引用本文： 郭鳳鳳, 于曉波, 孫中泱, 潘博, 蔣海越. 微型高頻針狀電極刺激輔助活體軟骨重塑形的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(5): 601-605. doi: 10.7507/1002-1892.201807032 復制
耳畸形是臨床常見的先天性顱頜面畸形之一，其中軟骨畸形是引起耳畸形最重要的因素。耳軟骨是一種彈性軟骨，主要由軟骨細胞、軟骨基質、彈性纖維等構成，這種組成決定了耳軟骨不容易機械塑形。1993 年 Helidonis 等[1]首次報道了激光輔助軟骨重塑形技術（laser-assisted cartilage reshaping，LACR），指出激光所產生的熱效應對軟骨有重塑形作用。之后，學者們嘗試使用該技術對招風耳畸形、鼻中隔偏曲畸形等顱頜面畸形進行矯治[2-6]。2006 年 Trelles 等[2]首次將 LACR 用于人招風耳畸形的矯治，獲得滿意效果。但因招風耳畸形矯治所用的激光參數尚無統一標準，影響了該技術在臨床的廣泛應用。此外，學者們發現在激光、射頻、直流電壓或者接觸熱源的情況下，離體或活體軟骨均會出現軟骨變軟并重塑形的情況[7-13]，為耳畸形矯治帶來新的思路。本研究擬采用微型高頻針狀電極刺激輔助兔耳軟骨重塑形，通過觀察組織學變化，分析微型高頻針狀電極熱效應對軟骨重塑形的作用，探討其作為耳畸形矯治方法的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要儀器
5～6 月齡雄性新西蘭白兔 5 只，體質量（2.0±0.5）kg，由北京協和醫學院中國醫學科學院整形外科醫院實驗動物中心提供。所有動物實驗均經北京協和醫學院中國醫學科學院整形外科醫院動物倫理委員會批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2015-0009。
ERBE VIO 300S 電外科工作站、ERBE NESSYΩ 一次性分片式負極板（型號 20193-083）［德國愛爾博（上海）醫療器械有限公司］；Colorado N103A 微型高頻針狀電極（微型鎢針）［美國史賽克（中國）有限公司］；發生器（與消融電極配合使用）（深圳市美成醫療用品有限公司）；全景掃描儀（3D HISTECH 公司，匈牙利）；Image-Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗方法
實驗采用自身對照。5 只新西蘭白兔隨機取一側耳作為實驗組；于微型高頻針狀電極刺激前 1 d 兔耳局麻下脫毛，沿 5 號注射器針筒（直徑 12 mm）塑形，針線固定。采用微型高頻針狀電極刺激耳塑形區，電極選用電凝模式（參數設置為 COAG：25，Effect：2），電極刺激層次經軟骨膜穿透軟骨層，微型高頻針狀電極刺激條帶垂直于兔耳長軸（刺激點間距約 2 mm，刺激條帶間距約 10 mm）。于針孔處涂抹紅霉素軟膏，預防傷口感染。另一側僅采用針筒固定塑形，不接受微型高頻針狀電極刺激，作為對照組。見圖 1。
圖1
兔耳模型
左側為實驗組（箭頭示微型針狀電極刺激區域），右側為對照組
Figure1. The rabbit ear modelLeft ear for experimental group (arrow indicated the microdissection needle insertion sites), right ear for control group
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
電極刺激后即刻及 4 周時觀察實驗組兔耳皮膚反應。4 周時拆除固定塑形裝置，觀察兩組兔耳塑形區形態。
1.3.2 組織學觀察
電極刺激后 8 周，切取兩組兔耳軟骨標本，制成 4 μm 厚切片，HE 染色。全景掃描儀掃描后，觀察軟骨細胞和基質變化。隨機選取 3 處不同區域，高倍鏡下采用 Image-Pro Plus 6.0 軟件測量軟骨細胞層厚度，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
