引用本文： 敬林果, 楊晨, 郇志廣, 徐合, 柯勤飛, 常江. 墨魚骨轉化羥基磷灰石多孔陶瓷表面納米結構調控及其對成骨細胞作用的研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(3): 363-369. doi: 10.7507/1002-1892.201804100 復制
骨組織工程支架材料需具有大尺寸、高連通孔結構，以促進物質交換以及細胞遷移[1-4]。而以墨魚骨為基底制備的墨魚骨轉化羥基磷灰石多孔陶瓷（cuttlefish bone transformed hydroxyapatite，CB-HA）不僅具有大尺寸、高連通孔結構，還具有羥基磷灰石優異的生物相容性，能夠滿足骨組織工程材料結構和成分的要求[5-8]。然而細胞在 CB-HA 上的成骨基因表達不夠理想，有待進一步提高[9-10]。有研究表明，通過在材料表面引入納米結構，提高材料比表面積，能明顯增強材料對多種蛋白（如免疫球蛋白、玻璃體結合蛋白等）的吸附能力，進而提高細胞黏附、增殖以及成骨基因表達的能力[11]。但是目前有關調控 CB-HA 表面納米結構，探究其生物學性能的研究報道較少。為此，我們進行了本次實驗，旨在探討調控 CB-HA 表面納米結構的方法，分析 CB-HA 表面納米結構以及結構尺寸對成骨細胞黏附、增殖及 ALP 表達的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
市售墨魚骨。MC3T3-E1 小鼠成骨細胞（中國科學院上海生命科學研究院）。NaClO、NH4Cl、Na2HPO4、六甲基二硅氮烷（分析純）、戊二醛［中國醫藥（集團）上海化學試劑公司］；MEM-α 培養基（GIBCO 公司，美國）；FBS（HyClone 公司，美國）；MTT 試劑盒（AMRESO 公司，美國）；0.25% 胰蛋白酶、pNPP 試劑盒（Sigma 公司，美國）；蛋白總量測試試劑盒（BioRad 公司，美國）。
X 射線衍射儀（Bruker 公司，德國）；380FT-IR 型傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 公司，美國）；715-ES 型電感耦合等離子體原子發射光譜（VARIAN 公司，美國）；S-4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；ET-320VP 孔隙率測試儀（北京儀特諾電子科技有限公司）；TRISTAR3000 比表面測試儀（Micromeritics 公司，美國）；EPOCH 酶標儀（BioTek 公司，美國）。
1.2 不同納米結構 CB-HA 的制備
將墨魚骨切割成直徑 10 mm、厚 2 mm 的圓片，置于去離子水中，在室溫下抽真空 1 h 使水充分注入墨魚骨后，轉至 1 mol/L NaClO 溶液中，室溫下放置 24 h 以去除材料表面有機成分。取出墨魚骨片，去離子水清洗 3 次，于去離子水中保存，備用。
根據處理條件不同，實驗分為 4 組。每組各取 4 g 制備的注水墨魚骨片與 15 mL 不同濃度磷源溶液（表 1）充分混合，置于水熱釜，放入烘箱于 120℃ 反應 24 h 后取出。取出后，組 1～3 材料清洗、烘干備用；組 4 進一步將材料置于管式爐中，于 1 200℃ 下燒結 3 h，去除其表面結構作為對照。
表1
CB-HA 轉化條件
Table1.
