引用本文： 斯海波, 梁明瑋, 程驚秋, 沈彬. 軟骨前體細胞及微小 RNA-140 在骨關節炎軟骨損傷修復中的作用. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(5): 650-658. doi: 10.7507/1002-1892.201806060 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以進行性關節軟骨損傷、軟骨下骨改變、骨質增生及滑膜炎性改變等為特征的常見退行性關節疾病。目前 OA 的發病機制尚未完全闡明，且缺乏有效延緩、阻止或逆轉病程的治療手段，已成為中老年人群疼痛和致殘的主要原因之一[1]。關節軟骨損傷在 OA 發病機制中起關鍵作用，但由于無血管和神經營養，關節軟骨組織的自我更新及修復能力非常弱，目前各種修復治療策略并未取得滿意療效[2-3]。近年有研究發現關節軟骨組織中存在一類具有干細胞特性的軟骨前體細胞（cartilage progenitor cells，CPCs），這為軟骨損傷修復研究提供了新的切入點[3]。微小 RNA-140（microRNA-140，miR-140）具有軟骨特異性，在人正常關節軟骨組織中穩定表達，對軟骨發育、穩態維持及損傷修復起重要調控作用[4-6]，最新研究發現 miR-140 具有較強的促干細胞成軟骨細胞分化能力[7]。本文就 CPCs 及 miR-140 在 OA 軟骨損傷修復中的作用及應用前景作一綜述。
1 誘導活化 CPCs 是促進 OA 軟骨損傷修復的潛在策略
1.1 干細胞修復 OA 軟骨損傷的研究現狀
關節軟骨屬于透明軟骨，是由細胞及細胞外基質（extra-cellular matrix，ECM）構成的特化致密結締組織，其中軟骨細胞量少，僅占正常軟骨組織的 5%，合成包括各種膠原蛋白、蛋白多糖及非膠原蛋白等 ECM 成分[8]。由于缺乏血管和神經營養，關節軟骨自我修復能力有限，MSCs 因具有很強的自我更新和形成特定組織的能力，近年來被作為軟骨損傷修復的種子細胞進行了大量研究[2]。既往已有較多文獻報道了不同組織來源的 MSCs，包括 BMSCs、脂肪來源干細胞（adipose-derived MSCs，ADSCs）及滑液來源干細胞等，體外擴增后通過局部移植或注射方式植入體內，可在一定程度上促進 OA 軟骨損傷修復、延緩 OA 進程[3, 9-12]。然而，MSCs 體外擴增后容易發生衰老、終末分化等改變[2, 9]。同時還存在一定組織特異性問題，即 MSCs 再生及分化能力與其組織來源密切相關[3, 10]。比如，BMSCs 具有較強的自發成骨分化潛能，即使在體外成軟骨誘導條件下，其合成的基質仍主要是Ⅰ型膠原，產生的是纖維軟骨，而不是正常的透明軟骨；而且 BMSCs 潛在的肥大分化能力在一定程度上可通過軟骨內成骨途徑誘導新生的纖維軟骨組織鈣化[13-14]。因此，非軟骨來源 MSCs 在軟骨損傷修復中的應用也存在一定局限性。近年在軟骨組織中發現一類具有干細胞特性的軟骨細胞亞群，為 OA 軟骨損傷修復提供了新的種子細胞及干預靶點。
1.2 CPCs 的發現及特征
既往學者們認為成熟軟骨細胞是關節軟骨組織中唯一存在的細胞類型，但 Barbero 等[15]發現軟骨來源細胞經單層培養擴增后，小部分細胞具有細胞克隆及三系分化（成骨、成軟骨及成脂分化）能力。隨后，多項研究證實關節軟骨中確實存在一類具有自我增殖性、干細胞表面抗原表達特性及多向分化潛能的軟骨細胞亞群，即 CPCs[7, 16-17]。CPCs 主要分散在軟骨表層，表達 CD105、CD106、CD146、CD166、Notch-1、Integrin α5β1 及 SOX-9 等干細胞標志分子，不表達造血干細胞和白細胞特異標志分子 CD34 和 CD45[16, 18]，這些特征均符合國際細胞治療協會（ISCT）2016 年定義的干細胞標準[19]，其中“CD105+/CD166+、CD34-、CD45-”組合已成為目前最常用的 CPCs 初步篩選及鑒定標準之一。
1.3 CPCs 在 OA 軟骨損傷修復中的應用前景
