引用本文： 陳榮, 周雪, 尹少妹, 盧澤鈺, 聶勁鵬, 周文成, 劉幸卉. 硫酸鎂啟動自噬對兔軟骨保護作用機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(10): 1340-1345. doi: 10.7507/1002-1892.201804015 復制
創傷性關節炎（post-traumatic osteoarthritis，PTOA）與原發性骨關節炎（osteoarthritis，OA）不同的是，有明顯關節外傷病史，患者以中青年居多，以反復疼痛及關節功能障礙為主要臨床表現，不僅嚴重影響患者工作和生活質量，同時加重了醫療負擔[1]。雖然目前骨科手術技術不斷改進，對軟骨損傷也越發重視，但仍不能減少 PTOA 的發生[2-4]。關節內炎性因子，如 IL-1β、TNF-α 等，在 PTOA 發生發展過程中起到關鍵作用[5]。研究發現，早期地塞米松干預能減輕關節內炎癥（抑制 IL-1、IL-6 等表達），但是不能預防遠期軟骨損傷[6]。而且過度抑制關節內炎癥可能導致大分子蛋白及損傷細胞器等聚集，啟動慢性炎性反應，反而破壞內環境平衡穩定，加重軟骨退變。
Lei 等[7]認為關節鏡術后單次關節腔內注射硫酸鎂有利于緩解疼痛，增強布比卡因鎮痛作用，增強軟骨細胞存活能力，對軟骨有一定保護作用。關節腔內注射硫酸鎂（0.5 mg/0.1 mL），每周 2 次，連續 5 周，可以通過抑制鈣離子通道 N-甲基-D-天冬氨酸受體調控軟骨細胞新陳代謝和凋亡，延緩 OA 病情發展[8]。有研究發現鎂缺乏會導致機體慢性炎癥[9]，抑制軟骨細胞增殖及分化，導致蛋白聚糖合成紊亂，進而導致軟骨退變[10]。鎂離子是鈣離子內流天然拮抗劑，可以抑制高選擇性鈣離子通道瞬時感受電位 V5（transient receptor potential channel vanilloid 5，TRPV5），從而減少鈣離子內流[11]，促進軟骨細胞自噬活化[12]。自噬具有清除聚集蛋白及損傷細胞器等功能，維持細胞活性及內環境動態平衡，對軟骨有保護作用，延緩 OA 進展[13-14]。然而目前鎂離子對軟骨作用機制的相關文獻報道較少。因此，本課題組探討鎂離子是否通過啟動自噬途徑對軟骨起到保護作用，為 PTOA 的預防及治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
成年雌性新西蘭兔 24 只，體質量 2.6～3.1 kg，由湖北醫藥學院動物實驗中心提供。硫酸鎂粉劑、戊巴比妥鈉粉劑（Sigma 公司，美國）；兔抗 TRPV5 抗體、兔抗微管相關蛋白 1 輕鏈 3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（Abcam 公司，美國）；兔抗 GAPDH 抗體（北京康為世紀生物科技有限公司）；RIPA 裂解液、辣根過氧化物酶底物化學發光液、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG（杭州弗德生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（南京凱基生物技術有限公司）；青霉素（山東圣旺藥業股份有限公司）、RNA 提取試劑盒（廣州行知生物技術有限公司）；反轉錄試劑盒、PCR Mix 試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國）；ELISA 試劑盒（上海優選生物科技有限公司）。Step One Plus 型 PCR 儀（ABI 公司，美國）。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 實驗分組及方法
將 24 只兔隨機分為 3 組，分別為 PTOA 組、蒸餾水組以及硫酸鎂組，每組 8 只。首先，各組采用前交叉韌帶切斷方法制備 PTOA 模型。經兔耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，無菌條件下取右膝前內側弧形切口，長 2～3 cm，顯露關節并切斷前交叉韌帶，注意止血。生理鹽水沖洗 3 遍，縫合切口后擠出關節腔內積液。術后即刻開始，蒸餾水組以及硫酸鎂組分別于關節腔內注射 0.5 mL 蒸餾水及 20 mmol/L 硫酸鎂溶液，注意避免滲出，每周 3 次（按星期一、三、五頻率），連續 4 周；PTOA 組不作處理。術前 30 min 及術后 3 d 內每天肌肉注射青霉素（40 萬 U/kg）1 次。術后不固定患肢，置于標準動物飼養籠中，允許其自由活動及進食。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察各組動物成活以及切口愈合、運動情況。
1.3.2 ELISA 檢測
