引用本文： 廖筱梅, 羅興前, 代蕾, 黃海峻, 郭杏. 脂肪間充質干細胞-殼聚糖凝膠復合物治療大鼠深Ⅱ度燙傷創面實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(1): 101-109. doi: 10.7507/1002-1892.201804109 復制
深度燒傷后皮膚屏障及再生功能常遭受破壞，如何快速且高效地修復深度燒傷創面，是燒傷整形科醫生面臨的巨大挑戰[1-2]。目前的治療方法主要有兩種：一是早期行創面削痂植皮，去除壞死組織，減少燒傷創面感染因素，縮短愈合時間，但面臨皮源不足、手術創傷大、費用較高等問題[3-4]；另一種方法是運用醫用敷料覆蓋創面，可以維持內環境穩定，促進殘存上皮再生，加速創面愈合。近年來，殼聚糖及其衍生物因具有良好的組織相容性、生物可降解性、廣譜抗菌性、止血防黏性等特點，被越來越多研究者運用于燒傷創面敷料的研究。特別是溫敏氯化殼聚糖（chitosan chloride，CSCl）凝膠，其三維立體多孔結構有利于促進細胞黏附和增殖，能夠有效阻止細菌感染，促進創面愈合[5-7]。而脂肪間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）免疫原性低，能自我更新、穩定增殖、多向分化，是組織工程種子細胞的研究熱點[8-9]。其分泌的細胞因子能促進表皮細胞、成纖維細胞增殖及微血管生成，被廣泛應用于燒傷創面修復研究[10-11]。因此本實驗結合兩者特點，制備 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物，將其運用于大鼠深Ⅱ度燙傷創面，觀察其對燙傷創面修復的可行性，旨在為深度燙傷創面修復提供一種新型的組織工程修復方式。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 6 周齡雄性 SD 大鼠 2 只，體質量 150～200 g；SPF 級 8 周齡雄性 SD 大鼠 72 只，體質量 200～250 g；均由西南醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2018-065。所有動物實驗獲得西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準（20171211021）。
CSCl（浙江金殼生物化學有限公司）；β-甘油磷酸鈉、Ⅰ型膠原酶及流式抗體 CD29、CD31、CD34、CD45、CD90（Sigma 公司，美國）；羥乙基纖維素（Fluka 公司，瑞士）；DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；青-鏈霉素溶液、0.25% 胰蛋白酶（ScienCell 公司，美國）；FBS（杭州天杭生物科技股份公司）；成脂誘導液、成骨誘導液（BD 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化學公司，日本）；Live/Dead 染色試劑盒（Molecular probe 公司，美國）；硫化鈉（成都科龍化工試劑廠）。
生物安全柜（Telstar 公司，西班牙）；CO2 恒溫培養箱（Thermo 公司，美國）；普通高速離心機（Bio-Rad 公司，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，德國）；低溫離心機（Eppendorff 公司，德國）；分光光度計（Leica 公司，德國）。
1.2 ADSCs 提取、傳代及鑒定
1.2.1 ADSCs 提取及傳代
取 SPF 級 6 周齡雄性 SD 大鼠脫頸處死，乙醇浸泡后，無菌提取腹股溝處皮下脂肪組織，PBS 反復沖洗，剔除筋膜和血管，剪至糊狀；加入 2～3 倍體積 0.1%Ⅰ型膠原酶 37℃ 恒溫消化 60 min，等量完全培養基（含 10%FBS 的 DMEM 培養基）終止消化，以 700×g 離心 10 min；去除上清液和上層脂肪，以等量完全培養基重懸混勻；70 μm 濾網過濾后完全培養基重懸混勻，以 180×g 離心 5 min；去上清液，PBS 吹打混勻，再次以 180×g 離心 5 min 后去上清液，完全培養基重懸混勻，接種入 25 cm2培養瓶中，37℃、5%CO2 培養箱中培養；24 h 后全量換液；每 3 天更換培養基，至細胞達 80%～90% 融合時，以 0.25% 胰蛋白酶消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.2.2 細胞鑒定
① 免疫表型鑒定：取第 3 代 ADSCs 用 0.25% 胰蛋白酶消化后制成密度為 1×106個/mL 的單細胞懸液，每管 100 μL 分裝于 1.5 mL EP 管中，分別加入流式抗體 CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90，設立陰性對照，室溫避光孵育 30 min 后流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達。② 成脂、成骨分化鑒定：取第 3 代 ADSCs 用 0.25% 胰蛋白酶消化后，按 2×105個/孔密度接種于 6 孔板中，待細胞達 100% 融合時分別更換成脂誘導液和成骨誘導液。成脂誘導 2 周后油紅 O 染色觀察成脂分化效果，成骨誘導 4 周后茜素紅染色觀察成骨分化效果。
1.3 溫敏 CSCl 凝膠制備及相關觀測
1.3.1 溫敏 CSCl 凝膠的制備
