引用本文： 張加強, 魏長征, 吳祎, 林浩東, 尹剛, 陳匯浩, 謝錚, 侯春林. 交聯幾丁糖治療兔膝骨關節炎的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(2): 185-189. doi: 10.7507/1002-1892.201804035 復制
骨關節炎是一種臨床常見的以關節疼痛和關節功能障礙為主要臨床表現的疾病。根據流行病學調查數據，我國目前癥狀性膝骨關節炎患病率為 8.1%，這意味著我國大約有 1.1 億膝骨關節炎患者[1]。根據病情嚴重程度，治療方式各有不同，以透明質酸鈉、幾丁糖關節腔內注射為代表的黏彈性補充療法是臨床常用方法之一。該方法能明顯緩解早、中期骨關節炎臨床癥狀，改善患肢運動功能，延緩骨關節炎發展，保護關節軟骨[1-3]。但是透明質酸鈉及幾丁糖體內吸收快、療效短，骨關節炎患者需長期、多次注射，增加患者經濟負擔及創面感染風險。本課題組利用幾丁糖帶正電荷的屬性，制備新型長效交聯幾丁糖，通過延長體內存留時間，增加交聯幾丁糖對骨關節炎有效作用時間，以達到減少注射次數、減輕患者痛苦的目的[4]。本次研究以新西蘭兔作為實驗對象，采用膝關節前交叉韌帶切斷術制備骨關節炎模型，通過膝關節腔注射交聯幾丁糖，探討其作為臨床膝骨關節炎治療藥物的可行性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、材料
健康 4～5 月齡新西蘭雌性白兔 32 只，體質量（2.5±0.5）kg，購自上海科碩實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號 SYXK（滬）2012-0006。交聯幾丁糖及幾丁糖由上海其勝生物制劑有限公司制備。Ⅱ型膠原染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
32 只新西蘭白兔隨機分為 A、B、C、D 4 組（n=8），其中 A、B、C 組制備骨關節炎模型后，分別關節腔內注射交聯幾丁糖、幾丁糖、生理鹽水；D 組為假手術組。4 組動物以耳緣靜脈注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，A～C 組作左后肢膝內側切口，橫斷前交叉韌帶，造成機械失穩，建立骨關節炎模型；D 組同法作左后肢膝內側切口，不切斷前交叉韌帶，直接關閉切口。術后 4 組動物每天腹腔注射頭孢唑林鈉 500 mg，連續 7 d。造模術后 4 周，觀察 A～C 組兔膝關節僵硬跛行且前抽屜試驗陽性，確認造模成功。
確認造模成功后，A 組關節腔內注射交聯幾丁糖 1 次 0.6 mL；B 組關節腔內注射幾丁糖，每 2 周 1 次，每次 0.3 mL，連續注射 2 次；C、D 組關節腔內注射生理鹽水，每 2 周 1 次，每次 0.3 mL，連續注射 2 次。于造模術后 8 周，4 組動物均經耳緣靜脈注射過量麻醉劑處死，沿左后肢原切口入路取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
各組觀察股骨髁磨損情況，于顯微鏡下觀察股骨髁關節面的病理改變，行大體標本評分。評分標準[5]：0 分，關節面光整，色澤如常；1 分，關節面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；2 分，關節面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表中層；3 分，關節面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層；4 分，軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露。
1.3.2 掃描電鏡觀察
大體觀察后，切取膝關節股骨髁，清除軟組織，用生理鹽水徹底沖洗標本表面凝血塊，于股骨髁關節面切取部分軟骨組織進行掃描電鏡觀察。將標本置于戊二醛及鋨酸中固定 3 h，梯度乙醇脫水，自然干燥，導電膠粘樣，離子濺射鍍膜，掃描電子顯微鏡下觀察軟骨表面顯微結構。
1.3.3 組織學觀察
將剩余部分軟骨組織置于 4% 多聚甲醛中固定 24 h，脫鈣、脫水、石蠟包埋。取部分軟骨石蠟塊切片，片厚 3 μm，常規行 HE 染色及番紅-固綠染色，中性樹膠封片。HE 染色切片光鏡下觀察軟骨組織結構，番紅-固綠染色切片光鏡下觀察軟骨基質著色情況；結合兩種染色圖像行 Mankin 評分[6]。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
