引用本文： 焦海山, 曹萍, 陳穎, 宋悅寧, 李東印, 王曉冬. 納米聚吡咯/甲殼素復合膜的制備及其生物相容性觀察. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(8): 1081-1087. doi: 10.7507/1002-1892.201802031 復制
研制組織工程神經作為神經移植的替代物，已成為神經缺損修復的一個重要研究領域。甲殼素、殼聚糖在生物相容性和降解性等方面優勢明顯，是相對較為理想的組織工程材料[1-5]。殼聚糖為甲殼素脫乙酰基所得，溶解性明顯高于天然甲殼素，較易加工成形，也已被研究用于制作多種醫學生物材料。與殼聚糖相比，甲殼素在降解速度和機械性能方面有一定優勢；但是天然甲殼素溶解性差，不易加工處理，且與甲殼素共存的蛋白質難以清除。本課題組前期研究中通過殼聚糖選擇性乙酰化改性制備甲殼素，規避了直接使用甲殼素溶解性差、蛋白質清除難等問題，且觀察到殼聚糖選擇性乙酰化的甲殼素具有良好的體內、外生物相容性[5-6]。
當然，無論是選擇甲殼素還是殼聚糖作為組織工程神經的支架材料，皆不具備導電性能，影響了其作為神經移植替代物的性能。而研究較多的導電材料如聚吡咯（polypyrrole，PPy）、聚四氟乙烯一類的高分子聚合材料，又因生物降解困難而限制其成為理想的組織工程神經支架材料。近年研究認為，通過改變 PPy 的尺寸、導電聚合物材料的表面功能化修飾，或通過合成既有共軛結構又有酯鍵的高聚物等途徑，有望實現導電高聚物的降解性[7-9]。另外，有文獻報道將小尺寸的導電聚合物和可生物降解的材料（如聚酯、殼聚糖等）偶聯或混雜，構建導電聚合物和生物降解材料的大分子框架，可初步實現整個大分子框架的導電性和降解性[10-11]。鑒于此，本研究擬制備出納米 PPy/甲殼素復合材料，并觀察其生物相容性、導電及降解性能，為構建新型導電性能好、降解速度快的復合材料神經導管提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料及儀器
殼聚糖（南通興成生物制品廠）；RSC96 大鼠雪旺細胞（中國科學院細胞庫）；DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，FDA）、溶菌酶（Sigma 公司，美國）；兔抗可溶性蛋白-100（soluble protein-100，S-100）多抗、羊抗兔 IgG-TRITC 二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。VERTEX 70 傅里葉紅外光譜儀（Bruker 公司，德國）；S4700 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；M-3 四探針電導測試儀（蘇州晶格電子有限公司）；TI CFIS60 倒置熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 納米 PPy 的合成與表征
使用文獻報道的微乳液聚合法[12-13]合成納米 PPy：將一定量的吡咯單體攪拌加入微乳液中［以十二烷基苯磺酸（dodecyl benzene sulfonic acid，DBSA）水溶液為乳化劑，FeCl3 為氧化劑，FeCl3∶Py 摩爾比為 3.75∶1］，室溫下聚合反應 24 h 后，丙酮終止反應，并用大量去離子水水洗，離心（6 500 r/min 離心 5 min），分離沉淀，真空干燥后即得納米 PPy 粉末。
取少量納米 PPy 粉末，常規 KBr 壓片，用傅里葉紅外光譜儀測定其紅外光譜圖。另取一定量的納米 PPy 在 0.5%（V/V）醋酸溶液中超聲震蕩制成 1.5%（W/V）納米 PPy 懸液，取 1 滴懸液干燥、噴金后掃描電鏡觀察。
1.3 納米 PPy/N-乙酰化殼聚糖復合膜的制備與表征