5 只新西蘭白兔均存活至實驗完成，術區皮膚未發生感染、潰爛和壞死等情況。實驗組：與電極刺激后即刻比較，4 周時皮膚已完全愈合，刺激針孔已消失。拆除固定塑形裝置后即刻兩組均有明顯塑形效果，8 h 后均部分恢復原形態；24 h 后對照組基本恢復原形態，而實驗組保持一定塑形形態，且一直維持至 8 周取材時。見圖 2。
圖2
兩組兔耳形態大體觀察
從左至右分別為電極刺激后 4 周及 8 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure2. Gross observation of rabbit ears in the two groupsFrom left to right for 4 and 8 weeks after stimulation a. Control group; b. Experimental group
2.2 組織學觀察
HE 染色示，對照組軟骨帶平滑，細胞分布均勻，基質染色基本一致，表皮、真皮、軟骨顯示正常組織學表現。實驗組可見軟骨細胞明顯增生、增大，細胞層數增厚；微型高頻電極刺激針孔處尚可見局部軟骨細胞損傷變性，結締組織中有壞死細胞及炎性細胞浸潤。見圖 3。對照組軟骨細胞層厚度為（385.714±2.027）μm，實驗組為（1 594.732±1.872）μm，兩組差異有統計學意義（t=–759.059，P=0.000）。
圖3
電極刺激后 8 周兩組 HE 染色觀察（×100）
a. 對照組；b. 實驗組 黑箭頭示局部軟骨細胞損傷變性，紅箭頭示結締組織中壞死細胞，黃箭頭示炎性細胞
Figure3. HE staining observation of the two groups at 8 weeks after stimulation (×100)a. Control group; b. Experimental group Black arrow indicated the degeneration and injury of cartilage cells, red arrow indicated the connective tissue with necrotic cells, and yellow arrow indicated the inflammatory cells
3 討論
3.1 LACR 技術作用機制
1993 年 Helidonis 等[1]首次報道了 LACR 技術，隨后學者們對該技術進行了不斷嘗試及研究，發現軟骨的生物力學、細胞增殖和分化具有溫度依賴性，在一定溫度范圍內會產生應力松弛，從而導致軟骨形狀的改變[14-16]。Helidonis 等[1]和 Hajiioannou 等[17]認為其作用機制是 65～75℃ 溫度下通過增加軟骨順應性來實現重塑形；Mordon 等[14]和 Trelles 等[2]則認為在激光等熱力作用下軟骨細胞的分裂、增殖是長期維持重塑形軟骨形狀的主要因素。目前普遍認為 LACR 技術是通過熱力引導的應力松弛來改變軟骨形態，從而達到重塑形目的[1, 7, 15]。微觀上主要有 3 種假說：① 熱力作用下，糖蛋白中的硫酸軟骨素鏈斷裂和再聚合反應改變了蛋白多糖的結構，繼而發生應力松弛；② 在熱力作用下，糖蛋白分子發生非變性解聚和再聚合反應導致軟骨基質空間結構改變，而細胞外基質未變性，從而發生應力松弛；③ 熱力作用下，鈣離子、鈉離子非選擇性結合軟骨組織內膠原及糖蛋白中的負電荷基團，引起軟骨局部礦化，發生應力松弛。但關于熱力作用的確切分子機制尚無定論，仍需進一步深入研究。有關創傷修復作用在軟骨重塑形方面有多大作用、軟骨膜及軟骨損傷修復對重塑形的影響，目前尚未見文獻報道。
3.2 組織形態學變化
根據軟骨的熱力學機制特性，學者陸續研究出應用射頻[8-9]、電流[10-13, 18-19]、激光[2-7, 14-15, 20-22]等對軟骨進行重塑形。本研究亦是根據該原理，應用微型高頻針狀電極對兔耳軟骨進行重塑形，目前尚無相關研究報道。Holden 等[20]的研究表明，單純機械塑形后，兔耳 HE 染色未見異常，軟骨細胞分布符合正常兔耳組織學表現，未見纖維增生及形態改變。本研究結果與 Holden 等的研究結果一致，在沒有激光或者微型高頻電極刺激等熱力作用下，機械塑形短期內（如 24 h）雖然可以部分重塑形軟骨，但不會長期維持塑形形態，也不會改變其組織形態學表現。而在激光或者直流電作用下兔耳軟骨會出現軟骨細胞增生、細胞層數增厚、基質染色加深[14, 19-23]，本研究結果與之一致。Leclère 等[24]報道這種組織學變化同樣可見于 LACR 矯正人招風耳畸形中的人耳軟骨中，并且指出這種變化是由于激光或直流電刺激區域軟骨溫度升高，導致生長因子協調表達的結果，TGF-β1 是其中起主要作用的因子之一。Mordon 等[14]認為軟骨細胞再生說明激光穿透深度和軟骨溫度升高可能達到重塑形要求的最優參數范圍，同時這可能也是軟骨可長久保持重塑形狀態的原因，值得進一步深入探究。
