引用本文： 戴伍飛, 石嘉琪, 劉莎, 徐梓淇, 石逸瑾, 趙亞紅, 楊宇民. 用于周圍神經再生的纖維基導電型復合支架制備及性能研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(3): 356-362. doi: 10.7507/1002-1892.201808004 復制
周圍神經缺損的修復是臨床研究熱點，神經損傷后有一定再生能力，但長距離、粗大神經損傷后仍難以自行恢復[1]。目前，臨床主要采用同種異體及自體神經修復周圍神經缺損，存在來源有限、組織尺寸和結構不能完全匹配，以及供區功能受損、長期失去神經支配等問題[2-3]。
人體神經系統是通過神經元生物電信號支配包括感覺和行動在內的各項日常活動[4]。如何讓神經元在復雜的信號網絡調控中實現有序增殖和定向生長，修復神經組織，是需要解決的難題[5-6]。如何讓不同類型神經纖維準確再生，從而實現對靶器官的支配；采用何種移植物能更快地修復周圍神經缺損，在靶肌肉完全萎縮前實現受損神經的再生，已成為解決神經再生的關鍵性難題。為此，我們設計并制備了“雙導”神經移植物——聚吡咯/絲素蛋白（polypyrrole/silk fibroin，PPy/SF）纖維基導電型復合支架，它是一種“殼-芯”結構導電型神經支架。本次研究通過分析該復合支架的理化性能和生物學性能，評價其作為神經支架材料的可能性，以期為組織工程神經移植物的構建提供新的方法和思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
NIH3T3 細胞株由中國科學院提供，將細胞加入含 10%FBS 的 DMEM 中，于 37℃、5%CO2 培養箱中孵育，每 2 天換液 1 次，選擇對數生長期細胞進行實驗研究。CaCl2/H2O/C2H5OH 三元溶劑體系，無水 CaCl2、無水 C2H5OH、三蒸水按照 1∶2∶8 比例配置，使用前配制。天然蠶絲（直徑 20/22D；浙江德清新聯制絲有限公司）；甲酸、鹽酸、三氯化鐵、無水碳酸鈉（阿拉丁生化科技股份有限公司）；PPy（Sigma 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；碧云天生物技術有限公司）。Regenovo 型 3D 打印機（捷諾飛生物科技股份有限公司）；自制滾筒式靜電紡絲裝置（由高壓電源設備、陽極發生器和陰極收集器組成）；TFW-5S 電子萬能試驗機（上海拓豐儀器科技有限公司）；Milli-Q 純水設備（Millipore 公司，德國）；AUY120 電子分析天平（SHIMADZU 公司，日本）；DF-101S 集熱式電熱恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器責任有限公司）；Model 2000 數字萬用表（Keithley 公司，美國）。
1.2 PPy/SF 纖維基導電型復合支架的制備
1.2.1 原料處理
① 以 1∶50 比例（M/V）將天然蠶絲置于 0.05% Na2CO3 溶液，煮沸脫膠，重復 3 次，得到脫膠的再生絲素 SF[7]。② SF 置于 CaCl2/H2O/C2H5OH 三元溶劑體系中完全溶解，得到黃色透明溶液，與聚環氧乙烷攪拌充分，制備 3D 打印漿料。③ 另將 SF 與三元溶解體系溶解后的黃色透明溶液置于透析袋中，在 Millipore 水中透析，收集得到 SF 溶液，平鋪在平皿中室溫晾干，得到再生絲素膜，將該膜溶解于甲酸后得到靜電紡絲溶液。④ PPy 減壓蒸餾提純，–20℃ 備用。
1.2.2 導電纖維結構的設計和制備
將上述 3D 打印漿料倒入 Regenovo 型 3D 打印機料筒中，選擇合適的參數（打印氣壓 0.10 MPa，速度 16 mm/s），按照取向性排列進行打印，即得到取向性排列的 3D 原始 SF 內芯，乙醇處理成型。利用電化學沉積技術，使導電聚合物 PPy 沉積在 SF 內芯上，形成黑色特征的 PPy 外殼[8-9]，構建“殼-芯”結構的 PPy/SF 導電纖維，作為實驗組。另取 PPy 直接進行 3D 打印，形成無 SF 內芯的 PPy 導電纖維，作為對照組。
1.2.3 纖維基導電型復合支架的制備
將上述制備的靜電紡絲溶液裝入自制滾筒式靜電紡絲裝置的微量注射泵中，作為陽極發生器；陰極收集器是絕緣收集板制成的高壓電源，滾筒接收器自制；兩者距離為 8～15 cm，通過微量注射泵維持靜電紡絲溶液恒定體積流速 0.1～0.3 mL/h。施加 18～22 kV 電壓，收集于接收器上從而形成靜電紡絲膜。將實驗組和對照組的導電纖維作為基底，平行于靜電紡噴絲方向放于接收裝置，靜電紡納米絲素纖維的排列與導電纖維方向一致，納米絲素纖維包覆導電纖維后，再繼續進行無序靜電紡絲，直至形成相應厚度和大小的支架，即纖維基導電型復合支架。通過改變接收裝置制備兩種形式支架用于實驗，包括復合膜和復合導管（直徑2.0 mm）。
1.3 觀測指標
1.3.1 表面性狀觀察
取實驗組復合導管進行大體觀察，光鏡下觀察其內表面和外表面，掃描電鏡觀察其“殼-芯”結構。
1.3.2 穩定性檢測