取部分軟骨蠟塊制備 3 μm 厚切片，二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇脫水，自來水沖洗，37℃ 恒溫箱中修復抗原 30 min，3% H2O2 室溫避光孵育 25 min，以抑制內源性過氧化物酶活性，滴加 3% BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉血清 30 min，直接甩干后，加入一抗Ⅱ型膠原，放于濕盒內 4℃ 孵育過夜，PBS 沖洗后，加二抗室溫孵育 50 min，加入 DAB 顯色，自來水沖洗終止反應，蘇木素復染、脫水、透明、封片。光鏡下觀察軟骨細胞染色情況。參考 Pelletier 等[7]的方法計算Ⅱ型膠原表達量，以細胞分數（陽性細胞數占細胞總數的百分比）表示。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 q 檢驗；計數資料組間比較采用秩和檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
A 組：關節面較光滑 ，有少量微裂隙形成，色澤稍灰暗；B 組：關節面有少量骨贅形成，關節面輕度磨損；C 組：關節面軟骨剝脫，骨贅增生，軟骨下骨暴露，關節滑膜充血；D 組關節面完整光滑，色澤明亮，無磨損。見圖 1。
圖1
各組軟骨大體觀察
a. A 組；b. B 組 箭頭示骨贅形成；c. C 組 箭頭示骨贅形成；d. D 組
Figure1. Macroscopic observation of cartilage in each groupa. Group A; b. Group B Arrow indicated osteophyte formation; c. Group C Arrow indicated osteophyte formation; d. Group D
軟骨大體評分比較，B、C 組軟骨缺損程度高于 D 組，C 組高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A 組與 B、D 組軟骨缺損程度比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
各組軟骨大體評分
Table1.
The macroscopic observation scores in each group
2.2 掃描電鏡觀察
A 組：關節軟骨表面纖維樣紋理結構清晰，表面較完整；B 組：關節軟骨表面纖維樣紋理結構較 A 組減少，部分磨損；C 組：關節軟骨表面纖維樣紋理結構消失，軟骨缺損；D 組：關節軟骨表面纖維樣紋理結構清晰，表面完整平滑。見圖 2。
圖2
各組軟骨掃描電鏡觀察（×2 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure2. Scanning electron microscopy of cartilage in each group (×2 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3 組織學觀察
HE 染色：A 組關節表面完整，軟骨細胞層次可；B 組關節表面粗糙，軟骨細胞數量較 A 組減少；C 組關節表面完整性破壞，裂紋明顯，并有纖維形成，軟骨細胞萎縮，排列紊亂，細胞外基質較其他組減少；D 組關節表面完整光滑，軟骨細胞形態正常。見圖 3a。
圖3
各組軟骨組織學觀察（×200）
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. HE 染色；b. 番紅-固綠染色
Figure3. Histological observation of cartilage in each group (×200)From left to right for groups A, B, C, and D，respectively a. HE staining; b. Safranin-fast green double staining
番紅-固綠染色：A 組軟骨基質少量分解，番紅染色較 D 組略減少；B 組軟骨基質部分分解，番紅染色較 D 組減少；C 組軟骨外基質大量分解，番紅染色較 D 組明顯減少；D 組軟骨結構規則，軟骨基質豐富，番紅染色最明顯。見圖 3b。
A、B、C、D 組關節軟骨 Mankin 評分分別為 4.88±0.99、5.75±1.04、8.25±1.28、0.63±0.74。B、C 組評分明顯高于 D 組，C 組高于 A 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 免疫組織化學染色觀察