Pretzel 等[20] 及 Alsalameh 等[21]均報道 OA 軟骨細胞中 CPCs（CD105+/CD166+）比例略高于正常軟骨細胞。Mazor 等[22]進一步報道輕度 OA 軟骨細胞 CD105、CD166 和 SOX-9 mRNA 水平高于重度 OA 軟骨細胞。Xia 等[23]也報道重度 OA 軟骨組織中 CPCs 比例（10.61%±6.97%）明顯低于正常軟骨組織（18.44%±9.97%），提示 CPCs 與 OA 發生發展密切相關。Seol 等[24]采用熒光蛋白標記示蹤技術發現軟骨損傷可刺激 CPCs 歸巢機制啟動，通過誘導 CPCs 增殖分化實現受損部位細胞群恢復，可促進軟骨損傷修復。McCarthy 等[25]發現 CPCs 多向分化能力和 BMSCs 相當，但自發成軟骨分化能力及再生軟骨組織功能優于 BMSCs。然而，Tao 等[26]報道在 OA 早期軟骨損傷部位雖有一定數量的 CPCs 聚集，但其自主活化及成軟骨分化能力并不能達到自主軟骨完全修復的要求。因此，誘導活化 CPCs 是促進 OA 早期軟骨損傷修復的潛在策略。
從自發成軟骨分化能力及再生軟骨組織功能上比較，CPCs 優于其他組織來源 MSCs（如 BMSCs、ADSCs、滑膜來源干細胞等），在 OA 早期內源性軟骨損傷修復中更具優勢[3]。然而，如果作為修復的種子細胞，目前大量獲得 CPCs 的技術相對不成熟。根據現有文獻報道結果，非軟骨來源 MSCs 更具優勢，尤其是 BMSCs 及 ADSCs，兩者用于 OA 的研究相對較多且已有臨床研究報道[27-29]。為解決 CPCs 來源問題，學者們進行了相關研究。Togo 等[30]研究發現兔耳軟骨膜中存在大量 CPCs，其具有良好的三系分化能力，比軟骨組織來源軟骨細胞具有更好的增殖分化能力，將 CPCs 接種在膠原海綿支架上并植入裸鼠中，4 周后可產生與軟骨細胞組相似質量、富含Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的軟骨組織，而作為對照的 BMSCs 軟骨組織生成能力明顯弱于 CPCs。Takebe 等[31]進一步構建了旋轉壁容器生物反應器，將耳軟骨來源 CPCs 接種至 pC-HAp/ChS（由膠原、羥基磷灰石和硫酸軟骨素組成的多孔材料）支架后，利用該反應器進行三維培養，成功構建出具有獨特的人關節軟骨特性的軟骨組織。這些研究提示耳軟骨來源 CPCs 是軟骨修復重建種子細胞來源之一，但后續仍需對 CPCs 來源及應用進行深入探索研究。
2 miR-140 是 CPCs 的潛在誘導活化因子
2.1 miR-140 參與 OA 發病機制
正常情況下軟骨組織保持合成與分解代謝平衡，并受環境、信號通路及 miRNA 等多種因素調節[8]。miRNA 是一類高度保守、長約 22 個堿基對的非編碼小 RNA，可在細胞質內以完全或部分互補形式與靶基因 mRNA 3’端非翻譯區（untranslated region，UTR）結合，引起靶基因 mRNA 降解或翻譯抑制，調控哺乳動物約 1/3 的 mRNA 翻譯，在細胞分化、增殖、衰老及凋亡等方面起重要調控作用[4, 32]。miR-140 基因位于大鼠 8 號染色體、人類 16 號染色體短臂上編碼 E3 泛素蛋白連接酶基因 Wwp2 的 16 號與 17 號外顯子之間，具有高度保守性，主要在軟骨組織中表達，具有軟骨特異性[4]，在軟骨生長發育、穩態維持及損傷修復過程中起重要作用[33]。
既往研究已證實 miR-140 在人正常關節軟骨中穩定表達[4]，其中多數研究發現 OA 軟骨組織或細胞中 miR-140 表達較正常軟骨組織或細胞減少[34-35]，但 Swingler 等[36]也報道 miR-140 在 OA 軟骨中表達較正常軟骨明顯增高。這可能與實驗樣品來源不同有關，如人體不同關節軟骨、不同小鼠、不同細胞系等都會對實驗結果造成影響，不同的實驗方法、體內和體外實驗之間的差異也會影響結果。雖然 miR-140 在 OA 軟骨中的表達變化規律目前尚存爭議，但這些研究均證實 miR-140 在關節軟骨發育、穩態及功能維持方面發揮著重要的調控作用。膝關節是 OA 最常累及的關節之一，目前膝關節來源軟骨組織及細胞相關研究均報道 OA 組 miR-140 表達較正常組顯著降低，學者們也檢測了人膝 OA 關節軟骨及關節液中 miR-140 表達水平，發現 OA 組 miR-140 表達較正常組顯著下降，其水平與 OA 的嚴重程度成顯著負相關[37]，而上調 miR-140 表達可部分抑制膝軟骨組織和細胞 OA 樣改變，延緩 OA 進程[38-41]，這也提示 miR-140 參與 OA 發病機制，而進一步研發基于 miR-140 的 OA 治療策略具有重要意義。