取兩組復合膜剪裁為 10 mm×10 mm×1 mm，置于 24 孔板，于 37℃ 分別浸泡于蒸餾水或 DMEM 中，每孔 1 mL；放置于搖床后，以 100 r/min 搖動。于浸泡 0、1、3、5、10、20、30 d 兩組各取 6 孔樣本（每孔 3 個樣本），干燥后于光鏡下觀察材料表面形貌，計數結構完整的樣本，計算支架穩定性（結構完整樣本數/樣本總數×100%）。
1.3.3 生物力學檢測
取兩組復合膜裁剪為 20 mm×20 mm×1 mm，浸泡于純水 4 h 后取出。用千分尺精確量取尺寸，然后使用電子萬能試驗機進行拉伸試驗（每組 6 個樣本），于室溫條件下以 5 mm/min 速度進行拉伸，膜斷裂時的拉力視為復合膜所能承受的最大抗拉伸強度。
1.3.4 導電性檢測
取實驗組復合膜和 3D 打印制備的原始 SF 內芯，每組 6 個樣本。利用數字萬用表在室溫下用雙探針法測量支架電阻率：將表筆線的測試端并聯到被測電阻上（被測樣本的平整表面上），被測電阻值將同時顯示在顯示屏上，根據理論公式 ρ=Rπr2/t（R 是電阻，r 是半徑，t 是樣本厚度），計算支架導電性。由于支架材料表面結構具有取向性，因此選擇多個方向進行測量，每個樣本至少測量 5 次。同時，實驗組測量不同“殼-芯”結構纖維直徑（80、120、180 μm）和不同距離（相鄰“殼-芯”結構纖維間距離 500 μm 和 700 μm）的復合膜。具體分組方法：a1 為直徑 80 μm、距離 500 μm；a2 為直徑 120 μm、距離 500 μm；a3 為直徑 180 μm、距離 500 μm；b1 為直徑 80 μm、距離 700 μm；b2 為直徑 120 μm、距離 700 μm；b3 為直徑 180 μm、距離 700 μm。
1.3.5 降解性檢測
取兩組復合膜裁剪成 10 mm×10 mm×1 mm，分別置于 0.01 mol/L PBS（pH7.4）和蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，觀察復合膜降解情況。將蛋白酶 ⅩⅣ 粉末溶解于 PBS 中配置成濃度為 1 U/mL 溶液，現配現用。具體方法：將樣本放入 60℃ 烘箱至恒重（稱量差異<0.03%），分析天平稱量樣本質量，記錄為 W0，放入離心管中編號；再用分析天平稱量離心管和樣本的總質量（不含蓋），記錄為 W1。在離心管中分別倒入 5 mL PBS 或蛋白酶 ⅩⅣ 溶液，置于 37℃ 恒溫振蕩器中，每天換液 1 次。于 1、2、3、4 周時每組分別取出 5 管，以離心半徑 26 cm、4 000 r/min 離心 10 min，棄去液體后倒入三蒸水再次洗滌離心（離心條件同上），重復 3 次后將離心管置于 60℃ 真空干燥箱 18 h，待導管中的水分完全蒸發、質量達恒重后，使用分析天平再次稱量，記錄為 W2。按以下公式計算支架降解率：（W1–W2）/W0×100%。
1.3.6 生物活性檢測
實驗分為 3 組，分別取纖維基導電型復合膜（A 組）、單純 PPy 導電纖維（B 組）、靜電紡單純 SF 纖維（C 組）放入 24 孔板內，每組 2 孔。每孔加入 500 μL 70%～75% 乙醇消毒 20～30 min 后，用等量 0.01 mol/L PBS 洗滌 3 次，吹干后備用。① 細胞形態觀察：將 NIH3T3 細胞按 5×105 個/mL 密度接種于各組材料上，每孔 500 μL，于 37℃、5%CO2 培養箱內培養。于培養 30、60、90、120、360、720 min 用 4% 多聚甲醛固定后，以 0.01 mol/L PBS 清洗 3 次后，甲苯胺藍染色 15 min，光鏡下觀察支架上細胞形態。② 細胞增殖檢測：將 NIH 3T3 細胞按 1×105 個/mL 密度接種于各組材料上，每孔 500 μL ，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱內培養。于培養 1、3、5 d 時采用 CCK-8 法檢測細胞增殖情況，以吸光度（A）值表示[10]。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 表面性狀觀察
大體觀察示，實驗組纖維基導電型復合導管內層鑲嵌均勻排列的導電纖維，導電纖維呈現 PPy 沉積反應后的黑色外觀。光鏡觀察示纖維基導電型復合導管內層由取向排列的 PPy 導電纖維和靜電紡取向性 SF 納米纖維膜組成，纖維均呈平行取向性排列；外層由靜電紡 SF 納米纖維組成，纖維隨機排列，交錯纏繞，形成大大小小的孔隙。掃描電鏡觀察導電纖維呈殼層包繞芯層式樣的“殼-芯”結構，與導管呈軸向平行排列。見圖 1。
圖1
實驗組 PPy/SF 纖維基導電型復合支架表面性狀觀察
a. 大體觀察；b. 掃描電鏡觀察（×500）；c. 支架內層光鏡觀察（×50）；d. 支架外層光鏡觀察（×50）
