引用本文： 隋吉生, 邵國強, 張露露, 張朋俊, 卜婷, 姚慶強, 王黎明. 整合素αvβ3受體靶向顯像骨肉瘤和診治肺轉移的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(2): 170-176. doi: 10.7507/1002-1892.201808014 復制
骨肉瘤發病率和惡性程度高，預后極差，病理上多數為溶骨性，也有少數為成骨性，多發生于骨端，偶發生于骨干或骨骺，邊界確定和早期精準手術困難，術后 3～5 年存活率僅為 5%～20%，遠處受累主要是肺部轉移，早期發現和及時有效治療困難[1-2]。治療性核素89Sr、77Lu 通過類似于鈣離子的代謝方式濃聚于成骨活躍部位，有效射程內對成骨性病變部位腫瘤細胞、成骨細胞發揮殺傷作用，是治療成骨性惡性腫瘤及成骨性骨轉移瘤的理想選擇，但對骨代謝水平低的溶骨性腫瘤灶療效差[3]，對核素有效射程外的腫瘤細胞無效且對腫瘤細胞的作用缺乏靶向性，對非骨轉移灶腫瘤細胞無效，在原成骨轉移病灶緩解的同時尚難以預防和延緩新轉移灶的形成。如何有效確定骨肉瘤邊界和手術范圍，如何增加治療性核素在骨肉瘤及肺轉移灶的聚集來提高靶向治療療效，并預防新的轉移灶形成，是目前亟待解決的難題。整合素 αvβ3 在骨肉瘤腫瘤細胞、新生血管內皮細胞及破骨細胞表面高水平表達[4-5]，而在正常組織細胞、成熟血管內皮細胞表面表達水平極低，是骨肉瘤和肺轉移灶靶向診治的良好靶點。近年來研究合成的線性、環狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）三肽及含 RGD 三肽序列的多肽，可與整合素 αvβ3 特異性結合[6-7]。本實驗擬合成整合素 αvβ3 受體靶向的68Ga-NODAGA-RGD2 及177Lu-NODAGA-RGD2，并探討其對骨肉瘤及肺轉移性骨肉瘤的靶向顯像和治療價值。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
4～5 周齡雄性 BALB/C-nu/nu 裸鼠 41 只，體質量（18±2）g，由中國科學院上海動物研究所提供，實驗動物使用許可證批準號：SYXK（蘇）2016-0006，所有動物實驗均遵守南京醫科大學和南京醫科大學附屬醫院動物倫理委員會要求。人骨肉瘤細胞株 MG63（南京凱基生物科技發展有限公司）。
NODAGA-RGD2（ABX 公司，德國）；177LuCl2（中國同輻股份有限公司）；羊血清、嚙齒動物抗整合素 CD61 抗體、大鼠抗 CD31 抗體、Cy3 標記羊抗嚙齒動物二抗、FITC 標記羊抗大鼠二抗（BD Biosciences 公司，美國）；甲醇、乙腈（Merck 公司，美國）；10%FBS、基礎培養基（GIBCO 公司，美國）；0.25%EDTA-胰蛋白酶、PBS、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES）、HCl（南京凱基生物工程有限公司）。
鍺-鎵發生器（ITG 公司，德國）；LC-20AT 高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（島津公司，日本）；micro PET/CT 設備（Siemens 公司，德國）；nanoScan SPECT-CT 設備（Mediso 公司，匈牙利）；熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 68Ga-NODAGA-RGD2 及 177Lu-NODAGA-RGD2 的制備及體外穩定性觀測
用 HCl 淋洗鍺-鎵發生器獲得 GaC13 洗脫液，取 0.1 mL 洗脫液 （37 MBq/mL）置于含 10 μL NODAGA-RGD2（1 mg/mL）和 25 μL HERPS 液（pH 4.0）的反應體系中，震蕩混勻，100℃ 水浴 15 min，獲得68Ga-NODAGA-RGD2，測定其放射性比活度。
采用 Radio-HPLC 法對制備的68Ga-NODAGA-RGD2 進行質量控制。流動相 A 為含 0.1% 三氟醋酸去離子水，流動相 B 為含 0.1% 三氟醋酸的乙腈，流速 0.5 mL/min；流動相梯度：0～5 min，5%B；5～15 min，5%～40% B；15～25 min，40% B；25～30 min，40%～5% B，柱溫 20℃，20 μL 標記物樣品上樣，另取 0.5 mL 68Ga-NODAGA-RGD2 加入至 10% FBS，37℃ 恒溫箱中溫育 1、4、8 h，分別測定68Ga-NODAGA-RGD2 放射性化學純度，考察其體外穩定性。
177Lu-NODAGA-RGD2 的制備和質量控制方法同68Ga-NODAGA-RGD2，制備后置于 37℃ 恒溫箱中溫育 1、7、14 d，測定其放射性化學純度，考察其體外穩定性。
1.3 68Ga-NODAGA-RGD2 及 177Lu-NODAGA-RGD2 整合素 αvβ3 受體結合實驗
取 MG63 人骨肉瘤細胞，調整細胞密度為 5×107個/L，接種至 96 孔板，每孔 200 μL；分別加入 3.7 MBq 68Ga-NODAGA-RGD2、177Lu-NODAGA-RGD2 和不等量遞增（0.05、0.1、0.5、1.0、5、20、100 μg）NODAGA-RGD2 進行競爭結合，置于 37℃、5% CO2 培養箱內培養 4 h，棄游離未結合的68Ga-NODAGA-RGD2、177Lu-NODAGA-RGD2，培養基沖洗 3 次，收集細胞進行放射性測定，計算68Ga-NODAGA-RGD2、177Lu-NODAGA-RGD2 與人骨肉瘤細胞的半抑制濃度率（50% inhibitory concentration，IC50）值。