A、B、C、D 組Ⅱ型膠原陽性軟骨細胞百分比分別為 74.00%±5.45%、59.25%±6.94%、42.25%±5.44%、82.38%±8.31%；B、C 組Ⅱ型膠原陽性軟骨細胞百分比明顯低于 D 組，A 組高于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
各組Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4. Immunohistochemical staining observation of collagen type Ⅱ in each group(×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
目前，骨關節炎相關研究中建立動物模型的方法有多種，如關節制動、手術、關節腔內物質注射誘導骨關節炎等，其中關節內手術法模型建立成功率高，效果穩定[8-10]。本研究采用的前交叉韌帶切斷法能造成關節失穩、誘導關節軟骨退變，骨贅形成，模擬人體骨關節炎的病理變化，適用于膝關節內注藥預防和減輕骨關節炎病理變化的研究[11-12]。
骨關節炎發病機制目前尚不清楚，研究表明可能是關節軟骨退變導致關節功能及再生修復過程受損[13-14]，本研究 C 組關節軟骨觀察結果也進一步證實該損傷機制。本研究結果顯示，交聯幾丁糖能明顯保護關節軟骨，減少關節軟骨的磨損及破壞。掃描電鏡觀察顯示 A、B 組關節表面纖維結構較 C 組完整，可能與交聯幾丁糖、幾丁糖作為外源性黏彈性物質，增強和改善關節的黏彈性有關[15-17]。此外，B 組關節軟骨表面纖維樣紋理結構較 A 組減少，可能與交聯幾丁糖誘導軟骨細胞再生、促進軟骨修復作用較幾丁糖更顯著有關。免疫組織化學染色觀察顯示，A 組Ⅱ型膠原陽性軟骨細胞百分比明顯高于 C 組，可能與交聯幾丁糖促進Ⅱ型膠原合成有關。組織學觀察顯示 C 組細胞排列不規則、軟骨基質減少，而 A 組細胞排列規則、軟骨基質較多，說明交聯幾丁糖可能具有促進蛋白多糖合成、減緩軟骨基質分解的作用[18-19]。關節軟骨 Mankin 評分 C 組明顯高于 A 組，提示交聯幾丁糖具有促進關節軟骨修復作用；雖然 A、B 組間差異無統計學意義，但由于 A 組注射次數少于 B 組，表明注射交聯幾丁糖一定程度上優于注射幾丁糖[20-22]。
綜上述，本研究通過評估交聯幾丁糖治療兔膝骨關節炎，發現其能有效保護關節軟骨，減少軟骨磨損，促進Ⅱ型膠原及細胞外基質合成，促進軟骨修復，有效延緩骨關節炎的病理進展。同時，與傳統幾丁糖相比具有注射次數少的特點，可能成為臨床上治療骨關節炎的較佳選擇。但是，本研究仍存在一定局限性，客觀定量檢測指標有限，觀測指標有待進一步完善；同時由于尚未完全掌握交聯幾丁糖在膝關節內降解機制及降解周期，需在其有效性的基礎上進一步研究。
骨關節炎是一種臨床常見的以關節疼痛和關節功能障礙為主要臨床表現的疾病。根據流行病學調查數據，我國目前癥狀性膝骨關節炎患病率為 8.1%，這意味著我國大約有 1.1 億膝骨關節炎患者[1]。根據病情嚴重程度，治療方式各有不同，以透明質酸鈉、幾丁糖關節腔內注射為代表的黏彈性補充療法是臨床常用方法之一。該方法能明顯緩解早、中期骨關節炎臨床癥狀，改善患肢運動功能，延緩骨關節炎發展，保護關節軟骨[1-3]。但是透明質酸鈉及幾丁糖體內吸收快、療效短，骨關節炎患者需長期、多次注射，增加患者經濟負擔及創面感染風險。本課題組利用幾丁糖帶正電荷的屬性，制備新型長效交聯幾丁糖，通過延長體內存留時間，增加交聯幾丁糖對骨關節炎有效作用時間，以達到減少注射次數、減輕患者痛苦的目的[4]。本次研究以新西蘭兔作為實驗對象，采用膝關節前交叉韌帶切斷術制備骨關節炎模型，通過膝關節腔注射交聯幾丁糖，探討其作為臨床膝骨關節炎治療藥物的可行性。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、材料
健康 4～5 月齡新西蘭雌性白兔 32 只，體質量（2.5±0.5）kg，購自上海科碩實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號 SYXK（滬）2012-0006。交聯幾丁糖及幾丁糖由上海其勝生物制劑有限公司制備。Ⅱ型膠原染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
