞松弛素 D 抑制肌動蛋白的聚合，有效阻斷細胞表面 CD44/MMP-9 復合物的形成，同時也抑制了 MMP-9 的激活，降低了破骨細胞的遷移效率，該結果提示 CD44/MMP-9 復合物的形成可能是破骨細胞功能中的一個獨特的運動增強信號。另外，缺乏 MMP-9 的小鼠則出現破骨細胞招募延遲的現象[22]。
1.2 骨吸收的主要信號因子
上世紀 90 年代發現，RANK 和 RANKL 是破骨細胞前體完全分化為成熟破骨細胞的必要因子，而 OPG 作為 RANKL 的受體調控破骨細胞發育，因此 OPG/RANKL/RANK 被視為影響骨吸收過程的主要信號因子。
1.2.1 RANKL/RANK
RANKL/RANK 信號調控著破骨前體細胞形成多核破骨細胞以及它們在正常骨骼改建和各種病理條件下的激活和存活。其中 RANK 屬于 TNF 受體（TNF receptor，TNFR）超家族，是一種存在于成熟破骨細胞表面的Ⅰ型跨膜蛋白，具有一個大的 C-胞漿域和一個 N-胞外域，其多聚化結構中含有豐富的半胱氨酸。與其他 TNFR 相關蛋白一樣，能激活細胞內信號傳導級聯反應。1999 年 Dougall 等[23]發現 RANK 是破骨細胞和淋巴結發育的一個必要受體，能夠為淋巴結組織和破骨細胞分化提供關鍵信號。2000 年 Li 等[24]通過載體構建 RW4 胚胎干細胞 RANK 基因敲除（RANK-/-），得到的基因敲除小鼠表現出破骨細胞增殖及骨吸收過程均被抑制的現象；而當把 RANK 的 cDNA 轉染進入 RANK-/-小鼠造血前體細胞，可啟動破骨細胞生成。隨后研究發現，RANK 是一種細胞表面決定因素，它可以影響 OPG 配體在骨吸收和骨改建中的作用，以及介導鈣激素和促生長因子的生理和病理效應。
RANKL 是 RANK 的配體，它是與巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）相關的Ⅱ型跨膜蛋白，隸屬于 TNF 超家族，在成骨細胞表面表達，可被幾個細胞外蛋白酶分解并從細胞膜中釋放出來。有研究認為 RANKL 是作為一種膜相關因素而支持破骨形成；同時，RANKL 是破骨細胞前體細胞招募和成熟的關鍵調節因子，在一定程度上介導了幾種重要骨吸收刺激劑的作用，這些刺激劑會聚集在成骨相關細胞表面以產生 RANKL，然后 RANKL 直接激活破骨細胞及其前體。RANKL 通過 TNFR6 銜接蛋白結合 RANK，激活破骨細胞前體細胞中 NF-κB 和 c-JNK 信號，從而刺激破骨細胞前體分化為成熟破骨細胞并促使其進一步活化[25]。另外，中和 RANKL 的抗體能抑制由前列腺素 E2、1，25-二羥基維生素 D3 和甲狀旁腺素誘導的骨吸收。
1.2.2 OPG
OPG 是 TNF 受體家族成員之一，主要功能為負調節破骨細胞的形成及骨吸收過程。OPG 包含 3 個結構域，第一個是 N 末端豐富的半胱氨酸結構域，是破骨形成抑制及半胱氨酸 400 介導的 OPG 二聚體化所必需的；第二結構域是肝素結合域，能與許多軟骨互動；第三個是對應于死亡域同源區，由 OPG 和 Fas 跨膜區組成的嵌合體蛋白，在細胞中的過度表達導致細胞凋亡。3 個結構域的數量和分布決定了 OPG 的生物活性。
OPG 作為一個可溶性受體，通過與 RANKL 結合來競爭性抑制 RANK 與 RANKL 的相互作用，從而抑制破骨細胞的分化和吸收，調節骨穩態。因此，OPG 和 RANKL 基因的平衡表達是調節骨密度的關鍵。Mizuno 等[26]通過基因敲除 OPG（OPG-/-）構建了第一個骨質疏松小鼠模型，研究結果證實 OPG 是抑制破骨細胞生成的一個關鍵因子。Bucay 等[27]發現 OPG-/-小鼠的骨質密度呈現明顯下降，其特征表現為較大的小梁骨和皮質骨孔隙度，顱骨明顯變薄，骨折發生率較高。此外，OPG 能夠抑制 Rho GTPase 信號傳導途徑基因的表達，進一步導致破骨細胞密封區的破壞，抑制骨吸收[28]。
1.3 其他影響骨吸收過程的蛋白因子
1.3.1 Rho GTPases
Rho GTPases 又稱為小 G 蛋白家族，習慣性稱為 Rho GTP 酶，是 Ras 超家族的一個亞家族，主要包括 Rho、Rac 和 Cdc42。Rho GTPases 可以影響破骨細胞的極性、遷移、囊泡和分裂等過程，同時可對破骨細胞的黏附、分化以及封閉區的形成產生影響，進而影響破骨細胞的功能[29]。
破骨細胞的封閉區結構是一個富含偽足的寬厚環，由富含 F-actin 及 CD44 的內核以及相關黏附蛋白組成，該結構能夠將破骨細胞牢固地與骨基質結合。研究表明，Rho GTPases 能夠參與維持偽足的穩定，從而保證破骨細胞封閉區結構不受影響，通過添加抑制劑降低 Rho 活性后，破骨細胞的封閉區將受到明顯破壞。
Rac1 是 Rho GTPases 的重要成員，在調控破骨細胞功能的過程中起著關鍵作用。研究表明 Rac1 基因敲除后小鼠骨密度、骨體積分數、骨小梁厚度均明顯提高，而小梁間體積降低，但破骨細胞的數量未發生明顯改變，說明 Rac1 主要是通過影響破骨細胞的功能來實現對骨量的調控。以 RNA 干擾下調 Rac1 后發現細胞的破骨分化受到影響，表現為封閉區完整性缺失以及細胞融合減少，說明 Rac1 能夠促進破骨細胞封閉區的形成以及破骨細胞的分化。Rac1 主要位于破骨細胞 F-actin 以及相關黏附蛋白周圍，局部注射 Rac1 有助于提高破骨細胞的遷移速率并促進封閉區的形成，而抑制 Rac1 則會導致 Vinculin 聚集失活并與 F-actin 解除聯系，從而影響細胞黏附與功能，說明 Rac1 可能通過對細胞黏附斑以及細胞骨架形成與解聚的影響調控破骨細胞的功能。
1.3.2 ILs
ILs 是骨改建過程中的一類重要調控因子，共有 33 種。其中 IL-3、IL-4、IL-10、IL-13 抑制破骨細胞的分化，IL-1、IL-6、IL-11 刺激破骨細胞的形成和增殖。
IL-1 可激活破骨細胞并影響破骨細胞的形成與增殖，但單獨的 IL-1 不能刺激破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞，必須與 RANKL 協同作用才能誘導破骨細胞的形成。IL-1 通過增加 M-CSF 來促進骨吸收進程，而 M-CSF 與 M-CSF 受體結合將進一步激活 RANKL，促進破骨細胞前體分化為破骨細胞。
IL-6 主要來源于成骨細胞和基質細胞，其作用是促進破骨細胞增殖及提升骨吸收效率。IL-6 在骨改建中的具體作用是，首先刺激 RANKL 相關破骨細胞下游效應物——成骨細胞的產生；然后，所產生的效應物能以自分泌或旁分泌的方式直接激活破骨細胞活性。Palmqvist 等[30]研究表明，單獨的人源 IL-6 和可溶性 IL-6 受體均不能刺激骨吸收，但當兩者結合時，能顯著刺激骨外植體的礦化及基質釋放。