2.2 miR-140 對 CPCs 的潛在誘導活化作用及機制
既往研究發現，成熟間充質譜系細胞（包括成熟軟骨細胞）可以通過“去分化”重編程回到干細胞狀態，并表現出高增殖能力和多向分化潛能[3, 15]。同時，自發性軟骨損傷修復是 CPCs 及成熟軟骨細胞共同作用的結果，兩者之間可能存在重疊作用[3]。Hossein 等[42]發現 miR-140 可誘導 BMSCs 向軟骨細胞分化，其誘導作用甚至強于目前經典的 TGF-β3 成軟骨分化誘導法，但在軟骨細胞中暫無相關研究報道。因此，后續驗證 miR-140 是否可調控 CPCs 與成熟軟骨細胞亞群重編程，將為 miR-140 促進軟骨損傷修復提供更多證據。
既往研究已證實 MSCs 及 CPCs 均表達 Notch 信號通路相關分子，而激活 Notch 信號對 MSCs 成軟骨分化具有明顯抑制作用[25, 43]。Grogan 等[44]發現 Notch 下游產物 HES1 及 HEY1 可與 DNA 序列中 SOX-9 增強子識別位點相結合，抑制 SOX-9 介導的Ⅱ型膠原α1 鏈（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）的轉錄激活，從而抑制軟骨細胞特異性 COL2A1 啟動子的活動。生物信息學分析發現 JAG1、解聚蛋白樣金屬蛋白酶 10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）及 HEY1 等 Notch 信號通路關鍵信號分子基因 3’端 UTR 均存在 miR-140 結合靶點，而 JAG1 介導的 Notch 信號通路抑制 MSCs 向軟骨細胞分化[45]。此外，Khayrullin 等[46]在肌萎縮癥中也發現 miR-140 可調控 DNER、JAG1 及 HEY1 等 Notch 通路關鍵分子表達。這些研究均提示 miR-140 具有通過抑制 Notch 信號通路而誘導活化 CPCs、促進 OA 軟骨損傷修復的潛力，后續有待進一步驗證。
3 基于 CPCs 及 miR-140 的 OA 治療策略
3.1 強調 OA 早期軟骨損傷修復的重要性
正常情況下，關節軟骨細胞屬于靜止類細胞，其合成與分解代謝處于動態平衡，這對關節軟骨穩態及功能維持起著至關重要的作用[3]。在各種內源性或外源性有害因素（如衰老、炎癥、創傷等）的刺激下，軟骨細胞可一定程度發生代償性改變，以維持軟骨細胞及組織穩態；當刺激因素持續存在并超過細胞代償能力時，細胞代謝平衡被打破，軟骨細胞發生終末分化，細胞凋亡程序啟動并產生多種有害物質[1]。正常關節軟骨表面光滑，而在 OA 早期軟骨表面出現小裂隙、裂縫及纖維化等改變，損傷僅累及軟骨表層區域，軟骨細胞凋亡少、ECM 降解程度輕，此時修復表層軟骨損傷尚有延遲、預防，甚至逆轉 OA 進展的可能[8]。隨著 OA 進展，相關病理改變逐漸加重，尤其在 OA 晚期，軟骨細胞大量死亡、ECM 廣泛降解、軟骨嚴重缺損伴軟骨下骨硬化、暴露，同時伴隨滑膜炎、骨贅形成等改變，此時軟骨損傷修復或再生的可能性極小，軟骨修復治療意義已不大，相應治療多局限于臨床癥狀控制（如鎮痛、骨骼肌松弛藥物等）和人工關節置換手術（單髁置換術、人工全膝關節置換術）[47-48]。因此，結合 CPCs 主要分散在軟骨表層的特點，強調 OA 早期干預具有重要臨床意義。
3.2 miR-140 在 OA 早期干預中的作用及潛在機制
關節軟骨損傷、穩態失衡是 OA 的主要特征之一，其中以Ⅱ型膠原和蛋白聚糖等 ECM 成分降解為主。既往研究已證實 miR-140 可直接調控基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、含血小板結合蛋白基序的 ADAMTS5、轉錄因子 Runx2 等多個基因，對軟骨穩態起重要調控作用。MMP-13 及 ADAMTS5 是目前公認的最重要的兩種軟骨基質降解酶[49]，已證實 miR-140 可直接與 MMP-13 和 ADAMTS5 mRNA 3’端 UTR 位點結合，對其進行負調控[5, 50]。Runx2 是調控骨形成的主要轉錄因子之一，可通過誘導 MMP-13、Ⅹ型膠原及 ALP 等表達，進而促進軟骨細胞終末分化及軟骨內成骨過程，其在正常關節軟骨細胞中幾乎不表達，而在肥大軟骨細胞中呈高表達[51-52]。