Reaction conditions of CB-HA
1.3 不同納米結構 CB-HA 物理化學性質表征
① 使用 X 射線衍射儀、傅里葉紅外光譜儀測試各組 CB-HA 的 X 射線衍射光譜、紅外線吸收光譜。② 將各組 CB-HA 研磨成粉末后濃鹽酸溶解稀釋，用電感耦合等離子體原子發射光譜分析其鈣磷比，計算轉換率。③ 掃描電鏡觀察各組 CB-HA 大孔結構及表面微納米結構。④ 使用孔隙率測試儀測試各組 CB-HA 孔隙率，使用比表面測試儀測試 CB-HA 比表面積以及孔徑分布。實驗重復 3 次。
1.4 不同納米結構 CB-HA 對成骨細胞的影響
1.4.1 細胞培養
取 MC3T3-E1 細胞系，加入完全培養液（含 10%FBS 的 MEM-α 培養基），置于 37℃、5%CO2 及 95% 飽和濕度的恒溫培養箱中培養，隔天換液。待細胞生長至 80%～90% 匯合度時，棄培養液，PBS 清洗 2～3 次，37℃、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化 1～3 min；加入完全培養液終止反應，用移液器反復吹打若干次。室溫下，以離心半徑 10 cm，1 200 r/min 離心 5 min，棄上清液后加入完全培養液重懸細胞，按 1∶4 比例進行傳代。
將各組 CB-HA 置于 48 孔板內，每孔 1 片。取第 4 代 MC3T3-E1 細胞接種于 CB-HA 上，每孔 8×103個細胞。置于 37℃、5%CO2 及 95% 飽和濕度的恒溫培養箱中培養，隔天換液。
1.4.2 細胞黏附觀察
培養 1 d，取出各組 CB-HA 置于 2.5% 戊二醛中，于 4℃ 冰箱中固定細胞 30 min，PBS 清洗 CB-HA 2 次，然后梯度脫水，分別用 30%、50%、70%、95%、100% 乙醇各脫水 5 min。最后六甲基二硅氮烷干燥、噴金，掃描電鏡觀察細胞形貌。
1.4.3 細胞增殖觀察
培養 1、3、7 d，采用 MTT 法分析細胞增殖情況。操作如下：在細胞培養液中加入 0.5 mg/mL MTT 染料孵化 4 h，然后加入 300 μL DMSO 反應 1 h，最后采用酶標儀于波長 490 nm 處測量吸光度（A）值，以實際測量值與空白板測量值的差值作為最終結果。實驗重復 3 次。
1.4.4 細胞 ALP 表達觀察
培養 7、14 d，通過 pNPP 法測試細胞 ALP 表達。操作如下：首先利用 0.2%（V/V）Triton-X/EDTA 裂解細胞，將細胞溶解物高速離心（離心半徑 6 cm，12 000 r/min 離心 5 min），然后取 100 μL 上清液和 200 μL pNPP 工作液在 37℃ 下反應 30 min，通過酶標儀在波長 405 nm 處測量 A 值。實驗重復 3 次。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 不同納米結構 CB-HA 物理化學性質表征
2.1.1 化學成分分析
X 射線衍射光譜顯示 4 組 CB-HA 均見羥基磷灰石的峰形，其中組 3、組 4 的結晶度更高。見圖 1a。紅外線吸收光譜顯示 4 組 CB-HA 的紅外吸收峰與羥基磷灰石一致；與組 1～3 相比，組 4 CB-HA 缺少 3 000～3 600 cm–1的水峰。見圖 1b。電感耦合等離子體原子發射光譜分析顯示，組 1～4 的 CB-HA 鈣磷比分為 1.76、1.72、1.73、1.68，轉換率分別為 94.9%、97.0%、96.5%、99.4%。
圖1
CB-HA 化學成分分析
a. X 射線衍射光譜；b. 紅外線吸收光譜
Figure1. Chemical composition analysis of CB-HAa. X-ray diffraction spectrum; b. Infrared absorption spectrum
2.1.2 物理性質分析
掃描電鏡觀察見，組 1 為大尺寸團簇結構，為厚度約 60 nm 的納米片組成的直徑約 3 μm 的團簇結構（圖 2a）；組 2 為中尺寸團簇結構，為厚度約 15 nm 的納米片組成的直徑約 2.5 μm 的團簇結構（圖 2b）；組 3 為小尺寸團簇結構，為厚度約 15 nm 的納米片組成的直徑約 2 μm 的團簇結構（圖 2c）；組 4 表面沒有明顯納米結構（圖 2d）。
圖2
CB-HA 掃描電鏡觀察