IL-11 與 IL-6 擁有許多類似的生物學特性，兩者通過一個共同的信號轉導因子糖蛋白 130 發揮作用[31]。IL-11 富含亮氨酸和脯氨酸，可通過抑制成骨細胞的活性進而抑制骨形成，同時還能刺激破骨細胞形成和增殖。
2 蛋白在骨形成過程中的作用機制
骨形成是一個成骨細胞鋪設形成新骨基質的過程，其中 MSCs 分化成骨是該過程的重要步驟。MSCs 分化為成骨細胞進而形成新骨組織是一個有序的過程，通過細胞增殖、分化、細胞外基質形成和礦化階段逐步進行。Kulterer 等[32]利用寡核苷酸芯片基因表達分析，證明了 MSCs 體外分化的特定時間，0～4 d 為增殖期，4～14 d 為基質成熟期，14～21 d 為成礦期。進一步研究發現，4～14 d 為成骨分化早期，14～21 d 為成骨分化晚期[33]。
在 MSCs 成骨分化過程中，蛋白因子骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）等都參與了基質形成和礦化，其中 BALP、Ⅰ型膠原、BMP-2 是成骨分化早期標志物，OCN、OPN、BSP 則是晚期標志物 [34-36]。
2.1 成骨分化早期標志性蛋白質
2.1.1 BALP
BALP 是同型二聚體糖蛋白構成的一種胞外酶，合成于骨基質成熟階段，與成骨細胞和前成骨細胞活性成線性相關，被認為是最精確的骨形成標志物。1977 年 Fleisher 等[37]發現 ALP 活性在 11～14 歲青少年體內達到高峰，提示 ALP 可能促進早期骨骼的生長。1983 年 Canalis[38]體外研究表明，胎鼠顱骨中 ALP 的活性與膠原蛋白的產生率成正比。同年 Marie 等[39]的正常幼鼠體內研究顯示，ALP 的活性與成骨細胞數量成正相關。隨后研究發現，體外 BALP 的活性正調控骨骼膠原的形成[40]。綜上，可以將 BALP 作為骨骼組織中骨形成率的一個通用指標[41-42]。
此外，BALP 還是基質鈣化過程中的第一個參與因子，在骨基質成礦中主要通過調節無機磷酸鹽（Pi）和無機焦磷酸鹽（PPi）之間的平衡來刺激礦化。所以，常把 BALP 作為成骨分化早期的標志。一般認為 BALP 產生的 Pi 是形成羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）所需要的，但水解 PPi 達到一定的 Pi/PPi 比例也能實現 HA 晶體形成和生長，其確切的釋放機制仍不清楚[43]。
2.1.2 Ⅰ型膠原
Ⅰ型膠原是骨細胞外基質的主要有機成分，是早期骨祖細胞的標志物[44]。它由 3 條多肽鏈組成的右手螺旋分子組成，有 2 個相同的 α1 鏈和 1 個 α2 鏈，作為骨基質的主要結構蛋白，占骨膠原總量的 95%，骨組織總蛋白的 80%。甚至有研究認為正常骨基質僅含有Ⅰ型膠原[45]。1999 年 Jikko 等[46]發現Ⅰ型膠原的 mRNA 表達水平在骨形成早期上調，提示Ⅰ型膠原可能是成骨早期的標志物。2014 年 Twine 等[47]鑒定了包括Ⅰ型膠原在內的骨骼相關基因在 8 個時間點的表達情況，證實了Ⅰ型膠原是成骨分化的早期標志物。此外，研究表明 ALP 的表達取決于Ⅰ型膠原的產生量[48-49]。因此Ⅰ型膠原是成骨分化早期的另一標志物。
從作用機制上來說，Ⅰ型膠原通過增強成骨細胞蛋白激酶 C 的活性，刺激 MSCs 分化為成骨細胞；然后，成骨細胞從微環境中攝取所需的氨基酸，合成并分泌膠原纖維及有機質。此外，Ⅰ型膠原還可增加組織血管數量，減慢巨噬細胞及破骨細胞活性，達到減輕炎性反應的效果。由于其具有生物可降解性、生物相容性和低免疫原性，而被廣泛用作組織工程支架材料中，也可以作為涂層或增強材料與其他骨組織工程直接材料復合使用。
2.1.3 BMP-2
BMPs 是 TGF-β 超家族（TGF-βs）中的一種低分子量酸性糖蛋白，富含谷氨酸，其分子結構是由 2 個多肽鏈通過 1 個單一的二硫鍵結合而成的二聚體分子，與 HA 具有較高的親和性，是唯一能單獨誘導骨組織形成的蛋白質因子。因此常與骨組織工程支架材料復合使用，以調節成骨細胞分化和骨形成過程。
迄今為止，已經鑒定出 20 多種 BMPs，但只有幾種可以誘導新骨形成。目前發現 BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9 對成骨細胞分化和骨形成起著重要的促進作用，其中 BMP-2 是 BMPs 家族最有效的成骨促進因子，且主要影響 ALP 的活性，因此常作為早期成骨分化的標志物。
BMP-2 通過刺激 ALP 的活性，上調 Runx2、Ⅰ型膠原、OCN、BSP 等成骨特異性基因的表達，促進成骨分化進而增加骨形成。早期研究發現 BMP-2 通過 Smad 或 GR 依賴性信號傳導途徑，調控轉錄因子 Runx2 和鋅指結構轉錄因子 osterix，同源框基因 Dlx5 和 Msx2 的表達來調節 ALP 的轉錄。2010 年 Mikami 等[50]發現 BMP-2 和地塞米松在成骨分化的同一階段相同路徑促進 ALP 的表達，且這種協同作用是通過 JAK/STAT 信號通路完成的。另一方面，將 BMP-2 與 BMP 家族的其他蛋白聯合應用，可在一定程度上提升骨形成效率。
2.2 成骨分化晚期標志性蛋白質
OCN 和 OPN 是主要的非膠原蛋白，它們在骨骼的生物和機械功能中起著關鍵作用。在礦化過程的后期，它們直接或間接地控制骨骼質量、礦物大小和方向[51-53]。因此，這兩種蛋白因子都可以作為晚期礦化的標志物。
2.2.1 OCN
OCN 是繼膠原后的第二豐富蛋白，由于其在成骨晚期的表達隨細胞分化和基質礦化而增加，且具有調控骨礦物沉積和轉移的作用，因此作為礦化晚期的標志物使用。結構上，它是由 46～50 個氨基酸組成的相對分子質量為 6×103 的小蛋白質，含有 3 種維生素 K 依賴的 γ-羧基谷氨酸，其殘基具有較高的 Ca2+ 結合親和力，且能穩定 OCN 的 α-結構，使 OCN 能與 HA 結合在一起[54]。