1.4 實驗方法
1.4.1 動物模型制備
取 41 只裸鼠異氟烷吸入麻醉后，將 MG63 人骨肉瘤細胞注射至 21 只裸鼠皮下，每只注射 5×106個細胞，構建皮下骨肉瘤模型；注射至 5 只脛骨髓腔內，每只注射 1×106個細胞，制備原位骨肉瘤模型；另 15 只經尾靜脈注入，每只注射 5×107個細胞，構建骨肉瘤肺轉移模型。
1.4.2 68Ga-NODAGA-RGD2 micro PET-CT 顯像
于以下時間點行68Ga-NODAGA-RGD2 microPET-CT 顯像，皮下骨肉瘤模型腫瘤直徑達 6 mm 時、原位骨肉瘤模型出現運動障礙或細胞注射 12 周時、骨肉瘤肺轉移模型細胞注射后 5、7、9 周，各取 5 只裸鼠。經尾靜脈注射 0.1 mL 68Ga-NODAGA-RGD2 （3.7 MBq），1 h 后行 micro PET-CT 顯像。掃描條件：電壓 80 kV、電流 500 μA、曝光時間 1 100 ms，掃描 CT 數據 10 min、采集 PET 數據 15 min。通過濾波反投影法重建冠狀面、橫斷面、矢狀面斷層圖像。其中皮下骨肉瘤模型、原位骨肉瘤模型及骨肉瘤肺轉移模型基于 micro PET/CT 融合圖像，勾畫感興趣區（region of interest，ROI）進行定量［標準化攝取值（standard uptake value，SUV）］和半定量［靶器官與非靶器官放射性攝取比值（target/nontarget，T/NT）］分析。其中原位骨肉瘤組裸鼠在顯像后過量麻醉處死，取脛骨部位的原位骨肉瘤組織行組織學及免疫組織化學染色觀察。
1.4.3 68Ga-NODAGA-RGD2 生物學分布實驗
取皮下骨肉瘤模型 16 只，其中 12 只經尾靜脈注射 0.1 mL68Ga-NODAGA-RGD2（0.37 MBq），作為實驗組；注射后 10、60、120 min 隨機取 4 只行心臟穿刺取血及頸椎脫臼處死，取腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、小腿肌肉、頂骨、股骨以及腫瘤組織，稱濕重并進行放射性計數，計算組織攝取占注射劑量百分比（%ID），最終獲得單位質量組織%ID（%ID/g），并計算組織放射性攝取比值［T/NT1（骨肉瘤/正常骨）及 T/NT2（骨肉瘤/小腿肌肉）］；同時取組織進行組織學及免疫組織化學染色觀察。其中注射后 120 min 處死的動物，收集大小便，乙腈提取后通過梯度 Radio-HPLC 檢查68Ga-NODAGA-RGD2 體內穩定性。
另外 4 只作為受體阻斷組（對照組），經尾靜脈注射68Ga-NODAGA-RGD2 前 10 min 注射冷化合物 NODAGA-RGD2（ 20 mg/kg ），尾靜脈注射后 60 min 處死，觀測方法同實驗組。
1.4.4 177Lu-NODAGA-RGD2 靶向治療骨肉瘤肺轉移
5 只骨肉瘤肺轉移模型細胞注射后 7 周行68Ga-NODAGA-RGD2 microPET-CT 顯像后（治療組），經尾靜脈注射 0.1 mL 177Lu-NODAGA-RGD2（370 MBq/mL），第 2 天行 SPECT-CT 顯像，第 2 周行 microPET-CT 顯像，對比評價治療效果。另取 5 只骨肉瘤肺轉移模型（擬定注射 9 周時顯像模型）在細胞注射后 7 周時，經尾靜脈注射生理鹽水 0.1 mL，作為空白對照組；同治療組行顯像處理。
1.4.5 組織學及免疫組織化學染色觀察
取 1.4.2 及 1.4.3 中獲得的原位骨肉瘤模型脛骨骨肉瘤組織以及骨肉瘤肺轉移模型的荷瘤肺組織，固定后石蠟包埋切片，片厚 5 μm，常規 HE 染色，鏡下觀察脛骨原位骨肉瘤及肺轉移灶腫瘤形成情況。
另取原位骨肉瘤模型的病理切片，羊血清封閉后加一抗嚙齒動物抗整合素 CD61 抗體（1∶100）和大鼠抗 CD31 抗體（1∶100）后，避光放置 4h，PBS 清洗，分別加 Cy3 標記羊抗-嚙齒動物二抗和熒光素（FITC）標記羊抗大鼠二抗，室溫下避光反應 4 h，PBS 清洗 3 次，甘油封片后，熒光顯微鏡下觀察原位骨肉瘤腫瘤細胞和新生血管內皮細胞整合素受體 β3 表達。腫瘤血管呈綠色（CD31），整合素 β3 表達陽性部分（包括腫瘤細胞和新生血管內皮細胞）呈紅色，圖像疊加后黃色表示新生血管內皮細胞。
1.5 統計學方法
采用 SPSS14.0 統計軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 68Ga-NODAGA-RGD2 和 177Lu-NODAGA-RGD2 體外理化性能
68Ga-NODAGA-RGD2 和177Lu-NODAGA-RGD2 的放射性比活度分別為（370.2±3.7）、（7 400.0±7.4） MBq/mL。體外穩定性實驗結果顯示，68Ga-NODAGA-RGD2 體外合成后 1、4、8 h，放射性化學純度分別為 98.5%±0.3%、98.3%±0.5%、97.9%±0.4%。177Lu-NODAGA-RGD2 體外合成后 1、7、14 d 放射性化學純度分別為 99.3%±0.7%、98.7%±1.2%、96.0%±2.8%。見圖 1。68Ga-NODAGA-RGD2 及177Lu-NODAGA-RGD2 整合素 αvβ3 受體結合實驗 IC50 值分別為（5.0±1.1）、（6.5±0.8）nmol/L。