Figure1. Surface character observation of the PPy/SF fiber-based composite conductive scaffold in experimental groupa. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation (×500); c. Light microscopic observation of inner layer of scaffold (×50); d. Light microscopic observation of outer layer of scaffold (×50)
2.2 穩定性測試
兩組支架材料浸泡于蒸餾水后，實驗組早期“殼-芯”結構支架無分層，結構保持完整；隨時間延長，支架大多數保持清晰完整的“殼-芯”結構，僅有極少量出現剝落現象。對照組無芯結構支架表面從早期即開始出現小的碎片和分層，穩定性較差；隨時間延長支架完整性逐漸丟失。浸泡 1 d 后各時間點實驗組支架穩定性均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 2a。
圖2
兩組支架穩定性檢測
a. 支架浸泡于蒸餾水；b. 支架浸泡于 DMEM
Figure2. Stability tests for two groups of the conductive scaffoldsa. Samples soaked in water; b. Samples soaked in DMEM
兩組支架浸泡于 DMEM 后，對照組無芯結構支架從早期即出現許多碎片或分層；2 d 后發現許多樣本的取向性條紋扭曲、剝落，甚至崩潰。而實驗組“殼-芯”結構支架的取向性條紋結構在浸泡期間仍清晰并保持良好，浸泡 30 d 時支架穩定性仍保持近 50%。浸泡 1 d 后各時間點實驗組支架穩定性均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2b。
2.3 生物力學試驗
對照組無芯結構支架抗拉伸強度為（0.58±0.01）N，顯著低于實驗組“殼-芯”結構支架（1.10±0.01）N，差異有統計學意義（t=28.31，P=0.00）。
2.4 導電性檢測
3D 原始 SF 內芯在儀器所測范圍內未顯示導電性（儀器靈敏度為 1×10–11 S/cm）。而實驗組支架的導電性為 8.45×10–4～1.56×10–3 S/cm；相同距離下導電性隨纖維直徑增大而增大，而相同纖維直徑下不同距離的導電纖維導電性比較無明顯差異。見圖 3。
圖3
不同導電纖維導電性檢測
Figure3.
Electrical conductivity of different conductive fibers
2.5 降解性檢測
在 PBS 溶液中，兩組支架質量變化均較小，各時間點兩組降解率比較差異均無統計學意義（P>0.05）。在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，實驗組支架質量變化較大，1 周時降解不明顯，隨時間延長形成細小碎片，2 周時質量下降明顯，之后降解速度趨于平緩；對照組支架質量下降緩慢；各時間點兩組降解率比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
兩組支架降解率檢測
a. 在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中；b. 在 PBS 中
Figure4. Degradation rate measurement of conductive scaffolds in two groupsa. In protease ⅩⅣ solution; b. In PBS
2.6 生物活性檢測
2.6.1 細胞形態觀察
培養 90 min 內各組細胞均呈圓形，其中 A 組在 90 min 時已有部分細胞開始長出偽足；120 min 時 A 組細胞有明顯突起，而 B、C 組細胞無此現象；360、720 min 時 A、C 組細胞開始沿纖維方向平行生長，而 B 組細胞呈現多種形態，其中 A 組細胞較 B、C 組細胞有更好的取向性，且細胞突起長于 C 組。見圖 5。
圖5
各組培養后各時間點NIH3T3 細胞形態觀察（甲苯胺藍×50）
從左至右依次為培養 30、60、90、120、360、720 min a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure5. Cellular morphology observations of different groups at various time points (Toluidine blue staining×50)From left to right for cultured 30, 60, 90, 120, 360, and 720 minutes, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.6.2 細胞增殖檢測
CCK-8 法檢測示，隨培養時間延長，各組細胞均逐漸增殖。各時間點 A 組 A 值均顯著高于 B、C 組，C 組高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
CCK-8 法檢測各組 NIH3T3 細胞增殖
Figure6.