取 0.2 g 無菌 CSCl 粉末溶于 10 mL 無菌超純水，制成 2%CSCl 溶液；1.15 g β-甘油磷酸鈉溶于 10 mL H-DMEM 中，制成 11.5%β-甘油磷酸鈉溶液；0.25 g 羥乙基纖維素溶于 10 mL H-DMEM 中，制成 2.5% 羥乙基纖維素溶液。將 CSCl、β-甘油磷酸鈉、羥乙基纖維素于 0.22 μm 濾菌器過濾后，依次按 8∶2∶2.5 的比例混勻，置于 37℃、5%CO2 孵箱中，15 min 后形成凝膠。
1.3.2 ADSCs 與溫敏 CSCl 凝膠的相容性
取 5 mL 溫敏 CSCl 凝膠與 1×107個 ADSCs 混合，制成密度為 2×106個/mL 的 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物，加入 24 孔板，每孔 1 mL，培養 72 h。配制 Live/Dead 染液，將 2 μL EthdD-1 避光加入 1 mL PBS 中，混勻后再加入 0.5 μL 鈣黃綠素，混合后加入上述 24 孔板中，37℃ 避光孵育 30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.3.3 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠中的增殖情況
取 5 mL 溫敏 CSCl 凝膠與 1×107個 ADSCs 混合，制成密度為 2×106個/mL 的 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物，為實驗組；ADSCs 組為對照組。均加入 96 孔板，每孔 50 μL，共 20 孔。放入 37℃ 孵箱待實驗組成凝膠后，每孔加入 0.1 mL 完全培養基。于培養 1、3、5、7 d 兩組分別取 5 孔，全量換液后，添加 10 μL CCK-8 原液；37℃ 孵育 4 h，分光光度計于 450 nm 處測其吸光度（A）值，并繪制細胞增殖曲線。
1.4 動物實驗
1.4.1 大鼠深Ⅱ度燙傷創面造模及處理
取 SPF 級 8 周齡雄性 SD 大鼠 72 只，2% 戊巴比妥（2 mL/kg）腹腔注射麻醉后，8% 硫化鈉脫去大鼠背部毛發，自制燙傷模具緊貼大鼠背部脫毛區域；將 10 mL 沸水迅速倒入模具中，10 s 后快速倒出沸水，制成一直徑約 2.5 cm 的圓形深Ⅱ度燙傷模型，行病理切片 HE 染色鑒定造模是否成功。造模后將大鼠單籠飼養，隨機分為 3 組，每組 24 只。燙傷后創面無菌紗布保護創面，每天更換紗布，3 d 后削痂，A 組為空白對照組，以凡士林紗布加無菌紗布覆蓋創面；B 組用 1 mL 溫敏 CSCl 凝膠，涂抹創面后凡士林紗布覆蓋；C 組以 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物（ADSCs 密度為 2×106個/mL）1 mL 涂抹創面后，凡士林紗布覆蓋。然后包扎固定，3 組均隔天換藥。
1.4.2 創面大體觀察
觀察大鼠創面閉合情況。術后 3、7、14、21 d 每組取 6 只大鼠，麻醉后無菌塑料薄膜覆蓋創面并用鉛筆描繪其大小，將繪制好的薄膜掃描入電腦，用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對輪廓大小進行分析，按以下公式計算創面閉合率：（燒傷創面面積?治療后創面面積）/燒傷創面面積×100%。
1.4.3 HE 染色觀察
術后 3、7、14、21 d 每組取 6 只大鼠，麻醉后處死，取創面全層皮膚置于 10% 中性甲醛浸泡固定 24 h，石蠟包埋并進行切片，片厚 4 μm，脫蠟后行 HE 染色。術后 7 d 隨機取近表面視野，先于低倍視野內（10×10）選擇炎性細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞）數目較多的區域，再于高倍視野內（10×40）取 5 個視野，觀察并計數視野內炎性細胞數量，取均值。術后 21 d 隨機取近表面視野，先于低倍視野內（10×10）選擇表皮厚度較均勻的區域，再于高倍視野內（10×40）取 5 個視野，檢測新生表皮厚度，取均值。
1.4.4 CD31 免疫組織化學染色觀察
取術后第 7 天組織標本蠟塊，二甲苯脫蠟，乙醇脫水、抗原修復和血清封閉后，切片加入兔抗 CD31 多克隆抗體標記血管內皮細胞，先于低倍視野內（10×10）選擇 3 個 CD31 標記微血管密度高的區域，然后于高倍視野內（10×20）每個區域計數 5 個視野內的微血管密度[12]，取均值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs 形態學觀察及鑒定
2.1.1 ADSCs 形態學觀察
原代細胞接種 24 h 后大部分貼壁，呈長梭形、三角形或多角形；7 d 細胞進入對數生長期，快速增殖；傳代培養后細胞生長增殖速度加快，形態均一，呈魚群狀、旋渦狀生長。見圖 1。
圖1
ADSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40）
a. 原代細胞接種 48 h；b. 原代細胞接種 7 d；c. 第 1 代細胞；d. 第 3 代細胞
Figure1. Morphology observation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×40)a. Primary cells after 24 hours inoculation; b. Primary cells after 7 days inoculation; c. The first generaration cells; d. The third generaration cells
2.1.2 細胞表型鑒定
流式細胞術檢測示，第 3 代 ADSCs 表面標志物 CD29、CD90 表達率分別為 99.91%、99.23%，呈陽性表達；CD31、CD34、CD44、CD45 表達率分別為 0.02%、0.01%、0.06%、3.65%，呈陰性表達。見圖 2。