圖1
Radio-HPLC 檢測
a. 體外合成后 4 h 的 68Ga-NODAGA-RGD2；b. 體外合成后 1 d 的 177Lu-NODAGA-RGD2
Figure1. Radio-HPLC resultsa. 68Ga-NODAGA-RGD2 at 4 hours after synthesis; b. 177Lu-NODAGA-RGD2 at 1 days after synthesis
2.2 68Ga-NODAGA-RGD2 micro PET-CT 顯像
皮下骨肉瘤模型及原位骨肉瘤模型均可見明顯68Ga-NODAGA-RGD2 濃聚，SUV 分別為 3.57±0.92 和 3.69±0.64，T/NT 分別為 8.5±2.7 和 9.5±2.7，兩種模型上述指標比較差異均無統計學意義（t=1.322，P=0.217；t=0.751，P=0.330）。
骨肉瘤肺轉移模型 5 周時 microPET-CT 顯像呈陰性，7 周時肺轉移灶可通過整合素受體靶向顯像探測，而 CT 仍為陰性；9 周時肺轉移灶表現為 CT 軟組織密度影伴肺內多灶性異常放射性濃聚影，部分相連呈片狀，縱膈淋巴結部位亦可見明顯異常放射性濃聚影。見圖 2。
圖2
68Ga-NODAGA-RGD2 microPET-CT 顯像觀察
a、b. 皮下骨肉瘤模型；c. 原位骨肉瘤模型；d. 骨肉瘤肺轉移模型注射 9 周
Figure2. 68Ga-NODAGA-RGD2 microPET-CT imagesa, b. Animal model bearing subcutaneous osteosarcoma; c. Animal model bearing osteosarcoma in tibia; d. Animal model bearing pulmonary metastatic osteosarcoma at 9 weeks after animal model establishment
2.3 68Ga-NODAGA-RGD2 生物學分布實驗
兩組各時間點體內生物學分布結果見表 1。實驗組68Ga-NODAGA-RGD2 經尾靜脈注射后從血液、心及肺中清除迅速，肝臟攝取、排泄快，在腎臟分布最高，但清除迅速；注射后 10、60、120 min 腫瘤放射性攝取分別為（2.68±0.19）、（3.57±0.92）、（3.85±0.84）%ID/g，T/NT1 及 T/NT2 分別為 10.5±1.0 和 13.8±1.39；60 min 與 120 min 時腫瘤放射性攝取均顯著高于 10 min 時（P<0.05），但 60 min 與 120 min 差異無統計學意義（P>0.05）。實驗組 60 min 時腫瘤放射性攝取顯著高于對照組 60 min 時，比較差異有統計學意義（t=3.572，P=0.008）。
表1
皮下骨肉瘤模型尾靜脈注射68Ga-NODAGA-RGD2 后體內生物學分布（%ID/g）
Table1.
Biodistribution of 68Ga-NODAGA-RGD2 after tail vein injection in animal model bearing subcutaneous osteosarcoma
實驗組注射 120 min 體內穩定性測量顯示，尿液和糞便中68Ga-NODAGA-RGD2 脫標率為 1.1%±0.8% 和 2.3%±0.5%。
2.4 177Lu-NODAGA-RGD2 靶向治療骨肉瘤肺轉移
治療組給藥后第 2 天肺部病灶及淋巴結轉移灶可見放射性177Lu-NODAGA-RGD2 攝取增加，相應轉移灶在 CT 上可見軟組織密度影；第 2 周，經靶向治療后肺部轉移病灶及縱膈淋巴結轉移較空白對照組明顯減少。見圖 3。
圖3
177Lu-NODAGA-RGD2靶向治療前后骨肉瘤肺轉移模型觀察
a. 治療組給藥后第 2 天 SPECT-CT 融合顯像觀察肺轉移灶對靶向藥物攝取；b. 治療組給藥后第 2 天 CT 觀察肺轉移灶大小；c. 治療組給藥后第 2 周 microPET-CT 顯像觀察靶向治療效果；d. 空白對照組 microPET-CT 顯像
Figure3. Investigation of therapeutic effect of 177Lu-NODAGA-RGD2 for animal model bearing pulmonary metastatic osteosarcomaa. SPECT-CT fusion images to study lesion uptake of 177Lu-NODAGA-RGD2 in pulmonary metastatic sites on the 2nd day in treatment group. b. CT images to display the tumor size of pulmonary metastasis; c. microPET-CT images to demonstrate therapeutic effect at 2nd week after endoradiotherapy in treatment group; d. microPET-CT images in control group
