在脊髓損傷再生修復的研究中，膠質瘢痕一直是非常重要的研究方向。幾十年來，主流觀念普遍認為膠質瘢痕是神經再生的物理屏障，而且其分泌的抑制因子會阻礙神經纖維再生。隨著技術發展和研究深入，脊髓損傷修復研究領域許多傳統主流觀念都受到了新生力量的沖擊，對膠質瘢痕的認識也不例外。該文簡要回顧自 20 世紀 30 年代至今數代研究人員對脊髓損傷后膠質瘢痕組織的研究歷史，并綜述膠質瘢痕在神經再生與功能重建方面作用的爭議及進展。希望能更好梳理和認清膠質瘢痕在脊髓損傷后的角色及定位，以期有效助力攻克脊髓損傷修復這一世界難題。
引用本文： 李星, 李佳音, 肖志峰, 戴建武. 脊髓損傷后膠質瘢痕在神經再生過程中作用的探討. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(8): 973-978. doi: 10.7507/1002-1892.201806093 復制
如今，涉及到脊髓損傷、病變及其治療修復相關的研究論文或評述，大都會談及膠質瘢痕的產生、形成及其在神經再生與功能修復過程中所扮演的角色[1-5]。長久以來的主流觀點普遍認為，成熟的瘢痕應該是阻止神經纖維再生跨越并與原始靶標重新產生神經聯系的一道物理屏障。此外，瘢痕組織中分泌的某些外基質分子也被證實具有抑制神經軸突生長的作用。因此，自 20 世紀 30 年代至今，瘢痕在神經再生過程中主要被認為是負面抑制角色。隨著研究的不斷深入，人們對瘢痕角色的認識在不斷深入，越發清晰明朗，但至今仍無定論。事實上，不僅僅是瘢痕組織在脊髓損傷修復中的角色，包括影響脊髓損傷后神經再生的主要原因之爭，在近百年間也有過數次變遷。爭論之后，回顧歷史，或許能讓我們更好地梳理和認清許多理論和觀念是如何產生、發展、篩選、淘汰、檢驗、完善、更新進步，直到成熟的。
1 膠質瘢痕是什么？
膠質瘢痕這個概念一直以來就含混不清，目前急需一個明確的界定。脊髓損傷后，損傷部位附近的星形膠質細胞會響應損傷信號而迅速活化為反應性星形膠質細胞。這類細胞與表達 NG2（neuron/glia antigen 2）的少突膠質前體細胞和小膠質細胞一起在損傷組織附近形成一圈致密的邊界結構，將整個損傷區域封閉隔離起來。而被封閉的損傷區內，在炎性反應穩定后，則聚集有許多不同來源且異質性很強的非神經類型細胞，具體包括與血管伴行的周細胞、脊膜及其他來源的成纖維細胞、MSCs、外周血來源的各種免疫細胞等[6]；也有研究表明，脊髓室管膜細胞響應損傷后增殖產生的星形膠質細胞（這類細胞表現為膠質纖維酸性蛋白陰性）也會出現在損傷核心區內[7]。因此，瘢痕組織的形成是一個進行性的、時間和成分上動態變化的過程。而膠質瘢痕這個名詞，許多年來一直含混地代表整個由反應性星形膠質細胞形成的致密邊界及其包裹的損傷核心區域。但是不難發現，損傷核心區域內神經細胞只占極其有限的一小部分，甚至在有些損傷模型中幾乎檢測不到其存在。基于此，有許多研究人員將損傷核心區域內的瘢痕組織稱為纖維性瘢痕或者間質性瘢痕[4]。而真正的膠質瘢痕應該是指損傷核心區外圍形成致密隔離作用的數個細胞厚度的那層膠質細胞的聚合結構。
近十多年來，膠質細胞在中樞神經系統中生理功能的異質性和復雜性已有了深入的研究。除了大量的反應性星形膠質細胞之外，膠質瘢痕內還包含兩類膠質細胞——NG2 細胞和小膠質細胞，這兩類細胞在損傷后均有別于各自常態下特征。
1983 年 Raff 等[8]首次發現 NG2 細胞，這類細胞在體外培養環境中會分化為少突膠質細胞或星形膠質細胞，被稱為 NG2 前體細胞，也被稱為少突膠質細胞-2 型星形膠質細胞祖細胞（O2A）。后續研究發現，NG2 細胞雖然在發育過程中能夠在腦部特定區域分化為星形膠質細胞，但在成體中樞神經系統中只能檢測到其向少突膠質細胞而非星形膠質細胞分化[9-10]。也有少數研究表明，成體大腦中的 NG2 細胞具有向神經元分化的潛力[11-12]，但是該研究結果還需要更多的證據進一步證實[13]。最近研究結果表明，在脊髓損傷后，NG2 細胞的分化潛能會被激活，除了少突膠質細胞外，還可以分化為星形膠質細胞及雪旺細胞[14]。研究表明，不同脊髓損傷模型中 NG2 細胞向星形膠質細胞分化的特性和比例存在一定差異。例如在脊髓挫傷模型中，NG2 細胞分化為星形膠質細胞的比例相對很高（25%），但在其他不同類型脊髓損傷模型中的分化比例則相對較低：背側半橫斷僅為 5%，皮質刺傷 5%～8%，局灶性脫髓鞘 3%，實驗性自身免疫性腦髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）1%，肌萎縮性脊髓側索硬化癥模型中幾乎檢測不到 NG2 細胞向星形膠質細胞的分化[14]。最近，邁阿密大學醫學院的 Lee 團隊利用遺傳譜系示蹤技術，分別考察了在脊髓挫傷模型和 EAE 兩種小鼠脊髓損傷模型下 NG2 細胞的遺傳命運圖譜，并考察其向星形膠質細胞分化的能力[14]。他們發現 NG2 細胞向星形膠質細胞的分化能力確因不同脊髓損傷模型而存在差異，在挫傷模型中，損傷后 4 周星形膠質細胞占膠質瘢痕中 NG2 細胞譜系總數的 25% 左右；但在 EAE 模型中，星形膠質細胞占膠質瘢痕中 NG2 細胞譜系總數的 9% 左右。提示在既往研究中低估了 NG2 膠質細胞來源的星形膠質細胞的可能性，同時也表明 NG2 細胞在不同脊髓損傷模型中具有復雜的響應或激活機制。