術后 4 周（末次注射后第 2 天），于各組兔術側膝關節內注射 1 mL 生理鹽水，屈伸活動膝關節后收集關節腔積液；于耳緣靜脈采靜脈血 5 mL；關節腔積液及靜脈血以離心半徑 21.5 cm、3 000 r/min 離心 15 min，收集上清–80℃ 保存。參照 ELISA 檢測試劑盒說明，檢測關節腔積液 TNF-α 和Ⅱ型膠原及靜脈血中Ⅱ型膠原的表達量。
1.3.3 Western blot 檢測
術后 4 周，收集各組股骨軟骨組織檢測 TRPV5 及 LC3（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）蛋白表達。用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白濃度測定法測定樣品總蛋白濃度。蛋白提取物煮沸 5 min，經 SDS/PAGE 電泳分離后轉膜，TBST 配制的含 5% 脫脂奶粉的封閉液分別稀釋抗 GAPDH 抗體（1∶3 000）、抗 TRPV5 抗體（1∶1 000）、抗 LC3 抗體（1∶1 000），4℃ 孵育過夜。用相應辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2 000）室溫孵育 1 h。ECL 化學發光法檢測相關蛋白表達，凝膠成像分析系統掃描蛋白條帶照片，分析蛋白條帶灰度，以目的蛋白與內參 GAPDH 的比值作為蛋白相對表達量。
1.3.4 實時熒光定量 PCR 檢測
術后 4 周，檢測各組滑膜組織中 IL-1β、TNF-α、基質金屬蛋白酶 3（matrix metalloproteinases 3，MMP-3）及軟骨組織中Ⅱ型膠原、蛋白聚糖（Aggrecan，AGN）、SOX9 mRNA 水平。提取各組滑膜及軟骨總 RNA，用 Oligo（dT）反轉錄得到 cDNA，經特定的引物 PCR 擴增，并檢測內參 GAPDH。IL-1β、TNF-α、MMP-3、Ⅱ型膠原、AGN、SOX9 引物序列見表 1。PCR 反應采用 SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix（2X），根據說明書配制 PCR 反應液，每個樣品 3 個復孔。反應結束后確認每個 PCR 反應的擴增曲線與溶解曲線。采用 2–ΔΔCt 法計算目標基因相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence for real-time fluorescence quantitative PCR
1.3.5 組織學觀察
術后 4 周，收集各組股骨內側髁置于 4% 多聚甲醛固定，脫水、脫鈣、切片（片厚 4 μm）。常規 HE 染色對軟骨表面和細胞形態學評價，Masson 染色評估蛋白膠原堆積及排列，阿利新藍染色評估 AGN 分布情況。遵循雙盲原則，根據改良組織學 OA 評分標準[15]進行評分。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成。術后切口周圍無發熱、紅腫、裂開，切口無感染，2 周時均愈合良好；術側肢體活動良好。
2.2 ELISA 檢測
硫酸鎂組關節腔積液中 TNF-α 以及關節腔積液及靜脈血中Ⅱ型膠原表達量均顯著低于其余兩組，差異有統計學意義（P<0.05）；PTOA 組及蒸餾水組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
ELISA 檢測各組 TNF-α 及Ⅱ型膠原表達量
a. TNF-α；b. Ⅱ型膠原
Figure1. The expressions of TNF-α and collagen type Ⅱ in each group detected by ELISAa. TNF-α; b. Collagen type Ⅱ
2.3 Western blot 檢測
PTOA 組、蒸餾水組、硫酸鎂組 TRPV5 蛋白相對表達量分別為 0.24±0.05、0.24±0.06、0.13±0.01，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分別為 0.89±0.38、0.90±0.17、1.74±0.27。與其他兩組比較，硫酸鎂組 TRPV5 蛋白表達明顯降低，而 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；PTOA 組與蒸餾水組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測各組目的蛋白表達
1：PTOA 組2：蒸餾水組 3：硫酸鎂組