盡管 OCN 在骨骼發育過程中起著至關重要的作用，且是多個領域骨骼形成和改建的標志物，但其確切的生理意義還未研究清楚。目前研究認為，OCN 具有促進成骨細胞分化成熟、骨細胞形成，維持骨正常礦化的作用。在 Rammelt 等[55]的研究中，OCN 能夠加速新形成的編織骨與內在骨組織的融合，在 OCN 復合 HA/膠原植入物周圍的界面處，骨特異性基質蛋白和多功能黏附蛋白表達增加，表明 OCN 可加速骨形成和再生。2017 年 Tsao 等[56]通過小干擾 RNA 沉默 OCN 后，礦物質的成熟被推遲，實驗組 HA 總量低于對照組，且 Runx2、ALP、Ⅰ型膠原等成骨相關基因的表達受抑制，從而證明了 OCN 對礦物質的成熟具有促進作用，并可調節 MSCs 的成骨分化。這與早期研究結果并不相符。1996 年 Ducy 等[57]在 OCN-/- 小鼠體內發現，長骨皮質厚度和密度隨著礦化骨基質數量的增加而增加，卵巢切除術前后的組織形態學表明，OCN 的缺失會導致骨形成的增加。相似的是，Bodine 等[58]在培養基中加入不同濃度的 OCN 培養成骨細胞，結果顯示 ALP 的活性隨 OCN 濃度的升高而降低，提示 OCN 抑制成骨細胞活性。這些研究表明，OCN 負調控骨形成過程。
2.2.2 OPN
OPN 也被稱為分泌磷蛋白 1，由 260～317 種氨基酸組成，相對分子質量為 33×103，是一種高度保守的多功能糖蛋白，主要沉積在細胞礦化組織表面的界膜處、骨質成礦位點及礦化前的有機物質中，通常被視為骨基質中細胞與 HA 的橋梁。研究發現，OPN 在骨改建中主要發揮 3 個方面的功能：調控骨細胞的黏附、調控基質礦化、調控破骨細胞的功能[59-60]。
OPN 在成骨細胞中原位存在，在軟骨內/膜內成骨過程中積聚在礦化骨基質中，通過增強成骨細胞的分化與增殖來增加 ALP 的活性。Kojima 等[61]通過重組腺病毒載 OPN 的 cDNA 轉染進入大鼠骨髓源成骨細胞的實驗，表明 OPN 過表達不僅能顯著提高 OCN 和 ALP 的表達，還能增強鈣結節的形成及 ALP 的活性。OPN 作為信號分子直接參與生物礦化過程，可直接結合到特定的磷灰石晶體表面，作為礦化抑制因子發揮作用。
此外，OPN 還通過刺激破骨細胞表面 CD44 的表達，促進破骨細胞黏附、遷移及骨吸收，同時作為細胞因子與 αⅤβ3 結合，激活非受體酪氨酸激酶和磷脂 3 羥基激酶，以刺激破骨細胞的信號傳導。
2.2.3 BSP
BSP 是 MSCs 成骨分化的晚期標志物，占骨骼和牙基質中非膠原蛋白的 8%～12%，由 281～327 種氨基酸組成，相對分子質量為（60～80）×103。Mizuno 等[62]將骨髓細胞培養在含抗 BSP 單克隆抗體的膠原基質中，結果顯示成骨表型的表達被抑制，但添加牛骨 BSP 后可消除抗體的效果，重新激發骨髓細胞成骨表型的表達。Gordon 等[63]發現小發夾 RNA 編碼質粒抑制 BSP 表達，同時也抑制成骨標志物的表達和鈣結節的形成，而體外成骨細胞過表達 BSP 能有效提高成骨分化及基質礦化，體內小鼠基因敲除實驗結果與體外一致[64]。進一步研究表明，成骨細胞過表達 BSP 可增強礦化作用，當加入抗 BSP 抗體后，成骨細胞則不表達 OCN 和 OPN 等成骨相關基因[65-66]。綜上，BSP 可作為標志物檢測晚期成骨分化。
同時，BSP 還是生物礦化和成骨分化的一個促進劑。這是因為 BSP 具有大量磷酸根和負電荷，可以與 Ca2+ 結合形成螯合物，參與膠原黏附、HA 成核和基質礦化等過程[67]。BSP 參與 HA 成核是由 BSP 中央區域的聚谷氨酸序列決定的，N-末端膠原結合域使 BSP 結合膠原來促進 HA 成核，C 末端的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序通過結合整合素，促進成骨分化和基質礦化。BSP 不僅能促進成骨細胞的分化與礦化，而且還與破骨細胞分化和過度活躍的骨吸收密切相關。
2.3 整合素
整合素是由 α 和 β 亞基組成的異二聚體黏附分子，通過裝配與細胞骨架相關的胞內蛋白質來控制黏著斑和細胞在細胞外基質上的附著。它是多種骨基質蛋白（Ⅰ型膠原、OPN、BMPs 等）的受體，包括膠原受體 α1β1/α2β1、層粘連蛋白受體 α3β1/α7β1、纖連蛋白受體 αⅤβ3/α4β1/α5β1、玻連蛋白受體 αⅤβ3/αⅤβ5 等。因此整合素可以通過介導細胞-基質之間的相互作用，促進成骨細胞遷移、增殖、存活及分化[68]。例如，α2β1 是Ⅰ型膠原的主要受體，調控著小鼠成骨細胞中膠原的合成；α4β1 通過促進成骨分化和骨形成，進而有效改善骨質疏松小鼠的骨密度；α5β1 具有增加小鼠骨形成及改善骨骼修復的作用等。此外，某些整合素也參與了細胞遷移以及破骨細胞黏附等生理過程。
3 基于蛋白質組學技術的其他成骨相關蛋白的發現
在骨改建過程中具有關鍵調控作用的蛋白質因子種類繁多，利用傳統的研究方法難以快速、全面地發現、鑒定并表征關鍵差異蛋白的結構、功能以及相關機制。隨著蛋白質組學技術的發展，上述問題有望得到解決。蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，利用一定技術手段在整體水平上揭示細胞內蛋白質的組成、結構、活動規律及其生物功能的科學，包括蛋白質的定性鑒定、定量分析、蛋白質加工修飾。根據蛋白質組學的研究策略，將蛋白質組學分為表達蛋白質組學、比較蛋白質組學和臨床蛋白質組學。其中比較蛋白質組學著重于研究不同時期細胞蛋白質的表達變化，或蛋白在不同環境下的差異表達，故其在各類疾病機制的揭示、藥物作用靶點的確定以及分子診斷等諸多方面發揮著重要作用。臨床蛋白質組學通過檢測不同病理過程中蛋白質種類和數量的變化，進而篩選到與疾病相關的生物標志物，為疾病病因和發病機制的揭示提供客觀依據。綜上，蛋白質組學方法是闡明蛋白質因子在骨改建中的功能及相關調控機制，以及檢測骨相關疾病生物標志物的有效手段。下面將對近年來利用蛋白質組學技術發現的幾類參與骨改建過程的差異蛋白進行介紹。
MSCs 成骨分化是一個復雜過程，涉及到成百上千的蛋白質，其中幾種具有明顯表達差異的蛋白，可能是成骨分化過程中的特異性標志因子。脂肪來源人 MSCs 中的Ⅰ型膠原、OCN、BMP-6、LIM 礦化蛋白 1（LIM mineralization protein-1，LAMP-1）直接與成骨途徑相關，由于前 3 種蛋白可用于檢測成骨分化過程，因此可以認為 LAMP-1 可能也是一個特異性標志蛋白[69]。另外，Granéli 等[70]在人 BMSCs 成骨成脂分化蛋白質譜中，發現 3 個特異性候選標志物——CD10、CD29、CRYaB（晶體蛋白 αB），其中 CRYaB 只在人 BMSCs 成骨分化中顯著增加，而對人 BMSCs 成脂、成軟骨分化無影響。