The proliferation of NIH3T3 cells of different groups determined by CCK8 assay
3 討論
神經再生研究的關鍵是尋找理想的組織工程支架材料[11]。考慮到神經組織、細胞的結構組成和電生理學特性，理想的神經支架材料除需具備獨特形貌特征，以改善與其接觸的神經細胞間的相互作用、調控細胞的生長分化，還需要具備與在體神經形成良好電生理整合的能力[12]。針對上述問題，近年來研究人員開始研究新型導電型生物材料[13]。PPy 因其優良的理化性能和良好的生物相容性，現已被用于細胞生長基質和作為電學記錄材料，其在組織工程生物醫用領域方面具有潛在的應用價值。但 PPy 存在力學性能差、不可降解、缺少活性基團等缺陷，目前研究主要是將其與其他生物材料制成復合材料[14]。SF 是天然蛋白材料，具有良好的生物相容性、降解可調控等特性，PPy 是一種共軛聚合物，其與 SF 大分子鏈的肽鏈有一定的相互作用，可以形成穩定的導電聚合物，因此本研究擬用 SF 與 PPy 形成導電型復合物[15-16]。
穩定性和力學性能是組織工程支架材料重要參數。材料植入體內一定時間內仍需要保持有效的形狀，使其能夠在體內承受一定壓力；同時，在植入手術過程中也要保持結構完整和穩定。本研究表明，單純 PPy 纖維導電膜無內芯結構，極容易由于拉伸發生變形或是斷裂拉斷，影響其應用；而“殼-芯”結構中 SF 與 PPy 的結合可以形成優勢互補，材料的拉伸性也得到顯著提升，“殼-芯”結構能夠增強復合支架的力學拉伸性。
生物材料的種類會不同程度影響導電聚合物的導電性、形貌及穩定性。我們在預實驗中選擇不同的導電材料作為外殼，不同的天然材料作為內芯，將導電材料和天然材料進行不同的組合，制備出不同的復合材料。結果表明 PPy 外殼、SF 內芯制備的纖維基導電型復合支架相較于其他材料組合，生物穩定性高，電活性維持長久，因此優選該組合用于制備纖維基導電型復合支架中的“殼-芯”結構。本研究結果與文獻報道一致，PPy 與影響 SF 大分子鏈的肽鏈有一定的相互作用，SF 和 PPy 可以形成穩定的導電聚合物[17-18]。
理想的組織工程神經支架應具備良好的生物可降解性，植入體內后可以被機體降解吸收，而且其降解速度與再生匹配為宜[19]。本研究結果顯示，PBS 溶液中，“殼-芯”結構 PPy/SF 纖維基導電型復合支架和對照組單純 PPy 導電纖維的質量變化都非常小。相對而言，在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，單純 PPy 導電纖維質量仍無明顯變化，說明 PPy 沉積的 SF 不容易被降解。這主要是由于 PPy 化學沉積在 SF 表層，PPy 分子鏈具有高度剛性，難溶于一般溶劑，對 SF 纖維起到了保護作用。而 PPy/SF 纖維基導電型復合支架在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中的質量變化則較大，實驗早期質量損失較少，因為 SF 肽鏈僅僅只是被分解成多肽，相對分子質量依然較大，仍然能夠維持原有結構；而隨著降解時間延長，在酶的作用下，蛋白的多肽結構被進一步分解，形成細小的碎片，同時 SF 結構中可溶性部分也被釋放到溶液中，因此質量下降明顯。
生物活性是組織工程支架材料生物相容性評價的重要組成部分，支架材料應具有良好的細胞相容性，能夠促進細胞的黏附、鋪展、遷移、增殖以及分化等行為，并能有效維持細胞正常的表型與生理功能[20]。本研究結果顯示，NIH3T3 細胞在 PPy/SF 纖維基導電型復合支架上黏附能力優于其他材料，細胞增殖活力高于其他材料。這可能是由于靜電紡絲技術制備的支架材料比表面積較高、納米纖維直徑接近于細胞外基質的纖維尺寸，同時生物電在一定范圍內可以起到促進細胞生長的作用，從而有利于細胞的識別，促進細胞的黏附、生長[21-22]。
生物材料不僅可以為組織和器官生長、修復提供三維結構和機械支撐，其自身的一些物理化學信號還可以調控再生速率，影響再生進程，尤其是材料的表面拓撲結構[23-24]。PPy/SF 纖維基導電型復合支架內膜由取向性納米絲素纖維和 PPy 導電纖維定向排列組成，能夠引導細胞定向生長，促進軸突生長。靜電紡外膜孔隙率結構可以實現物質交換，有效促進神經修復。
綜上述，在有取向性的纖維狀導電材料基礎上進行 SF 靜電紡絲，可以制備成膜和導管形式的 PPy/SF 纖維基導電型復合支架。該復合支架具備穩定性好、力學性能優越、電活性維持長久等理化性能；同時可以通過調節 3D 打印參數制備不同尺寸的 PPy/SF 纖維基導電型復合支架，具有合適導電性大小的 PPy/SF 纖維基導電型復合支架有利于細胞附著在表面，且細胞狀態良好，增殖活性強。因此，本研究制備的 PPy/SF 纖維基導電型復合支架可作為組織工程神經支架材料。