Figure2. The expressions of target proteins in each group detected by Western blot1: PTOA group 2: Distilled water group 3: Magnesium sulfate group
2.4 實時熒光定量 PCR 檢測
與其他兩組比較，硫酸鎂組滑膜組織中 IL-1β、TNF-α、MMP-3 mRNA 相對表達量降低，軟骨組織中Ⅱ型膠原、AGN、SOX9 mRNA 相對表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；PTOA 組與蒸餾水組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
實時熒光定量 PCR 檢測各組目的基因表達
a. 滑膜組織；b. 軟骨組織
Figure3. The target gene expressions in each group detected by real-time fluorescent quantitative PCRa. Synovial tissue; b. Cartilage tissue
2.5 組織學觀察
硫酸鎂組關節面較光滑、維持良好軟骨細胞學形態，具有良好膠原纖維排列及高密度 AGN。PTOA 組及蒸餾水組關節表面有不同程度不平整、軟骨細胞排列紊亂和細胞簇形成，膠原纖維排列紊亂以及 AGN 密度變低、丟失嚴重。PTOA 組、蒸餾水組、硫酸鎂組 OA 評分分別為（11.34±1.41）、（11.26±2.25）、（5.66±2.06）分；硫酸鎂組 OA 評分顯著低于其他兩組，差異有統計學意義（P<0.05）；PTOA 組及蒸餾水組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
各組組織學觀察（×100）
從左至右分別為 PTOA 組、蒸餾水組、硫酸鎂組 a. HE 染色；b. Masson 染色；c. 阿利新藍染色
Figure4. Histological observation of each group (×100)From left to right for PTOA group, distilled water group, and magnesium sulfate group, respectively a. HE staining; b. Masson staining; c. Alcian blue staining
3 討論
目前研究認為鎂攝入有利于預防 OA[16-17]，可以減少羊水中炎性因子（IL-1β、TNF-α）的表達[18]。在相同濃度（20 mmol/L）下，硫酸鎂比氯化鎂具有更好地保護軟骨、減少Ⅱ型膠原及 AGN 丟失的作用，但是隨著濃度增高（50 mmol/L 和 100 mmol/L），其作用反而降低[19-20]。不同于原發性 OA，PTOA 有明確受傷時間，可以確定早期干預時間。早期軟骨細胞壞死，會導致細胞支架外露及對應力耐受減弱，在炎癥影響下加速軟骨細胞壞死、加重軟骨基質降解，導致軟骨退變[3]。因此，本研究中我們在損傷后早期，采用關節腔內注射 20 mmol/L 硫酸鎂溶液進行干預。研究發現，硫酸鎂組滑膜組織炎性因子 IL-1β、TNF-α mRNA 表達降低，關節腔積液中 TNF-α 分泌減少，同時 MMP-3 mRNA 表達也減少。MMP-3 是一種軟骨蛋白聚糖降解酶，在 OA 滑膜或其積液中表達增高，促進 OA 進展。Wang 等[21]研究發現鎂離子通過抑制 N-甲基-D-天冬氨酸受體不僅能緩解疼痛，還能抑制 TNF-α 表達。
自噬對維持軟骨中細胞活性及組織內環境動態平衡起到重要作用，自噬活化可以對抗機械性損傷或炎性因子誘導的軟骨凋亡、壞死及 AGN 丟失，維持軟骨內環境動態平衡，延緩 OA 進展[13-14, 22-23]。鈣離子是細胞內重要的第二信使，是細胞生存的關鍵調節因子，細胞質內鈣離子升高將抑制自噬啟動[24]。TRPV5 是 TRPV 一種亞型，對鈣離子有高度選擇性，可以促進鈣離子轉運，也可以被鈣離子內流天然拮抗劑鎂離子所抑制[11]。鈣離子內流激活鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 2，抑制自噬活化關鍵因子 LC3-Ⅱ表達[12, 24]。本研究結果表明，關節腔內注射硫酸鎂可以抑制軟骨鈣離子通道 TRPV5 蛋白表達，促進自噬因子 LC3-Ⅱ蛋白表達，從而啟動軟骨自噬，促進軟骨再生基因Ⅱ型膠原、AGN、SOX9 表達，減少Ⅱ型膠原及蛋白聚糖丟失，從而維持軟骨內環境動態平衡，對軟骨起到保護作用。鎂離子缺乏將削弱整合素功能，導致細胞增殖分化功能及蛋白聚糖合成紊亂[25]，導致 SOX9 表達水平降低，抑制軟骨細胞增殖及分化，導致軟骨細胞形成減少及軟骨退變[10]。