2.5 組織學及免疫組織化學染色觀察
HE 染色：原位骨肉瘤模型可見脛骨內大量骨肉瘤腫瘤細胞存在，部分可見明顯骨質破壞；骨肉瘤肺轉移模型的荷瘤肺組織內可見大量散在骨肉瘤灶，部分相互融合呈較大病灶。見圖 4。免疫組織化學染色：原位骨肉瘤模型可見腫瘤細胞及新生血管內皮細胞高豐度表達整合素受體 β3。見圖 5。
圖4
組織學觀察（HE×20）
a. 原位骨肉瘤模型；b. 骨肉瘤肺轉移模型
Figure4. Histological observation (HE×20)a. Animal model bearing osteosarcoma in tibia; b. Animal bearing pulmonary metastatic osteosarcoma
圖5
原位骨肉瘤模型免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右分別為 β3、CD31 和融合圖像
Figure5. Immunohistochemistry observation of tumor tissues from animal model bearing osteosarcoma in tibia（×100）From left to right for β3、CD31, and overlay images，respectively
3 討論
整合素 αvβ3 作為一種跨膜糖蛋白，在骨肉瘤細胞等腫瘤細胞及其新生血管內皮細胞、破骨細胞表面高表達，放射性核素標記 RGD 作為其特異性配體，在骨肉瘤及其轉移灶的靶向診治領域具有潛在應用優勢[7]。而且，配體通過配基的多價性增加整合素 αvβ3 受體局部 RGD 濃度是其主要機制，即 RGD 多聚體中一個配基與腫瘤細胞整合素 αvβ3 的靶向結合將顯著增加鄰近整合素 αvβ3 周圍 RGD 配基濃度，從而加速與整合素 αvβ3 的結合并減緩解離。如放射性核素標記 RGD2 與整合素 αvβ3 的親和力及在腫瘤的靶向分布比 RGD 單體高出 1 個數量級[8-9]。本研究制備的整合素 αvβ3 受體靶向顯像劑68Ga-NODAGA-RGD2 和靶向治療性藥物177Lu-NODAGA-RGD2，體外實驗結果顯示穩定性較好，尤其是177Lu-NODAGA-RGD2，在標記后 14 d 仍具有較好的穩定性，為治療提供了保障。而且兩種放射性藥物均具有較好的整合素 αvβ3 受體靶向特異性和親和性，為體內生物學分布實驗和動物顯像所證實。
手術是臨床治療骨肉瘤的主要手段，腫瘤邊界和手術切除范圍的確定及全身情況評估決定了預后，早期發現和臨床分期對治療方案的制定至關重要。基于解剖結構的影像檢測手段對疾病的發現常常遲于代謝水平的改變，且常規顯像常難以評價全身情況。PET 顯像基于分子水平的變化，早于 CT 影像的異常，且常規一次給藥可完成全身檢查，對原發、復發、轉移灶的全面評估具有一定優勢。本研究結果均顯示相應病灶對68Ga-NODAGA-RGD2 的異常濃聚。68Ga-NODAGA-RGD2 生物學分布和顯像結果顯示其在正常骨骼組織中的分布極低，而在骨肉瘤可見明顯聚集，腫瘤與周圍正常組織（如骨骼）放射性攝取比值較高，對骨肉瘤邊界的精確勾畫具有潛在應用優勢，預期可通過整合素 αvβ3 受體靶向顯像指導骨肉瘤根治性手術。
本研究中骨肉瘤肺轉移動物實驗結果顯示，整合素 αvβ3 受體靶向顯像可早期有效探測骨肉瘤肺轉移灶和淋巴結轉移灶，具有較高靈敏度，而且肺轉移灶的形成與骨肉瘤細胞注射時間密切相關，提示整合素 αvβ3 受體靶向顯像可動態監測病情進展。如本研究結果所示，早期骨肉瘤肺轉移灶較小時，對68Ga-NODAGA-RGD2 的放射性攝取較低，考慮一方面與腫瘤體積小所致腫瘤細胞表面表達整合素 αvβ3 較少有關，另一方面與腫瘤微小轉移灶所需營養和氧氣靠周圍組織液供應，新生血管和新生血管內皮細胞密度低所致整合素 αvβ3 表達低；最后，還可能與 microPET-CT 空間分辨率的局限性有關。在骨肉瘤肺轉移模型構建 7 周時，68Ga-NODAGA-RGD2 顯像可有效探測骨肉瘤肺轉移灶，明顯早于 CT 顯像，提示68Ga-NODAGA-RGD2 受體靶向 PET 顯像對骨肉瘤肺轉移灶的早期診斷具有顯著優勢。
目前，骨肉瘤及其肺轉移尚無有效的治療方案，預后爭議也較多[10-13]，轉移灶表面高表達的整合素 αvβ3 受體為其靶向治療提供了良好選擇，如整合素 αvβ3 受體靶向 RGD 多肽介導化療具有良好的靶向性[14-18]。而且正常肺組織整合素 αvβ3 受體表達極低甚至陰性，177Lu 是理想的治療性放射性核素，177 Lu 的半衰期為 6.7 d，發射的 β-粒子平均能量為 133 keV，平均射程（670 μm）內生物學作用強，還發射能量為 113 keV 和 208 keV 的 γ 射線，可用于顯像監測和指導治療過程，尤其是對骨肉瘤細胞，具有一定治療效果[19]。本研究結果顯示 177Lu-NODAGA-RGD2 microSPECT-CT 與68Ga-NODAGA-RGD2 具有類似的體內分布特點，肺轉移灶部位均具有明顯放射性攝取，且177Lu 的 SPECT-CT 顯像可用于定量分析，可能有利于骨肉瘤肺轉移灶的靶向診療一體化[20-21]，除了發揮病情分期作用外，在整合素 αvβ3 受體靶向內放射性治療的適應證選擇方面具有一定價值。177Lu-NODAGA-RGD2 顯像本身也可以作為實時評估療效的重要依據。本研究結果為177Lu-NODAGA-RGD2 用于骨肉瘤肺轉移的靶向治療奠定了實驗基礎。