周圍神經缺損的修復是臨床研究熱點，神經損傷后有一定再生能力，但長距離、粗大神經損傷后仍難以自行恢復[1]。目前，臨床主要采用同種異體及自體神經修復周圍神經缺損，存在來源有限、組織尺寸和結構不能完全匹配，以及供區功能受損、長期失去神經支配等問題[2-3]。
人體神經系統是通過神經元生物電信號支配包括感覺和行動在內的各項日常活動[4]。如何讓神經元在復雜的信號網絡調控中實現有序增殖和定向生長，修復神經組織，是需要解決的難題[5-6]。如何讓不同類型神經纖維準確再生，從而實現對靶器官的支配；采用何種移植物能更快地修復周圍神經缺損，在靶肌肉完全萎縮前實現受損神經的再生，已成為解決神經再生的關鍵性難題。為此，我們設計并制備了“雙導”神經移植物——聚吡咯/絲素蛋白（polypyrrole/silk fibroin，PPy/SF）纖維基導電型復合支架，它是一種“殼-芯”結構導電型神經支架。本次研究通過分析該復合支架的理化性能和生物學性能，評價其作為神經支架材料的可能性，以期為組織工程神經移植物的構建提供新的方法和思路。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
NIH3T3 細胞株由中國科學院提供，將細胞加入含 10%FBS 的 DMEM 中，于 37℃、5%CO2 培養箱中孵育，每 2 天換液 1 次，選擇對數生長期細胞進行實驗研究。CaCl2/H2O/C2H5OH 三元溶劑體系，無水 CaCl2、無水 C2H5OH、三蒸水按照 1∶2∶8 比例配置，使用前配制。天然蠶絲（直徑 20/22D；浙江德清新聯制絲有限公司）；甲酸、鹽酸、三氯化鐵、無水碳酸鈉（阿拉丁生化科技股份有限公司）；PPy（Sigma 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；碧云天生物技術有限公司）。Regenovo 型 3D 打印機（捷諾飛生物科技股份有限公司）；自制滾筒式靜電紡絲裝置（由高壓電源設備、陽極發生器和陰極收集器組成）；TFW-5S 電子萬能試驗機（上海拓豐儀器科技有限公司）；Milli-Q 純水設備（Millipore 公司，德國）；AUY120 電子分析天平（SHIMADZU 公司，日本）；DF-101S 集熱式電熱恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器責任有限公司）；Model 2000 數字萬用表（Keithley 公司，美國）。
1.2 PPy/SF 纖維基導電型復合支架的制備
1.2.1 原料處理
① 以 1∶50 比例（M/V）將天然蠶絲置于 0.05% Na2CO3 溶液，煮沸脫膠，重復 3 次，得到脫膠的再生絲素 SF[7]。② SF 置于 CaCl2/H2O/C2H5OH 三元溶劑體系中完全溶解，得到黃色透明溶液，與聚環氧乙烷攪拌充分，制備 3D 打印漿料。③ 另將 SF 與三元溶解體系溶解后的黃色透明溶液置于透析袋中，在 Millipore 水中透析，收集得到 SF 溶液，平鋪在平皿中室溫晾干，得到再生絲素膜，將該膜溶解于甲酸后得到靜電紡絲溶液。④ PPy 減壓蒸餾提純，–20℃ 備用。
1.2.2 導電纖維結構的設計和制備
將上述 3D 打印漿料倒入 Regenovo 型 3D 打印機料筒中，選擇合適的參數（打印氣壓 0.10 MPa，速度 16 mm/s），按照取向性排列進行打印，即得到取向性排列的 3D 原始 SF 內芯，乙醇處理成型。利用電化學沉積技術，使導電聚合物 PPy 沉積在 SF 內芯上，形成黑色特征的 PPy 外殼[8-9]，構建“殼-芯”結構的 PPy/SF 導電纖維，作為實驗組。另取 PPy 直接進行 3D 打印，形成無 SF 內芯的 PPy 導電纖維，作為對照組。
1.2.3 纖維基導電型復合支架的制備
將上述制備的靜電紡絲溶液裝入自制滾筒式靜電紡絲裝置的微量注射泵中，作為陽極發生器；陰極收集器是絕緣收集板制成的高壓電源，滾筒接收器自制；兩者距離為 8～15 cm，通過微量注射泵維持靜電紡絲溶液恒定體積流速 0.1～0.3 mL/h。施加 18～22 kV 電壓，收集于接收器上從而形成靜電紡絲膜。將實驗組和對照組的導電纖維作為基底，平行于靜電紡噴絲方向放于接收裝置，靜電紡納米絲素纖維的排列與導電纖維方向一致，納米絲素纖維包覆導電纖維后，再繼續進行無序靜電紡絲，直至形成相應厚度和大小的支架，即纖維基導電型復合支架。通過改變接收裝置制備兩種形式支架用于實驗，包括復合膜和復合導管（直徑2.0 mm）。
1.3 觀測指標
1.3.1 表面性狀觀察
取實驗組復合導管進行大體觀察，光鏡下觀察其內表面和外表面，掃描電鏡觀察其“殼-芯”結構。
1.3.2 穩定性檢測
取兩組復合膜剪裁為 10 mm×10 mm×1 mm，置于 24 孔板，于 37℃ 分別浸泡于蒸餾水或 DMEM 中，每孔 1 mL；放置于搖床后，以 100 r/min 搖動。于浸泡 0、1、3、5、10、20、30 d 兩組各取 6 孔樣本（每孔 3 個樣本），干燥后于光鏡下觀察材料表面形貌，計數結構完整的樣本，計算支架穩定性（結構完整樣本數/樣本總數×100%）。