綜上述，硫酸鎂可以通過抑制鈣離子通道 TRPV5，啟動軟骨自噬途徑，對軟骨有一定保護作用。但是本研究也存在一些不足，如觀察時間短、缺少軟骨自噬免疫熒光檢測及調亡方面相關檢測等，均有待進一步研究。
創傷性關節炎（post-traumatic osteoarthritis，PTOA）與原發性骨關節炎（osteoarthritis，OA）不同的是，有明顯關節外傷病史，患者以中青年居多，以反復疼痛及關節功能障礙為主要臨床表現，不僅嚴重影響患者工作和生活質量，同時加重了醫療負擔[1]。雖然目前骨科手術技術不斷改進，對軟骨損傷也越發重視，但仍不能減少 PTOA 的發生[2-4]。關節內炎性因子，如 IL-1β、TNF-α 等，在 PTOA 發生發展過程中起到關鍵作用[5]。研究發現，早期地塞米松干預能減輕關節內炎癥（抑制 IL-1、IL-6 等表達），但是不能預防遠期軟骨損傷[6]。而且過度抑制關節內炎癥可能導致大分子蛋白及損傷細胞器等聚集，啟動慢性炎性反應，反而破壞內環境平衡穩定，加重軟骨退變。
Lei 等[7]認為關節鏡術后單次關節腔內注射硫酸鎂有利于緩解疼痛，增強布比卡因鎮痛作用，增強軟骨細胞存活能力，對軟骨有一定保護作用。關節腔內注射硫酸鎂（0.5 mg/0.1 mL），每周 2 次，連續 5 周，可以通過抑制鈣離子通道 N-甲基-D-天冬氨酸受體調控軟骨細胞新陳代謝和凋亡，延緩 OA 病情發展[8]。有研究發現鎂缺乏會導致機體慢性炎癥[9]，抑制軟骨細胞增殖及分化，導致蛋白聚糖合成紊亂，進而導致軟骨退變[10]。鎂離子是鈣離子內流天然拮抗劑，可以抑制高選擇性鈣離子通道瞬時感受電位 V5（transient receptor potential channel vanilloid 5，TRPV5），從而減少鈣離子內流[11]，促進軟骨細胞自噬活化[12]。自噬具有清除聚集蛋白及損傷細胞器等功能，維持細胞活性及內環境動態平衡，對軟骨有保護作用，延緩 OA 進展[13-14]。然而目前鎂離子對軟骨作用機制的相關文獻報道較少。因此，本課題組探討鎂離子是否通過啟動自噬途徑對軟骨起到保護作用，為 PTOA 的預防及治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
成年雌性新西蘭兔 24 只，體質量 2.6～3.1 kg，由湖北醫藥學院動物實驗中心提供。硫酸鎂粉劑、戊巴比妥鈉粉劑（Sigma 公司，美國）；兔抗 TRPV5 抗體、兔抗微管相關蛋白 1 輕鏈 3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（Abcam 公司，美國）；兔抗 GAPDH 抗體（北京康為世紀生物科技有限公司）；RIPA 裂解液、辣根過氧化物酶底物化學發光液、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG（杭州弗德生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（南京凱基生物技術有限公司）；青霉素（山東圣旺藥業股份有限公司）、RNA 提取試劑盒（廣州行知生物技術有限公司）；反轉錄試劑盒、PCR Mix 試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國）；ELISA 試劑盒（上海優選生物科技有限公司）。Step One Plus 型 PCR 儀（ABI 公司，美國）。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2 實驗分組及方法
將 24 只兔隨機分為 3 組，分別為 PTOA 組、蒸餾水組以及硫酸鎂組，每組 8 只。首先，各組采用前交叉韌帶切斷方法制備 PTOA 模型。經兔耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，無菌條件下取右膝前內側弧形切口，長 2～3 cm，顯露關節并切斷前交叉韌帶，注意止血。生理鹽水沖洗 3 遍，縫合切口后擠出關節腔內積液。術后即刻開始，蒸餾水組以及硫酸鎂組分別于關節腔內注射 0.5 mL 蒸餾水及 20 mmol/L 硫酸鎂溶液，注意避免滲出，每周 3 次（按星期一、三、五頻率），連續 4 周；PTOA 組不作處理。術前 30 min 及術后 3 d 內每天肌肉注射青霉素（40 萬 U/kg）1 次。術后不固定患肢，置于標準動物飼養籠中，允許其自由活動及進食。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察各組動物成活以及切口愈合、運動情況。
1.3.2 ELISA 檢測
術后 4 周（末次注射后第 2 天），于各組兔術側膝關節內注射 1 mL 生理鹽水，屈伸活動膝關節后收集關節腔積液；于耳緣靜脈采靜脈血 5 mL；關節腔積液及靜脈血以離心半徑 21.5 cm、3 000 r/min 離心 15 min，收集上清–80℃ 保存。參照 ELISA 檢測試劑盒說明，檢測關節腔積液 TNF-α 和Ⅱ型膠原及靜脈血中Ⅱ型膠原的表達量。