從左至右分別為放大 50、3 000、30 k 倍圖片 a. 組 1；b. 組 2；c.組 3；d. 組 4
Figure2. Morphological analysis of CB-HA by scanning electron microscopyFrom left to right for the magnifications of 50, 3 000, and 30 k times, respectively a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
組 1～4 CB-HA 的孔隙率分別為 95.3%±0.3%、94.9%±0.4%、95.1%±0.3%、95.5%±0.3%，組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；比表面積為（23.1±0.2）、（30.3±0.6）、（34.1±0.4）、（8.2±0.1）m2/g，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。孔徑分布觀察，與組 4 表面沒有明顯納米結構的 CB-HA 相比，組 1～3 具有表面團簇結構的 CB-HA 具有更多的孔徑<50 nm 微孔，并且隨著納米團簇結構尺寸的減小，表面微孔逐漸增多。
2.2 不同納米結構 CB-HA 對成骨細胞的影響
2.2.1 細胞黏附觀察
培養 1 d 后掃描電鏡觀察見，在各組具有不同納米結構的 CB-HA 表面，MC3T3-E1 細胞伸展姿態不同。與組 1 以及組 4 相比，組 2 以及組 3 CB-HA 表面的 MC3T3-E1 細胞伸展出了更多絲狀偽足，細胞也有更好的伸展狀態。見圖 3。
圖3
培養 1 d 后掃描電鏡觀察 CB-HA 表面細胞形態
從左至右分別為放大 1.5 k、3 k、6 k 倍圖片 a. 組 1；b. 組 2；c.組 3；d. 組 4
Figure3. Morphological analysis of cells on CB-HA by scanning electron microscopyFrom left to right for the magnifications of 1.5 k, 3 k, and 6 k times, respectively a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
2.2.2 細胞增殖觀察
培養 1、3 d，各組未見細胞明顯增殖，組間 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）。7 d 時，各組均表現出更好的增殖情況；其中，組 2 及組 3 A 值明顯高于組 1 及組 4，差異有統計學意義（P<0.05）；組 2 及組 3 間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
MTT 檢測培養1、3、7 d 細胞增殖曲線
Figure4.
Cell proliferation evaluated by MTT assay after 1, 3, and 7 days of co-culture
2.2.3 細胞 ALP 表達
培養 7 d，組 1～4 MC3T3-E1 細胞 ALP 表達分別為 28.17±0.37、30.94±1.15、39.35±2.15、8.91±0.32，14 d 時分別為 40.19±4.14、61.27±3.10、66.99±4.01、23.13±2.70；各時間點組 3 的 ALP 表達顯著高于組 1、2、4，組 1、2 高于組 4，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
大量研究表明，在材料表面引入納米結構，能夠顯著提高材料的比表面積；而更大的比表面積能夠提高材料對周圍環境中離子、蛋白的吸附能力，從而促進細胞在材料表面的黏附、增殖以及成骨基因表達[11-14]。因此，本研究通過改變 CB-HA 表面納米結構的尺寸，旨在篩選更適合 MC3T3-E1 細胞黏附、增殖以及促進 ALP 表達的 CB-HA 表面納米結構。