脊髓損傷后，損傷局部的星形膠質細胞響應損傷而轉變為反應性星形膠質細胞，后者進一步成熟為瘢痕樣星形膠質細胞，最終在損傷區域周圍形成致密的膠質瘢痕。這類反應性星形膠質細胞也被稱為 A1 型星形膠質細胞，它們并不能為損傷后殘存的神經元提供營養支持與保護，也不具有吞噬髓鞘碎片的能力，反而會殺死損傷的神經元和少突膠質細胞[15]。其廣泛存在于阿爾茲海默癥、亨廷頓舞蹈癥、帕金森氏癥、肌肉側索硬化以及多發性硬化等多種神經退行性疾病中。近期美國斯坦福大學醫學院神經生物學系 Barres 團隊的實驗結果證實，脊髓損傷后，正是損傷處激活的小膠質細胞通過分泌 IL-1α、TNF 和 C1q 3 種細胞因子，誘導 A1 型反應性星形膠質細胞的產生[15]。
小膠質細胞是脊髓中具有免疫特性的細胞，其數量占中樞神經膠質細胞總數的 5%～20%[16]。脊髓損傷后，小膠質細胞會迅速被激活，并類似于反應性星形膠質細胞，可轉化為兩種不同的功能狀態：經典激活型（M1 型）和選擇激活型（M2 型）[17]。其中 M1 型細胞具有促炎性反應及神經毒性作用，會進一步加重脊髓損傷，同時 M1 型細胞也是 A1 型反應性星形膠質細胞的重要誘導來源；M2 型細胞具有一定的神經營養和神經保護作用，促進脊髓損傷后神經再生與功能修復[18]。脊髓損傷后，損傷部位的小膠質細胞可能會依據損傷程度及損傷類型，激活產生不同類型和比例的小膠質細胞。對于修復不利的 M1 型和有益于神經再生的 M2 型小膠質細胞的相對比例和分布，或許是機體響應局部損傷微環境達到的某種動態平衡的結果。有研究表明 IFN-γ 和脂多糖-TLR4 能夠誘導小膠質細胞向 M1 型轉換；IL-4、IL-13、IL-10 及 TLRs 則可刺激誘導 M2 型小膠質細胞的產生，參與免疫調節、抗炎性反應、細胞碎片清除、軸突再生及損傷修復等[19-20]。因此，干預或影響脊髓損傷后 M1 型和 M2 型之間的轉變，或許是為了實現神經再生和功能修復的一個潛在具有臨床應用價值的修復策略[21]。
2 膠質瘢痕是物理屏障源自臆測？
20 世紀初，現代神經科學之父 Santiago Ramón y Cajal 根據著名的外周神經移植物能誘導中樞神經細胞的神經軸突再生長入實驗，提出了趨化因子理論，來解釋中樞神經系統再生困難的原因[22]。他認為，中樞神經系統損傷后可能存在或缺乏某種對神經纖維再生必不可少的相關趨化因子。此概念暗示中樞神經系統可能相較外周神經系統存在一些抑制神經再生的因素，或者缺乏一些能促進神經再生的因素。
至 20 世紀四五十年代，有一些研究人員開始觀察到，損傷后的軸突總是無法再生穿越上述由損傷后形成的結締組織樣的膠質瘢痕區域，而且許多神經軸突似乎停止在膠質瘢痕邊緣，無法長入[4]。由此，人們推測是致密的瘢痕組織本身形成了一個阻礙軸突穿越再生的物理障礙。1954 年 Clemente 等[23]研究表明，當用藥物衰減貓脊髓損傷部位膠質瘢痕的形成，能觀察到更多神經軸突再生及脊髓損傷后貓的行為學改善。但此結果并未被人信服。在該論文發表后 2 年，Arteta[24]在同一期刊刊文，稱 Clemente 等報道的再生結果及功能恢復無法驗證。二十多年后仍有研究者在重復這一實驗結果[25]，遺憾的是同樣也無法重復出陽性結果。但是瘢痕組織是神經再生的物理障礙這一觀念非常直觀明了，難以讓人輕易否決。
3 膠質瘢痕產生的硫酸軟骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）是抑制軸突再生的因素之一
受限于 20 世紀 50～80 年代細胞干預技術和實驗分析手段，并沒有太多令人信服的實驗來多角度驗證膠質瘢痕作為神經軸突再生障礙角色的科學性。直至 20 世紀 90 年代后，隨著手術精細程度提升，分離鑒定手段突飛猛進，顯微觀察示蹤術的發展，圍繞膠質瘢痕的研究也在不斷向前推進。Cajal 的理論自提出至上世紀 90 年代，數代科研人員雖然未能篩選和尋找到中樞神經系統中有利再生的因素，但是卻陸續發現了不少起抑制作用的蛋白因素，例如 Nogo 蛋白、髓鞘堿性蛋白和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白等[26-28]。在此期間，Martin Schwab 實驗室引領了 1980s–2000s 時期脊髓損傷修復領域以外界抑制因素為主要歸因的研究高潮。