同時我們研究發現，在微型高頻電極刺激的針孔區域除可見軟骨新生帶形成外，局部軟骨細胞損傷變性、結締組織中有壞死細胞及炎性細胞浸潤，說明電極刺激區域的局部耳組織產生了不可逆性損傷，同時也說明軟骨重塑形的機制與創傷修復無明顯關系。有關不可逆性損傷的具體原因尚不清楚，主要考慮有以下兩方面原因：一方面，由于國內外尚未見微型高頻針狀電極刺激相關報道，缺乏實驗相關參考依據，因此我們根據中國醫學科學院整形外科醫院蔣海越教授團隊在臨床人耳手術過程中使用微型高頻針狀電極的經驗，采用電凝模式（參數設置為 COAG：25，Effect：2）對兔耳軟骨進行刺激和重塑形，但兔耳和人耳組織存在一定差別。此外，由于本研究實驗動物有限，僅以實驗組及對照組進行比較，無法確定是否為能量過高導致局部不可逆性損傷，后續需對比分析不同參數的電凝模式結果，從而尋找微型高頻針狀電極輔助的 LACR 技術最優參數范圍。另一方面，與 Mordon 等[14]、Holden 等[20]、Chlebicki 等[21]、Leclère 等[24]的研究不同，本實驗過程中未采用快速冷卻系統對刺激區域局部進行及時冷卻處理，而是借助空氣對流作用自動冷卻，因此這種組織學變化可能是刺激后局部區域即時熱力損傷所致，后續實驗會考慮加入快速冷卻系統，對比分析病理結果。
綜上述，本研究結果顯示微型高頻針狀電極刺激對兔耳軟骨進行重塑形所產生的組織學變化，與既往采用激光、直流電等輔助技術所產生結果基本一致。但本研究樣本量有限，觀測指標單一，接下來需要擴大實驗樣本量進一步證實本研究是否具有可重復性，并分析導致軟骨變形的分子機制；設置多個能量參數進行實驗觀察，明確最佳能量參數范圍，為下一步臨床試驗奠定基礎。
耳畸形是臨床常見的先天性顱頜面畸形之一，其中軟骨畸形是引起耳畸形最重要的因素。耳軟骨是一種彈性軟骨，主要由軟骨細胞、軟骨基質、彈性纖維等構成，這種組成決定了耳軟骨不容易機械塑形。1993 年 Helidonis 等[1]首次報道了激光輔助軟骨重塑形技術（laser-assisted cartilage reshaping，LACR），指出激光所產生的熱效應對軟骨有重塑形作用。之后，學者們嘗試使用該技術對招風耳畸形、鼻中隔偏曲畸形等顱頜面畸形進行矯治[2-6]。2006 年 Trelles 等[2]首次將 LACR 用于人招風耳畸形的矯治，獲得滿意效果。但因招風耳畸形矯治所用的激光參數尚無統一標準，影響了該技術在臨床的廣泛應用。此外，學者們發現在激光、射頻、直流電壓或者接觸熱源的情況下，離體或活體軟骨均會出現軟骨變軟并重塑形的情況[7-13]，為耳畸形矯治帶來新的思路。本研究擬采用微型高頻針狀電極刺激輔助兔耳軟骨重塑形，通過觀察組織學變化，分析微型高頻針狀電極熱效應對軟骨重塑形的作用，探討其作為耳畸形矯治方法的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要儀器
5～6 月齡雄性新西蘭白兔 5 只，體質量（2.0±0.5）kg，由北京協和醫學院中國醫學科學院整形外科醫院實驗動物中心提供。所有動物實驗均經北京協和醫學院中國醫學科學院整形外科醫院動物倫理委員會批準，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2015-0009。
ERBE VIO 300S 電外科工作站、ERBE NESSYΩ 一次性分片式負極板（型號 20193-083）［德國愛爾博（上海）醫療器械有限公司］；Colorado N103A 微型高頻針狀電極（微型鎢針）［美國史賽克（中國）有限公司］；發生器（與消融電極配合使用）（深圳市美成醫療用品有限公司）；全景掃描儀（3D HISTECH 公司，匈牙利）；Image-Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗方法