材料制備與表征結果表明，隨著轉化溶液中銨根離子濃度的增加，CB-HA 表面的納米團簇結構尺寸縮小、片狀結構變薄，因此比表面積隨之增加。其原因可能是羥基磷灰石晶體的 c 面富含磷酸根和羥基，因此帶負電荷；其 a 面富含鈣離子，因此帶正電[15]。在羥基磷灰石生長體系中，某些離子、氨基酸能夠吸附在羥基磷灰石特定晶面上，抑制羥基磷灰石特定晶面的生長，進而達到調控其表面結構的作用[16-19]。在本研究中可能是銨根離子與帶負電荷的 c 面相結合，導致 c 面的生長被抑制，從而使 CB-HA 表面團簇結構越來越薄，整體尺寸也越來越小。并且，隨著 CB-HA 表面團簇結構的減小，出現了更多孔徑在 10 μm 以下的微孔，因此材料的比表面積也隨之提高。
細胞實驗表明，具有小尺寸團簇結構的 CB-HA 最有利于 MC3T3-E1 細胞黏附、增殖以及促進 ALP 表達，提示減小表面納米結構的尺寸有利于細胞的黏附、增殖以及成骨分化。分析可能是因為隨著納米結構尺寸的減小，材料的比表面積增加，因此材料表面具有更多的蛋白吸附位點。前期研究已經證明，在共培養環境中，具有納米結構的材料首先能夠與周圍環境相作用吸收環境中蛋白，如免疫球蛋白、玻璃體結合蛋白等[11-14, 20-22]，之后材料上吸附的蛋白能夠與細胞膜表面的蛋白相結合，最終有利于細胞黏附、增殖。但是，具有納米結構的 CB-HA 能否作為骨組織工程材料，還需要進一步體內研究。
綜上述，通過控制轉化溶液中銨根離子濃度，可以在 CB-HA 表面獲得不同納米團簇表面形貌的多孔陶瓷。具有小尺寸納米團簇結構的 CB-HA 能更好地促進成骨細胞黏附、增殖以及 ALP 表達的能力，為后續 CB-HA 的應用研究提供了新的改性思路。
骨組織工程支架材料需具有大尺寸、高連通孔結構，以促進物質交換以及細胞遷移[1-4]。而以墨魚骨為基底制備的墨魚骨轉化羥基磷灰石多孔陶瓷（cuttlefish bone transformed hydroxyapatite，CB-HA）不僅具有大尺寸、高連通孔結構，還具有羥基磷灰石優異的生物相容性，能夠滿足骨組織工程材料結構和成分的要求[5-8]。然而細胞在 CB-HA 上的成骨基因表達不夠理想，有待進一步提高[9-10]。有研究表明，通過在材料表面引入納米結構，提高材料比表面積，能明顯增強材料對多種蛋白（如免疫球蛋白、玻璃體結合蛋白等）的吸附能力，進而提高細胞黏附、增殖以及成骨基因表達的能力[11]。但是目前有關調控 CB-HA 表面納米結構，探究其生物學性能的研究報道較少。為此，我們進行了本次實驗，旨在探討調控 CB-HA 表面納米結構的方法，分析 CB-HA 表面納米結構以及結構尺寸對成骨細胞黏附、增殖及 ALP 表達的影響。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
市售墨魚骨。MC3T3-E1 小鼠成骨細胞（中國科學院上海生命科學研究院）。NaClO、NH4Cl、Na2HPO4、六甲基二硅氮烷（分析純）、戊二醛［中國醫藥（集團）上海化學試劑公司］；MEM-α 培養基（GIBCO 公司，美國）；FBS（HyClone 公司，美國）；MTT 試劑盒（AMRESO 公司，美國）；0.25% 胰蛋白酶、pNPP 試劑盒（Sigma 公司，美國）；蛋白總量測試試劑盒（BioRad 公司，美國）。
X 射線衍射儀（Bruker 公司，德國）；380FT-IR 型傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 公司，美國）；715-ES 型電感耦合等離子體原子發射光譜（VARIAN 公司，美國）；S-4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；ET-320VP 孔隙率測試儀（北京儀特諾電子科技有限公司）；TRISTAR3000 比表面測試儀（Micromeritics 公司，美國）；EPOCH 酶標儀（BioTek 公司，美國）。
1.2 不同納米結構 CB-HA 的制備
將墨魚骨切割成直徑 10 mm、厚 2 mm 的圓片，置于去離子水中，在室溫下抽真空 1 h 使水充分注入墨魚骨后，轉至 1 mol/L NaClO 溶液中，室溫下放置 24 h 以去除材料表面有機成分。取出墨魚骨片，去離子水清洗 3 次，于去離子水中保存，備用。
根據處理條件不同，實驗分為 4 組。每組各取 4 g 制備的注水墨魚骨片與 15 mL 不同濃度磷源溶液（表 1）充分混合，置于水熱釜，放入烘箱于 120℃ 反應 24 h 后取出。取出后，組 1～3 材料清洗、烘干備用；組 4 進一步將材料置于管式爐中，于 1 200℃ 下燒結 3 h，去除其表面結構作為對照。
表1
CB-HA 轉化條件
Table1.