在抑制類蛋白因素中，瘢痕組織中由反應性星形膠質細胞及其他細胞大量表達的 CSPGs 細胞外基質分子，在此期間被視為是主要影響軸突再生的抑制因素之一。1991 年，凱斯西儲大學 Jerry Silver 實驗室通過體外實驗表明，脊髓損傷后瘢痕組織中反應性星形膠質細胞來源的 CSPGs 在體外能抑制神經軸突的生長，暗示其在體內可能的神經再生抑制角色[29]。之后，劍橋大學國王學院 James Fawcett 實驗室研究表明，通過施加硫酸軟骨素酶 ABC（chondroitinase ABC，ChABC）消化損傷區瘢痕組織內 CSPGs 分子使其失去活性，可以有效促進脊髓損傷動物的運動功能恢復[30]；此外，他們還觀察到損傷部位附近明顯的神經軸突出芽再生。此后，James Fawcett 實驗室一直致力于 ChABC 治療脊髓損傷的臨床推廣。后續的許多研究也較好地重復驗證了 ChABC 在治療脊髓損傷上的效果[31-35]。
近年，Jerry Silver 實驗室的研究結果還顯示，當軸突中的蛋白酪氨酸磷酸酶 σ（protein tyrosine phosphatase σ，PTPσ）與膠質瘢痕中 CSPGs 相互作用時，會阻止軸突生長。他們設計了名為細胞內 σ 肽段（可作為 PTPσ 的模擬肽）的拮抗劑來阻斷 PTPσ 與 CSPGs 的結合，皮下注射該藥物后能使脊髓損傷的癱瘓小鼠恢復軸突再生，并可有效改善運動和膀胱功能[36]。
由此可見，膠質瘢痕及其分泌物 CSPGs 可能通過本身形成物理屏障，以及通過某種抑制信號導致軸突再生障礙和再生軸突的再髓鞘化障礙，來負面影響脊髓損傷后神經功能再生。
4 為膠質瘢痕及 CSPGs 抑制角色的抗辯
膠質瘢痕本身及其分泌的外基質成分 CSPGs 是否就是軸突難以再生的抑制因素之一，從一開始就面臨著諸多質疑。否認 CSPGs 抑制角色觀點的研究人員認為，無論是酶切消化 CSPGs 的側鏈，還是對其所謂抑制軸突再生的信號通路進行拮抗和衰減，雖然檢測到一定的神經功能恢復，卻并無體內確切證據顯示運動神經纖維能跨越瘢痕組織進行長距離再生。此外，CSPGs 能體內抑制神經軸突再生的結論也不是一成不變的，加州大學圣迭戈分校的 Mark Tuszynski 教授團隊發現，少部分軸突是可以再生長入瘢痕組織之中的，而且這類瘢痕組織能檢測到 NG2（又名 CSPG4，是由瘢痕區內大量少突膠質前體細胞，即 NG2 細胞，所分泌的 CSPGs 的主要類型）、L1、層粘連蛋白和神經細胞黏附分子等諸多細胞外基質蛋白的表達。上述細胞外基質分子中，除了 NG2 被視為抑制分子外，后三類細胞黏附因子通常被視為軸突生長的促進因子[37-38]，該現象提示損傷部位諸多抑制軸突再生的因素與促進因素共同存在，而它們之間的相互影響和作用或許對部分類型神經軸突的再生有協調調節作用。
CSPGs 的種類繁多，至今已發現的有 30 多種類型，但并非所有 CSPGs 均表現出對神經再生具有抑制作用。例如，有研究表明 CSPG4（NG2）和 CSPG5（又名神經多糖 C）就表現出對軸突生長的促進作用[39-40]。此外，還有研究表明 NG2 缺陷的小鼠在脊髓損傷后，5-羥色胺能神經纖維在瘢痕組織中的再生依舊受到限制[41]。其他類型 CSPGs 對軸突再生、炎性反應的響應、神經環路的重塑以及功能修復的作用，目前報道較少，且結果復雜多樣，相關內容可參考近期相關綜述[42]。事實上，體內損傷微環境異常復雜，除了 CSPGs 之外，還有大量其他細胞外基質存在，如膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等。而 CSPGs 能與細胞外基質中上述所有黏附分子和其他神經生長因子等相結合或相互作用，這些不同組合又會產生不同的生物學效應。因此，在復雜的損傷微環境中，單純考慮 CSPGs 的存在對神經軸突再生的影響，這種概率幾乎是不存在的。總之，最終觀察到 CSPGs 的存在是促進還是抑制軸突再生的現象，很可能是由于軸突所處的不同損傷微環境中多種不同的外基質成分或其他因素共同存在、相互博弈所取得的某種平衡所致。