1.3.3 Western blot 檢測
術后 4 周，收集各組股骨軟骨組織檢測 TRPV5 及 LC3（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）蛋白表達。用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白濃度測定法測定樣品總蛋白濃度。蛋白提取物煮沸 5 min，經 SDS/PAGE 電泳分離后轉膜，TBST 配制的含 5% 脫脂奶粉的封閉液分別稀釋抗 GAPDH 抗體（1∶3 000）、抗 TRPV5 抗體（1∶1 000）、抗 LC3 抗體（1∶1 000），4℃ 孵育過夜。用相應辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2 000）室溫孵育 1 h。ECL 化學發光法檢測相關蛋白表達，凝膠成像分析系統掃描蛋白條帶照片，分析蛋白條帶灰度，以目的蛋白與內參 GAPDH 的比值作為蛋白相對表達量。
1.3.4 實時熒光定量 PCR 檢測
術后 4 周，檢測各組滑膜組織中 IL-1β、TNF-α、基質金屬蛋白酶 3（matrix metalloproteinases 3，MMP-3）及軟骨組織中Ⅱ型膠原、蛋白聚糖（Aggrecan，AGN）、SOX9 mRNA 水平。提取各組滑膜及軟骨總 RNA，用 Oligo（dT）反轉錄得到 cDNA，經特定的引物 PCR 擴增，并檢測內參 GAPDH。IL-1β、TNF-α、MMP-3、Ⅱ型膠原、AGN、SOX9 引物序列見表 1。PCR 反應采用 SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix（2X），根據說明書配制 PCR 反應液，每個樣品 3 個復孔。反應結束后確認每個 PCR 反應的擴增曲線與溶解曲線。采用 2–ΔΔCt 法計算目標基因相對表達量。
表1
實時熒光定量 PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence for real-time fluorescence quantitative PCR
1.3.5 組織學觀察
術后 4 周，收集各組股骨內側髁置于 4% 多聚甲醛固定，脫水、脫鈣、切片（片厚 4 μm）。常規 HE 染色對軟骨表面和細胞形態學評價，Masson 染色評估蛋白膠原堆積及排列，阿利新藍染色評估 AGN 分布情況。遵循雙盲原則，根據改良組織學 OA 評分標準[15]進行評分。
1.4 統計學方法
采用 SPSS18.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
各組動物均存活至實驗完成。術后切口周圍無發熱、紅腫、裂開，切口無感染，2 周時均愈合良好；術側肢體活動良好。
2.2 ELISA 檢測
硫酸鎂組關節腔積液中 TNF-α 以及關節腔積液及靜脈血中Ⅱ型膠原表達量均顯著低于其余兩組，差異有統計學意義（P<0.05）；PTOA 組及蒸餾水組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
圖1
ELISA 檢測各組 TNF-α 及Ⅱ型膠原表達量
a. TNF-α；b. Ⅱ型膠原
Figure1. The expressions of TNF-α and collagen type Ⅱ in each group detected by ELISAa. TNF-α; b. Collagen type Ⅱ
2.3 Western blot 檢測
PTOA 組、蒸餾水組、硫酸鎂組 TRPV5 蛋白相對表達量分別為 0.24±0.05、0.24±0.06、0.13±0.01，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分別為 0.89±0.38、0.90±0.17、1.74±0.27。與其他兩組比較，硫酸鎂組 TRPV5 蛋白表達明顯降低，而 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；PTOA 組與蒸餾水組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測各組目的蛋白表達
1：PTOA 組2：蒸餾水組 3：硫酸鎂組
Figure2. The expressions of target proteins in each group detected by Western blot1: PTOA group 2: Distilled water group 3: Magnesium sulfate group