用 1%（V/V）醋酸溶解殼聚糖制成 1.5%（W/V）殼聚糖溶液，加入前述 1.5%（W/V）納米 PPy 懸液，配成 2.5%（W/W）納米 PPy/殼聚糖混合溶液。強烈攪拌 4 h 后，真空減壓脫氣，再將混合溶液注入平皿中，自然流延成膜，50℃ 烘箱過夜（用于降解測試的膜采用冷凍干燥，下同），2%NaOH 脫酸中和 24 h，去離子水水洗至中性，室溫干燥得到納米 PPy/殼聚糖膜。再將得到的納米 PPy/殼聚糖膜浸入 5%（V/V）醋酐甲醇溶液中，室溫乙酰化反應 2 h，4%NaOH 溶液處理后，去離子水水洗至中性，干燥得納米 PPy/N-乙酰化殼聚糖復合膜，作為實驗組（A 組）。將部分 1.5%（W/V）殼聚糖溶液直接自然流延成膜，經同法干燥、脫酸得到殼聚糖膜（B 組）；另將部分殼聚糖膜經乙酰化等處理后制備成 N-乙酰化殼聚糖膜（C 組）；B、C 組均為對照組。
取制成的 A、B、C 組 3 種膜，部分用傅里葉紅外光譜儀測定其紅外光譜圖，采用董炎明等[14]報道的紅外光譜法測定膜的乙酰度；部分使用四探針電導測試儀測定電導率；取 A、B 組膜經干燥、噴金后掃描電鏡觀察。
1.4 膜體外生物相容性觀察
1.4.1 雪旺細胞與膜共培養后形態觀察
取部分上述 3 種膜，修剪成直徑 15.6 mm 的圓形膜，經紫外線照射 4 h 后，0.01 mol/L PBS 水洗，含 10%FBS 的 DMEM 培養基浸泡后平鋪于 24 孔培養板底部。取處于對數生長期的大鼠雪旺細胞，0.125%胰蛋白酶消化后，以 2×104個/mL 密度接種于 3 組膜上，用含 10%FBS 的 DMEM 培養基于 37℃、5%CO2 條件下培養，隔天半量換液。細胞接種后每天倒置顯微鏡觀察雪旺細胞在膜上的生長、遷移情況。
1.4.2 活細胞染色觀察
雪旺細胞與膜共培養 2 d 后，每組各任取出 3 個復孔，向培養系統中加入 5 μL FDA（5 mg/mL），避光反應 5 min，吸出培養液，0.01 mol/L PBS 水洗，倒置顯微鏡觀察活細胞染色情況。
1.4.3 細胞增殖情況觀察
雪旺細胞與膜共培養 2、4 d 后，每組各任取出 3 個復孔，吸出培養液，0.01 mol/L PBS 水洗、胰蛋白酶消化后，以計數板細胞計數，并計算每孔細胞增殖數量，觀察細胞增殖情況。
1.4.4 細胞免疫熒光染色觀察
雪旺細胞與膜共培養 4 d 后，每組各任取出 3 個復孔，吸出培養基，分別經 0.01 mol/L PBS 水洗、4% 多聚甲醛固定、封閉液封閉、一抗兔抗 S-100（1∶250）孵育、水洗、二抗 TRITC-羊抗兔（1∶64）孵育、水洗等步驟，熒光顯微鏡觀察。
1.5 膜體外降解觀察
使用溶菌酶溶液評價各組膜的體外降解情況。首先配制濃度為 0.004 g/mL 的溶菌酶溶液（溶劑為 PBS 溶液，pH7.4）；配制完成后用針頭濾器過濾，之后分裝，放入–20℃ 中保存。應用時，根據膜的表面積與酶溶液的體積比（10 cm2∶1 mL），將 3 種膜（每種膜每個時間點 3 個樣本）分別浸入上述溶菌酶溶液中，置于 37℃ 烘箱中進行降解。之后每天更換 1 次溶菌酶溶液。實驗前詳細稱量并記錄膜材料樣品凍干后的初始重量（W1）；于降解第 1、2、4、6、8、10 天，分別從溶菌酶溶液中取出膜，初步觀察降解情況后，用蒸餾水徹底洗滌，凍干后稱重并記錄（W2），按以下公式計算膜體外降解率 D=（W1–W2）/W1×100%。
1.6 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 納米 PPy 的表征
2.1.1 傅里葉紅外光譜儀檢測
納米 PPy 紅外光譜圖顯示，在 1 543.4 cm–1 和 1 458.4 cm–1 處出現吸收峰，為納米 PPy C=C 的特征振動吸收峰，前者為非對稱伸縮振動引起的，后者為對稱伸縮振動引起的，說明聚合時吡咯環未改變。1 100～1 300 cm–1范圍內為吡咯環上 C-N 的伸縮振動峰，1 035 cm–1處為吡咯環上 C-H 的搖擺振動峰，785 cm–1 處為C-H 的面外變形振動吸收峰。但并未出現文獻報道的純納米 PPy 在 3 430 cm–1 附近有寬大的 N-H 吸收峰，這與 DBSA 的摻雜有關，在吡咯聚體摻雜復合程度較高時，摻雜物改變了納米 PPy 的結構，在紅外光譜上則觀察不到該峰；間接說明 DBSA 摻雜成功。見圖 1。
圖1
納米 PPy 傅里葉紅外光譜圖
Figure1.