2016 年，加州大學洛杉磯分校的 Micheal Sofroniew 教授團隊[40]通過遺傳手段特異去除成年小鼠脊髓內響應脊髓損傷的具有瘢痕形成能力的反應性星形膠質細胞的增殖能力，并觀察在急性期及陳舊性時期，特異阻礙膠質瘢痕形成后 3 種不同類型中樞神經系統上下行神經軸突的再生情況及總體 CSPGs 水平。結果表明，減少形成瘢痕的星形膠質細胞，雖然可以有效阻止膠質瘢痕的形成，但是無論阻礙急性期膠質瘢痕形成還是慢性膠質瘢痕形成，都不能引起有效的神經纖維再生進入損傷區內，同時該類細胞的增殖與否對 CSPGs 的沉積并無顯著影響。斯坦福大學 Ben Barres 教授在同期《Nature》雜志配發的宣傳文，題為“Not everything is scary about a glial scar”，文章上線后引發了不小的震動[40]。瘢痕研究領域知名的 Silver 教授隨后在《Experiment Neurology》雜志撰文，對上述 Ben Barres 教授的文章提出了見解與異議[43]。在 Micheal Sofroniew 教授的研究中，無論急性期還是慢性期內，特異衰減由反應性星形膠質細胞所形成的星形膠質瘢痕，均觀察不到皮質脊髓束的再生；同時未對星形膠質瘢痕做處理的對照組也并未見到有效的皮質脊髓束再生。因此以膠質瘢痕有助于軸突再生為標題略顯得夸張。另外，急性期內衰減瘢痕形成反而使得軸突再生情況變差，這可能是反應性星形膠質細胞的改變引起了免疫反應的改變而導致的結果。
瘢痕組織的成分原本就是復雜的，因此，試圖通過單一去掉某種細胞存在的因素去衡量其在損傷修復中的作用，最終結果可能與現實情況差異甚大；其次，瘢痕組織的組分及從急性期到慢性期的形成過程應該是動態變化的，因此，瘢痕組織對神經纖維再生的影響隨時間和具體環境而扮演辯證的角色。所以，部分研究者認為[36, 42-45]，膠質瘢痕在早期很可能對軸突再生是有益的，而陳舊性的膠質瘢痕可能主要對軸突再生起到障礙和抑制作用。戴建武研究團隊近日發表在《Experimental Neurology》雜志的文章似乎可以印證這一觀點[44]。該研究中分別分離了大鼠脊髓全橫斷損傷后 2 周及 8 周的瘢痕組織，對亞急性期和陳舊性期的瘢痕組織進行蛋白質組學分析，結果顯示 2 周形成的瘢痕組織中含有更多營養因子，而一些長期被視為不利于軸突再生的外基質的分泌則在 8 周形成的瘢痕組織中更多。上述結果表明亞急性期與陳舊性期的瘢痕組織在蛋白質表達上存在差異，這也暗示亞急性期的瘢痕組織相對更有益于促進神經再生，而陳舊性期的瘢痕組織則對軸突再生更多起到的是負面抑制作用。
日本九州大學 Seiji Okada 研究團隊通過在脊髓損傷 2 周后，特異性通過藥物抑制 integral 信號來衰減膠質瘢痕的形成，也觀察到在亞急性期之后處理瘢痕組織，可以明顯改善脊髓損傷動物的行為學水平[46]，該結果也與上述推測相吻合。在 Micheal Sofroniew 教授發表于《Nature》雜志的文章中[40]，脊髓損傷 5 周后通過遺傳學手段減少陳舊性膠質瘢痕的形成后，未能觀察到損傷區內明顯的神經纖維再生。這一結果似乎提示陳舊性膠質瘢痕的衰減并不能有效促進神經纖維再生。但戴建武組的研究結果卻并不相同，他們在脊髓損傷 8 周后，手術清除陳舊性瘢痕組織，能觀察到明顯的神經纖維再生，其結果提示陳舊性瘢痕組織的存在可能確實影響了神經軸突的再生[44]。
由此可見，膠質瘢痕在急性期內促進神經再生很可能是通過分泌神經營養因子，通過其各自的信號通路對損傷的神經組織起營養支持和神經保護作用。此外，膠質瘢痕在急性期內的促進神經再生作用，還可能通過將損傷區隔離起來阻止其進一步擴大，并隔絕和降低免疫反應帶來的繼發性損傷等機制實現[47]。目前主流觀念認為，膠質瘢痕在陳舊性時期對神經再生的抑制主要是通過其分泌的一些細胞外基質如 CSPGs 來實現的，少數 CSPGs 抑制或促進損傷軸突再生的具體分子機制目前已有所知[42]，但尚未完全明確。然而其他大量 CSPGs 的角色及其作用機制，目前仍然知之甚少。
早在 2015 年 1 月，戴建武團隊在國際首次開展了神經再生膠原支架移植治療陳舊性完全性脊髓損傷的臨床研究[48]。他們通過損傷部位原位電生理檢測來區分神經電生理傳導的響應區域與非響應區域，并首次在術中對陳舊性脊髓損傷患者損傷部位無神經傳導活性的瘢痕組織進行清理。隨后，他們在瘢痕組織清除區域移植了其自主研發的神經再生膠原支架。首批 5 例患者經過 1 年的安全性評估，未發現與瘢痕清理和神經再生膠原支架移植相關的不良反應，證明產品及治療方案的安全性，這是國際上首次將功能膠原支架應用于患者的臨床研究。目前，戴建武團隊已完成近 60 例陳舊性脊髓損傷患者的功能膠原支架移植手術，部分患者出現植物神經功能以及感覺平面擴展等效果，證實陳舊性瘢痕組織的存在可能確實影響了神經功能恢復，而科學清除陳舊性瘢痕組織可以有效改善患者的感覺及運動功能[49]。