Runx2 主要通過與 Smads 蛋白結合形成 Runx2-Smads 復合體起作用；Smad1 與 Smad3 競爭性結合 Runx2，前者激活 Runx2 活性，后者抑制 Runx2 活性[53-54]。Smad1、Smad3 分別是 BMP 和 TGF-β 信號通路關鍵信號分子[55]，目前已證實 BMP 通路受體 TGFBR1 是 miR-140 的直接作用靶點，上調 miR-140 可抑制 TGFBR1 及其下游 Smad1 的表達，Smad3 更多地結合 Runx2 并抑制其活性，這也提示 miR-140 可通過 TGF-β/BMP 通路調控軟骨細胞穩態。
最近，Li 等[45]通過生物信息學手段預測出人 miR-140 存在 123 個潛在靶基因，通過基因功能富集分析發現，這些靶基因主要參與調節代謝進程、細胞交流、信號傳導、化學刺激反應、干細胞增殖、細胞表面受體信號通路等生物過程，KEGG 通路分析發現 miR-140 的靶基因主要參與 Notch、TGF-β、PI3K/Akt、Hippo 等三十余條信號通路過程；進一步查閱文獻發現，目前有 26 篇研究對 miR-140 靶點進行了報道，包含 23 個靶基因、涉及 7 條信號通路。因此，miR-140 在軟骨細胞中可調控多個靶基因、參與多條信號通路、涉及多個生物過程，其在 OA 發病中的作用范圍可能遠超目前已發表文獻報道的內容，值得進一步研究。
3.3 miR-140 在 OA 治療中的應用策略
miR-140 是一種高度保守、主要在軟骨組織中表達的非編碼小 RNA，和其他 RNA 一樣，其在體外及外周血中很容易降解，導致既往關于 miR-140 治療 OA 的研究多集中在體外細胞或轉基因動物中，這對后續探索 miR-140 治療 OA 的指導作用有限。關節腔局部給藥因其安全性獲得廣泛應用，是目前治療 OA 的主要方式之一[38, 56-57]。有學者首次報道了關節腔注射 miR-140 可延緩大鼠 OA 進展[38]，但既往研究證實由于淋巴管及滑膜血管的作用，直接注射到關節內的藥物或基因在關節液中清除速度快、停留時間短；同時，藥物或基因在關節內的非靶向聚集也會降低軟骨對它們的生物利用度，并加速從關節中清除，導致常常需要多次高劑量注射藥物，而且操作繁瑣、增加感染風險[58]。因此，為了增強 miR-140 軟骨靶向遞送效率及最小化藥物劑量需求，構建具有良好安全性、軟骨靶向性及高效遞送 miR-140 的載體材料，對后續基于 miR-140 的 OA 治療策略研發及臨床轉化具有重要意義。
目前已有研究報道多種 miRNA 遞送載體，包括腺病毒、慢病毒、膠原蛋白支架、水凝膠等[57, 59-61]，進一步利用能選擇性結合目標組織成分或具有生物功能的生化基團修飾，可提高載體材料的靶向性、藥物遞送效率及生物活性[56]。例如，Li 等[62]最近報道了 N-Cadherin 模擬肽修飾的自組裝多肽納米材料可增強 MSCs 的成軟骨分化能力。軟骨基質密集且呈高負電荷狀態（主要源于蛋白多糖）是關節腔藥物進入軟骨組織的一大障礙。既往研究報道陽離子載體和帶負電荷 ECM 之間的非特異性靜電作用有利于藥物快速滲透軟骨，而且軟骨基質高負電荷狀態將大大增加陽離子載體的停留時間，從而使軟骨從藥物屏障轉變成藥物儲存庫[63]。目前已有研究報道陽離子納米材料可通過靜電作用高效遞送表面呈負電荷的 miRNA[64]，選取合適的陽離子基團或分子修飾功能化載體材料不僅可作為軟骨靶向、高效遞送 miR-140 的載體，兩者還可協同增強 OA 軟骨損傷修復，具有良好的應用前景。
4 總結與展望
CPCs 與 OA 發生發展密切相關，雖然其具有良好的自我增殖性、干細胞表面抗原表達特性及多向分化潛能等特點，但其在 OA 軟骨損傷部位自主活化及成軟骨分化能力尚未達到軟骨完全修復要求。miR-140 具有軟骨特異性，以及抑制 Notch 信號通路、誘導活化 CPCs 并增強其增殖及成軟骨分化的能力，從而促進 OA 軟骨損傷修復的潛能。關節腔注射 miR-140 雖能在一定程度上延緩關節軟骨退變，但也存在非靶向聚集、生物利用度低及清除快等問題，因此構建安全、軟骨靶向且能高效遞送 miR-140 的載體材料具有良好應用前景。此外，由于 CPCs 主要分散在軟骨表層，而 OA 軟骨損傷也開始于該層，因此強調 OA 早期干預至關重要。