骨肉瘤發病率和惡性程度高，預后極差，病理上多數為溶骨性，也有少數為成骨性，多發生于骨端，偶發生于骨干或骨骺，邊界確定和早期精準手術困難，術后 3～5 年存活率僅為 5%～20%，遠處受累主要是肺部轉移，早期發現和及時有效治療困難[1-2]。治療性核素89Sr、77Lu 通過類似于鈣離子的代謝方式濃聚于成骨活躍部位，有效射程內對成骨性病變部位腫瘤細胞、成骨細胞發揮殺傷作用，是治療成骨性惡性腫瘤及成骨性骨轉移瘤的理想選擇，但對骨代謝水平低的溶骨性腫瘤灶療效差[3]，對核素有效射程外的腫瘤細胞無效且對腫瘤細胞的作用缺乏靶向性，對非骨轉移灶腫瘤細胞無效，在原成骨轉移病灶緩解的同時尚難以預防和延緩新轉移灶的形成。如何有效確定骨肉瘤邊界和手術范圍，如何增加治療性核素在骨肉瘤及肺轉移灶的聚集來提高靶向治療療效，并預防新的轉移灶形成，是目前亟待解決的難題。整合素 αvβ3 在骨肉瘤腫瘤細胞、新生血管內皮細胞及破骨細胞表面高水平表達[4-5]，而在正常組織細胞、成熟血管內皮細胞表面表達水平極低，是骨肉瘤和肺轉移灶靶向診治的良好靶點。近年來研究合成的線性、環狀精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）三肽及含 RGD 三肽序列的多肽，可與整合素 αvβ3 特異性結合[6-7]。本實驗擬合成整合素 αvβ3 受體靶向的68Ga-NODAGA-RGD2 及177Lu-NODAGA-RGD2，并探討其對骨肉瘤及肺轉移性骨肉瘤的靶向顯像和治療價值。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
4～5 周齡雄性 BALB/C-nu/nu 裸鼠 41 只，體質量（18±2）g，由中國科學院上海動物研究所提供，實驗動物使用許可證批準號：SYXK（蘇）2016-0006，所有動物實驗均遵守南京醫科大學和南京醫科大學附屬醫院動物倫理委員會要求。人骨肉瘤細胞株 MG63（南京凱基生物科技發展有限公司）。
NODAGA-RGD2（ABX 公司，德國）；177LuCl2（中國同輻股份有限公司）；羊血清、嚙齒動物抗整合素 CD61 抗體、大鼠抗 CD31 抗體、Cy3 標記羊抗嚙齒動物二抗、FITC 標記羊抗大鼠二抗（BD Biosciences 公司，美國）；甲醇、乙腈（Merck 公司，美國）；10%FBS、基礎培養基（GIBCO 公司，美國）；0.25%EDTA-胰蛋白酶、PBS、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，HEPES）、HCl（南京凱基生物工程有限公司）。
鍺-鎵發生器（ITG 公司，德國）；LC-20AT 高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（島津公司，日本）；micro PET/CT 設備（Siemens 公司，德國）；nanoScan SPECT-CT 設備（Mediso 公司，匈牙利）；熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 68Ga-NODAGA-RGD2 及 177Lu-NODAGA-RGD2 的制備及體外穩定性觀測
用 HCl 淋洗鍺-鎵發生器獲得 GaC13 洗脫液，取 0.1 mL 洗脫液 （37 MBq/mL）置于含 10 μL NODAGA-RGD2（1 mg/mL）和 25 μL HERPS 液（pH 4.0）的反應體系中，震蕩混勻，100℃ 水浴 15 min，獲得68Ga-NODAGA-RGD2，測定其放射性比活度。
采用 Radio-HPLC 法對制備的68Ga-NODAGA-RGD2 進行質量控制。流動相 A 為含 0.1% 三氟醋酸去離子水，流動相 B 為含 0.1% 三氟醋酸的乙腈，流速 0.5 mL/min；流動相梯度：0～5 min，5%B；5～15 min，5%～40% B；15～25 min，40% B；25～30 min，40%～5% B，柱溫 20℃，20 μL 標記物樣品上樣，另取 0.5 mL 68Ga-NODAGA-RGD2 加入至 10% FBS，37℃ 恒溫箱中溫育 1、4、8 h，分別測定68Ga-NODAGA-RGD2 放射性化學純度，考察其體外穩定性。
177Lu-NODAGA-RGD2 的制備和質量控制方法同68Ga-NODAGA-RGD2，制備后置于 37℃ 恒溫箱中溫育 1、7、14 d，測定其放射性化學純度，考察其體外穩定性。
1.3 68Ga-NODAGA-RGD2 及 177Lu-NODAGA-RGD2 整合素 αvβ3 受體結合實驗
取 MG63 人骨肉瘤細胞，調整細胞密度為 5×107個/L，接種至 96 孔板，每孔 200 μL；分別加入 3.7 MBq 68Ga-NODAGA-RGD2、177Lu-NODAGA-RGD2 和不等量遞增（0.05、0.1、0.5、1.0、5、20、100 μg）NODAGA-RGD2 進行競爭結合，置于 37℃、5% CO2 培養箱內培養 4 h，棄游離未結合的68Ga-NODAGA-RGD2、177Lu-NODAGA-RGD2，培養基沖洗 3 次，收集細胞進行放射性測定，計算68Ga-NODAGA-RGD2、177Lu-NODAGA-RGD2 與人骨肉瘤細胞的半抑制濃度率（50% inhibitory concentration，IC50）值。