5 總結
膠質瘢痕組織及其分泌蛋白 CSPGs 在脊髓損傷后所扮演的角色已經爭論了近百年，這種科學研究中的分歧和爭議成為了推動科學進步的有效動力之一。相信隨著科技的進步和研究的深入，用科學、動態和辯證的眼光去分析瘢痕組織及其在神經再生過程中的角色，會使得對瘢痕的定位和認知越發清晰合理。同時，這樣的認知也將有效助力脊髓損傷修復這一世界難題的早日攻克。
如今，涉及到脊髓損傷、病變及其治療修復相關的研究論文或評述，大都會談及膠質瘢痕的產生、形成及其在神經再生與功能修復過程中所扮演的角色[1-5]。長久以來的主流觀點普遍認為，成熟的瘢痕應該是阻止神經纖維再生跨越并與原始靶標重新產生神經聯系的一道物理屏障。此外，瘢痕組織中分泌的某些外基質分子也被證實具有抑制神經軸突生長的作用。因此，自 20 世紀 30 年代至今，瘢痕在神經再生過程中主要被認為是負面抑制角色。隨著研究的不斷深入，人們對瘢痕角色的認識在不斷深入，越發清晰明朗，但至今仍無定論。事實上，不僅僅是瘢痕組織在脊髓損傷修復中的角色，包括影響脊髓損傷后神經再生的主要原因之爭，在近百年間也有過數次變遷。爭論之后，回顧歷史，或許能讓我們更好地梳理和認清許多理論和觀念是如何產生、發展、篩選、淘汰、檢驗、完善、更新進步，直到成熟的。
1 膠質瘢痕是什么？
膠質瘢痕這個概念一直以來就含混不清，目前急需一個明確的界定。脊髓損傷后，損傷部位附近的星形膠質細胞會響應損傷信號而迅速活化為反應性星形膠質細胞。這類細胞與表達 NG2（neuron/glia antigen 2）的少突膠質前體細胞和小膠質細胞一起在損傷組織附近形成一圈致密的邊界結構，將整個損傷區域封閉隔離起來。而被封閉的損傷區內，在炎性反應穩定后，則聚集有許多不同來源且異質性很強的非神經類型細胞，具體包括與血管伴行的周細胞、脊膜及其他來源的成纖維細胞、MSCs、外周血來源的各種免疫細胞等[6]；也有研究表明，脊髓室管膜細胞響應損傷后增殖產生的星形膠質細胞（這類細胞表現為膠質纖維酸性蛋白陰性）也會出現在損傷核心區內[7]。因此，瘢痕組織的形成是一個進行性的、時間和成分上動態變化的過程。而膠質瘢痕這個名詞，許多年來一直含混地代表整個由反應性星形膠質細胞形成的致密邊界及其包裹的損傷核心區域。但是不難發現，損傷核心區域內神經細胞只占極其有限的一小部分，甚至在有些損傷模型中幾乎檢測不到其存在。基于此，有許多研究人員將損傷核心區域內的瘢痕組織稱為纖維性瘢痕或者間質性瘢痕[4]。而真正的膠質瘢痕應該是指損傷核心區外圍形成致密隔離作用的數個細胞厚度的那層膠質細胞的聚合結構。
近十多年來，膠質細胞在中樞神經系統中生理功能的異質性和復雜性已有了深入的研究。除了大量的反應性星形膠質細胞之外，膠質瘢痕內還包含兩類膠質細胞——NG2 細胞和小膠質細胞，這兩類細胞在損傷后均有別于各自常態下特征。
1983 年 Raff 等[8]首次發現 NG2 細胞，這類細胞在體外培養環境中會分化為少突膠質細胞或星形膠質細胞，被稱為 NG2 前體細胞，也被稱為少突膠質細胞-2 型星形膠質細胞祖細胞（O2A）。后續研究發現，NG2 細胞雖然在發育過程中能夠在腦部特定區域分化為星形膠質細胞，但在成體中樞神經系統中只能檢測到其向少突膠質細胞而非星形膠質細胞分化[9-10]。也有少數研究表明，成體大腦中的 NG2 細胞具有向神經元分化的潛力[11-12]，但是該研究結果還需要更多的證據進一步證實[13]。最近研究結果表明，在脊髓損傷后，NG2 細胞的分化潛能會被激活，除了少突膠質細胞外，還可以分化為星形膠質細胞及雪旺細胞[14]。研究表明，不同脊髓損傷模型中 NG2 細胞向星形膠質細胞分化的特性和比例存在一定差異。例如在脊髓挫傷模型中，NG2 細胞分化為星形膠質細胞的比例相對很高（25%），但在其他不同類型脊髓損傷模型中的分化比例則相對較低：背側半橫斷僅為 5%，皮質刺傷 5%～8%，局灶性脫髓鞘 3%，實驗性自身免疫性腦髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）1%，肌萎縮性脊髓側索硬化癥模型中幾乎檢測不到 NG2 細胞向星形膠質細胞的分化[14]。最近，邁阿密大學醫學院的 Lee 團隊利用遺傳譜系示蹤技術，分別考察了在脊髓挫傷模型和 EAE 兩種小鼠脊髓損傷模型下 NG2 細胞的遺傳命運圖譜，并考察其向星形膠質細胞分化的能力[14]。他們發現 NG2 細胞向星形膠質細胞的分化能力確因不同脊髓損傷模型而存在差異，在挫傷模型中，損傷后 4 周星形膠質細胞占膠質瘢痕中 NG2 細胞譜系總數的 25% 左右；但在 EAE 模型中，星形膠質細胞占膠質瘢痕中 NG2 細胞譜系總數的 9% 左右。提示在既往研究中低估了 NG2 膠質細胞來源的星形膠質細胞的可能性，同時也表明 NG2 細胞在不同脊髓損傷模型中具有復雜的響應或激活機制。