研究還發現，膜聯蛋白是 MSCs 成骨分化過程中的一類關鍵蛋白。2007 年 Zhang 等[71]對人 BMSCs 成骨分化過程中蛋白質的表達進行分析，揭示了 102 個蛋白位點的表達具有≥2 倍的差異，并成功鑒定出 52 個差異表達蛋白，其中膜聯蛋白 A1（annexin A1，ANXA1）的表達在第 3 天及第 7 天均下調。William 等[72]和 Ye 等[73]認為 ANXA1 參與調控了 BMSCs 的生長、分化和凋亡；另外 ANXA2 及 ANXAⅤ的表達量在第 3 天及第 7 天均增加，說明了 ANXA1、ANXA2 和 ANXAⅤ在 MSCs 成骨分化中可能存在不同的調控作用。周穎等[74]對 BMSCs 定向成骨誘導 0、1、7、14、21 d 的蛋白譜進行分析，結果顯示 ANXA2 的表達為不同程度的上調趨勢，進一步證實了其在成骨過程中具有促進作用。Kim 等[75]對人 BMSCs 成骨分化中分泌蛋白質的研究顯示，在成骨過程中，鈣穩態相關蛋白質的表達上調，包括 ANXA1 和 ANXA2，而 ANXA1 的表達與 Zhang 等[71]的結果相矛盾。在近年的研究中，Alves 等[76]證明了纖連蛋白 1、ANXA2 和核纖層蛋白 A/C 特異性調節成骨分化的不同階段，但其具體的作用機制并不清楚。隨后，Pan[77]等發現，沉默 ANXA1 可顯著抑制細胞外信號調節激酶 1/2 的磷酸化以及成骨相關基因（Runx2、OPN、OCN）的表達，并導致大鼠 BMSCs 成骨分化減少，確證了 ANXA1 可促進 BMSCs 的增殖和成骨分化。
雖然蛋白質組學技術能快速、全面地檢測成骨分化過程中的差異表達蛋白，但鑒定得到的成骨分化相關蛋白不一定是特異性表達蛋白，需通過蛋白質功能研究方法來進一步闡述。如 Kim 等[78]首次鑒定出 4 種與 MSCs 成骨分化相關的蛋白質——磷酸甘油變位酶 1、前折疊素 3、熱休克蛋白 27 kDa、β-肌動蛋白，但由于這些蛋白也可用作成骨細胞溶質生物標志物，因此均不能認為是成骨細胞特異性蛋白。
此外，不同 MSCs 分泌的細胞外基質在調節 MSCs 的成骨能力方面起著關鍵作用，細胞外基質蛋白的作用更多地指向調節細胞功能和骨形成相關的過程，如血管生成，而不是直接影響礦化[79]。
4 小結與展望
體內骨穩態是一個新骨與舊骨不斷更替的動態平衡過程，骨穩態平衡一旦失調，就會導致嚴重的骨代謝疾病，如骨質疏松、骨硬化病、風濕性關節炎等。骨改建是維持骨穩態的重要生物學過程，蛋白作為骨改建過程中的重要骨刺激因子, 調控著骨吸收與骨形成之間的平衡。
目前，骨代謝疾病的研究主要集中于發病機制及藥物治療方面，由于蛋白質是生理功能的執行者、生命現象的直接體現者，因此對蛋白質結構和功能的研究，將直接闡明機體在生理和病理條件下的變化機制，而理解骨改建過程中關鍵蛋白的分子結構及作用機制，是解決以上問題的基礎。
本文詳細綜述了破骨細胞主導的骨吸收過程中破骨細胞標志酶、骨吸收的主要信號因子、Rho GTPases 和 ILs 等蛋白因子的結構特點、作用機制及研究進展，同時也說明了成骨分化早期、晚期標志性蛋白及整合素在骨形成過程中的作用機制，但某些蛋白的生理意義尚存在爭議，還有待進一步研究確證。此外，還闡述了蛋白質組學技術在 MSCs 成骨分化中的研究應用，結合其他分子技術研究發現，LAMP-1、CRYaB、ANXA1、ANXA2、ANXAⅤ等蛋白對成骨分化具有促進作用，但確切的調控機制目前還不清楚。因此深入研究以上蛋白在骨改建過程中的具體作用，將有望闡明骨改建過程并揭示骨代謝疾病的分子機制，這對于進一步提高骨疾病的治療效果具有重要意義。
骨是一種動態組織，隨著承載機械負荷的變化，其血鈣水平以及各種旁分泌、內分泌因素也會隨之發生變化，進而導致骨的不斷吸收和形成。兩者的平衡是維持骨正常發育的關鍵。骨改建是一個動態的循環過程，主要是由破骨細胞主導的骨吸收和成骨細胞主導的骨形成兩個方面共同組成[1]。具體來說，在接到骨刺激信號（機械負荷、激素、生長因子）后，破骨細胞先出現在骨表面，通過細胞外酸性基質吸收礦物成分，形成骨吸收陷窩；成骨細胞一旦被破骨細胞接觸，或者被破骨細胞可溶性因子刺激，將立刻在陷窩部位沉積骨樣物質，引發后續的骨形成階段。研究表明，骨改建是一個周期長且比較復雜的生理過程，受到多種因素的影響。其中，蛋白質因子作為一種主要的骨刺激因子，其特殊的結構和功能將決定上述細胞的增殖及活性，同時介導細胞之間的相互作用，最終影響骨改建過程的穩定狀態[2]。比如破骨細胞質膜上的組織蛋白酶 K（cathepsin K，CTSK）可有效降解骨有機質，對骨吸收過程有明顯的加速作用；而成骨細胞中的 BMPs 則是唯一能單獨誘導骨組織形成的局部生長因子，能夠有效提高骨形成及發育的效果。因此，蛋白質因子在調控骨改建過程中發揮著關鍵作用，深入研究其具體影響和相關機制將對于探索骨相關疾病的病理以及尋找合適的治療手段具有重要意義。本文將對骨改建過程中涉及到的主要蛋白質因子及其機制綜述如下。
1 蛋白質因子在骨吸收過程中的作用機制
骨吸收是由破骨細胞通過分泌酸性物質及蛋白酶來降解骨組織中的骨鹽和骨基質成分的過程，包括破骨細胞的附著和極化、基質脫礦和降解、細胞脫落等行為[3]。骨吸收過程中涉及到眾多蛋白因子，其中 CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）和基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）是破骨細胞的標志酶；骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/NF-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）是骨吸收的主要信號因子；此外，鳥苷三磷酸酶結合蛋白家族（Rho GTPases）影響著破骨細胞封閉區功能；白介素類蛋白（interleukines，ILs）既能刺激破骨細胞的形成與增殖，又能抑制其分化。
1.1 破骨細胞標志酶
1.1.1 CTSK
CTSK 是一種破骨細胞分泌的半胱氨酸蛋白酶，主要存在于破骨細胞溶酶體和細胞質囊泡中[4]。它是破骨細胞唯一高表達的組織蛋白酶，且 CTSK 過表達可明顯加速骨吸收進程，因此常作為破骨細胞的標志物使用[5]。
因其分子結構中具有疏水性側鏈，易于降解膠原螺旋結構域，所以 CTSK 在骨吸收過程中可以完全降解膠原蛋白和其他基質蛋白。相關研究顯示，CTSK 能在 24 h 溶解孵育的成年皮質骨膠原螺旋和端肽的 40%，72 h 溶解 80%，96 h 接近 100%[6]。其機制主要是依靠 CTSK 的聚脯氨酸區可以對Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原進行剪切，進而有效地將膠原三螺旋和肽的膠原蛋白分離出來，最終產生膠原單體。2012 年 Borel 等[7]將提取得到的骨膠原與不同濃度下的人重組 CTSK 及其抑制劑進行孵育培養，結果顯示 CTSK 能夠優先溶解成熟的膠原基質。