綜上述，miR-140 具有誘導活化 CPCs、促進 OA 早期軟骨損傷修復的潛力，進一步探索 miR-140 在 OA 發生機制中的作用及研發基于 miR-140 新的 OA 治療策略具有重要臨床意義。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以進行性關節軟骨損傷、軟骨下骨改變、骨質增生及滑膜炎性改變等為特征的常見退行性關節疾病。目前 OA 的發病機制尚未完全闡明，且缺乏有效延緩、阻止或逆轉病程的治療手段，已成為中老年人群疼痛和致殘的主要原因之一[1]。關節軟骨損傷在 OA 發病機制中起關鍵作用，但由于無血管和神經營養，關節軟骨組織的自我更新及修復能力非常弱，目前各種修復治療策略并未取得滿意療效[2-3]。近年有研究發現關節軟骨組織中存在一類具有干細胞特性的軟骨前體細胞（cartilage progenitor cells，CPCs），這為軟骨損傷修復研究提供了新的切入點[3]。微小 RNA-140（microRNA-140，miR-140）具有軟骨特異性，在人正常關節軟骨組織中穩定表達，對軟骨發育、穩態維持及損傷修復起重要調控作用[4-6]，最新研究發現 miR-140 具有較強的促干細胞成軟骨細胞分化能力[7]。本文就 CPCs 及 miR-140 在 OA 軟骨損傷修復中的作用及應用前景作一綜述。
1 誘導活化 CPCs 是促進 OA 軟骨損傷修復的潛在策略
1.1 干細胞修復 OA 軟骨損傷的研究現狀
關節軟骨屬于透明軟骨，是由細胞及細胞外基質（extra-cellular matrix，ECM）構成的特化致密結締組織，其中軟骨細胞量少，僅占正常軟骨組織的 5%，合成包括各種膠原蛋白、蛋白多糖及非膠原蛋白等 ECM 成分[8]。由于缺乏血管和神經營養，關節軟骨自我修復能力有限，MSCs 因具有很強的自我更新和形成特定組織的能力，近年來被作為軟骨損傷修復的種子細胞進行了大量研究[2]。既往已有較多文獻報道了不同組織來源的 MSCs，包括 BMSCs、脂肪來源干細胞（adipose-derived MSCs，ADSCs）及滑液來源干細胞等，體外擴增后通過局部移植或注射方式植入體內，可在一定程度上促進 OA 軟骨損傷修復、延緩 OA 進程[3, 9-12]。然而，MSCs 體外擴增后容易發生衰老、終末分化等改變[2, 9]。同時還存在一定組織特異性問題，即 MSCs 再生及分化能力與其組織來源密切相關[3, 10]。比如，BMSCs 具有較強的自發成骨分化潛能，即使在體外成軟骨誘導條件下，其合成的基質仍主要是Ⅰ型膠原，產生的是纖維軟骨，而不是正常的透明軟骨；而且 BMSCs 潛在的肥大分化能力在一定程度上可通過軟骨內成骨途徑誘導新生的纖維軟骨組織鈣化[13-14]。因此，非軟骨來源 MSCs 在軟骨損傷修復中的應用也存在一定局限性。近年在軟骨組織中發現一類具有干細胞特性的軟骨細胞亞群，為 OA 軟骨損傷修復提供了新的種子細胞及干預靶點。
1.2 CPCs 的發現及特征
既往學者們認為成熟軟骨細胞是關節軟骨組織中唯一存在的細胞類型，但 Barbero 等[15]發現軟骨來源細胞經單層培養擴增后，小部分細胞具有細胞克隆及三系分化（成骨、成軟骨及成脂分化）能力。隨后，多項研究證實關節軟骨中確實存在一類具有自我增殖性、干細胞表面抗原表達特性及多向分化潛能的軟骨細胞亞群，即 CPCs[7, 16-17]。CPCs 主要分散在軟骨表層，表達 CD105、CD106、CD146、CD166、Notch-1、Integrin α5β1 及 SOX-9 等干細胞標志分子，不表達造血干細胞和白細胞特異標志分子 CD34 和 CD45[16, 18]，這些特征均符合國際細胞治療協會（ISCT）2016 年定義的干細胞標準[19]，其中“CD105+/CD166+、CD34-、CD45-”組合已成為目前最常用的 CPCs 初步篩選及鑒定標準之一。
1.3 CPCs 在 OA 軟骨損傷修復中的應用前景