FT-IR spectra of nano-PPy
2.1.2 掃描電鏡觀察
可見納米 PPy 呈球形，堆積緊密，顆粒細致均勻，顆粒間空隙較多。納米 PPy 粒子聚合體直徑為 100～200 nm，且該聚合體是由更細小的直徑 10～20 nm 左右的粒子團聚而成。見圖 2。
圖2
納米 PPy 掃描電鏡觀察（×20 k）
Figure2.
Scanning electron microscope observation of PPy particles (×20 k)
2.2 納米 PPy/N-乙酰化殼聚糖復合膜的制備與表征
2.2.1 傅里葉紅外光譜儀檢測
3 種膜的紅外光譜圖中均可見 1 310 cm–1 左右的酰胺 Ⅲ 譜帶（C-N）和 1 647 cm–1 左右的酰胺 Ⅰ 譜帶（C=O），不同的是 B 組中可見 1 590 cm–1 左右的殼聚糖 NH2 彎曲振動特征峰，A、C 組中由于 1 562 cm–1 左右的酰胺 Ⅱ 譜帶增強，掩蓋了 NH2 彎曲峰。經測定，B 組膜的乙酰度為 9.19%（與商品殼聚糖標示的脫乙酰度相符），A、C 組膜的乙酰度分別為 82.15%、75.60%。上述譜線變化及計算結果說明，經過乙酰化處理，殼聚糖已經乙酰化變成了甲殼素。A、C 組間譜線比較變化不大，因納米 PPy 在復合膜中占比<10%，難以明顯影響紅外光譜中吸收峰的特點。見圖 3。
圖3
3 種膜傅里葉紅外光譜圖
3 條譜線自上而下依次為 B 組、C 組、A 組
Figure3. FT-IR spectra of 3 membranesThe 3 lines from top to bottom for groups B, C, and A respectively
2.2.2 電導率檢測
A 組膜的電導率為（1.259 2±0.005 7）×10–3 S/cm；B、C 組膜均未檢測出電導率。
2.2.3 掃描電鏡觀察
B、C 組膜表面光滑平整；而 A 組膜則因為納米 PPy 的復合，表面可見與納米 PPy 掃描電鏡圖中大小基本一致的納米 PPy 聚合顆粒，致復合膜表面雖平整但不光滑，為有均勻分布顆粒的粗糙面。見圖 4。
圖4
3 組膜掃描電鏡觀察（×5 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Scanning electron microscope observation of 3 membranes (×5 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3 膜體外生物相容性觀察
2.3.1 雪旺細胞與膜共培養后形態觀察
倒置顯微鏡觀察示，雪旺細胞在 3 組膜上均能黏附并成功生長，細胞形態從接種初期的類圓形逐漸延伸成梭形，邊緣清晰，胞體透亮有光澤，有較強的立體感，并長出多個突起，相鄰細胞間突起相互連接。見圖 5。
圖5
雪旺細胞在 3 組膜上生長情況觀察（倒置顯微鏡×200）
從左至右依次為 A 組、B 組、C 組膜 a. 培養 1 d；b. 培養 4 d
Figure5. Growth condition observation of Schwann cells co-cultured on 3 membranes (Inverted microscope×200)From left to right for membranes of groups A, B, and C respectively a. Cultured for 1 day; b. Cultured for 4 days
2.3.2 活細胞染色觀察
雪旺細胞與各組膜共培養 2 d，FDA 活細胞染色觀察示雪旺細胞均存活，功能狀態良好，部分細胞已長出明顯突起。見圖 6。
圖6
雪旺細胞與 3 組膜共培養 2 d FDA 活細胞染色觀察（熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure6. FDA living cell staining observation of Schwann cells co-cultured on 3 membranes for 2 days (Fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.3 細胞增殖情況觀察
共培養 2、4 d，雪旺細胞在 3 種膜上均成功黏附、增殖。共培養 2 d 時 A、B、C 組膜上細胞增殖數量分別為（6.026 7±0.201 3）×105、（5.483 3±0.225 5）×105、（4.956 7±0.188 7）×105個/mL，4 d 時分別為（94.620 0±1.697 4）×105、（82.466 7±1.350 3）×105、（81.453 3±1.163 8）×105個/mL。兩個時間點 A 組膜上細胞增殖數量均顯著高于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；共培養 2 d，B 組膜上細胞增殖數量多于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05），但共培養 4 d 時 B、C 組間比較細胞增殖數量，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.4 細胞免疫熒光染色觀察
雪旺細胞與膜共培養 4 d 后，細胞免疫熒光染色觀察可見 3 組膜上均黏附有 S-100 陽性細胞，胞體呈橢圓形或梭形，可見突起。見圖 7。
圖7
雪旺細胞與 3 組膜共培養 4 d S-100 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure7. S-100 immunocytochemical staining of Schwann cells co-cultured on 3 membranes for 4 days (Fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.4 膜體外降解觀察
隨著降解時間延長，3 組膜均出現不同程度的質量丟失。B 組膜質量變化最小；A、C 組膜在降解第 6 天時質量丟失即達約 45%，以后隨時間延長，基本穩定在近 50% 水平。各時間點 A、C 組膜體外降解率均顯著高于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
各時間點各組膜體外降解率
Figure8.