1.3.3 生物力學檢測
取兩組復合膜裁剪為 20 mm×20 mm×1 mm，浸泡于純水 4 h 后取出。用千分尺精確量取尺寸，然后使用電子萬能試驗機進行拉伸試驗（每組 6 個樣本），于室溫條件下以 5 mm/min 速度進行拉伸，膜斷裂時的拉力視為復合膜所能承受的最大抗拉伸強度。
1.3.4 導電性檢測
取實驗組復合膜和 3D 打印制備的原始 SF 內芯，每組 6 個樣本。利用數字萬用表在室溫下用雙探針法測量支架電阻率：將表筆線的測試端并聯到被測電阻上（被測樣本的平整表面上），被測電阻值將同時顯示在顯示屏上，根據理論公式 ρ=Rπr2/t（R 是電阻，r 是半徑，t 是樣本厚度），計算支架導電性。由于支架材料表面結構具有取向性，因此選擇多個方向進行測量，每個樣本至少測量 5 次。同時，實驗組測量不同“殼-芯”結構纖維直徑（80、120、180 μm）和不同距離（相鄰“殼-芯”結構纖維間距離 500 μm 和 700 μm）的復合膜。具體分組方法：a1 為直徑 80 μm、距離 500 μm；a2 為直徑 120 μm、距離 500 μm；a3 為直徑 180 μm、距離 500 μm；b1 為直徑 80 μm、距離 700 μm；b2 為直徑 120 μm、距離 700 μm；b3 為直徑 180 μm、距離 700 μm。
1.3.5 降解性檢測
取兩組復合膜裁剪成 10 mm×10 mm×1 mm，分別置于 0.01 mol/L PBS（pH7.4）和蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，觀察復合膜降解情況。將蛋白酶 ⅩⅣ 粉末溶解于 PBS 中配置成濃度為 1 U/mL 溶液，現配現用。具體方法：將樣本放入 60℃ 烘箱至恒重（稱量差異<0.03%），分析天平稱量樣本質量，記錄為 W0，放入離心管中編號；再用分析天平稱量離心管和樣本的總質量（不含蓋），記錄為 W1。在離心管中分別倒入 5 mL PBS 或蛋白酶 ⅩⅣ 溶液，置于 37℃ 恒溫振蕩器中，每天換液 1 次。于 1、2、3、4 周時每組分別取出 5 管，以離心半徑 26 cm、4 000 r/min 離心 10 min，棄去液體后倒入三蒸水再次洗滌離心（離心條件同上），重復 3 次后將離心管置于 60℃ 真空干燥箱 18 h，待導管中的水分完全蒸發、質量達恒重后，使用分析天平再次稱量，記錄為 W2。按以下公式計算支架降解率：（W1–W2）/W0×100%。
1.3.6 生物活性檢測
實驗分為 3 組，分別取纖維基導電型復合膜（A 組）、單純 PPy 導電纖維（B 組）、靜電紡單純 SF 纖維（C 組）放入 24 孔板內，每組 2 孔。每孔加入 500 μL 70%～75% 乙醇消毒 20～30 min 后，用等量 0.01 mol/L PBS 洗滌 3 次，吹干后備用。① 細胞形態觀察：將 NIH3T3 細胞按 5×105 個/mL 密度接種于各組材料上，每孔 500 μL，于 37℃、5%CO2 培養箱內培養。于培養 30、60、90、120、360、720 min 用 4% 多聚甲醛固定后，以 0.01 mol/L PBS 清洗 3 次后，甲苯胺藍染色 15 min，光鏡下觀察支架上細胞形態。② 細胞增殖檢測：將 NIH 3T3 細胞按 1×105 個/mL 密度接種于各組材料上，每孔 500 μL ，置于 37℃、5%CO2 細胞培養箱內培養。于培養 1、3、5 d 時采用 CCK-8 法檢測細胞增殖情況，以吸光度（A）值表示[10]。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 表面性狀觀察
大體觀察示，實驗組纖維基導電型復合導管內層鑲嵌均勻排列的導電纖維，導電纖維呈現 PPy 沉積反應后的黑色外觀。光鏡觀察示纖維基導電型復合導管內層由取向排列的 PPy 導電纖維和靜電紡取向性 SF 納米纖維膜組成，纖維均呈平行取向性排列；外層由靜電紡 SF 納米纖維組成，纖維隨機排列，交錯纏繞，形成大大小小的孔隙。掃描電鏡觀察導電纖維呈殼層包繞芯層式樣的“殼-芯”結構，與導管呈軸向平行排列。見圖 1。
圖1
實驗組 PPy/SF 纖維基導電型復合支架表面性狀觀察
a. 大體觀察；b. 掃描電鏡觀察（×500）；c. 支架內層光鏡觀察（×50）；d. 支架外層光鏡觀察（×50）
Figure1. Surface character observation of the PPy/SF fiber-based composite conductive scaffold in experimental groupa. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation (×500); c. Light microscopic observation of inner layer of scaffold (×50); d. Light microscopic observation of outer layer of scaffold (×50)