Pretzel 等[20] 及 Alsalameh 等[21]均報道 OA 軟骨細胞中 CPCs（CD105+/CD166+）比例略高于正常軟骨細胞。Mazor 等[22]進一步報道輕度 OA 軟骨細胞 CD105、CD166 和 SOX-9 mRNA 水平高于重度 OA 軟骨細胞。Xia 等[23]也報道重度 OA 軟骨組織中 CPCs 比例（10.61%±6.97%）明顯低于正常軟骨組織（18.44%±9.97%），提示 CPCs 與 OA 發生發展密切相關。Seol 等[24]采用熒光蛋白標記示蹤技術發現軟骨損傷可刺激 CPCs 歸巢機制啟動，通過誘導 CPCs 增殖分化實現受損部位細胞群恢復，可促進軟骨損傷修復。McCarthy 等[25]發現 CPCs 多向分化能力和 BMSCs 相當，但自發成軟骨分化能力及再生軟骨組織功能優于 BMSCs。然而，Tao 等[26]報道在 OA 早期軟骨損傷部位雖有一定數量的 CPCs 聚集，但其自主活化及成軟骨分化能力并不能達到自主軟骨完全修復的要求。因此，誘導活化 CPCs 是促進 OA 早期軟骨損傷修復的潛在策略。
從自發成軟骨分化能力及再生軟骨組織功能上比較，CPCs 優于其他組織來源 MSCs（如 BMSCs、ADSCs、滑膜來源干細胞等），在 OA 早期內源性軟骨損傷修復中更具優勢[3]。然而，如果作為修復的種子細胞，目前大量獲得 CPCs 的技術相對不成熟。根據現有文獻報道結果，非軟骨來源 MSCs 更具優勢，尤其是 BMSCs 及 ADSCs，兩者用于 OA 的研究相對較多且已有臨床研究報道[27-29]。為解決 CPCs 來源問題，學者們進行了相關研究。Togo 等[30]研究發現兔耳軟骨膜中存在大量 CPCs，其具有良好的三系分化能力，比軟骨組織來源軟骨細胞具有更好的增殖分化能力，將 CPCs 接種在膠原海綿支架上并植入裸鼠中，4 周后可產生與軟骨細胞組相似質量、富含Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的軟骨組織，而作為對照的 BMSCs 軟骨組織生成能力明顯弱于 CPCs。Takebe 等[31]進一步構建了旋轉壁容器生物反應器，將耳軟骨來源 CPCs 接種至 pC-HAp/ChS（由膠原、羥基磷灰石和硫酸軟骨素組成的多孔材料）支架后，利用該反應器進行三維培養，成功構建出具有獨特的人關節軟骨特性的軟骨組織。這些研究提示耳軟骨來源 CPCs 是軟骨修復重建種子細胞來源之一，但后續仍需對 CPCs 來源及應用進行深入探索研究。
2 miR-140 是 CPCs 的潛在誘導活化因子
2.1 miR-140 參與 OA 發病機制
正常情況下軟骨組織保持合成與分解代謝平衡，并受環境、信號通路及 miRNA 等多種因素調節[8]。miRNA 是一類高度保守、長約 22 個堿基對的非編碼小 RNA，可在細胞質內以完全或部分互補形式與靶基因 mRNA 3’端非翻譯區（untranslated region，UTR）結合，引起靶基因 mRNA 降解或翻譯抑制，調控哺乳動物約 1/3 的 mRNA 翻譯，在細胞分化、增殖、衰老及凋亡等方面起重要調控作用[4, 32]。miR-140 基因位于大鼠 8 號染色體、人類 16 號染色體短臂上編碼 E3 泛素蛋白連接酶基因 Wwp2 的 16 號與 17 號外顯子之間，具有高度保守性，主要在軟骨組織中表達，具有軟骨特異性[4]，在軟骨生長發育、穩態維持及損傷修復過程中起重要作用[33]。
既往研究已證實 miR-140 在人正常關節軟骨中穩定表達[4]，其中多數研究發現 OA 軟骨組織或細胞中 miR-140 表達較正常軟骨組織或細胞減少[34-35]，但 Swingler 等[36]也報道 miR-140 在 OA 軟骨中表達較正常軟骨明顯增高。這可能與實驗樣品來源不同有關，如人體不同關節軟骨、不同小鼠、不同細胞系等都會對實驗結果造成影響，不同的實驗方法、體內和體外實驗之間的差異也會影響結果。雖然 miR-140 在 OA 軟骨中的表達變化規律目前尚存爭議，但這些研究均證實 miR-140 在關節軟骨發育、穩態及功能維持方面發揮著重要的調控作用。膝關節是 OA 最常累及的關節之一，目前膝關節來源軟骨組織及細胞相關研究均報道 OA 組 miR-140 表達較正常組顯著降低，學者們也檢測了人膝 OA 關節軟骨及關節液中 miR-140 表達水平，發現 OA 組 miR-140 表達較正常組顯著下降，其水平與 OA 的嚴重程度成顯著負相關[37]，而上調 miR-140 表達可部分抑制膝軟骨組織和細胞 OA 樣改變，延緩 OA 進程[38-41]，這也提示 miR-140 參與 OA 發病機制，而進一步研發基于 miR-140 的 OA 治療策略具有重要意義。
2.2 miR-140 對 CPCs 的潛在誘導活化作用及機制