In vitro degradation rate of each film at each time point
3 討論
納米 PPy 的聚合方法較多，包括電化學聚合、化學氧化、模板法、靜電紡絲法等，其中又以模板法較為常用。本研究采用的是被譽為制備納米粒子的“萬能方法”—微乳液聚合法，制備出的納米 PPy 經掃描電鏡測定尺寸達到納米級，經紅外光譜儀鑒定符合納米 PPy 的紅外光譜特點，且 DBSA 成功摻雜，為通過改變 PPy 的尺寸實現導電高聚物的降解創造了條件。對于納米 PPy 的尺寸，文獻報道微乳液聚合法所能得到的聚合物尺寸最低可達到直徑幾納米的超細粒子[13-15]，本研究中掃描電鏡下亦觀察到直徑 10～20 nm 的粒子，但因納米粒子的團聚效應，聚合成了較大的顆粒。因此如何進一步優化制備工藝，降低納米粒子的團聚效應，應是下一步研究需要解決的問題。
對于殼聚糖的乙酰化改性研究，方法比較成熟，一般認為在甲醇或乙醇體系中，以乙酸酐作為酰化劑，可以較為方便地對殼聚糖進行 N-酰化改性；另外，由于氨基的反應活性比羥基大，乙酰化反應首先在氨基上發生，要想得到 O-酰化的殼聚糖反而是較為困難的[16]。本研究中乙酰化反應后膜的紅外光譜圖中未觀察到 O-酰基的特征吸收峰，說明酸酐與殼聚糖的氨基發生了乙酰化反應，得到了研究需要的甲殼素。A 組膜的紅外光譜圖中因納米 PPy 含量較低，未能在光譜圖中反映出混合物的特性，但掃描電鏡表面可見到與納米 PPy 掃描電鏡圖中大小基本一致的納米 PPy 聚合顆粒，分布均勻，致復合膜表面呈現出有均勻分布顆粒的粗糙面，與 B、C 組光滑平整的表面區別明顯，間接說明納米 PPy 成功混合入甲殼素膜中。
雪旺細胞是周圍神經系統膠質細胞，在周圍神經的發生發育、髓鞘形成、損傷再生中均發揮著關鍵作用[6]。甲殼素膜在既往研究中已被證實具有較好的細胞相容性[6, 17]。因此，本研究采用雪旺細胞與制備的納米 PPy/甲殼素復合膜共培養，以殼聚糖、甲殼素膜為對照。共培養實驗中，觀察到雪旺細胞在 3 組膜上均能成功黏附、增殖，且培養的細胞經 S-100 免疫熒光細胞染色鑒定為陽性，說明 A 組膜與 B、C 組類似，均有著良好的生物安全性，納米 PPy 的加入未影響膜的生物安全性。殼聚糖經 N-乙酰化改性后，乙酰化本身并不會影響材料的生物安全性，但研究認為，乙酰度增加，氨基含量減少，細胞黏附能力和分化增殖能力有下降趨勢[17-18]。本研究中觀察到殼聚糖膜上共培養的細胞增殖能力稍強于 N-乙酰化改性后的甲殼素膜，與文獻報道相符。
對于納米 PPy，多數研究認為，其作為一種新型共軛結構導電聚合物材料，在離子檢測、超電容、防靜電材料及電化學生物傳感器等方面廣泛應用，也是重要的組織工程材料，報道顯示納米 PPy 具有生物活性的表面，且可為神經細胞、內皮細胞、心肌細胞等提供黏附與增殖的錨點[19-21]，以支持貼壁性細胞的生長。本研究在甲殼素膜中引入高聚物納米 PPy 后，膜表面形態平整，但出現有均勻分布納米 PPy 顆粒的粗糙面，膜的光整度雖受一定程度的影響，但納米 PPy 顆粒形成的粗糙面有可能提供了細胞黏附與增殖的錨點，從而表現出在 A 組膜上培養的細胞增殖能力優于 B、C 組。