在骨代謝疾病研究方面 ，CTSK 基因敲除小鼠表現出骨質疏松癥狀，且這種癥狀是基質降解而非脫礦導致的，此結論完全符合 CTSK 的基質降解功能[8]。缺乏 CTSK 將導致小鼠骨吸收能力受損，并且進一步引發骨硬化疾病[9]。由此可見，CTSK 與某些骨代謝疾病的發生與發展密切相關。
目前，隨著對 CTSK 的結構、作用以及致病機制有了更為清晰的理解，許多研究開始致力于開發 CTSK 的有效抑制劑來治療某些相關骨代謝疾病。與其他抗吸收劑相比，CTSK 抑制劑對降低骨吸收生化指標同樣有效，但同時會減少骨形成標志物的活性，具有一定的致病風險。如奧當卡替可有效降低多個部位的骨折幾率，但同時它也可能引起腦血管的意外疾病。因此，只有通過對 CTSK 抑制劑生物學特性及臨床效果進行不斷優化，徹底排除對其他疾病的致病風險后，才有望成為一種治療骨質疏松癥的新方法[10]。
1.1.2 TRACP 5b
TRACP 是酸性磷酸酶的第 5 型同工酶，為一種高度保守的金屬蛋白酶，根據其糖基化形式的不同可分為 5a 和 5b 兩種類型。其中 TRACP 5b 的活性與骨代謝標志物的表達變化顯著相關，同時與骨礦物質密度成負相關，其功能與 CTSK 類似，也具有降解骨有機質的作用。TRACP 5b 產生于 CTSK 降解有機質的過程中，當最初的降解產物連同 CTSK 被吞噬進入破骨細胞并通過細胞膜轉囊泡進行運輸后[11-12]，含有 TRACP 的囊泡被融合到這些囊泡中，進而產生具有高度特異性的 TRACP 5b[13-14]。當囊泡移開吸收旋渦時，其 pH 值變為中性，為 TRACP 的活性氧（reactive oxygen species，ROS）發揮功能提供最佳環境，然后 ROS 在其胞吞作用下會進一步促進有機基質的降解[15]。
由于 TRACP 5b 與破骨細胞的數量以及反映破骨活性的膠原蛋白密切相關，因此多數研究把它作為破骨細胞數量的準確標志物，可用于測定動物模型中破骨細胞的數量，或者用于體外骨細胞培養中對破骨細胞的微觀計數等功能[16]。2000 年 Alatalo 等[16]研究了小鼠體外破骨細胞分化過程中 TRACP 5b 的釋放，發現 TRACP 5b 的活性與破骨細胞數量有顯著相關性（P<0.000 1）；2008 年 Rissanen 等[17]探討了阻斷雌激素對去勢大鼠模型中破骨細胞數量和活性的影響，進一步證明 TRACP 5b 是檢測破骨細胞數量的一個可靠指標。臨床試驗結果也同樣證實 TRACP 5b 可以作為骨吸收速率的量化指標[18]。此外，TRACP 5b 還受甲狀旁腺激素和降鈣素的調節，甲狀旁腺激素刺激破骨細胞分泌 TRACP，而降鈣素則能抑制其分泌。
1.1.3 MMP-9
MMP-9 又稱明膠酶 B，是主要骨吸收蛋白酶之一，屬于 MMPs 的成員。由于它是破骨細胞中含量最豐富的 MMP，且通過降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原，加速細胞外基質的降解，所以常作為破骨細胞的標志物使用。
MMP-9 作為骨吸收過程中的關鍵酶，通過影響破骨細胞的遷移、破骨細胞的招募和細胞外基質中生長因子的釋放，調控骨吸收進程。在遷移和骨吸收過程中，破骨細胞會分泌 CD44 和 MMP-9 進入再吸收區，兩者在細胞表面結合后產生的復合物，能直接加速Ⅳ型膠原蛋白的降解。因此，可通過加入 MMP-9 化學抑制劑弱化破骨細胞的遷移能力，減緩骨吸收進程[19-20]。2007 年 Samanna 等[21]利用雙膦酸阿侖膦酸鹽和細胞松弛素 D 抑制肌動蛋白的聚合，有效阻斷細胞表面 CD44/MMP-9 復合物的形成，同時也抑制了 MMP-9 的激活，降低了破骨細胞的遷移效率，該結果提示 CD44/MMP-9 復合物的形成可能是破骨細胞功能中的一個獨特的運動增強信號。另外，缺乏 MMP-9 的小鼠則出現破骨細胞招募延遲的現象[22]。
1.2 骨吸收的主要信號因子
上世紀 90 年代發現，RANK 和 RANKL 是破骨細胞前體完全分化為成熟破骨細胞的必要因子，而 OPG 作為 RANKL 的受體調控破骨細胞發育，因此 OPG/RANKL/RANK 被視為影響骨吸收過程的主要信號因子。
1.2.1 RANKL/RANK
RANKL/RANK 信號調控著破骨前體細胞形成多核破骨細胞以及它們在正常骨骼改建和各種病理條件下的激活和存活。其中 RANK 屬于 TNF 受體（TNF receptor，TNFR）超家族，是一種存在于成熟破骨細胞表面的Ⅰ型跨膜蛋白，具有一個大的 C-胞漿域和一個 N-胞外域，其多聚化結構中含有豐富的半胱氨酸。與其他 TNFR 相關蛋白一樣，能激活細胞內信號傳導級聯反應。1999 年 Dougall 等[23]發現 RANK 是破骨細胞和淋巴結發育的一個必要受體，能夠為淋巴結組織和破骨細胞分化提供關鍵信號。2000 年 Li 等[24]通過載體構建 RW4 胚胎干細胞 RANK 基因敲除（RANK-/-），得到的基因敲除小鼠表現出破骨細胞增殖及骨吸收過程均被抑制的現象；而當把 RANK 的 cDNA 轉染進入 RANK-/-小鼠造血前體細胞，可啟動破骨細胞生成。隨后研究發現，RANK 是一種細胞表面決定因素，它可以影響 OPG 配體在骨吸收和骨改建中的作用，以及介導鈣激素和促生長因子的生理和病理效應。
RANKL 是 RANK 的配體，它是與巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）相關的Ⅱ型跨膜蛋白，隸屬于 TNF 超家族，在成骨細胞表面表達，可被幾個細胞外蛋白酶分解并從細胞膜中釋放出來。有研究認為 RANKL 是作為一種膜相關因素而支持破骨形成；同時，RANKL 是破骨細胞前體細胞招募和成熟的關鍵調節因子，在一定程度上介導了幾種重要骨吸收刺激劑的作用，這些刺激劑會聚集在成骨相關細胞表面以產生 RANKL，然后 RANKL 直接激活破骨細胞及其前體。RANKL 通過 TNFR6 銜接蛋白結合 RANK，激活破骨細胞前體細胞中 NF-κB 和 c-JNK 信號，從而刺激破骨細胞前體分化為成熟破骨細胞并促使其進一步活化[25]。另外，中和 RANKL 的抗體能抑制由前列腺素 E2、1，25-二羥基維生素 D3 和甲狀旁腺素誘導的骨吸收。
1.2.2 OPG
OPG 是 TNF 受體家族成員之一，主要功能為負調節破骨細胞的形成及骨吸收過程。OPG 包含 3 個結構域，第一個是 N 末端豐富的半胱氨酸結構域，是破骨形成抑制及半胱氨酸 400 介導的 OPG 二聚體化所必需的；第二結構域是肝素結合域，能與許多軟骨互動；第三個是對應于死亡域同源區，由 OPG 和 Fas 跨膜區組成的嵌合體蛋白，在細胞中的過度表達導致細胞凋亡。3 個結構域的數量和分布決定了 OPG 的生物活性。