2.2 穩定性測試
兩組支架材料浸泡于蒸餾水后，實驗組早期“殼-芯”結構支架無分層，結構保持完整；隨時間延長，支架大多數保持清晰完整的“殼-芯”結構，僅有極少量出現剝落現象。對照組無芯結構支架表面從早期即開始出現小的碎片和分層，穩定性較差；隨時間延長支架完整性逐漸丟失。浸泡 1 d 后各時間點實驗組支架穩定性均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見圖 2a。
圖2
兩組支架穩定性檢測
a. 支架浸泡于蒸餾水；b. 支架浸泡于 DMEM
Figure2. Stability tests for two groups of the conductive scaffoldsa. Samples soaked in water; b. Samples soaked in DMEM
兩組支架浸泡于 DMEM 后，對照組無芯結構支架從早期即出現許多碎片或分層；2 d 后發現許多樣本的取向性條紋扭曲、剝落，甚至崩潰。而實驗組“殼-芯”結構支架的取向性條紋結構在浸泡期間仍清晰并保持良好，浸泡 30 d 時支架穩定性仍保持近 50%。浸泡 1 d 后各時間點實驗組支架穩定性均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2b。
2.3 生物力學試驗
對照組無芯結構支架抗拉伸強度為（0.58±0.01）N，顯著低于實驗組“殼-芯”結構支架（1.10±0.01）N，差異有統計學意義（t=28.31，P=0.00）。
2.4 導電性檢測
3D 原始 SF 內芯在儀器所測范圍內未顯示導電性（儀器靈敏度為 1×10–11 S/cm）。而實驗組支架的導電性為 8.45×10–4～1.56×10–3 S/cm；相同距離下導電性隨纖維直徑增大而增大，而相同纖維直徑下不同距離的導電纖維導電性比較無明顯差異。見圖 3。
圖3
不同導電纖維導電性檢測
Figure3.
Electrical conductivity of different conductive fibers
2.5 降解性檢測
在 PBS 溶液中，兩組支架質量變化均較小，各時間點兩組降解率比較差異均無統計學意義（P>0.05）。在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，實驗組支架質量變化較大，1 周時降解不明顯，隨時間延長形成細小碎片，2 周時質量下降明顯，之后降解速度趨于平緩；對照組支架質量下降緩慢；各時間點兩組降解率比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
兩組支架降解率檢測
a. 在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中；b. 在 PBS 中
Figure4. Degradation rate measurement of conductive scaffolds in two groupsa. In protease ⅩⅣ solution; b. In PBS
2.6 生物活性檢測
2.6.1 細胞形態觀察
培養 90 min 內各組細胞均呈圓形，其中 A 組在 90 min 時已有部分細胞開始長出偽足；120 min 時 A 組細胞有明顯突起，而 B、C 組細胞無此現象；360、720 min 時 A、C 組細胞開始沿纖維方向平行生長，而 B 組細胞呈現多種形態，其中 A 組細胞較 B、C 組細胞有更好的取向性，且細胞突起長于 C 組。見圖 5。
圖5
各組培養后各時間點NIH3T3 細胞形態觀察（甲苯胺藍×50）
從左至右依次為培養 30、60、90、120、360、720 min a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure5. Cellular morphology observations of different groups at various time points (Toluidine blue staining×50)From left to right for cultured 30, 60, 90, 120, 360, and 720 minutes, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.6.2 細胞增殖檢測
CCK-8 法檢測示，隨培養時間延長，各組細胞均逐漸增殖。各時間點 A 組 A 值均顯著高于 B、C 組，C 組高于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
CCK-8 法檢測各組 NIH3T3 細胞增殖
Figure6.