32 只新西蘭白兔隨機分為 A、B、C、D 4 組（n=8），其中 A、B、C 組制備骨關節炎模型后，分別關節腔內注射交聯幾丁糖、幾丁糖、生理鹽水；D 組為假手術組。4 組動物以耳緣靜脈注射 10% 水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，A～C 組作左后肢膝內側切口，橫斷前交叉韌帶，造成機械失穩，建立骨關節炎模型；D 組同法作左后肢膝內側切口，不切斷前交叉韌帶，直接關閉切口。術后 4 組動物每天腹腔注射頭孢唑林鈉 500 mg，連續 7 d。造模術后 4 周，觀察 A～C 組兔膝關節僵硬跛行且前抽屜試驗陽性，確認造模成功。
確認造模成功后，A 組關節腔內注射交聯幾丁糖 1 次 0.6 mL；B 組關節腔內注射幾丁糖，每 2 周 1 次，每次 0.3 mL，連續注射 2 次；C、D 組關節腔內注射生理鹽水，每 2 周 1 次，每次 0.3 mL，連續注射 2 次。于造模術后 8 周，4 組動物均經耳緣靜脈注射過量麻醉劑處死，沿左后肢原切口入路取材進行觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
各組觀察股骨髁磨損情況，于顯微鏡下觀察股骨髁關節面的病理改變，行大體標本評分。評分標準[5]：0 分，關節面光整，色澤如常；1 分，關節面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；2 分，關節面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表中層；3 分，關節面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層；4 分，軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露。
1.3.2 掃描電鏡觀察
大體觀察后，切取膝關節股骨髁，清除軟組織，用生理鹽水徹底沖洗標本表面凝血塊，于股骨髁關節面切取部分軟骨組織進行掃描電鏡觀察。將標本置于戊二醛及鋨酸中固定 3 h，梯度乙醇脫水，自然干燥，導電膠粘樣，離子濺射鍍膜，掃描電子顯微鏡下觀察軟骨表面顯微結構。
1.3.3 組織學觀察
將剩余部分軟骨組織置于 4% 多聚甲醛中固定 24 h，脫鈣、脫水、石蠟包埋。取部分軟骨石蠟塊切片，片厚 3 μm，常規行 HE 染色及番紅-固綠染色，中性樹膠封片。HE 染色切片光鏡下觀察軟骨組織結構，番紅-固綠染色切片光鏡下觀察軟骨基質著色情況；結合兩種染色圖像行 Mankin 評分[6]。
1.3.4 免疫組織化學染色觀察
取部分軟骨蠟塊制備 3 μm 厚切片，二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇脫水，自來水沖洗，37℃ 恒溫箱中修復抗原 30 min，3% H2O2 室溫避光孵育 25 min，以抑制內源性過氧化物酶活性，滴加 3% BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉血清 30 min，直接甩干后，加入一抗Ⅱ型膠原，放于濕盒內 4℃ 孵育過夜，PBS 沖洗后，加二抗室溫孵育 50 min，加入 DAB 顯色，自來水沖洗終止反應，蘇木素復染、脫水、透明、封片。光鏡下觀察軟骨細胞染色情況。參考 Pelletier 等[7]的方法計算Ⅱ型膠原表達量，以細胞分數（陽性細胞數占細胞總數的百分比）表示。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 q 檢驗；計數資料組間比較采用秩和檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
A 組：關節面較光滑 ，有少量微裂隙形成，色澤稍灰暗；B 組：關節面有少量骨贅形成，關節面輕度磨損；C 組：關節面軟骨剝脫，骨贅增生，軟骨下骨暴露，關節滑膜充血；D 組關節面完整光滑，色澤明亮，無磨損。見圖 1。
圖1
各組軟骨大體觀察
a. A 組；b. B 組 箭頭示骨贅形成；c. C 組 箭頭示骨贅形成；d. D 組
Figure1. Macroscopic observation of cartilage in each groupa. Group A; b. Group B Arrow indicated osteophyte formation; c. Group C Arrow indicated osteophyte formation; d. Group D
軟骨大體評分比較，B、C 組軟骨缺損程度高于 D 組，C 組高于 A 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A 組與 B、D 組軟骨缺損程度比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
各組軟骨大體評分
Table1.