本研究所獲得的納米 PPy/甲殼素復合膜經檢測具備導電性能，其電導率與文獻報道的納米 PPy 濃度對應的電導率相符[12, 22]。增加納米 PPy 在復合材料中的濃度固然可以獲得更好的導電性能，但考慮到納米 PPy 本身尚未發現可被體內某種酶降解，目前方案也只是利用其納米尺寸的優勢，以期能被排泄器官排出體外，但納米尺寸的粒子團聚問題尚未得到滿意解決，因而需要在導電和降解之間合理選擇，以獲得需要的導電能力及最佳的降解性能。至于殼聚糖、甲殼素的降解性能，一般認為二者均具備降解性能，但在一定脫乙酰度范圍內，殼聚糖的降解性能與其脫乙酰度成負相關[17, 23]。本研究制備的 3 種膜的降解性能變化規律與文獻報道一致[23-24]，但納米 PPy/甲殼素復合膜與 Wan 等[12, 22]制備的納米 PPy/殼聚糖復合材料（同樣采用凍干干燥法）相比，導電性能類似，降解性更好，符合組織工程材料對降解性能的要求。
綜上述，本研究制備的納米 PPy/甲殼素復合材料膜具備較好的生物安全性，適宜外周神經膠質細胞的黏附、增殖，具備良好的體外生物相容性、導電性，同等條件下降解性能優于殼聚糖膜。下一步將圍繞優化制備工藝，降低納米粒子的團聚效應，復合膜的降解性能與神經再生時間之間的匹配等方面展開進一步研究，為構建新型導電可降解組織工程支架復合材料提供依據。
研制組織工程神經作為神經移植的替代物，已成為神經缺損修復的一個重要研究領域。甲殼素、殼聚糖在生物相容性和降解性等方面優勢明顯，是相對較為理想的組織工程材料[1-5]。殼聚糖為甲殼素脫乙酰基所得，溶解性明顯高于天然甲殼素，較易加工成形，也已被研究用于制作多種醫學生物材料。與殼聚糖相比，甲殼素在降解速度和機械性能方面有一定優勢；但是天然甲殼素溶解性差，不易加工處理，且與甲殼素共存的蛋白質難以清除。本課題組前期研究中通過殼聚糖選擇性乙酰化改性制備甲殼素，規避了直接使用甲殼素溶解性差、蛋白質清除難等問題，且觀察到殼聚糖選擇性乙酰化的甲殼素具有良好的體內、外生物相容性[5-6]。
當然，無論是選擇甲殼素還是殼聚糖作為組織工程神經的支架材料，皆不具備導電性能，影響了其作為神經移植替代物的性能。而研究較多的導電材料如聚吡咯（polypyrrole，PPy）、聚四氟乙烯一類的高分子聚合材料，又因生物降解困難而限制其成為理想的組織工程神經支架材料。近年研究認為，通過改變 PPy 的尺寸、導電聚合物材料的表面功能化修飾，或通過合成既有共軛結構又有酯鍵的高聚物等途徑，有望實現導電高聚物的降解性[7-9]。另外，有文獻報道將小尺寸的導電聚合物和可生物降解的材料（如聚酯、殼聚糖等）偶聯或混雜，構建導電聚合物和生物降解材料的大分子框架，可初步實現整個大分子框架的導電性和降解性[10-11]。鑒于此，本研究擬制備出納米 PPy/甲殼素復合材料，并觀察其生物相容性、導電及降解性能，為構建新型導電性能好、降解速度快的復合材料神經導管提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要實驗材料及儀器
殼聚糖（南通興成生物制品廠）；RSC96 大鼠雪旺細胞（中國科學院細胞庫）；DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；二乙酸熒光素（fluorescein diacetate，FDA）、溶菌酶（Sigma 公司，美國）；兔抗可溶性蛋白-100（soluble protein-100，S-100）多抗、羊抗兔 IgG-TRITC 二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。VERTEX 70 傅里葉紅外光譜儀（Bruker 公司，德國）；S4700 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；M-3 四探針電導測試儀（蘇州晶格電子有限公司）；TI CFIS60 倒置熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 納米 PPy 的合成與表征