1.4 實驗方法
1.4.1 動物模型制備
取 41 只裸鼠異氟烷吸入麻醉后，將 MG63 人骨肉瘤細胞注射至 21 只裸鼠皮下，每只注射 5×106個細胞，構建皮下骨肉瘤模型；注射至 5 只脛骨髓腔內，每只注射 1×106個細胞，制備原位骨肉瘤模型；另 15 只經尾靜脈注入，每只注射 5×107個細胞，構建骨肉瘤肺轉移模型。
1.4.2 68Ga-NODAGA-RGD2 micro PET-CT 顯像
于以下時間點行68Ga-NODAGA-RGD2 microPET-CT 顯像，皮下骨肉瘤模型腫瘤直徑達 6 mm 時、原位骨肉瘤模型出現運動障礙或細胞注射 12 周時、骨肉瘤肺轉移模型細胞注射后 5、7、9 周，各取 5 只裸鼠。經尾靜脈注射 0.1 mL 68Ga-NODAGA-RGD2 （3.7 MBq），1 h 后行 micro PET-CT 顯像。掃描條件：電壓 80 kV、電流 500 μA、曝光時間 1 100 ms，掃描 CT 數據 10 min、采集 PET 數據 15 min。通過濾波反投影法重建冠狀面、橫斷面、矢狀面斷層圖像。其中皮下骨肉瘤模型、原位骨肉瘤模型及骨肉瘤肺轉移模型基于 micro PET/CT 融合圖像，勾畫感興趣區（region of interest，ROI）進行定量［標準化攝取值（standard uptake value，SUV）］和半定量［靶器官與非靶器官放射性攝取比值（target/nontarget，T/NT）］分析。其中原位骨肉瘤組裸鼠在顯像后過量麻醉處死，取脛骨部位的原位骨肉瘤組織行組織學及免疫組織化學染色觀察。
1.4.3 68Ga-NODAGA-RGD2 生物學分布實驗
取皮下骨肉瘤模型 16 只，其中 12 只經尾靜脈注射 0.1 mL68Ga-NODAGA-RGD2（0.37 MBq），作為實驗組；注射后 10、60、120 min 隨機取 4 只行心臟穿刺取血及頸椎脫臼處死，取腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、小腿肌肉、頂骨、股骨以及腫瘤組織，稱濕重并進行放射性計數，計算組織攝取占注射劑量百分比（%ID），最終獲得單位質量組織%ID（%ID/g），并計算組織放射性攝取比值［T/NT1（骨肉瘤/正常骨）及 T/NT2（骨肉瘤/小腿肌肉）］；同時取組織進行組織學及免疫組織化學染色觀察。其中注射后 120 min 處死的動物，收集大小便，乙腈提取后通過梯度 Radio-HPLC 檢查68Ga-NODAGA-RGD2 體內穩定性。
另外 4 只作為受體阻斷組（對照組），經尾靜脈注射68Ga-NODAGA-RGD2 前 10 min 注射冷化合物 NODAGA-RGD2（ 20 mg/kg ），尾靜脈注射后 60 min 處死，觀測方法同實驗組。
1.4.4 177Lu-NODAGA-RGD2 靶向治療骨肉瘤肺轉移
5 只骨肉瘤肺轉移模型細胞注射后 7 周行68Ga-NODAGA-RGD2 microPET-CT 顯像后（治療組），經尾靜脈注射 0.1 mL 177Lu-NODAGA-RGD2（370 MBq/mL），第 2 天行 SPECT-CT 顯像，第 2 周行 microPET-CT 顯像，對比評價治療效果。另取 5 只骨肉瘤肺轉移模型（擬定注射 9 周時顯像模型）在細胞注射后 7 周時，經尾靜脈注射生理鹽水 0.1 mL，作為空白對照組；同治療組行顯像處理。
1.4.5 組織學及免疫組織化學染色觀察
取 1.4.2 及 1.4.3 中獲得的原位骨肉瘤模型脛骨骨肉瘤組織以及骨肉瘤肺轉移模型的荷瘤肺組織，固定后石蠟包埋切片，片厚 5 μm，常規 HE 染色，鏡下觀察脛骨原位骨肉瘤及肺轉移灶腫瘤形成情況。
另取原位骨肉瘤模型的病理切片，羊血清封閉后加一抗嚙齒動物抗整合素 CD61 抗體（1∶100）和大鼠抗 CD31 抗體（1∶100）后，避光放置 4h，PBS 清洗，分別加 Cy3 標記羊抗-嚙齒動物二抗和熒光素（FITC）標記羊抗大鼠二抗，室溫下避光反應 4 h，PBS 清洗 3 次，甘油封片后，熒光顯微鏡下觀察原位骨肉瘤腫瘤細胞和新生血管內皮細胞整合素受體 β3 表達。腫瘤血管呈綠色（CD31），整合素 β3 表達陽性部分（包括腫瘤細胞和新生血管內皮細胞）呈紅色，圖像疊加后黃色表示新生血管內皮細胞。
1.5 統計學方法
采用 SPSS14.0 統計軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 68Ga-NODAGA-RGD2 和 177Lu-NODAGA-RGD2 體外理化性能
68Ga-NODAGA-RGD2 和177Lu-NODAGA-RGD2 的放射性比活度分別為（370.2±3.7）、（7 400.0±7.4） MBq/mL。體外穩定性實驗結果顯示，68Ga-NODAGA-RGD2 體外合成后 1、4、8 h，放射性化學純度分別為 98.5%±0.3%、98.3%±0.5%、97.9%±0.4%。177Lu-NODAGA-RGD2 體外合成后 1、7、14 d 放射性化學純度分別為 99.3%±0.7%、98.7%±1.2%、96.0%±2.8%。見圖 1。68Ga-NODAGA-RGD2 及177Lu-NODAGA-RGD2 整合素 αvβ3 受體結合實驗 IC50 值分別為（5.0±1.1）、（6.5±0.8）nmol/L。