OPG 作為一個可溶性受體，通過與 RANKL 結合來競爭性抑制 RANK 與 RANKL 的相互作用，從而抑制破骨細胞的分化和吸收，調節骨穩態。因此，OPG 和 RANKL 基因的平衡表達是調節骨密度的關鍵。Mizuno 等[26]通過基因敲除 OPG（OPG-/-）構建了第一個骨質疏松小鼠模型，研究結果證實 OPG 是抑制破骨細胞生成的一個關鍵因子。Bucay 等[27]發現 OPG-/-小鼠的骨質密度呈現明顯下降，其特征表現為較大的小梁骨和皮質骨孔隙度，顱骨明顯變薄，骨折發生率較高。此外，OPG 能夠抑制 Rho GTPase 信號傳導途徑基因的表達，進一步導致破骨細胞密封區的破壞，抑制骨吸收[28]。
1.3 其他影響骨吸收過程的蛋白因子
1.3.1 Rho GTPases
Rho GTPases 又稱為小 G 蛋白家族，習慣性稱為 Rho GTP 酶，是 Ras 超家族的一個亞家族，主要包括 Rho、Rac 和 Cdc42。Rho GTPases 可以影響破骨細胞的極性、遷移、囊泡和分裂等過程，同時可對破骨細胞的黏附、分化以及封閉區的形成產生影響，進而影響破骨細胞的功能[29]。
破骨細胞的封閉區結構是一個富含偽足的寬厚環，由富含 F-actin 及 CD44 的內核以及相關黏附蛋白組成，該結構能夠將破骨細胞牢固地與骨基質結合。研究表明，Rho GTPases 能夠參與維持偽足的穩定，從而保證破骨細胞封閉區結構不受影響，通過添加抑制劑降低 Rho 活性后，破骨細胞的封閉區將受到明顯破壞。
Rac1 是 Rho GTPases 的重要成員，在調控破骨細胞功能的過程中起著關鍵作用。研究表明 Rac1 基因敲除后小鼠骨密度、骨體積分數、骨小梁厚度均明顯提高，而小梁間體積降低，但破骨細胞的數量未發生明顯改變，說明 Rac1 主要是通過影響破骨細胞的功能來實現對骨量的調控。以 RNA 干擾下調 Rac1 后發現細胞的破骨分化受到影響，表現為封閉區完整性缺失以及細胞融合減少，說明 Rac1 能夠促進破骨細胞封閉區的形成以及破骨細胞的分化。Rac1 主要位于破骨細胞 F-actin 以及相關黏附蛋白周圍，局部注射 Rac1 有助于提高破骨細胞的遷移速率并促進封閉區的形成，而抑制 Rac1 則會導致 Vinculin 聚集失活并與 F-actin 解除聯系，從而影響細胞黏附與功能，說明 Rac1 可能通過對細胞黏附斑以及細胞骨架形成與解聚的影響調控破骨細胞的功能。
1.3.2 ILs
ILs 是骨改建過程中的一類重要調控因子，共有 33 種。其中 IL-3、IL-4、IL-10、IL-13 抑制破骨細胞的分化，IL-1、IL-6、IL-11 刺激破骨細胞的形成和增殖。
IL-1 可激活破骨細胞并影響破骨細胞的形成與增殖，但單獨的 IL-1 不能刺激破骨細胞前體細胞分化為破骨細胞，必須與 RANKL 協同作用才能誘導破骨細胞的形成。IL-1 通過增加 M-CSF 來促進骨吸收進程，而 M-CSF 與 M-CSF 受體結合將進一步激活 RANKL，促進破骨細胞前體分化為破骨細胞。
IL-6 主要來源于成骨細胞和基質細胞，其作用是促進破骨細胞增殖及提升骨吸收效率。IL-6 在骨改建中的具體作用是，首先刺激 RANKL 相關破骨細胞下游效應物——成骨細胞的產生；然后，所產生的效應物能以自分泌或旁分泌的方式直接激活破骨細胞活性。Palmqvist 等[30]研究表明，單獨的人源 IL-6 和可溶性 IL-6 受體均不能刺激骨吸收，但當兩者結合時，能顯著刺激骨外植體的礦化及基質釋放。
IL-11 與 IL-6 擁有許多類似的生物學特性，兩者通過一個共同的信號轉導因子糖蛋白 130 發揮作用[31]。IL-11 富含亮氨酸和脯氨酸，可通過抑制成骨細胞的活性進而抑制骨形成，同時還能刺激破骨細胞形成和增殖。
2 蛋白在骨形成過程中的作用機制
骨形成是一個成骨細胞鋪設形成新骨基質的過程，其中 MSCs 分化成骨是該過程的重要步驟。MSCs 分化為成骨細胞進而形成新骨組織是一個有序的過程，通過細胞增殖、分化、細胞外基質形成和礦化階段逐步進行。Kulterer 等[32]利用寡核苷酸芯片基因表達分析，證明了 MSCs 體外分化的特定時間，0～4 d 為增殖期，4～14 d 為基質成熟期，14～21 d 為成礦期。進一步研究發現，4～14 d 為成骨分化早期，14～21 d 為成骨分化晚期[33]。
在 MSCs 成骨分化過程中，蛋白因子骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、Ⅰ型膠原、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）等都參與了基質形成和礦化，其中 BALP、Ⅰ型膠原、BMP-2 是成骨分化早期標志物，OCN、OPN、BSP 則是晚期標志物 [34-36]。
2.1 成骨分化早期標志性蛋白質
2.1.1 BALP
BALP 是同型二聚體糖蛋白構成的一種胞外酶，合成于骨基質成熟階段，與成骨細胞和前成骨細胞活性成線性相關，被認為是最精確的骨形成標志物。1977 年 Fleisher 等[37]發現 ALP 活性在 11～14 歲青少年體內達到高峰，提示 ALP 可能促進早期骨骼的生長。1983 年 Canalis[38]體外研究表明，胎鼠顱骨中 ALP 的活性與膠原蛋白的產生率成正比。同年 Marie 等[39]的正常幼鼠體內研究顯示，ALP 的活性與成骨細胞數量成正相關。隨后研究發現，體外 BALP 的活性正調控骨骼膠原的形成[40]。綜上，可以將 BALP 作為骨骼組織中骨形成率的一個通用指標[41-42]。
此外，BALP 還是基質鈣化過程中的第一個參與因子，在骨基質成礦中主要通過調節無機磷酸鹽（Pi）和無機焦磷酸鹽（PPi）之間的平衡來刺激礦化。所以，常把 BALP 作為成骨分化早期的標志。一般認為 BALP 產生的 Pi 是形成羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）所需要的，但水解 PPi 達到一定的 Pi/PPi 比例也能實現 HA 晶體形成和生長，其確切的釋放機制仍不清楚[43]。
2.1.2 Ⅰ型膠原
Ⅰ型膠原是骨細胞外基質的主要有機成分，是早期骨祖細胞的標志物[44]。它由 3 條多肽鏈組成的右手螺旋分子組成，有 2 個相同的 α1 鏈和 1 個 α2 鏈，作為骨基質的主要結構蛋白，占骨膠原總量的 95%，骨組織總蛋白的 80%。甚至有研究認為正常骨基質僅含有Ⅰ型膠原[45]。1999 年 Jikko 等[46]發現Ⅰ型膠原的 mRNA 表達水平在骨形成早期上調，提示Ⅰ型膠原可能是成骨早期的標志物。2014 年 Twine 等[47]鑒定了包括Ⅰ型膠原在內的骨骼相關基因在 8 個時間點的表達情況，證實了Ⅰ型膠原是成骨分化的早期標志物。此外，研究表明 ALP 的表達取決于Ⅰ型膠原的產生量[48-49]。因此Ⅰ型膠原是成骨分化早期的另一標志物。