圖2
流式細胞儀檢測第 3 代 ADSCs 表面標志物
a. CD29；b. CD90；c. CD31；d. CD34；e. CD45；f. CD44
Figure2. Detection of surface markers of the third generation ADSCs by flow cytometrya. CD29; b. CD90; c. CD31; d. CD34; e. CD45; f. CD44
2.1.3 成脂、成骨誘導鑒定
成脂誘導 2 周，細胞質內出現形態各異的脂滴，油紅 O 染色呈陽性；成骨誘導 4 周，細胞形態變得模糊，呈多形性，鏡下觀察細胞間形成鈣結節，茜素紅染色呈陽性。見圖 3。
圖3
ADSCs 成脂、成骨分化鑒定（倒置相差顯微鏡×200）
a. 成脂誘導 2 周油紅 O 染色；b. 成骨誘導 4 周茜素紅染色
Figure3. Identification of adipogenic and osteogenic differentiation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×200)a. Oil red staining after 2 weeks of adipogenic induction; b. Alizarin red staining after 4 weeks of osteogenic induction
2.2 溫敏 CSCl 凝膠相關觀測
2.2.1 大體觀察
剛配制的溫敏 CSCl 凝膠 4℃ 呈液態、淡黃色，較黏稠；37℃ 恒溫孵箱放置 15 min 后成凝膠。見圖 4。
圖4
溫敏 CSCl 凝膠大體觀察
a. 液態；b. 凝膠狀
Figure4. General observation of thermosensitive CSCl gela. Liquid state; b. Gelatinous
2.2.2 ADSCs 與溫敏 CSCl 凝膠的相容性
體外培養 72 h 后 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物行 Live/Dead 染色，倒置熒光顯微鏡觀察示細胞分布較均勻，大部分細胞被染成綠色，表示細胞存活；少部分細胞呈紅色，表示細胞死亡。見圖 5。
圖5
ADSCs-溫敏 CSCl 凝膠復合物培養 72 h 后 Live/Dead 染 色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
Figure5.
Live/Dead staining of ADSCs-thermosensitive CSCl gel composites cultured for 72 hours (Inverted fluorescence microscope×200)
2.2.3 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠中的增殖情況
CCK-8 法檢測示，培養 1、3、5、7 d 實驗組 A 值均低于對照組。第 1 天兩組 A 值差異無統計學意義（P>0.05）；對照組 A 值從第 3 天開始呈下降趨勢，而實驗組 A 值繼續上升，兩組 3、5、7 d 時比較差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 6。
圖6
CCK-8 法檢測 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠中的增殖情況
Figure6.
The proliferation of ADSCs in thermosensitive CSCl gel detected by CCK-8 method
2.3 動物實驗
2.3.1 創面大體觀察
燙傷后大鼠背部創面即刻出現腫脹，與周圍正常皮膚形成明顯界限；HE 染色示皮膚表皮和部分真皮層結構消失，形成凝固性壞死，并有大量炎性細胞浸潤。見圖 7。3 組大鼠均存活至實驗結束，實驗期間除 A 組有 1 只大鼠創面創緣紅腫外，余均未見創面感染。3 組大鼠創面均隨時間推移而縮小，術后 3 d，B、C 組創面閉合速度快于 A 組；7、14 d，3 組創面閉合速度減慢，C 組創面閉合率高于 A、B 組；21 d，各組大鼠創面均可見新生上皮覆蓋，但均未完全閉合，已閉合部位毛發長出，未閉合部位形狀不規則。術后各時間點 B、C 組創面閉合率均大于 A 組，C 組大于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 8、9。
圖7
燙傷 3 d 后大鼠皮膚組織 HE 染色觀察（倒置相差顯微 鏡×40）
Figure7.
HE staining observation of rats skin tissue at 3 days after burn (Inverted phase contrast microscope×40)
圖8
術后各時間點各組大鼠創面閉合情況比較
從左至右依次為術后 3、7、14、21 d a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure8. Comparison of wound closure in each group at different time points after operationFrom left to right for the time at 3, 7, 14, and 21 days after operation a. Group A; b. Group B; c. Group C
圖9
術后各時間點各組大鼠創面閉合率比較
Figure9.