Reaction conditions of CB-HA
1.3 不同納米結構 CB-HA 物理化學性質表征
① 使用 X 射線衍射儀、傅里葉紅外光譜儀測試各組 CB-HA 的 X 射線衍射光譜、紅外線吸收光譜。② 將各組 CB-HA 研磨成粉末后濃鹽酸溶解稀釋，用電感耦合等離子體原子發射光譜分析其鈣磷比，計算轉換率。③ 掃描電鏡觀察各組 CB-HA 大孔結構及表面微納米結構。④ 使用孔隙率測試儀測試各組 CB-HA 孔隙率，使用比表面測試儀測試 CB-HA 比表面積以及孔徑分布。實驗重復 3 次。
1.4 不同納米結構 CB-HA 對成骨細胞的影響
1.4.1 細胞培養
取 MC3T3-E1 細胞系，加入完全培養液（含 10%FBS 的 MEM-α 培養基），置于 37℃、5%CO2 及 95% 飽和濕度的恒溫培養箱中培養，隔天換液。待細胞生長至 80%～90% 匯合度時，棄培養液，PBS 清洗 2～3 次，37℃、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化 1～3 min；加入完全培養液終止反應，用移液器反復吹打若干次。室溫下，以離心半徑 10 cm，1 200 r/min 離心 5 min，棄上清液后加入完全培養液重懸細胞，按 1∶4 比例進行傳代。
將各組 CB-HA 置于 48 孔板內，每孔 1 片。取第 4 代 MC3T3-E1 細胞接種于 CB-HA 上，每孔 8×103個細胞。置于 37℃、5%CO2 及 95% 飽和濕度的恒溫培養箱中培養，隔天換液。
1.4.2 細胞黏附觀察
培養 1 d，取出各組 CB-HA 置于 2.5% 戊二醛中，于 4℃ 冰箱中固定細胞 30 min，PBS 清洗 CB-HA 2 次，然后梯度脫水，分別用 30%、50%、70%、95%、100% 乙醇各脫水 5 min。最后六甲基二硅氮烷干燥、噴金，掃描電鏡觀察細胞形貌。
1.4.3 細胞增殖觀察
培養 1、3、7 d，采用 MTT 法分析細胞增殖情況。操作如下：在細胞培養液中加入 0.5 mg/mL MTT 染料孵化 4 h，然后加入 300 μL DMSO 反應 1 h，最后采用酶標儀于波長 490 nm 處測量吸光度（A）值，以實際測量值與空白板測量值的差值作為最終結果。實驗重復 3 次。
1.4.4 細胞 ALP 表達觀察
培養 7、14 d，通過 pNPP 法測試細胞 ALP 表達。操作如下：首先利用 0.2%（V/V）Triton-X/EDTA 裂解細胞，將細胞溶解物高速離心（離心半徑 6 cm，12 000 r/min 離心 5 min），然后取 100 μL 上清液和 200 μL pNPP 工作液在 37℃ 下反應 30 min，通過酶標儀在波長 405 nm 處測量 A 值。實驗重復 3 次。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 不同納米結構 CB-HA 物理化學性質表征
2.1.1 化學成分分析
X 射線衍射光譜顯示 4 組 CB-HA 均見羥基磷灰石的峰形，其中組 3、組 4 的結晶度更高。見圖 1a。紅外線吸收光譜顯示 4 組 CB-HA 的紅外吸收峰與羥基磷灰石一致；與組 1～3 相比，組 4 CB-HA 缺少 3 000～3 600 cm–1的水峰。見圖 1b。電感耦合等離子體原子發射光譜分析顯示，組 1～4 的 CB-HA 鈣磷比分為 1.76、1.72、1.73、1.68，轉換率分別為 94.9%、97.0%、96.5%、99.4%。
圖1
CB-HA 化學成分分析
a. X 射線衍射光譜；b. 紅外線吸收光譜
Figure1. Chemical composition analysis of CB-HAa. X-ray diffraction spectrum; b. Infrared absorption spectrum
2.1.2 物理性質分析
掃描電鏡觀察見，組 1 為大尺寸團簇結構，為厚度約 60 nm 的納米片組成的直徑約 3 μm 的團簇結構（圖 2a）；組 2 為中尺寸團簇結構，為厚度約 15 nm 的納米片組成的直徑約 2.5 μm 的團簇結構（圖 2b）；組 3 為小尺寸團簇結構，為厚度約 15 nm 的納米片組成的直徑約 2 μm 的團簇結構（圖 2c）；組 4 表面沒有明顯納米結構（圖 2d）。
圖2
CB-HA 掃描電鏡觀察
從左至右分別為放大 50、3 000、30 k 倍圖片 a. 組 1；b. 組 2；c.組 3；d. 組 4
Figure2. Morphological analysis of CB-HA by scanning electron microscopyFrom left to right for the magnifications of 50, 3 000, and 30 k times, respectively a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
組 1～4 CB-HA 的孔隙率分別為 95.3%±0.3%、94.9%±0.4%、95.1%±0.3%、95.5%±0.3%，組間比較差異無統計學意義（P>0.05）；比表面積為（23.1±0.2）、（30.3±0.6）、（34.1±0.4）、（8.2±0.1）m2/g，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。孔徑分布觀察，與組 4 表面沒有明顯納米結構的 CB-HA 相比，組 1～3 具有表面團簇結構的 CB-HA 具有更多的孔徑<50 nm 微孔，并且隨著納米團簇結構尺寸的減小，表面微孔逐漸增多。
2.2 不同納米結構 CB-HA 對成骨細胞的影響
2.2.1 細胞黏附觀察
培養 1 d 后掃描電鏡觀察見，在各組具有不同納米結構的 CB-HA 表面，MC3T3-E1 細胞伸展姿態不同。與組 1 以及組 4 相比，組 2 以及組 3 CB-HA 表面的 MC3T3-E1 細胞伸展出了更多絲狀偽足，細胞也有更好的伸展狀態。見圖 3。
圖3
培養 1 d 后掃描電鏡觀察 CB-HA 表面細胞形態
從左至右分別為放大 1.5 k、3 k、6 k 倍圖片 a. 組 1；b. 組 2；c.組 3；d. 組 4
Figure3. Morphological analysis of cells on CB-HA by scanning electron microscopyFrom left to right for the magnifications of 1.5 k, 3 k, and 6 k times, respectively a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
2.2.2 細胞增殖觀察
培養 1、3 d，各組未見細胞明顯增殖，組間 A 值比較差異無統計學意義（P>0.05）。7 d 時，各組均表現出更好的增殖情況；其中，組 2 及組 3 A 值明顯高于組 1 及組 4，差異有統計學意義（P<0.05）；組 2 及組 3 間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
MTT 檢測培養1、3、7 d 細胞增殖曲線
Figure4.