脊髓損傷后，損傷局部的星形膠質細胞響應損傷而轉變為反應性星形膠質細胞，后者進一步成熟為瘢痕樣星形膠質細胞，最終在損傷區域周圍形成致密的膠質瘢痕。這類反應性星形膠質細胞也被稱為 A1 型星形膠質細胞，它們并不能為損傷后殘存的神經元提供營養支持與保護，也不具有吞噬髓鞘碎片的能力，反而會殺死損傷的神經元和少突膠質細胞[15]。其廣泛存在于阿爾茲海默癥、亨廷頓舞蹈癥、帕金森氏癥、肌肉側索硬化以及多發性硬化等多種神經退行性疾病中。近期美國斯坦福大學醫學院神經生物學系 Barres 團隊的實驗結果證實，脊髓損傷后，正是損傷處激活的小膠質細胞通過分泌 IL-1α、TNF 和 C1q 3 種細胞因子，誘導 A1 型反應性星形膠質細胞的產生[15]。
小膠質細胞是脊髓中具有免疫特性的細胞，其數量占中樞神經膠質細胞總數的 5%～20%[16]。脊髓損傷后，小膠質細胞會迅速被激活，并類似于反應性星形膠質細胞，可轉化為兩種不同的功能狀態：經典激活型（M1 型）和選擇激活型（M2 型）[17]。其中 M1 型細胞具有促炎性反應及神經毒性作用，會進一步加重脊髓損傷，同時 M1 型細胞也是 A1 型反應性星形膠質細胞的重要誘導來源；M2 型細胞具有一定的神經營養和神經保護作用，促進脊髓損傷后神經再生與功能修復[18]。脊髓損傷后，損傷部位的小膠質細胞可能會依據損傷程度及損傷類型，激活產生不同類型和比例的小膠質細胞。對于修復不利的 M1 型和有益于神經再生的 M2 型小膠質細胞的相對比例和分布，或許是機體響應局部損傷微環境達到的某種動態平衡的結果。有研究表明 IFN-γ 和脂多糖-TLR4 能夠誘導小膠質細胞向 M1 型轉換；IL-4、IL-13、IL-10 及 TLRs 則可刺激誘導 M2 型小膠質細胞的產生，參與免疫調節、抗炎性反應、細胞碎片清除、軸突再生及損傷修復等[19-20]。因此，干預或影響脊髓損傷后 M1 型和 M2 型之間的轉變，或許是為了實現神經再生和功能修復的一個潛在具有臨床應用價值的修復策略[21]。
2 膠質瘢痕是物理屏障源自臆測？
20 世紀初，現代神經科學之父 Santiago Ramón y Cajal 根據著名的外周神經移植物能誘導中樞神經細胞的神經軸突再生長入實驗，提出了趨化因子理論，來解釋中樞神經系統再生困難的原因[22]。他認為，中樞神經系統損傷后可能存在或缺乏某種對神經纖維再生必不可少的相關趨化因子。此概念暗示中樞神經系統可能相較外周神經系統存在一些抑制神經再生的因素，或者缺乏一些能促進神經再生的因素。
至 20 世紀四五十年代，有一些研究人員開始觀察到，損傷后的軸突總是無法再生穿越上述由損傷后形成的結締組織樣的膠質瘢痕區域，而且許多神經軸突似乎停止在膠質瘢痕邊緣，無法長入[4]。由此，人們推測是致密的瘢痕組織本身形成了一個阻礙軸突穿越再生的物理障礙。1954 年 Clemente 等[23]研究表明，當用藥物衰減貓脊髓損傷部位膠質瘢痕的形成，能觀察到更多神經軸突再生及脊髓損傷后貓的行為學改善。但此結果并未被人信服。在該論文發表后 2 年，Arteta[24]在同一期刊刊文，稱 Clemente 等報道的再生結果及功能恢復無法驗證。二十多年后仍有研究者在重復這一實驗結果[25]，遺憾的是同樣也無法重復出陽性結果。但是瘢痕組織是神經再生的物理障礙這一觀念非常直觀明了，難以讓人輕易否決。
3 膠質瘢痕產生的硫酸軟骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）是抑制軸突再生的因素之一
受限于 20 世紀 50～80 年代細胞干預技術和實驗分析手段，并沒有太多令人信服的實驗來多角度驗證膠質瘢痕作為神經軸突再生障礙角色的科學性。直至 20 世紀 90 年代后，隨著手術精細程度提升，分離鑒定手段突飛猛進，顯微觀察示蹤術的發展，圍繞膠質瘢痕的研究也在不斷向前推進。Cajal 的理論自提出至上世紀 90 年代，數代科研人員雖然未能篩選和尋找到中樞神經系統中有利再生的因素，但是卻陸續發現了不少起抑制作用的蛋白因素，例如 Nogo 蛋白、髓鞘堿性蛋白和少突膠質細胞髓鞘糖蛋白等[26-28]。在此期間，Martin Schwab 實驗室引領了 1980s–2000s 時期脊髓損傷修復領域以外界抑制因素為主要歸因的研究高潮。