Wound closure rate of rats at each time point after operation
2.3.2 HE 染色觀察創面修復情況
術后 3 d，3 組大鼠創面均可見大量中性粒細胞浸潤，成纖維細胞數量較少。術后 7 d，3 組大鼠創面修復進入纖維增生期，各組可見膠原沉積，真皮層可見炎性細胞浸潤，A、B、C 組炎性細胞數分別為（29.61±2.99）、（22.89±1.71）、（16.61±2.15）個/視野，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.01）。術后 14 d，3 組大鼠創面出現大量纖維結締組織，可見新生表皮，C 組新生表皮較致密。術后 21 d，與正常皮膚組織相比，B、C 組新生上皮排列整齊，真皮層纖維結締組織排列整齊，可見成纖維細胞及新生毛細血管，A 組亦可見新生表皮覆蓋，但真皮層纖維結締組織排列較紊亂，見零星毛細血管。A、B、C 組新生表皮厚度分別為（65.87±1.13）、（107.20±3.35）、（123.96±4.20）μm，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 10、11。
圖10
HE 染色觀察術后 7 d 各組炎性細胞（倒置相差顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure10. HE staining observation of inflammatory cells in each group at 7 days after operation (Inverted phase contrast microscope×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C
圖11
HE 染色觀察術后 21 d 各組新生表皮厚度 （倒置相差顯微鏡 ×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure11. HE staining observation of epidermal thickness in each group at 21 days after operation (Inverted phase contrast microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C2.3.3 CD31 免疫組織化學染色觀察
術后 7 d，CD31 免疫組織化學染色示各組均可見新生微血管。A、B、C 組大鼠創面新生微血管數分別為（21.64±5.36）、（48.14±5.33）、（71.63±8.03）個/視野，C 組顯著高于 A、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 12。
圖12
術后 7 d 各組 CD31 免疫組織化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure12. CD31 immunohistochemical staining observation in each group at 7 days after operation (Inverted phase contrast microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C3 討論
MSCs 能夠自我更新、穩定增殖、多向分化，被廣泛運用于再生醫學及皮膚組織工程[13]。MSCs 可以通過分化、自我增殖及分泌生長因子等方式促進受損皮膚再生、膠原沉積、微血管生成。研究證實其創面修復過程主要是在趨化因子作用下遷移至受損部位，分化為特定的細胞，調節免疫反應增加創面血管生成，同時能分泌抗菌因子直接殺滅細菌[14]。ADSCs 同 BMSCs 有著相似的細胞表型和分化潛能，但 ADSCs 來源更豐富、獲取更方便，數量更多。將 ADSCs 連續培養至第 11 代，發現其細胞形態無明顯變化，證明其具有強大增殖能力，可穩定傳代[15]。將 ADSCs 懸液運用于放射性損傷后大鼠創面和缺血再灌注損傷后的皮膚創面發現，ADSCs 可以通過增加皮瓣血液供應及創面血管數量，提高皮瓣存活率[16-17]；將 ADSCs 懸液注射入經紫外線誘導后的裸鼠皮膚老化模型中，發現其促進真皮層膠原合成，增加真皮厚度[18]。本研究使用酶原消化并差速貼壁的方式獲取 ADSCs 并培養傳代，通過檢測其表面標志物提示本實驗提取所得細胞為 ADSCs，且細胞純度較高；通過對第 3 代 ADSCs 進行成脂、成骨誘導分化實驗，油紅 O 染色可見細胞質內有大小不一的脂滴形成，茜素紅染色可見鈣結節，提示 ADSCs 具有成骨、成脂分化潛能。
然而，直接運用 ADSCs 懸液進行相關研究面臨著細胞存活率低、移植效率不高等問題，尋找合適的 ADSCs 支架材料，可以增加其存活率及利用率。有研究將 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物運用于大鼠心肌梗死模型治療中，發現溫敏 CSCl 凝膠作為 ADSCs 載體，為 ADSCs 提供了適宜的生存環境，改變心肌梗死部位微環境，增加 ADSCs 殘留及存活數，通過檢測心肌標志物的表達發現 ADSCs 加速向心肌細胞轉化，梗死部位微血管密度較高，新生血管生成加快，膠原合成減少[19]。溫敏 CSCl 凝膠作為 ADSCs 支架，在急性腎損傷治療研究中發現腎細胞增殖加快、凋亡減少，腎臟微血管數目增加和腎小管細胞再生加快[12, 20]。在皮膚組織工程研究中，將三維培養的 ADSCs 運用于糖尿病大鼠創面修復實驗中，通過 CD31 及 Ki67 免疫組織化學染色法，發現創面血管生成增加，細胞自我增殖加快，同時創面閉合速率也大幅度提升[12]。本實驗采用三維培養的 ADSCs 對燒傷創面進行修復。既往研究證實溫敏 CSCl 凝膠具有溫度敏感性，4℃ 下有流動性，呈液態，37℃ 成凝膠后鏡下觀察強度較高，內部具有均勻、連續的多孔通道，具備細胞生長所需的三維空間結構，將細胞包埋于凝膠中后，細胞生長良好，增殖加快，凋亡減慢，具有良好的組織相容性[21]。軟骨組織工程研究中也發現溫敏 CSCl 凝膠細胞毒性較小，具有良好的組織相容性，包埋于其中的種子細胞能夠存活并穩定增殖，修復軟骨組織缺損的同時具有良好的可降解性[22]。本研究體外實驗階段通過 Live/Dead 染色和 CCK-8 法觀察 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠的存活和增殖情況，發現 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠中生長良好，雖增殖速率較二維培養慢，但是研究期間一直保持穩定增殖率持續生長。為探究 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物對燙傷創面的修復情況，本研究通過開水接觸燙傷法成功制備大鼠深Ⅱ度燙傷模型，將 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物運用于大鼠深Ⅱ度燙傷創面，觀察其對創面修復的影響。結果顯示其顯著加速 SD 大鼠燙傷創面閉合；組織學觀察示，相對于溫敏 CSCl 凝膠組和對照組，ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物組創面上皮化加快、炎性細胞浸潤較少；免疫組織化學染色法檢測創面 CD31 表達，觀察創面新生微血管密度，與既往研究結果相似，發現 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物組 CD31 陽性表達細胞數明顯高于其他兩組，表明 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物可以通過增加大鼠深Ⅱ度燒傷皮膚微血管數量來加速創面修復。至于 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物是通過分泌細胞因子還是誘導表皮細胞、血管內皮細胞分化來加速創面修復，有待后期進一步研究。