Cell proliferation evaluated by MTT assay after 1, 3, and 7 days of co-culture
2.2.3 細胞 ALP 表達
培養 7 d，組 1～4 MC3T3-E1 細胞 ALP 表達分別為 28.17±0.37、30.94±1.15、39.35±2.15、8.91±0.32，14 d 時分別為 40.19±4.14、61.27±3.10、66.99±4.01、23.13±2.70；各時間點組 3 的 ALP 表達顯著高于組 1、2、4，組 1、2 高于組 4，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
大量研究表明，在材料表面引入納米結構，能夠顯著提高材料的比表面積；而更大的比表面積能夠提高材料對周圍環境中離子、蛋白的吸附能力，從而促進細胞在材料表面的黏附、增殖以及成骨基因表達[11-14]。因此，本研究通過改變 CB-HA 表面納米結構的尺寸，旨在篩選更適合 MC3T3-E1 細胞黏附、增殖以及促進 ALP 表達的 CB-HA 表面納米結構。
材料制備與表征結果表明，隨著轉化溶液中銨根離子濃度的增加，CB-HA 表面的納米團簇結構尺寸縮小、片狀結構變薄，因此比表面積隨之增加。其原因可能是羥基磷灰石晶體的 c 面富含磷酸根和羥基，因此帶負電荷；其 a 面富含鈣離子，因此帶正電[15]。在羥基磷灰石生長體系中，某些離子、氨基酸能夠吸附在羥基磷灰石特定晶面上，抑制羥基磷灰石特定晶面的生長，進而達到調控其表面結構的作用[16-19]。在本研究中可能是銨根離子與帶負電荷的 c 面相結合，導致 c 面的生長被抑制，從而使 CB-HA 表面團簇結構越來越薄，整體尺寸也越來越小。并且，隨著 CB-HA 表面團簇結構的減小，出現了更多孔徑在 10 μm 以下的微孔，因此材料的比表面積也隨之提高。
細胞實驗表明，具有小尺寸團簇結構的 CB-HA 最有利于 MC3T3-E1 細胞黏附、增殖以及促進 ALP 表達，提示減小表面納米結構的尺寸有利于細胞的黏附、增殖以及成骨分化。分析可能是因為隨著納米結構尺寸的減小，材料的比表面積增加，因此材料表面具有更多的蛋白吸附位點。前期研究已經證明，在共培養環境中，具有納米結構的材料首先能夠與周圍環境相作用吸收環境中蛋白，如免疫球蛋白、玻璃體結合蛋白等[11-14, 20-22]，之后材料上吸附的蛋白能夠與細胞膜表面的蛋白相結合，最終有利于細胞黏附、增殖。但是，具有納米結構的 CB-HA 能否作為骨組織工程材料，還需要進一步體內研究。
綜上述，通過控制轉化溶液中銨根離子濃度，可以在 CB-HA 表面獲得不同納米團簇表面形貌的多孔陶瓷。具有小尺寸納米團簇結構的 CB-HA 能更好地促進成骨細胞黏附、增殖以及 ALP 表達的能力，為后續 CB-HA 的應用研究提供了新的改性思路。