在抑制類蛋白因素中，瘢痕組織中由反應性星形膠質細胞及其他細胞大量表達的 CSPGs 細胞外基質分子，在此期間被視為是主要影響軸突再生的抑制因素之一。1991 年，凱斯西儲大學 Jerry Silver 實驗室通過體外實驗表明，脊髓損傷后瘢痕組織中反應性星形膠質細胞來源的 CSPGs 在體外能抑制神經軸突的生長，暗示其在體內可能的神經再生抑制角色[29]。之后，劍橋大學國王學院 James Fawcett 實驗室研究表明，通過施加硫酸軟骨素酶 ABC（chondroitinase ABC，ChABC）消化損傷區瘢痕組織內 CSPGs 分子使其失去活性，可以有效促進脊髓損傷動物的運動功能恢復[30]；此外，他們還觀察到損傷部位附近明顯的神經軸突出芽再生。此后，James Fawcett 實驗室一直致力于 ChABC 治療脊髓損傷的臨床推廣。后續的許多研究也較好地重復驗證了 ChABC 在治療脊髓損傷上的效果[31-35]。
近年，Jerry Silver 實驗室的研究結果還顯示，當軸突中的蛋白酪氨酸磷酸酶 σ（protein tyrosine phosphatase σ，PTPσ）與膠質瘢痕中 CSPGs 相互作用時，會阻止軸突生長。他們設計了名為細胞內 σ 肽段（可作為 PTPσ 的模擬肽）的拮抗劑來阻斷 PTPσ 與 CSPGs 的結合，皮下注射該藥物后能使脊髓損傷的癱瘓小鼠恢復軸突再生，并可有效改善運動和膀胱功能[36]。
由此可見，膠質瘢痕及其分泌物 CSPGs 可能通過本身形成物理屏障，以及通過某種抑制信號導致軸突再生障礙和再生軸突的再髓鞘化障礙，來負面影響脊髓損傷后神經功能再生。
4 為膠質瘢痕及 CSPGs 抑制角色的抗辯
膠質瘢痕本身及其分泌的外基質成分 CSPGs 是否就是軸突難以再生的抑制因素之一，從一開始就面臨著諸多質疑。否認 CSPGs 抑制角色觀點的研究人員認為，無論是酶切消化 CSPGs 的側鏈，還是對其所謂抑制軸突再生的信號通路進行拮抗和衰減，雖然檢測到一定的神經功能恢復，卻并無體內確切證據顯示運動神經纖維能跨越瘢痕組織進行長距離再生。此外，CSPGs 能體內抑制神經軸突再生的結論也不是一成不變的，加州大學圣迭戈分校的 Mark Tuszynski 教授團隊發現，少部分軸突是可以再生長入瘢痕組織之中的，而且這類瘢痕組織能檢測到 NG2（又名 CSPG4，是由瘢痕區內大量少突膠質前體細胞，即 NG2 細胞，所分泌的 CSPGs 的主要類型）、L1、層粘連蛋白和神經細胞黏附分子等諸多細胞外基質蛋白的表達。上述細胞外基質分子中，除了 NG2 被視為抑制分子外，后三類細胞黏附因子通常被視為軸突生長的促進因子[37-38]，該現象提示損傷部位諸多抑制軸突再生的因素與促進因素共同存在，而它們之間的相互影響和作用或許對部分類型神經軸突的再生有協調調節作用。
CSPGs 的種類繁多，至今已發現的有 30 多種類型，但并非所有 CSPGs 均表現出對神經再生具有抑制作用。例如，有研究表明 CSPG4（NG2）和 CSPG5（又名神經多糖 C）就表現出對軸突生長的促進作用[39-40]。此外，還有研究表明 NG2 缺陷的小鼠在脊髓損傷后，5-羥色胺能神經纖維在瘢痕組織中的再生依舊受到限制[41]。其他類型 CSPGs 對軸突再生、炎性反應的響應、神經環路的重塑以及功能修復的作用，目前報道較少，且結果復雜多樣，相關內容可參考近期相關綜述[42]。事實上，體內損傷微環境異常復雜，除了 CSPGs 之外，還有大量其他細胞外基質存在，如膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等。而 CSPGs 能與細胞外基質中上述所有黏附分子和其他神經生長因子等相結合或相互作用，這些不同組合又會產生不同的生物學效應。因此，在復雜的損傷微環境中，單純考慮 CSPGs 的存在對神經軸突再生的影響，這種概率幾乎是不存在的。總之，最終觀察到 CSPGs 的存在是促進還是抑制軸突再生的現象，很可能是由于軸突所處的不同損傷微環境中多種不同的外基質成分或其他因素共同存在、相互博弈所取得的某種平衡所致。