綜上述，ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物的成功制備為干細胞和皮膚組織工程研究在燒傷方面的運用提供了新的方向。通過初步探討其促進燒傷創面修復的情況，發現 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠可以通過加速創面上皮化、減少炎性細胞浸潤及增加創面微血管等方式促進大鼠深Ⅱ度燙傷創面修復。
深度燒傷后皮膚屏障及再生功能常遭受破壞，如何快速且高效地修復深度燒傷創面，是燒傷整形科醫生面臨的巨大挑戰[1-2]。目前的治療方法主要有兩種：一是早期行創面削痂植皮，去除壞死組織，減少燒傷創面感染因素，縮短愈合時間，但面臨皮源不足、手術創傷大、費用較高等問題[3-4]；另一種方法是運用醫用敷料覆蓋創面，可以維持內環境穩定，促進殘存上皮再生，加速創面愈合。近年來，殼聚糖及其衍生物因具有良好的組織相容性、生物可降解性、廣譜抗菌性、止血防黏性等特點，被越來越多研究者運用于燒傷創面敷料的研究。特別是溫敏氯化殼聚糖（chitosan chloride，CSCl）凝膠，其三維立體多孔結構有利于促進細胞黏附和增殖，能夠有效阻止細菌感染，促進創面愈合[5-7]。而脂肪間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）免疫原性低，能自我更新、穩定增殖、多向分化，是組織工程種子細胞的研究熱點[8-9]。其分泌的細胞因子能促進表皮細胞、成纖維細胞增殖及微血管生成，被廣泛應用于燒傷創面修復研究[10-11]。因此本實驗結合兩者特點，制備 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物，將其運用于大鼠深Ⅱ度燙傷創面，觀察其對燙傷創面修復的可行性，旨在為深度燙傷創面修復提供一種新型的組織工程修復方式。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF 級 6 周齡雄性 SD 大鼠 2 只，體質量 150～200 g；SPF 級 8 周齡雄性 SD 大鼠 72 只，體質量 200～250 g；均由西南醫科大學動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2018-065。所有動物實驗獲得西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準（20171211021）。
CSCl（浙江金殼生物化學有限公司）；β-甘油磷酸鈉、Ⅰ型膠原酶及流式抗體 CD29、CD31、CD34、CD45、CD90（Sigma 公司，美國）；羥乙基纖維素（Fluka 公司，瑞士）；DMEM/F12 培養基（HyClone 公司，美國）；青-鏈霉素溶液、0.25% 胰蛋白酶（ScienCell 公司，美國）；FBS（杭州天杭生物科技股份公司）；成脂誘導液、成骨誘導液（BD 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化學公司，日本）；Live/Dead 染色試劑盒（Molecular probe 公司，美國）；硫化鈉（成都科龍化工試劑廠）。
生物安全柜（Telstar 公司，西班牙）；CO2 恒溫培養箱（Thermo 公司，美國）；普通高速離心機（Bio-Rad 公司，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；流式細胞儀（BD 公司，德國）；低溫離心機（Eppendorff 公司，德國）；分光光度計（Leica 公司，德國）。
1.2 ADSCs 提取、傳代及鑒定
1.2.1 ADSCs 提取及傳代
取 SPF 級 6 周齡雄性 SD 大鼠脫頸處死，乙醇浸泡后，無菌提取腹股溝處皮下脂肪組織，PBS 反復沖洗，剔除筋膜和血管，剪至糊狀；加入 2～3 倍體積 0.1%Ⅰ型膠原酶 37℃ 恒溫消化 60 min，等量完全培養基（含 10%FBS 的 DMEM 培養基）終止消化，以 700×g 離心 10 min；去除上清液和上層脂肪，以等量完全培養基重懸混勻；70 μm 濾網過濾后完全培養基重懸混勻，以 180×g 離心 5 min；去上清液，PBS 吹打混勻，再次以 180×g 離心 5 min 后去上清液，完全培養基重懸混勻，接種入 25 cm2培養瓶中，37℃、5%CO2 培養箱中培養；24 h 后全量換液；每 3 天更換培養基，至細胞達 80%～90% 融合時，以 0.25% 胰蛋白酶消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.2.2 細胞鑒定
① 免疫表型鑒定：取第 3 代 ADSCs 用 0.25% 胰蛋白酶消化后制成密度為 1×106個/mL 的單細胞懸液，每管 100 μL 分裝于 1.5 mL EP 管中，分別加入流式抗體 CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90，設立陰性對照，室溫避光孵育 30 min 后流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達。② 成脂、成骨分化鑒定：取第 3 代 ADSCs 用 0.25% 胰蛋白酶消化后，按 2×105個/孔密度接種于 6 孔板中，待細胞達 100% 融合時分別更換成脂誘導液和成骨誘導液。成脂誘導 2 周后油紅 O 染色觀察成脂分化效果，成骨誘導 4 周后茜素紅染色觀察成骨分化效果。
1.3 溫敏 CSCl 凝膠制備及相關觀測
1.3.1 溫敏 CSCl 凝膠的制備
取 0.2 g 無菌 CSCl 粉末溶于 10 mL 無菌超純水，制成 2%CSCl 溶液；1.15 g β-甘油磷酸鈉溶于 10 mL H-DMEM 中，制成 11.5%β-甘油磷酸鈉溶液；0.25 g 羥乙基纖維素溶于 10 mL H-DMEM 中，制成 2.5% 羥乙基纖維素溶液。將 CSCl、β-甘油磷酸鈉、羥乙基纖維素于 0.22 μm 濾菌器過濾后，依次按 8∶2∶2.5 的比例混勻，置于 37℃、5%CO2 孵箱中，15 min 后形成凝膠。
1.3.2 ADSCs 與溫敏 CSCl 凝膠的相容性
取 5 mL 溫敏 CSCl 凝膠與 1×107個 ADSCs 混合，制成密度為 2×106個/mL 的 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物，加入 24 孔板，每孔 1 mL，培養 72 h。配制 Live/Dead 染液，將 2 μL EthdD-1 避光加入 1 mL PBS 中，混勻后再加入 0.5 μL 鈣黃綠素，混合后加入上述 24 孔板中，37℃ 避光孵育 30 min，倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.3.3 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠中的增殖情況