既往研究發現，成熟間充質譜系細胞（包括成熟軟骨細胞）可以通過“去分化”重編程回到干細胞狀態，并表現出高增殖能力和多向分化潛能[3, 15]。同時，自發性軟骨損傷修復是 CPCs 及成熟軟骨細胞共同作用的結果，兩者之間可能存在重疊作用[3]。Hossein 等[42]發現 miR-140 可誘導 BMSCs 向軟骨細胞分化，其誘導作用甚至強于目前經典的 TGF-β3 成軟骨分化誘導法，但在軟骨細胞中暫無相關研究報道。因此，后續驗證 miR-140 是否可調控 CPCs 與成熟軟骨細胞亞群重編程，將為 miR-140 促進軟骨損傷修復提供更多證據。
既往研究已證實 MSCs 及 CPCs 均表達 Notch 信號通路相關分子，而激活 Notch 信號對 MSCs 成軟骨分化具有明顯抑制作用[25, 43]。Grogan 等[44]發現 Notch 下游產物 HES1 及 HEY1 可與 DNA 序列中 SOX-9 增強子識別位點相結合，抑制 SOX-9 介導的Ⅱ型膠原α1 鏈（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）的轉錄激活，從而抑制軟骨細胞特異性 COL2A1 啟動子的活動。生物信息學分析發現 JAG1、解聚蛋白樣金屬蛋白酶 10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）及 HEY1 等 Notch 信號通路關鍵信號分子基因 3’端 UTR 均存在 miR-140 結合靶點，而 JAG1 介導的 Notch 信號通路抑制 MSCs 向軟骨細胞分化[45]。此外，Khayrullin 等[46]在肌萎縮癥中也發現 miR-140 可調控 DNER、JAG1 及 HEY1 等 Notch 通路關鍵分子表達。這些研究均提示 miR-140 具有通過抑制 Notch 信號通路而誘導活化 CPCs、促進 OA 軟骨損傷修復的潛力，后續有待進一步驗證。
3 基于 CPCs 及 miR-140 的 OA 治療策略
3.1 強調 OA 早期軟骨損傷修復的重要性
正常情況下，關節軟骨細胞屬于靜止類細胞，其合成與分解代謝處于動態平衡，這對關節軟骨穩態及功能維持起著至關重要的作用[3]。在各種內源性或外源性有害因素（如衰老、炎癥、創傷等）的刺激下，軟骨細胞可一定程度發生代償性改變，以維持軟骨細胞及組織穩態；當刺激因素持續存在并超過細胞代償能力時，細胞代謝平衡被打破，軟骨細胞發生終末分化，細胞凋亡程序啟動并產生多種有害物質[1]。正常關節軟骨表面光滑，而在 OA 早期軟骨表面出現小裂隙、裂縫及纖維化等改變，損傷僅累及軟骨表層區域，軟骨細胞凋亡少、ECM 降解程度輕，此時修復表層軟骨損傷尚有延遲、預防，甚至逆轉 OA 進展的可能[8]。隨著 OA 進展，相關病理改變逐漸加重，尤其在 OA 晚期，軟骨細胞大量死亡、ECM 廣泛降解、軟骨嚴重缺損伴軟骨下骨硬化、暴露，同時伴隨滑膜炎、骨贅形成等改變，此時軟骨損傷修復或再生的可能性極小，軟骨修復治療意義已不大，相應治療多局限于臨床癥狀控制（如鎮痛、骨骼肌松弛藥物等）和人工關節置換手術（單髁置換術、人工全膝關節置換術）[47-48]。因此，結合 CPCs 主要分散在軟骨表層的特點，強調 OA 早期干預具有重要臨床意義。
3.2 miR-140 在 OA 早期干預中的作用及潛在機制
關節軟骨損傷、穩態失衡是 OA 的主要特征之一，其中以Ⅱ型膠原和蛋白聚糖等 ECM 成分降解為主。既往研究已證實 miR-140 可直接調控基質金屬蛋白酶 13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、含血小板結合蛋白基序的 ADAMTS5、轉錄因子 Runx2 等多個基因，對軟骨穩態起重要調控作用。MMP-13 及 ADAMTS5 是目前公認的最重要的兩種軟骨基質降解酶[49]，已證實 miR-140 可直接與 MMP-13 和 ADAMTS5 mRNA 3’端 UTR 位點結合，對其進行負調控[5, 50]。Runx2 是調控骨形成的主要轉錄因子之一，可通過誘導 MMP-13、Ⅹ型膠原及 ALP 等表達，進而促進軟骨細胞終末分化及軟骨內成骨過程，其在正常關節軟骨細胞中幾乎不表達，而在肥大軟骨細胞中呈高表達[51-52]。Runx2 主要通過與 Smads 蛋白結合形成 Runx2-Smads 復合體起作用；Smad1 與 Smad3 競爭性結合 Runx2，前者激活 Runx2 活性，后者抑制 Runx2 活性[53-54]。Smad1、Smad3 分別是 BMP 和 TGF-β 信號通路關鍵信號分子[55]，目前已證實 BMP 通路受體 TGFBR1 是 miR-140 的直接作用靶點，上調 miR-140 可抑制 TGFBR1 及其下游 Smad1 的表達，Smad3 更多地結合 Runx2 并抑制其活性，這也提示 miR-140 可通過 TGF-β/BMP 通路調控軟骨細胞穩態。