The macroscopic observation scores in each group
2.2 掃描電鏡觀察
A 組：關節軟骨表面纖維樣紋理結構清晰，表面較完整；B 組：關節軟骨表面纖維樣紋理結構較 A 組減少，部分磨損；C 組：關節軟骨表面纖維樣紋理結構消失，軟骨缺損；D 組：關節軟骨表面纖維樣紋理結構清晰，表面完整平滑。見圖 2。
圖2
各組軟骨掃描電鏡觀察（×2 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure2. Scanning electron microscopy of cartilage in each group (×2 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.3 組織學觀察
HE 染色：A 組關節表面完整，軟骨細胞層次可；B 組關節表面粗糙，軟骨細胞數量較 A 組減少；C 組關節表面完整性破壞，裂紋明顯，并有纖維形成，軟骨細胞萎縮，排列紊亂，細胞外基質較其他組減少；D 組關節表面完整光滑，軟骨細胞形態正常。見圖 3a。
圖3
各組軟骨組織學觀察（×200）
從左至右分別為 A、B、C、D 組 a. HE 染色；b. 番紅-固綠染色
Figure3. Histological observation of cartilage in each group (×200)From left to right for groups A, B, C, and D，respectively a. HE staining; b. Safranin-fast green double staining
番紅-固綠染色：A 組軟骨基質少量分解，番紅染色較 D 組略減少；B 組軟骨基質部分分解，番紅染色較 D 組減少；C 組軟骨外基質大量分解，番紅染色較 D 組明顯減少；D 組軟骨結構規則，軟骨基質豐富，番紅染色最明顯。見圖 3b。
A、B、C、D 組關節軟骨 Mankin 評分分別為 4.88±0.99、5.75±1.04、8.25±1.28、0.63±0.74。B、C 組評分明顯高于 D 組，C 組高于 A 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 免疫組織化學染色觀察
A、B、C、D 組Ⅱ型膠原陽性軟骨細胞百分比分別為 74.00%±5.45%、59.25%±6.94%、42.25%±5.44%、82.38%±8.31%；B、C 組Ⅱ型膠原陽性軟骨細胞百分比明顯低于 D 組，A 組高于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
各組Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure4. Immunohistochemical staining observation of collagen type Ⅱ in each group(×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
目前，骨關節炎相關研究中建立動物模型的方法有多種，如關節制動、手術、關節腔內物質注射誘導骨關節炎等，其中關節內手術法模型建立成功率高，效果穩定[8-10]。本研究采用的前交叉韌帶切斷法能造成關節失穩、誘導關節軟骨退變，骨贅形成，模擬人體骨關節炎的病理變化，適用于膝關節內注藥預防和減輕骨關節炎病理變化的研究[11-12]。
骨關節炎發病機制目前尚不清楚，研究表明可能是關節軟骨退變導致關節功能及再生修復過程受損[13-14]，本研究 C 組關節軟骨觀察結果也進一步證實該損傷機制。本研究結果顯示，交聯幾丁糖能明顯保護關節軟骨，減少關節軟骨的磨損及破壞。掃描電鏡觀察顯示 A、B 組關節表面纖維結構較 C 組完整，可能與交聯幾丁糖、幾丁糖作為外源性黏彈性物質，增強和改善關節的黏彈性有關[15-17]。此外，B 組關節軟骨表面纖維樣紋理結構較 A 組減少，可能與交聯幾丁糖誘導軟骨細胞再生、促進軟骨修復作用較幾丁糖更顯著有關。免疫組織化學染色觀察顯示，A 組Ⅱ型膠原陽性軟骨細胞百分比明顯高于 C 組，可能與交聯幾丁糖促進Ⅱ型膠原合成有關。組織學觀察顯示 C 組細胞排列不規則、軟骨基質減少，而 A 組細胞排列規則、軟骨基質較多，說明交聯幾丁糖可能具有促進蛋白多糖合成、減緩軟骨基質分解的作用[18-19]。關節軟骨 Mankin 評分 C 組明顯高于 A 組，提示交聯幾丁糖具有促進關節軟骨修復作用；雖然 A、B 組間差異無統計學意義，但由于 A 組注射次數少于 B 組，表明注射交聯幾丁糖一定程度上優于注射幾丁糖[20-22]。
綜上述，本研究通過評估交聯幾丁糖治療兔膝骨關節炎，發現其能有效保護關節軟骨，減少軟骨磨損，促進Ⅱ型膠原及細胞外基質合成，促進軟骨修復，有效延緩骨關節炎的病理進展。同時，與傳統幾丁糖相比具有注射次數少的特點，可能成為臨床上治療骨關節炎的較佳選擇。但是，本研究仍存在一定局限性，客觀定量檢測指標有限，觀測指標有待進一步完善；同時由于尚未完全掌握交聯幾丁糖在膝關節內降解機制及降解周期，需在其有效性的基礎上進一步研究。