圖1
Radio-HPLC 檢測
a. 體外合成后 4 h 的 68Ga-NODAGA-RGD2；b. 體外合成后 1 d 的 177Lu-NODAGA-RGD2
Figure1. Radio-HPLC resultsa. 68Ga-NODAGA-RGD2 at 4 hours after synthesis; b. 177Lu-NODAGA-RGD2 at 1 days after synthesis
2.2 68Ga-NODAGA-RGD2 micro PET-CT 顯像
皮下骨肉瘤模型及原位骨肉瘤模型均可見明顯68Ga-NODAGA-RGD2 濃聚，SUV 分別為 3.57±0.92 和 3.69±0.64，T/NT 分別為 8.5±2.7 和 9.5±2.7，兩種模型上述指標比較差異均無統計學意義（t=1.322，P=0.217；t=0.751，P=0.330）。
骨肉瘤肺轉移模型 5 周時 microPET-CT 顯像呈陰性，7 周時肺轉移灶可通過整合素受體靶向顯像探測，而 CT 仍為陰性；9 周時肺轉移灶表現為 CT 軟組織密度影伴肺內多灶性異常放射性濃聚影，部分相連呈片狀，縱膈淋巴結部位亦可見明顯異常放射性濃聚影。見圖 2。
圖2
68Ga-NODAGA-RGD2 microPET-CT 顯像觀察
a、b. 皮下骨肉瘤模型；c. 原位骨肉瘤模型；d. 骨肉瘤肺轉移模型注射 9 周
Figure2. 68Ga-NODAGA-RGD2 microPET-CT imagesa, b. Animal model bearing subcutaneous osteosarcoma; c. Animal model bearing osteosarcoma in tibia; d. Animal model bearing pulmonary metastatic osteosarcoma at 9 weeks after animal model establishment
2.3 68Ga-NODAGA-RGD2 生物學分布實驗
兩組各時間點體內生物學分布結果見表 1。實驗組68Ga-NODAGA-RGD2 經尾靜脈注射后從血液、心及肺中清除迅速，肝臟攝取、排泄快，在腎臟分布最高，但清除迅速；注射后 10、60、120 min 腫瘤放射性攝取分別為（2.68±0.19）、（3.57±0.92）、（3.85±0.84）%ID/g，T/NT1 及 T/NT2 分別為 10.5±1.0 和 13.8±1.39；60 min 與 120 min 時腫瘤放射性攝取均顯著高于 10 min 時（P<0.05），但 60 min 與 120 min 差異無統計學意義（P>0.05）。實驗組 60 min 時腫瘤放射性攝取顯著高于對照組 60 min 時，比較差異有統計學意義（t=3.572，P=0.008）。
表1
皮下骨肉瘤模型尾靜脈注射68Ga-NODAGA-RGD2 后體內生物學分布（%ID/g）
Table1.
Biodistribution of 68Ga-NODAGA-RGD2 after tail vein injection in animal model bearing subcutaneous osteosarcoma
實驗組注射 120 min 體內穩定性測量顯示，尿液和糞便中68Ga-NODAGA-RGD2 脫標率為 1.1%±0.8% 和 2.3%±0.5%。
2.4 177Lu-NODAGA-RGD2 靶向治療骨肉瘤肺轉移
治療組給藥后第 2 天肺部病灶及淋巴結轉移灶可見放射性177Lu-NODAGA-RGD2 攝取增加，相應轉移灶在 CT 上可見軟組織密度影；第 2 周，經靶向治療后肺部轉移病灶及縱膈淋巴結轉移較空白對照組明顯減少。見圖 3。
圖3
177Lu-NODAGA-RGD2靶向治療前后骨肉瘤肺轉移模型觀察
a. 治療組給藥后第 2 天 SPECT-CT 融合顯像觀察肺轉移灶對靶向藥物攝取；b. 治療組給藥后第 2 天 CT 觀察肺轉移灶大小；c. 治療組給藥后第 2 周 microPET-CT 顯像觀察靶向治療效果；d. 空白對照組 microPET-CT 顯像
Figure3. Investigation of therapeutic effect of 177Lu-NODAGA-RGD2 for animal model bearing pulmonary metastatic osteosarcomaa. SPECT-CT fusion images to study lesion uptake of 177Lu-NODAGA-RGD2 in pulmonary metastatic sites on the 2nd day in treatment group. b. CT images to display the tumor size of pulmonary metastasis; c. microPET-CT images to demonstrate therapeutic effect at 2nd week after endoradiotherapy in treatment group; d. microPET-CT images in control group
2.5 組織學及免疫組織化學染色觀察