最近，Li 等[45]通過生物信息學手段預測出人 miR-140 存在 123 個潛在靶基因，通過基因功能富集分析發現，這些靶基因主要參與調節代謝進程、細胞交流、信號傳導、化學刺激反應、干細胞增殖、細胞表面受體信號通路等生物過程，KEGG 通路分析發現 miR-140 的靶基因主要參與 Notch、TGF-β、PI3K/Akt、Hippo 等三十余條信號通路過程；進一步查閱文獻發現，目前有 26 篇研究對 miR-140 靶點進行了報道，包含 23 個靶基因、涉及 7 條信號通路。因此，miR-140 在軟骨細胞中可調控多個靶基因、參與多條信號通路、涉及多個生物過程，其在 OA 發病中的作用范圍可能遠超目前已發表文獻報道的內容，值得進一步研究。
3.3 miR-140 在 OA 治療中的應用策略
miR-140 是一種高度保守、主要在軟骨組織中表達的非編碼小 RNA，和其他 RNA 一樣，其在體外及外周血中很容易降解，導致既往關于 miR-140 治療 OA 的研究多集中在體外細胞或轉基因動物中，這對后續探索 miR-140 治療 OA 的指導作用有限。關節腔局部給藥因其安全性獲得廣泛應用，是目前治療 OA 的主要方式之一[38, 56-57]。有學者首次報道了關節腔注射 miR-140 可延緩大鼠 OA 進展[38]，但既往研究證實由于淋巴管及滑膜血管的作用，直接注射到關節內的藥物或基因在關節液中清除速度快、停留時間短；同時，藥物或基因在關節內的非靶向聚集也會降低軟骨對它們的生物利用度，并加速從關節中清除，導致常常需要多次高劑量注射藥物，而且操作繁瑣、增加感染風險[58]。因此，為了增強 miR-140 軟骨靶向遞送效率及最小化藥物劑量需求，構建具有良好安全性、軟骨靶向性及高效遞送 miR-140 的載體材料，對后續基于 miR-140 的 OA 治療策略研發及臨床轉化具有重要意義。
目前已有研究報道多種 miRNA 遞送載體，包括腺病毒、慢病毒、膠原蛋白支架、水凝膠等[57, 59-61]，進一步利用能選擇性結合目標組織成分或具有生物功能的生化基團修飾，可提高載體材料的靶向性、藥物遞送效率及生物活性[56]。例如，Li 等[62]最近報道了 N-Cadherin 模擬肽修飾的自組裝多肽納米材料可增強 MSCs 的成軟骨分化能力。軟骨基質密集且呈高負電荷狀態（主要源于蛋白多糖）是關節腔藥物進入軟骨組織的一大障礙。既往研究報道陽離子載體和帶負電荷 ECM 之間的非特異性靜電作用有利于藥物快速滲透軟骨，而且軟骨基質高負電荷狀態將大大增加陽離子載體的停留時間，從而使軟骨從藥物屏障轉變成藥物儲存庫[63]。目前已有研究報道陽離子納米材料可通過靜電作用高效遞送表面呈負電荷的 miRNA[64]，選取合適的陽離子基團或分子修飾功能化載體材料不僅可作為軟骨靶向、高效遞送 miR-140 的載體，兩者還可協同增強 OA 軟骨損傷修復，具有良好的應用前景。
4 總結與展望
CPCs 與 OA 發生發展密切相關，雖然其具有良好的自我增殖性、干細胞表面抗原表達特性及多向分化潛能等特點，但其在 OA 軟骨損傷部位自主活化及成軟骨分化能力尚未達到軟骨完全修復要求。miR-140 具有軟骨特異性，以及抑制 Notch 信號通路、誘導活化 CPCs 并增強其增殖及成軟骨分化的能力，從而促進 OA 軟骨損傷修復的潛能。關節腔注射 miR-140 雖能在一定程度上延緩關節軟骨退變，但也存在非靶向聚集、生物利用度低及清除快等問題，因此構建安全、軟骨靶向且能高效遞送 miR-140 的載體材料具有良好應用前景。此外，由于 CPCs 主要分散在軟骨表層，而 OA 軟骨損傷也開始于該層，因此強調 OA 早期干預至關重要。
綜上述，miR-140 具有誘導活化 CPCs、促進 OA 早期軟骨損傷修復的潛力，進一步探索 miR-140 在 OA 發生機制中的作用及研發基于 miR-140 新的 OA 治療策略具有重要臨床意義。