實驗采用自身對照。5 只新西蘭白兔隨機取一側耳作為實驗組；于微型高頻針狀電極刺激前 1 d 兔耳局麻下脫毛，沿 5 號注射器針筒（直徑 12 mm）塑形，針線固定。采用微型高頻針狀電極刺激耳塑形區，電極選用電凝模式（參數設置為 COAG：25，Effect：2），電極刺激層次經軟骨膜穿透軟骨層，微型高頻針狀電極刺激條帶垂直于兔耳長軸（刺激點間距約 2 mm，刺激條帶間距約 10 mm）。于針孔處涂抹紅霉素軟膏，預防傷口感染。另一側僅采用針筒固定塑形，不接受微型高頻針狀電極刺激，作為對照組。見圖 1。
圖1
兔耳模型
左側為實驗組（箭頭示微型針狀電極刺激區域），右側為對照組
Figure1. The rabbit ear modelLeft ear for experimental group (arrow indicated the microdissection needle insertion sites), right ear for control group
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
電極刺激后即刻及 4 周時觀察實驗組兔耳皮膚反應。4 周時拆除固定塑形裝置，觀察兩組兔耳塑形區形態。
1.3.2 組織學觀察
電極刺激后 8 周，切取兩組兔耳軟骨標本，制成 4 μm 厚切片，HE 染色。全景掃描儀掃描后，觀察軟骨細胞和基質變化。隨機選取 3 處不同區域，高倍鏡下采用 Image-Pro Plus 6.0 軟件測量軟骨細胞層厚度，取均值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
5 只新西蘭白兔均存活至實驗完成，術區皮膚未發生感染、潰爛和壞死等情況。實驗組：與電極刺激后即刻比較，4 周時皮膚已完全愈合，刺激針孔已消失。拆除固定塑形裝置后即刻兩組均有明顯塑形效果，8 h 后均部分恢復原形態；24 h 后對照組基本恢復原形態，而實驗組保持一定塑形形態，且一直維持至 8 周取材時。見圖 2。
圖2
兩組兔耳形態大體觀察
從左至右分別為電極刺激后 4 周及 8 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure2. Gross observation of rabbit ears in the two groupsFrom left to right for 4 and 8 weeks after stimulation a. Control group; b. Experimental group
2.2 組織學觀察
HE 染色示，對照組軟骨帶平滑，細胞分布均勻，基質染色基本一致，表皮、真皮、軟骨顯示正常組織學表現。實驗組可見軟骨細胞明顯增生、增大，細胞層數增厚；微型高頻電極刺激針孔處尚可見局部軟骨細胞損傷變性，結締組織中有壞死細胞及炎性細胞浸潤。見圖 3。對照組軟骨細胞層厚度為（385.714±2.027）μm，實驗組為（1 594.732±1.872）μm，兩組差異有統計學意義（t=–759.059，P=0.000）。
圖3
電極刺激后 8 周兩組 HE 染色觀察（×100）
a. 對照組；b. 實驗組 黑箭頭示局部軟骨細胞損傷變性，紅箭頭示結締組織中壞死細胞，黃箭頭示炎性細胞
Figure3. HE staining observation of the two groups at 8 weeks after stimulation (×100)a. Control group; b. Experimental group Black arrow indicated the degeneration and injury of cartilage cells, red arrow indicated the connective tissue with necrotic cells, and yellow arrow indicated the inflammatory cells
3 討論
3.1 LACR 技術作用機制