從作用機制上來說，Ⅰ型膠原通過增強成骨細胞蛋白激酶 C 的活性，刺激 MSCs 分化為成骨細胞；然后，成骨細胞從微環境中攝取所需的氨基酸，合成并分泌膠原纖維及有機質。此外，Ⅰ型膠原還可增加組織血管數量，減慢巨噬細胞及破骨細胞活性，達到減輕炎性反應的效果。由于其具有生物可降解性、生物相容性和低免疫原性，而被廣泛用作組織工程支架材料中，也可以作為涂層或增強材料與其他骨組織工程直接材料復合使用。
2.1.3 BMP-2
BMPs 是 TGF-β 超家族（TGF-βs）中的一種低分子量酸性糖蛋白，富含谷氨酸，其分子結構是由 2 個多肽鏈通過 1 個單一的二硫鍵結合而成的二聚體分子，與 HA 具有較高的親和性，是唯一能單獨誘導骨組織形成的蛋白質因子。因此常與骨組織工程支架材料復合使用，以調節成骨細胞分化和骨形成過程。
迄今為止，已經鑒定出 20 多種 BMPs，但只有幾種可以誘導新骨形成。目前發現 BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9 對成骨細胞分化和骨形成起著重要的促進作用，其中 BMP-2 是 BMPs 家族最有效的成骨促進因子，且主要影響 ALP 的活性，因此常作為早期成骨分化的標志物。
BMP-2 通過刺激 ALP 的活性，上調 Runx2、Ⅰ型膠原、OCN、BSP 等成骨特異性基因的表達，促進成骨分化進而增加骨形成。早期研究發現 BMP-2 通過 Smad 或 GR 依賴性信號傳導途徑，調控轉錄因子 Runx2 和鋅指結構轉錄因子 osterix，同源框基因 Dlx5 和 Msx2 的表達來調節 ALP 的轉錄。2010 年 Mikami 等[50]發現 BMP-2 和地塞米松在成骨分化的同一階段相同路徑促進 ALP 的表達，且這種協同作用是通過 JAK/STAT 信號通路完成的。另一方面，將 BMP-2 與 BMP 家族的其他蛋白聯合應用，可在一定程度上提升骨形成效率。
2.2 成骨分化晚期標志性蛋白質
OCN 和 OPN 是主要的非膠原蛋白，它們在骨骼的生物和機械功能中起著關鍵作用。在礦化過程的后期，它們直接或間接地控制骨骼質量、礦物大小和方向[51-53]。因此，這兩種蛋白因子都可以作為晚期礦化的標志物。
2.2.1 OCN
OCN 是繼膠原后的第二豐富蛋白，由于其在成骨晚期的表達隨細胞分化和基質礦化而增加，且具有調控骨礦物沉積和轉移的作用，因此作為礦化晚期的標志物使用。結構上，它是由 46～50 個氨基酸組成的相對分子質量為 6×103 的小蛋白質，含有 3 種維生素 K 依賴的 γ-羧基谷氨酸，其殘基具有較高的 Ca2+ 結合親和力，且能穩定 OCN 的 α-結構，使 OCN 能與 HA 結合在一起[54]。
盡管 OCN 在骨骼發育過程中起著至關重要的作用，且是多個領域骨骼形成和改建的標志物，但其確切的生理意義還未研究清楚。目前研究認為，OCN 具有促進成骨細胞分化成熟、骨細胞形成，維持骨正常礦化的作用。在 Rammelt 等[55]的研究中，OCN 能夠加速新形成的編織骨與內在骨組織的融合，在 OCN 復合 HA/膠原植入物周圍的界面處，骨特異性基質蛋白和多功能黏附蛋白表達增加，表明 OCN 可加速骨形成和再生。2017 年 Tsao 等[56]通過小干擾 RNA 沉默 OCN 后，礦物質的成熟被推遲，實驗組 HA 總量低于對照組，且 Runx2、ALP、Ⅰ型膠原等成骨相關基因的表達受抑制，從而證明了 OCN 對礦物質的成熟具有促進作用，并可調節 MSCs 的成骨分化。這與早期研究結果并不相符。1996 年 Ducy 等[57]在 OCN-/- 小鼠體內發現，長骨皮質厚度和密度隨著礦化骨基質數量的增加而增加，卵巢切除術前后的組織形態學表明，OCN 的缺失會導致骨形成的增加。相似的是，Bodine 等[58]在培養基中加入不同濃度的 OCN 培養成骨細胞，結果顯示 ALP 的活性隨 OCN 濃度的升高而降低，提示 OCN 抑制成骨細胞活性。這些研究表明，OCN 負調控骨形成過程。
2.2.2 OPN
OPN 也被稱為分泌磷蛋白 1，由 260～317 種氨基酸組成，相對分子質量為 33×103，是一種高度保守的多功能糖蛋白，主要沉積在細胞礦化組織表面的界膜處、骨質成礦位點及礦化前的有機物質中，通常被視為骨基質中細胞與 HA 的橋梁。研究發現，OPN 在骨改建中主要發揮 3 個方面的功能：調控骨細胞的黏附、調控基質礦化、調控破骨細胞的功能[59-60]。
OPN 在成骨細胞中原位存在，在軟骨內/膜內成骨過程中積聚在礦化骨基質中，通過增強成骨細胞的分化與增殖來增加 ALP 的活性。Kojima 等[61]通過重組腺病毒載 OPN 的 cDNA 轉染進入大鼠骨髓源成骨細胞的實驗，表明 OPN 過表達不僅能顯著提高 OCN 和 ALP 的表達，還能增強鈣結節的形成及 ALP 的活性。OPN 作為信號分子直接參與生物礦化過程，可直接結合到特定的磷灰石晶體表面，作為礦化抑制因子發揮作用。
此外，OPN 還通過刺激破骨細胞表面 CD44 的表達，促進破骨細胞黏附、遷移及骨吸收，同時作為細胞因子與 αⅤβ3 結合，激活非受體酪氨酸激酶和磷脂 3 羥基激酶，以刺激破骨細胞的信號傳導。
2.2.3 BSP
BSP 是 MSCs 成骨分化的晚期標志物，占骨骼和牙基質中非膠原蛋白的 8%～12%，由 281～327 種氨基酸組成，相對分子質量為（60～80）×103。Mizuno 等[62]將骨髓細胞培養在含抗 BSP 單克隆抗體的膠原基質中，結果顯示成骨表型的表達被抑制，但添加牛骨 BSP 后可消除抗體的效果，重新激發骨髓細胞成骨表型的表達。Gordon 等[63]發現小發夾 RNA 編碼質粒抑制 BSP 表達，同時也抑制成骨標志物的表達和鈣結節的形成，而體外成骨細胞過表達 BSP 能有效提高成骨分化及基質礦化，體內小鼠基因敲除實驗結果與體外一致[64]。進一步研究表明，成骨細胞過表達 BSP 可增強礦化作用，當加入抗 BSP 抗體后，成骨細胞則不表達 OCN 和 OPN 等成骨相關基因[65-66]。綜上，BSP 可作為標志物檢測晚期成骨分化。
同時，BSP 還是生物礦化和成骨分化的一個促進劑。這是因為 BSP 具有大量磷酸根和負電荷，可以與 Ca2+ 結合形成螯合物，參與膠原黏附、HA 成核和基質礦化等過程[67]。BSP 參與 HA 成核是由 BSP 中央區域的聚谷氨酸序列決定的，N-末端膠原結合域使 BSP 結合膠原來促進 HA 成核，C 末端的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序通過結合整合素，促進成骨分化和基質礦化。BSP 不僅能促進成骨細胞的分化與礦化，而且還與破骨細胞分化和過度活躍的骨吸收密切相關。