2016 年，加州大學洛杉磯分校的 Micheal Sofroniew 教授團隊[40]通過遺傳手段特異去除成年小鼠脊髓內響應脊髓損傷的具有瘢痕形成能力的反應性星形膠質細胞的增殖能力，并觀察在急性期及陳舊性時期，特異阻礙膠質瘢痕形成后 3 種不同類型中樞神經系統上下行神經軸突的再生情況及總體 CSPGs 水平。結果表明，減少形成瘢痕的星形膠質細胞，雖然可以有效阻止膠質瘢痕的形成，但是無論阻礙急性期膠質瘢痕形成還是慢性膠質瘢痕形成，都不能引起有效的神經纖維再生進入損傷區內，同時該類細胞的增殖與否對 CSPGs 的沉積并無顯著影響。斯坦福大學 Ben Barres 教授在同期《Nature》雜志配發的宣傳文，題為“Not everything is scary about a glial scar”，文章上線后引發了不小的震動[40]。瘢痕研究領域知名的 Silver 教授隨后在《Experiment Neurology》雜志撰文，對上述 Ben Barres 教授的文章提出了見解與異議[43]。在 Micheal Sofroniew 教授的研究中，無論急性期還是慢性期內，特異衰減由反應性星形膠質細胞所形成的星形膠質瘢痕，均觀察不到皮質脊髓束的再生；同時未對星形膠質瘢痕做處理的對照組也并未見到有效的皮質脊髓束再生。因此以膠質瘢痕有助于軸突再生為標題略顯得夸張。另外，急性期內衰減瘢痕形成反而使得軸突再生情況變差，這可能是反應性星形膠質細胞的改變引起了免疫反應的改變而導致的結果。
瘢痕組織的成分原本就是復雜的，因此，試圖通過單一去掉某種細胞存在的因素去衡量其在損傷修復中的作用，最終結果可能與現實情況差異甚大；其次，瘢痕組織的組分及從急性期到慢性期的形成過程應該是動態變化的，因此，瘢痕組織對神經纖維再生的影響隨時間和具體環境而扮演辯證的角色。所以，部分研究者認為[36, 42-45]，膠質瘢痕在早期很可能對軸突再生是有益的，而陳舊性的膠質瘢痕可能主要對軸突再生起到障礙和抑制作用。戴建武研究團隊近日發表在《Experimental Neurology》雜志的文章似乎可以印證這一觀點[44]。該研究中分別分離了大鼠脊髓全橫斷損傷后 2 周及 8 周的瘢痕組織，對亞急性期和陳舊性期的瘢痕組織進行蛋白質組學分析，結果顯示 2 周形成的瘢痕組織中含有更多營養因子，而一些長期被視為不利于軸突再生的外基質的分泌則在 8 周形成的瘢痕組織中更多。上述結果表明亞急性期與陳舊性期的瘢痕組織在蛋白質表達上存在差異，這也暗示亞急性期的瘢痕組織相對更有益于促進神經再生，而陳舊性期的瘢痕組織則對軸突再生更多起到的是負面抑制作用。
日本九州大學 Seiji Okada 研究團隊通過在脊髓損傷 2 周后，特異性通過藥物抑制 integral 信號來衰減膠質瘢痕的形成，也觀察到在亞急性期之后處理瘢痕組織，可以明顯改善脊髓損傷動物的行為學水平[46]，該結果也與上述推測相吻合。在 Micheal Sofroniew 教授發表于《Nature》雜志的文章中[40]，脊髓損傷 5 周后通過遺傳學手段減少陳舊性膠質瘢痕的形成后，未能觀察到損傷區內明顯的神經纖維再生。這一結果似乎提示陳舊性膠質瘢痕的衰減并不能有效促進神經纖維再生。但戴建武組的研究結果卻并不相同，他們在脊髓損傷 8 周后，手術清除陳舊性瘢痕組織，能觀察到明顯的神經纖維再生，其結果提示陳舊性瘢痕組織的存在可能確實影響了神經軸突的再生[44]。
由此可見，膠質瘢痕在急性期內促進神經再生很可能是通過分泌神經營養因子，通過其各自的信號通路對損傷的神經組織起營養支持和神經保護作用。此外，膠質瘢痕在急性期內的促進神經再生作用，還可能通過將損傷區隔離起來阻止其進一步擴大，并隔絕和降低免疫反應帶來的繼發性損傷等機制實現[47]。目前主流觀念認為，膠質瘢痕在陳舊性時期對神經再生的抑制主要是通過其分泌的一些細胞外基質如 CSPGs 來實現的，少數 CSPGs 抑制或促進損傷軸突再生的具體分子機制目前已有所知[42]，但尚未完全明確。然而其他大量 CSPGs 的角色及其作用機制，目前仍然知之甚少。
早在 2015 年 1 月，戴建武團隊在國際首次開展了神經再生膠原支架移植治療陳舊性完全性脊髓損傷的臨床研究[48]。他們通過損傷部位原位電生理檢測來區分神經電生理傳導的響應區域與非響應區域，并首次在術中對陳舊性脊髓損傷患者損傷部位無神經傳導活性的瘢痕組織進行清理。隨后，他們在瘢痕組織清除區域移植了其自主研發的神經再生膠原支架。首批 5 例患者經過 1 年的安全性評估，未發現與瘢痕清理和神經再生膠原支架移植相關的不良反應，證明產品及治療方案的安全性，這是國際上首次將功能膠原支架應用于患者的臨床研究。目前，戴建武團隊已完成近 60 例陳舊性脊髓損傷患者的功能膠原支架移植手術，部分患者出現植物神經功能以及感覺平面擴展等效果，證實陳舊性瘢痕組織的存在可能確實影響了神經功能恢復，而科學清除陳舊性瘢痕組織可以有效改善患者的感覺及運動功能[49]。
5 總結
膠質瘢痕組織及其分泌蛋白 CSPGs 在脊髓損傷后所扮演的角色已經爭論了近百年，這種科學研究中的分歧和爭議成為了推動科學進步的有效動力之一。相信隨著科技的進步和研究的深入，用科學、動態和辯證的眼光去分析瘢痕組織及其在神經再生過程中的角色，會使得對瘢痕的定位和認知越發清晰合理。同時，這樣的認知也將有效助力脊髓損傷修復這一世界難題的早日攻克。