取 5 mL 溫敏 CSCl 凝膠與 1×107個 ADSCs 混合，制成密度為 2×106個/mL 的 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物，為實驗組；ADSCs 組為對照組。均加入 96 孔板，每孔 50 μL，共 20 孔。放入 37℃ 孵箱待實驗組成凝膠后，每孔加入 0.1 mL 完全培養基。于培養 1、3、5、7 d 兩組分別取 5 孔，全量換液后，添加 10 μL CCK-8 原液；37℃ 孵育 4 h，分光光度計于 450 nm 處測其吸光度（A）值，并繪制細胞增殖曲線。
1.4 動物實驗
1.4.1 大鼠深Ⅱ度燙傷創面造模及處理
取 SPF 級 8 周齡雄性 SD 大鼠 72 只，2% 戊巴比妥（2 mL/kg）腹腔注射麻醉后，8% 硫化鈉脫去大鼠背部毛發，自制燙傷模具緊貼大鼠背部脫毛區域；將 10 mL 沸水迅速倒入模具中，10 s 后快速倒出沸水，制成一直徑約 2.5 cm 的圓形深Ⅱ度燙傷模型，行病理切片 HE 染色鑒定造模是否成功。造模后將大鼠單籠飼養，隨機分為 3 組，每組 24 只。燙傷后創面無菌紗布保護創面，每天更換紗布，3 d 后削痂，A 組為空白對照組，以凡士林紗布加無菌紗布覆蓋創面；B 組用 1 mL 溫敏 CSCl 凝膠，涂抹創面后凡士林紗布覆蓋；C 組以 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物（ADSCs 密度為 2×106個/mL）1 mL 涂抹創面后，凡士林紗布覆蓋。然后包扎固定，3 組均隔天換藥。
1.4.2 創面大體觀察
觀察大鼠創面閉合情況。術后 3、7、14、21 d 每組取 6 只大鼠，麻醉后無菌塑料薄膜覆蓋創面并用鉛筆描繪其大小，將繪制好的薄膜掃描入電腦，用 Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對輪廓大小進行分析，按以下公式計算創面閉合率：（燒傷創面面積?治療后創面面積）/燒傷創面面積×100%。
1.4.3 HE 染色觀察
術后 3、7、14、21 d 每組取 6 只大鼠，麻醉后處死，取創面全層皮膚置于 10% 中性甲醛浸泡固定 24 h，石蠟包埋并進行切片，片厚 4 μm，脫蠟后行 HE 染色。術后 7 d 隨機取近表面視野，先于低倍視野內（10×10）選擇炎性細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞）數目較多的區域，再于高倍視野內（10×40）取 5 個視野，觀察并計數視野內炎性細胞數量，取均值。術后 21 d 隨機取近表面視野，先于低倍視野內（10×10）選擇表皮厚度較均勻的區域，再于高倍視野內（10×40）取 5 個視野，檢測新生表皮厚度，取均值。
1.4.4 CD31 免疫組織化學染色觀察
取術后第 7 天組織標本蠟塊，二甲苯脫蠟，乙醇脫水、抗原修復和血清封閉后，切片加入兔抗 CD31 多克隆抗體標記血管內皮細胞，先于低倍視野內（10×10）選擇 3 個 CD31 標記微血管密度高的區域，然后于高倍視野內（10×20）每個區域計數 5 個視野內的微血管密度[12]，取均值。
1.5 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs 形態學觀察及鑒定
2.1.1 ADSCs 形態學觀察
原代細胞接種 24 h 后大部分貼壁，呈長梭形、三角形或多角形；7 d 細胞進入對數生長期，快速增殖；傳代培養后細胞生長增殖速度加快，形態均一，呈魚群狀、旋渦狀生長。見圖 1。
圖1
ADSCs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×40）
a. 原代細胞接種 48 h；b. 原代細胞接種 7 d；c. 第 1 代細胞；d. 第 3 代細胞
Figure1. Morphology observation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×40)a. Primary cells after 24 hours inoculation; b. Primary cells after 7 days inoculation; c. The first generaration cells; d. The third generaration cells
2.1.2 細胞表型鑒定
流式細胞術檢測示，第 3 代 ADSCs 表面標志物 CD29、CD90 表達率分別為 99.91%、99.23%，呈陽性表達；CD31、CD34、CD44、CD45 表達率分別為 0.02%、0.01%、0.06%、3.65%，呈陰性表達。見圖 2。
圖2
流式細胞儀檢測第 3 代 ADSCs 表面標志物
a. CD29；b. CD90；c. CD31；d. CD34；e. CD45；f. CD44
Figure2. Detection of surface markers of the third generation ADSCs by flow cytometrya. CD29; b. CD90; c. CD31; d. CD34; e. CD45; f. CD44
2.1.3 成脂、成骨誘導鑒定
成脂誘導 2 周，細胞質內出現形態各異的脂滴，油紅 O 染色呈陽性；成骨誘導 4 周，細胞形態變得模糊，呈多形性，鏡下觀察細胞間形成鈣結節，茜素紅染色呈陽性。見圖 3。
圖3
ADSCs 成脂、成骨分化鑒定（倒置相差顯微鏡×200）
a. 成脂誘導 2 周油紅 O 染色；b. 成骨誘導 4 周茜素紅染色
Figure3. Identification of adipogenic and osteogenic differentiation of ADSCs (Inverted phase contrast microscope×200)a. Oil red staining after 2 weeks of adipogenic induction; b. Alizarin red staining after 4 weeks of osteogenic induction
2.2 溫敏 CSCl 凝膠相關觀測
2.2.1 大體觀察
剛配制的溫敏 CSCl 凝膠 4℃ 呈液態、淡黃色，較黏稠；37℃ 恒溫孵箱放置 15 min 后成凝膠。見圖 4。
圖4
溫敏 CSCl 凝膠大體觀察
a. 液態；b. 凝膠狀
Figure4. General observation of thermosensitive CSCl gela. Liquid state; b. Gelatinous
2.2.2 ADSCs 與溫敏 CSCl 凝膠的相容性
體外培養 72 h 后 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物行 Live/Dead 染色，倒置熒光顯微鏡觀察示細胞分布較均勻，大部分細胞被染成綠色，表示細胞存活；少部分細胞呈紅色，表示細胞死亡。見圖 5。
圖5
ADSCs-溫敏 CSCl 凝膠復合物培養 72 h 后 Live/Dead 染 色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
Figure5.