HE 染色：原位骨肉瘤模型可見脛骨內大量骨肉瘤腫瘤細胞存在，部分可見明顯骨質破壞；骨肉瘤肺轉移模型的荷瘤肺組織內可見大量散在骨肉瘤灶，部分相互融合呈較大病灶。見圖 4。免疫組織化學染色：原位骨肉瘤模型可見腫瘤細胞及新生血管內皮細胞高豐度表達整合素受體 β3。見圖 5。
圖4
組織學觀察（HE×20）
a. 原位骨肉瘤模型；b. 骨肉瘤肺轉移模型
Figure4. Histological observation (HE×20)a. Animal model bearing osteosarcoma in tibia; b. Animal bearing pulmonary metastatic osteosarcoma
圖5
原位骨肉瘤模型免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右分別為 β3、CD31 和融合圖像
Figure5. Immunohistochemistry observation of tumor tissues from animal model bearing osteosarcoma in tibia（×100）From left to right for β3、CD31, and overlay images，respectively
3 討論
整合素 αvβ3 作為一種跨膜糖蛋白，在骨肉瘤細胞等腫瘤細胞及其新生血管內皮細胞、破骨細胞表面高表達，放射性核素標記 RGD 作為其特異性配體，在骨肉瘤及其轉移灶的靶向診治領域具有潛在應用優勢[7]。而且，配體通過配基的多價性增加整合素 αvβ3 受體局部 RGD 濃度是其主要機制，即 RGD 多聚體中一個配基與腫瘤細胞整合素 αvβ3 的靶向結合將顯著增加鄰近整合素 αvβ3 周圍 RGD 配基濃度，從而加速與整合素 αvβ3 的結合并減緩解離。如放射性核素標記 RGD2 與整合素 αvβ3 的親和力及在腫瘤的靶向分布比 RGD 單體高出 1 個數量級[8-9]。本研究制備的整合素 αvβ3 受體靶向顯像劑68Ga-NODAGA-RGD2 和靶向治療性藥物177Lu-NODAGA-RGD2，體外實驗結果顯示穩定性較好，尤其是177Lu-NODAGA-RGD2，在標記后 14 d 仍具有較好的穩定性，為治療提供了保障。而且兩種放射性藥物均具有較好的整合素 αvβ3 受體靶向特異性和親和性，為體內生物學分布實驗和動物顯像所證實。
手術是臨床治療骨肉瘤的主要手段，腫瘤邊界和手術切除范圍的確定及全身情況評估決定了預后，早期發現和臨床分期對治療方案的制定至關重要。基于解剖結構的影像檢測手段對疾病的發現常常遲于代謝水平的改變，且常規顯像常難以評價全身情況。PET 顯像基于分子水平的變化，早于 CT 影像的異常，且常規一次給藥可完成全身檢查，對原發、復發、轉移灶的全面評估具有一定優勢。本研究結果均顯示相應病灶對68Ga-NODAGA-RGD2 的異常濃聚。68Ga-NODAGA-RGD2 生物學分布和顯像結果顯示其在正常骨骼組織中的分布極低，而在骨肉瘤可見明顯聚集，腫瘤與周圍正常組織（如骨骼）放射性攝取比值較高，對骨肉瘤邊界的精確勾畫具有潛在應用優勢，預期可通過整合素 αvβ3 受體靶向顯像指導骨肉瘤根治性手術。
本研究中骨肉瘤肺轉移動物實驗結果顯示，整合素 αvβ3 受體靶向顯像可早期有效探測骨肉瘤肺轉移灶和淋巴結轉移灶，具有較高靈敏度，而且肺轉移灶的形成與骨肉瘤細胞注射時間密切相關，提示整合素 αvβ3 受體靶向顯像可動態監測病情進展。如本研究結果所示，早期骨肉瘤肺轉移灶較小時，對68Ga-NODAGA-RGD2 的放射性攝取較低，考慮一方面與腫瘤體積小所致腫瘤細胞表面表達整合素 αvβ3 較少有關，另一方面與腫瘤微小轉移灶所需營養和氧氣靠周圍組織液供應，新生血管和新生血管內皮細胞密度低所致整合素 αvβ3 表達低；最后，還可能與 microPET-CT 空間分辨率的局限性有關。在骨肉瘤肺轉移模型構建 7 周時，68Ga-NODAGA-RGD2 顯像可有效探測骨肉瘤肺轉移灶，明顯早于 CT 顯像，提示68Ga-NODAGA-RGD2 受體靶向 PET 顯像對骨肉瘤肺轉移灶的早期診斷具有顯著優勢。
目前，骨肉瘤及其肺轉移尚無有效的治療方案，預后爭議也較多[10-13]，轉移灶表面高表達的整合素 αvβ3 受體為其靶向治療提供了良好選擇，如整合素 αvβ3 受體靶向 RGD 多肽介導化療具有良好的靶向性[14-18]。而且正常肺組織整合素 αvβ3 受體表達極低甚至陰性，177Lu 是理想的治療性放射性核素，177 Lu 的半衰期為 6.7 d，發射的 β-粒子平均能量為 133 keV，平均射程（670 μm）內生物學作用強，還發射能量為 113 keV 和 208 keV 的 γ 射線，可用于顯像監測和指導治療過程，尤其是對骨肉瘤細胞，具有一定治療效果[19]。本研究結果顯示 177Lu-NODAGA-RGD2 microSPECT-CT 與68Ga-NODAGA-RGD2 具有類似的體內分布特點，肺轉移灶部位均具有明顯放射性攝取，且177Lu 的 SPECT-CT 顯像可用于定量分析，可能有利于骨肉瘤肺轉移灶的靶向診療一體化[20-21]，除了發揮病情分期作用外，在整合素 αvβ3 受體靶向內放射性治療的適應證選擇方面具有一定價值。177Lu-NODAGA-RGD2 顯像本身也可以作為實時評估療效的重要依據。本研究結果為177Lu-NODAGA-RGD2 用于骨肉瘤肺轉移的靶向治療奠定了實驗基礎。