2.4 實時熒光定量 PCR 檢測
與其他兩組比較，硫酸鎂組滑膜組織中 IL-1β、TNF-α、MMP-3 mRNA 相對表達量降低，軟骨組織中Ⅱ型膠原、AGN、SOX9 mRNA 相對表達量升高，差異均有統計學意義（P<0.05）；PTOA 組與蒸餾水組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
實時熒光定量 PCR 檢測各組目的基因表達
a. 滑膜組織；b. 軟骨組織
Figure3. The target gene expressions in each group detected by real-time fluorescent quantitative PCRa. Synovial tissue; b. Cartilage tissue
2.5 組織學觀察
硫酸鎂組關節面較光滑、維持良好軟骨細胞學形態，具有良好膠原纖維排列及高密度 AGN。PTOA 組及蒸餾水組關節表面有不同程度不平整、軟骨細胞排列紊亂和細胞簇形成，膠原纖維排列紊亂以及 AGN 密度變低、丟失嚴重。PTOA 組、蒸餾水組、硫酸鎂組 OA 評分分別為（11.34±1.41）、（11.26±2.25）、（5.66±2.06）分；硫酸鎂組 OA 評分顯著低于其他兩組，差異有統計學意義（P<0.05）；PTOA 組及蒸餾水組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4。
圖4
各組組織學觀察（×100）
從左至右分別為 PTOA 組、蒸餾水組、硫酸鎂組 a. HE 染色；b. Masson 染色；c. 阿利新藍染色
Figure4. Histological observation of each group (×100)From left to right for PTOA group, distilled water group, and magnesium sulfate group, respectively a. HE staining; b. Masson staining; c. Alcian blue staining
3 討論
目前研究認為鎂攝入有利于預防 OA[16-17]，可以減少羊水中炎性因子（IL-1β、TNF-α）的表達[18]。在相同濃度（20 mmol/L）下，硫酸鎂比氯化鎂具有更好地保護軟骨、減少Ⅱ型膠原及 AGN 丟失的作用，但是隨著濃度增高（50 mmol/L 和 100 mmol/L），其作用反而降低[19-20]。不同于原發性 OA，PTOA 有明確受傷時間，可以確定早期干預時間。早期軟骨細胞壞死，會導致細胞支架外露及對應力耐受減弱，在炎癥影響下加速軟骨細胞壞死、加重軟骨基質降解，導致軟骨退變[3]。因此，本研究中我們在損傷后早期，采用關節腔內注射 20 mmol/L 硫酸鎂溶液進行干預。研究發現，硫酸鎂組滑膜組織炎性因子 IL-1β、TNF-α mRNA 表達降低，關節腔積液中 TNF-α 分泌減少，同時 MMP-3 mRNA 表達也減少。MMP-3 是一種軟骨蛋白聚糖降解酶，在 OA 滑膜或其積液中表達增高，促進 OA 進展。Wang 等[21]研究發現鎂離子通過抑制 N-甲基-D-天冬氨酸受體不僅能緩解疼痛，還能抑制 TNF-α 表達。
自噬對維持軟骨中細胞活性及組織內環境動態平衡起到重要作用，自噬活化可以對抗機械性損傷或炎性因子誘導的軟骨凋亡、壞死及 AGN 丟失，維持軟骨內環境動態平衡，延緩 OA 進展[13-14, 22-23]。鈣離子是細胞內重要的第二信使，是細胞生存的關鍵調節因子，細胞質內鈣離子升高將抑制自噬啟動[24]。TRPV5 是 TRPV 一種亞型，對鈣離子有高度選擇性，可以促進鈣離子轉運，也可以被鈣離子內流天然拮抗劑鎂離子所抑制[11]。鈣離子內流激活鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 2，抑制自噬活化關鍵因子 LC3-Ⅱ表達[12, 24]。本研究結果表明，關節腔內注射硫酸鎂可以抑制軟骨鈣離子通道 TRPV5 蛋白表達，促進自噬因子 LC3-Ⅱ蛋白表達，從而啟動軟骨自噬，促進軟骨再生基因Ⅱ型膠原、AGN、SOX9 表達，減少Ⅱ型膠原及蛋白聚糖丟失，從而維持軟骨內環境動態平衡，對軟骨起到保護作用。鎂離子缺乏將削弱整合素功能，導致細胞增殖分化功能及蛋白聚糖合成紊亂[25]，導致 SOX9 表達水平降低，抑制軟骨細胞增殖及分化，導致軟骨細胞形成減少及軟骨退變[10]。
綜上述，硫酸鎂可以通過抑制鈣離子通道 TRPV5，啟動軟骨自噬途徑，對軟骨有一定保護作用。但是本研究也存在一些不足，如觀察時間短、缺少軟骨自噬免疫熒光檢測及調亡方面相關檢測等，均有待進一步研究。