Live/Dead staining of ADSCs-thermosensitive CSCl gel composites cultured for 72 hours (Inverted fluorescence microscope×200)
2.2.3 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠中的增殖情況
CCK-8 法檢測示，培養 1、3、5、7 d 實驗組 A 值均低于對照組。第 1 天兩組 A 值差異無統計學意義（P>0.05）；對照組 A 值從第 3 天開始呈下降趨勢，而實驗組 A 值繼續上升，兩組 3、5、7 d 時比較差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 6。
圖6
CCK-8 法檢測 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠中的增殖情況
Figure6.
The proliferation of ADSCs in thermosensitive CSCl gel detected by CCK-8 method
2.3 動物實驗
2.3.1 創面大體觀察
燙傷后大鼠背部創面即刻出現腫脹，與周圍正常皮膚形成明顯界限；HE 染色示皮膚表皮和部分真皮層結構消失，形成凝固性壞死，并有大量炎性細胞浸潤。見圖 7。3 組大鼠均存活至實驗結束，實驗期間除 A 組有 1 只大鼠創面創緣紅腫外，余均未見創面感染。3 組大鼠創面均隨時間推移而縮小，術后 3 d，B、C 組創面閉合速度快于 A 組；7、14 d，3 組創面閉合速度減慢，C 組創面閉合率高于 A、B 組；21 d，各組大鼠創面均可見新生上皮覆蓋，但均未完全閉合，已閉合部位毛發長出，未閉合部位形狀不規則。術后各時間點 B、C 組創面閉合率均大于 A 組，C 組大于 B 組，差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 8、9。
圖7
燙傷 3 d 后大鼠皮膚組織 HE 染色觀察（倒置相差顯微 鏡×40）
Figure7.
HE staining observation of rats skin tissue at 3 days after burn (Inverted phase contrast microscope×40)
圖8
術后各時間點各組大鼠創面閉合情況比較
從左至右依次為術后 3、7、14、21 d a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure8. Comparison of wound closure in each group at different time points after operationFrom left to right for the time at 3, 7, 14, and 21 days after operation a. Group A; b. Group B; c. Group C
圖9
術后各時間點各組大鼠創面閉合率比較
Figure9.
Wound closure rate of rats at each time point after operation
2.3.2 HE 染色觀察創面修復情況
術后 3 d，3 組大鼠創面均可見大量中性粒細胞浸潤，成纖維細胞數量較少。術后 7 d，3 組大鼠創面修復進入纖維增生期，各組可見膠原沉積，真皮層可見炎性細胞浸潤，A、B、C 組炎性細胞數分別為（29.61±2.99）、（22.89±1.71）、（16.61±2.15）個/視野，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.01）。術后 14 d，3 組大鼠創面出現大量纖維結締組織，可見新生表皮，C 組新生表皮較致密。術后 21 d，與正常皮膚組織相比，B、C 組新生上皮排列整齊，真皮層纖維結締組織排列整齊，可見成纖維細胞及新生毛細血管，A 組亦可見新生表皮覆蓋，但真皮層纖維結締組織排列較紊亂，見零星毛細血管。A、B、C 組新生表皮厚度分別為（65.87±1.13）、（107.20±3.35）、（123.96±4.20）μm，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.01）。見圖 10、11。
圖10
HE 染色觀察術后 7 d 各組炎性細胞（倒置相差顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure10. HE staining observation of inflammatory cells in each group at 7 days after operation (Inverted phase contrast microscope×40)a. Group A; b. Group B; c. Group C
圖11
HE 染色觀察術后 21 d 各組新生表皮厚度 （倒置相差顯微鏡 ×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure11. HE staining observation of epidermal thickness in each group at 21 days after operation (Inverted phase contrast microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C2.3.3 CD31 免疫組織化學染色觀察
術后 7 d，CD31 免疫組織化學染色示各組均可見新生微血管。A、B、C 組大鼠創面新生微血管數分別為（21.64±5.36）、（48.14±5.33）、（71.63±8.03）個/視野，C 組顯著高于 A、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 12。