1993 年 Helidonis 等[1]首次報道了 LACR 技術，隨后學者們對該技術進行了不斷嘗試及研究，發現軟骨的生物力學、細胞增殖和分化具有溫度依賴性，在一定溫度范圍內會產生應力松弛，從而導致軟骨形狀的改變[14-16]。Helidonis 等[1]和 Hajiioannou 等[17]認為其作用機制是 65～75℃ 溫度下通過增加軟骨順應性來實現重塑形；Mordon 等[14]和 Trelles 等[2]則認為在激光等熱力作用下軟骨細胞的分裂、增殖是長期維持重塑形軟骨形狀的主要因素。目前普遍認為 LACR 技術是通過熱力引導的應力松弛來改變軟骨形態，從而達到重塑形目的[1, 7, 15]。微觀上主要有 3 種假說：① 熱力作用下，糖蛋白中的硫酸軟骨素鏈斷裂和再聚合反應改變了蛋白多糖的結構，繼而發生應力松弛；② 在熱力作用下，糖蛋白分子發生非變性解聚和再聚合反應導致軟骨基質空間結構改變，而細胞外基質未變性，從而發生應力松弛；③ 熱力作用下，鈣離子、鈉離子非選擇性結合軟骨組織內膠原及糖蛋白中的負電荷基團，引起軟骨局部礦化，發生應力松弛。但關于熱力作用的確切分子機制尚無定論，仍需進一步深入研究。有關創傷修復作用在軟骨重塑形方面有多大作用、軟骨膜及軟骨損傷修復對重塑形的影響，目前尚未見文獻報道。
3.2 組織形態學變化
根據軟骨的熱力學機制特性，學者陸續研究出應用射頻[8-9]、電流[10-13, 18-19]、激光[2-7, 14-15, 20-22]等對軟骨進行重塑形。本研究亦是根據該原理，應用微型高頻針狀電極對兔耳軟骨進行重塑形，目前尚無相關研究報道。Holden 等[20]的研究表明，單純機械塑形后，兔耳 HE 染色未見異常，軟骨細胞分布符合正常兔耳組織學表現，未見纖維增生及形態改變。本研究結果與 Holden 等的研究結果一致，在沒有激光或者微型高頻電極刺激等熱力作用下，機械塑形短期內（如 24 h）雖然可以部分重塑形軟骨，但不會長期維持塑形形態，也不會改變其組織形態學表現。而在激光或者直流電作用下兔耳軟骨會出現軟骨細胞增生、細胞層數增厚、基質染色加深[14, 19-23]，本研究結果與之一致。Leclère 等[24]報道這種組織學變化同樣可見于 LACR 矯正人招風耳畸形中的人耳軟骨中，并且指出這種變化是由于激光或直流電刺激區域軟骨溫度升高，導致生長因子協調表達的結果，TGF-β1 是其中起主要作用的因子之一。Mordon 等[14]認為軟骨細胞再生說明激光穿透深度和軟骨溫度升高可能達到重塑形要求的最優參數范圍，同時這可能也是軟骨可長久保持重塑形狀態的原因，值得進一步深入探究。
同時我們研究發現，在微型高頻電極刺激的針孔區域除可見軟骨新生帶形成外，局部軟骨細胞損傷變性、結締組織中有壞死細胞及炎性細胞浸潤，說明電極刺激區域的局部耳組織產生了不可逆性損傷，同時也說明軟骨重塑形的機制與創傷修復無明顯關系。有關不可逆性損傷的具體原因尚不清楚，主要考慮有以下兩方面原因：一方面，由于國內外尚未見微型高頻針狀電極刺激相關報道，缺乏實驗相關參考依據，因此我們根據中國醫學科學院整形外科醫院蔣海越教授團隊在臨床人耳手術過程中使用微型高頻針狀電極的經驗，采用電凝模式（參數設置為 COAG：25，Effect：2）對兔耳軟骨進行刺激和重塑形，但兔耳和人耳組織存在一定差別。此外，由于本研究實驗動物有限，僅以實驗組及對照組進行比較，無法確定是否為能量過高導致局部不可逆性損傷，后續需對比分析不同參數的電凝模式結果，從而尋找微型高頻針狀電極輔助的 LACR 技術最優參數范圍。另一方面，與 Mordon 等[14]、Holden 等[20]、Chlebicki 等[21]、Leclère 等[24]的研究不同，本實驗過程中未采用快速冷卻系統對刺激區域局部進行及時冷卻處理，而是借助空氣對流作用自動冷卻，因此這種組織學變化可能是刺激后局部區域即時熱力損傷所致，后續實驗會考慮加入快速冷卻系統，對比分析病理結果。
綜上述，本研究結果顯示微型高頻針狀電極刺激對兔耳軟骨進行重塑形所產生的組織學變化，與既往采用激光、直流電等輔助技術所產生結果基本一致。但本研究樣本量有限，觀測指標單一，接下來需要擴大實驗樣本量進一步證實本研究是否具有可重復性，并分析導致軟骨變形的分子機制；設置多個能量參數進行實驗觀察，明確最佳能量參數范圍，為下一步臨床試驗奠定基礎。