The proliferation of NIH3T3 cells of different groups determined by CCK8 assay
3 討論
神經再生研究的關鍵是尋找理想的組織工程支架材料[11]。考慮到神經組織、細胞的結構組成和電生理學特性，理想的神經支架材料除需具備獨特形貌特征，以改善與其接觸的神經細胞間的相互作用、調控細胞的生長分化，還需要具備與在體神經形成良好電生理整合的能力[12]。針對上述問題，近年來研究人員開始研究新型導電型生物材料[13]。PPy 因其優良的理化性能和良好的生物相容性，現已被用于細胞生長基質和作為電學記錄材料，其在組織工程生物醫用領域方面具有潛在的應用價值。但 PPy 存在力學性能差、不可降解、缺少活性基團等缺陷，目前研究主要是將其與其他生物材料制成復合材料[14]。SF 是天然蛋白材料，具有良好的生物相容性、降解可調控等特性，PPy 是一種共軛聚合物，其與 SF 大分子鏈的肽鏈有一定的相互作用，可以形成穩定的導電聚合物，因此本研究擬用 SF 與 PPy 形成導電型復合物[15-16]。
穩定性和力學性能是組織工程支架材料重要參數。材料植入體內一定時間內仍需要保持有效的形狀，使其能夠在體內承受一定壓力；同時，在植入手術過程中也要保持結構完整和穩定。本研究表明，單純 PPy 纖維導電膜無內芯結構，極容易由于拉伸發生變形或是斷裂拉斷，影響其應用；而“殼-芯”結構中 SF 與 PPy 的結合可以形成優勢互補，材料的拉伸性也得到顯著提升，“殼-芯”結構能夠增強復合支架的力學拉伸性。
生物材料的種類會不同程度影響導電聚合物的導電性、形貌及穩定性。我們在預實驗中選擇不同的導電材料作為外殼，不同的天然材料作為內芯，將導電材料和天然材料進行不同的組合，制備出不同的復合材料。結果表明 PPy 外殼、SF 內芯制備的纖維基導電型復合支架相較于其他材料組合，生物穩定性高，電活性維持長久，因此優選該組合用于制備纖維基導電型復合支架中的“殼-芯”結構。本研究結果與文獻報道一致，PPy 與影響 SF 大分子鏈的肽鏈有一定的相互作用，SF 和 PPy 可以形成穩定的導電聚合物[17-18]。
理想的組織工程神經支架應具備良好的生物可降解性，植入體內后可以被機體降解吸收，而且其降解速度與再生匹配為宜[19]。本研究結果顯示，PBS 溶液中，“殼-芯”結構 PPy/SF 纖維基導電型復合支架和對照組單純 PPy 導電纖維的質量變化都非常小。相對而言，在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，單純 PPy 導電纖維質量仍無明顯變化，說明 PPy 沉積的 SF 不容易被降解。這主要是由于 PPy 化學沉積在 SF 表層，PPy 分子鏈具有高度剛性，難溶于一般溶劑，對 SF 纖維起到了保護作用。而 PPy/SF 纖維基導電型復合支架在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中的質量變化則較大，實驗早期質量損失較少，因為 SF 肽鏈僅僅只是被分解成多肽，相對分子質量依然較大，仍然能夠維持原有結構；而隨著降解時間延長，在酶的作用下，蛋白的多肽結構被進一步分解，形成細小的碎片，同時 SF 結構中可溶性部分也被釋放到溶液中，因此質量下降明顯。
生物活性是組織工程支架材料生物相容性評價的重要組成部分，支架材料應具有良好的細胞相容性，能夠促進細胞的黏附、鋪展、遷移、增殖以及分化等行為，并能有效維持細胞正常的表型與生理功能[20]。本研究結果顯示，NIH3T3 細胞在 PPy/SF 纖維基導電型復合支架上黏附能力優于其他材料，細胞增殖活力高于其他材料。這可能是由于靜電紡絲技術制備的支架材料比表面積較高、納米纖維直徑接近于細胞外基質的纖維尺寸，同時生物電在一定范圍內可以起到促進細胞生長的作用，從而有利于細胞的識別，促進細胞的黏附、生長[21-22]。
生物材料不僅可以為組織和器官生長、修復提供三維結構和機械支撐，其自身的一些物理化學信號還可以調控再生速率，影響再生進程，尤其是材料的表面拓撲結構[23-24]。PPy/SF 纖維基導電型復合支架內膜由取向性納米絲素纖維和 PPy 導電纖維定向排列組成，能夠引導細胞定向生長，促進軸突生長。靜電紡外膜孔隙率結構可以實現物質交換，有效促進神經修復。
綜上述，在有取向性的纖維狀導電材料基礎上進行 SF 靜電紡絲，可以制備成膜和導管形式的 PPy/SF 纖維基導電型復合支架。該復合支架具備穩定性好、力學性能優越、電活性維持長久等理化性能；同時可以通過調節 3D 打印參數制備不同尺寸的 PPy/SF 纖維基導電型復合支架，具有合適導電性大小的 PPy/SF 纖維基導電型復合支架有利于細胞附著在表面，且細胞狀態良好，增殖活性強。因此，本研究制備的 PPy/SF 纖維基導電型復合支架可作為組織工程神經支架材料。