圖12
術后 7 d 各組 CD31 免疫組織化學染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure12. CD31 immunohistochemical staining observation in each group at 7 days after operation (Inverted phase contrast microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C3 討論
MSCs 能夠自我更新、穩定增殖、多向分化，被廣泛運用于再生醫學及皮膚組織工程[13]。MSCs 可以通過分化、自我增殖及分泌生長因子等方式促進受損皮膚再生、膠原沉積、微血管生成。研究證實其創面修復過程主要是在趨化因子作用下遷移至受損部位，分化為特定的細胞，調節免疫反應增加創面血管生成，同時能分泌抗菌因子直接殺滅細菌[14]。ADSCs 同 BMSCs 有著相似的細胞表型和分化潛能，但 ADSCs 來源更豐富、獲取更方便，數量更多。將 ADSCs 連續培養至第 11 代，發現其細胞形態無明顯變化，證明其具有強大增殖能力，可穩定傳代[15]。將 ADSCs 懸液運用于放射性損傷后大鼠創面和缺血再灌注損傷后的皮膚創面發現，ADSCs 可以通過增加皮瓣血液供應及創面血管數量，提高皮瓣存活率[16-17]；將 ADSCs 懸液注射入經紫外線誘導后的裸鼠皮膚老化模型中，發現其促進真皮層膠原合成，增加真皮厚度[18]。本研究使用酶原消化并差速貼壁的方式獲取 ADSCs 并培養傳代，通過檢測其表面標志物提示本實驗提取所得細胞為 ADSCs，且細胞純度較高；通過對第 3 代 ADSCs 進行成脂、成骨誘導分化實驗，油紅 O 染色可見細胞質內有大小不一的脂滴形成，茜素紅染色可見鈣結節，提示 ADSCs 具有成骨、成脂分化潛能。
然而，直接運用 ADSCs 懸液進行相關研究面臨著細胞存活率低、移植效率不高等問題，尋找合適的 ADSCs 支架材料，可以增加其存活率及利用率。有研究將 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物運用于大鼠心肌梗死模型治療中，發現溫敏 CSCl 凝膠作為 ADSCs 載體，為 ADSCs 提供了適宜的生存環境，改變心肌梗死部位微環境，增加 ADSCs 殘留及存活數，通過檢測心肌標志物的表達發現 ADSCs 加速向心肌細胞轉化，梗死部位微血管密度較高，新生血管生成加快，膠原合成減少[19]。溫敏 CSCl 凝膠作為 ADSCs 支架，在急性腎損傷治療研究中發現腎細胞增殖加快、凋亡減少，腎臟微血管數目增加和腎小管細胞再生加快[12, 20]。在皮膚組織工程研究中，將三維培養的 ADSCs 運用于糖尿病大鼠創面修復實驗中，通過 CD31 及 Ki67 免疫組織化學染色法，發現創面血管生成增加，細胞自我增殖加快，同時創面閉合速率也大幅度提升[12]。本實驗采用三維培養的 ADSCs 對燒傷創面進行修復。既往研究證實溫敏 CSCl 凝膠具有溫度敏感性，4℃ 下有流動性，呈液態，37℃ 成凝膠后鏡下觀察強度較高，內部具有均勻、連續的多孔通道，具備細胞生長所需的三維空間結構，將細胞包埋于凝膠中后，細胞生長良好，增殖加快，凋亡減慢，具有良好的組織相容性[21]。軟骨組織工程研究中也發現溫敏 CSCl 凝膠細胞毒性較小，具有良好的組織相容性，包埋于其中的種子細胞能夠存活并穩定增殖，修復軟骨組織缺損的同時具有良好的可降解性[22]。本研究體外實驗階段通過 Live/Dead 染色和 CCK-8 法觀察 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠的存活和增殖情況，發現 ADSCs 在溫敏 CSCl 凝膠中生長良好，雖增殖速率較二維培養慢，但是研究期間一直保持穩定增殖率持續生長。為探究 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物對燙傷創面的修復情況，本研究通過開水接觸燙傷法成功制備大鼠深Ⅱ度燙傷模型，將 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物運用于大鼠深Ⅱ度燙傷創面，觀察其對創面修復的影響。結果顯示其顯著加速 SD 大鼠燙傷創面閉合；組織學觀察示，相對于溫敏 CSCl 凝膠組和對照組，ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物組創面上皮化加快、炎性細胞浸潤較少；免疫組織化學染色法檢測創面 CD31 表達，觀察創面新生微血管密度，與既往研究結果相似，發現 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物組 CD31 陽性表達細胞數明顯高于其他兩組，表明 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物可以通過增加大鼠深Ⅱ度燒傷皮膚微血管數量來加速創面修復。至于 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物是通過分泌細胞因子還是誘導表皮細胞、血管內皮細胞分化來加速創面修復，有待后期進一步研究。
綜上述，ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠復合物的成功制備為干細胞和皮膚組織工程研究在燒傷方面的運用提供了新的方向。通過初步探討其促進燒傷創面修復的情況，發現 ADSCs/溫敏 CSCl 凝膠可以通過加速創面上皮化、減少炎性細胞浸潤及增加創面微血管等方式促進大鼠深Ⅱ度燙傷創面修復。