2.3 整合素
整合素是由 α 和 β 亞基組成的異二聚體黏附分子，通過裝配與細胞骨架相關的胞內蛋白質來控制黏著斑和細胞在細胞外基質上的附著。它是多種骨基質蛋白（Ⅰ型膠原、OPN、BMPs 等）的受體，包括膠原受體 α1β1/α2β1、層粘連蛋白受體 α3β1/α7β1、纖連蛋白受體 αⅤβ3/α4β1/α5β1、玻連蛋白受體 αⅤβ3/αⅤβ5 等。因此整合素可以通過介導細胞-基質之間的相互作用，促進成骨細胞遷移、增殖、存活及分化[68]。例如，α2β1 是Ⅰ型膠原的主要受體，調控著小鼠成骨細胞中膠原的合成；α4β1 通過促進成骨分化和骨形成，進而有效改善骨質疏松小鼠的骨密度；α5β1 具有增加小鼠骨形成及改善骨骼修復的作用等。此外，某些整合素也參與了細胞遷移以及破骨細胞黏附等生理過程。
3 基于蛋白質組學技術的其他成骨相關蛋白的發現
在骨改建過程中具有關鍵調控作用的蛋白質因子種類繁多，利用傳統的研究方法難以快速、全面地發現、鑒定并表征關鍵差異蛋白的結構、功能以及相關機制。隨著蛋白質組學技術的發展，上述問題有望得到解決。蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，利用一定技術手段在整體水平上揭示細胞內蛋白質的組成、結構、活動規律及其生物功能的科學，包括蛋白質的定性鑒定、定量分析、蛋白質加工修飾。根據蛋白質組學的研究策略，將蛋白質組學分為表達蛋白質組學、比較蛋白質組學和臨床蛋白質組學。其中比較蛋白質組學著重于研究不同時期細胞蛋白質的表達變化，或蛋白在不同環境下的差異表達，故其在各類疾病機制的揭示、藥物作用靶點的確定以及分子診斷等諸多方面發揮著重要作用。臨床蛋白質組學通過檢測不同病理過程中蛋白質種類和數量的變化，進而篩選到與疾病相關的生物標志物，為疾病病因和發病機制的揭示提供客觀依據。綜上，蛋白質組學方法是闡明蛋白質因子在骨改建中的功能及相關調控機制，以及檢測骨相關疾病生物標志物的有效手段。下面將對近年來利用蛋白質組學技術發現的幾類參與骨改建過程的差異蛋白進行介紹。
MSCs 成骨分化是一個復雜過程，涉及到成百上千的蛋白質，其中幾種具有明顯表達差異的蛋白，可能是成骨分化過程中的特異性標志因子。脂肪來源人 MSCs 中的Ⅰ型膠原、OCN、BMP-6、LIM 礦化蛋白 1（LIM mineralization protein-1，LAMP-1）直接與成骨途徑相關，由于前 3 種蛋白可用于檢測成骨分化過程，因此可以認為 LAMP-1 可能也是一個特異性標志蛋白[69]。另外，Granéli 等[70]在人 BMSCs 成骨成脂分化蛋白質譜中，發現 3 個特異性候選標志物——CD10、CD29、CRYaB（晶體蛋白 αB），其中 CRYaB 只在人 BMSCs 成骨分化中顯著增加，而對人 BMSCs 成脂、成軟骨分化無影響。
研究還發現，膜聯蛋白是 MSCs 成骨分化過程中的一類關鍵蛋白。2007 年 Zhang 等[71]對人 BMSCs 成骨分化過程中蛋白質的表達進行分析，揭示了 102 個蛋白位點的表達具有≥2 倍的差異，并成功鑒定出 52 個差異表達蛋白，其中膜聯蛋白 A1（annexin A1，ANXA1）的表達在第 3 天及第 7 天均下調。William 等[72]和 Ye 等[73]認為 ANXA1 參與調控了 BMSCs 的生長、分化和凋亡；另外 ANXA2 及 ANXAⅤ的表達量在第 3 天及第 7 天均增加，說明了 ANXA1、ANXA2 和 ANXAⅤ在 MSCs 成骨分化中可能存在不同的調控作用。周穎等[74]對 BMSCs 定向成骨誘導 0、1、7、14、21 d 的蛋白譜進行分析，結果顯示 ANXA2 的表達為不同程度的上調趨勢，進一步證實了其在成骨過程中具有促進作用。Kim 等[75]對人 BMSCs 成骨分化中分泌蛋白質的研究顯示，在成骨過程中，鈣穩態相關蛋白質的表達上調，包括 ANXA1 和 ANXA2，而 ANXA1 的表達與 Zhang 等[71]的結果相矛盾。在近年的研究中，Alves 等[76]證明了纖連蛋白 1、ANXA2 和核纖層蛋白 A/C 特異性調節成骨分化的不同階段，但其具體的作用機制并不清楚。隨后，Pan[77]等發現，沉默 ANXA1 可顯著抑制細胞外信號調節激酶 1/2 的磷酸化以及成骨相關基因（Runx2、OPN、OCN）的表達，并導致大鼠 BMSCs 成骨分化減少，確證了 ANXA1 可促進 BMSCs 的增殖和成骨分化。
雖然蛋白質組學技術能快速、全面地檢測成骨分化過程中的差異表達蛋白，但鑒定得到的成骨分化相關蛋白不一定是特異性表達蛋白，需通過蛋白質功能研究方法來進一步闡述。如 Kim 等[78]首次鑒定出 4 種與 MSCs 成骨分化相關的蛋白質——磷酸甘油變位酶 1、前折疊素 3、熱休克蛋白 27 kDa、β-肌動蛋白，但由于這些蛋白也可用作成骨細胞溶質生物標志物，因此均不能認為是成骨細胞特異性蛋白。
此外，不同 MSCs 分泌的細胞外基質在調節 MSCs 的成骨能力方面起著關鍵作用，細胞外基質蛋白的作用更多地指向調節細胞功能和骨形成相關的過程，如血管生成，而不是直接影響礦化[79]。
4 小結與展望
體內骨穩態是一個新骨與舊骨不斷更替的動態平衡過程，骨穩態平衡一旦失調，就會導致嚴重的骨代謝疾病，如骨質疏松、骨硬化病、風濕性關節炎等。骨改建是維持骨穩態的重要生物學過程，蛋白作為骨改建過程中的重要骨刺激因子, 調控著骨吸收與骨形成之間的平衡。
目前，骨代謝疾病的研究主要集中于發病機制及藥物治療方面，由于蛋白質是生理功能的執行者、生命現象的直接體現者，因此對蛋白質結構和功能的研究，將直接闡明機體在生理和病理條件下的變化機制，而理解骨改建過程中關鍵蛋白的分子結構及作用機制，是解決以上問題的基礎。
本文詳細綜述了破骨細胞主導的骨吸收過程中破骨細胞標志酶、骨吸收的主要信號因子、Rho GTPases 和 ILs 等蛋白因子的結構特點、作用機制及研究進展，同時也說明了成骨分化早期、晚期標志性蛋白及整合素在骨形成過程中的作用機制，但某些蛋白的生理意義尚存在爭議，還有待進一步研究確證。此外，還闡述了蛋白質組學技術在 MSCs 成骨分化中的研究應用，結合其他分子技術研究發現，LAMP-1、CRYaB、ANXA1、ANXA2、ANXAⅤ等蛋白對成骨分化具有促進作用，但確切的調控機制目前還不清楚。因此深入研究以上蛋白在骨改建過程中的具體作用，將有望闡明骨改建過程并揭示骨代謝疾病的分子機制，這對于進一步提高骨疾病的治療效果具有重要意義。