使用文獻報道的微乳液聚合法[12-13]合成納米 PPy：將一定量的吡咯單體攪拌加入微乳液中［以十二烷基苯磺酸（dodecyl benzene sulfonic acid，DBSA）水溶液為乳化劑，FeCl3 為氧化劑，FeCl3∶Py 摩爾比為 3.75∶1］，室溫下聚合反應 24 h 后，丙酮終止反應，并用大量去離子水水洗，離心（6 500 r/min 離心 5 min），分離沉淀，真空干燥后即得納米 PPy 粉末。
取少量納米 PPy 粉末，常規 KBr 壓片，用傅里葉紅外光譜儀測定其紅外光譜圖。另取一定量的納米 PPy 在 0.5%（V/V）醋酸溶液中超聲震蕩制成 1.5%（W/V）納米 PPy 懸液，取 1 滴懸液干燥、噴金后掃描電鏡觀察。
1.3 納米 PPy/N-乙酰化殼聚糖復合膜的制備與表征
用 1%（V/V）醋酸溶解殼聚糖制成 1.5%（W/V）殼聚糖溶液，加入前述 1.5%（W/V）納米 PPy 懸液，配成 2.5%（W/W）納米 PPy/殼聚糖混合溶液。強烈攪拌 4 h 后，真空減壓脫氣，再將混合溶液注入平皿中，自然流延成膜，50℃ 烘箱過夜（用于降解測試的膜采用冷凍干燥，下同），2%NaOH 脫酸中和 24 h，去離子水水洗至中性，室溫干燥得到納米 PPy/殼聚糖膜。再將得到的納米 PPy/殼聚糖膜浸入 5%（V/V）醋酐甲醇溶液中，室溫乙酰化反應 2 h，4%NaOH 溶液處理后，去離子水水洗至中性，干燥得納米 PPy/N-乙酰化殼聚糖復合膜，作為實驗組（A 組）。將部分 1.5%（W/V）殼聚糖溶液直接自然流延成膜，經同法干燥、脫酸得到殼聚糖膜（B 組）；另將部分殼聚糖膜經乙酰化等處理后制備成 N-乙酰化殼聚糖膜（C 組）；B、C 組均為對照組。
取制成的 A、B、C 組 3 種膜，部分用傅里葉紅外光譜儀測定其紅外光譜圖，采用董炎明等[14]報道的紅外光譜法測定膜的乙酰度；部分使用四探針電導測試儀測定電導率；取 A、B 組膜經干燥、噴金后掃描電鏡觀察。
1.4 膜體外生物相容性觀察
1.4.1 雪旺細胞與膜共培養后形態觀察
取部分上述 3 種膜，修剪成直徑 15.6 mm 的圓形膜，經紫外線照射 4 h 后，0.01 mol/L PBS 水洗，含 10%FBS 的 DMEM 培養基浸泡后平鋪于 24 孔培養板底部。取處于對數生長期的大鼠雪旺細胞，0.125%胰蛋白酶消化后，以 2×104個/mL 密度接種于 3 組膜上，用含 10%FBS 的 DMEM 培養基于 37℃、5%CO2 條件下培養，隔天半量換液。細胞接種后每天倒置顯微鏡觀察雪旺細胞在膜上的生長、遷移情況。
1.4.2 活細胞染色觀察
雪旺細胞與膜共培養 2 d 后，每組各任取出 3 個復孔，向培養系統中加入 5 μL FDA（5 mg/mL），避光反應 5 min，吸出培養液，0.01 mol/L PBS 水洗，倒置顯微鏡觀察活細胞染色情況。
1.4.3 細胞增殖情況觀察
雪旺細胞與膜共培養 2、4 d 后，每組各任取出 3 個復孔，吸出培養液，0.01 mol/L PBS 水洗、胰蛋白酶消化后，以計數板細胞計數，并計算每孔細胞增殖數量，觀察細胞增殖情況。
1.4.4 細胞免疫熒光染色觀察
雪旺細胞與膜共培養 4 d 后，每組各任取出 3 個復孔，吸出培養基，分別經 0.01 mol/L PBS 水洗、4% 多聚甲醛固定、封閉液封閉、一抗兔抗 S-100（1∶250）孵育、水洗、二抗 TRITC-羊抗兔（1∶64）孵育、水洗等步驟，熒光顯微鏡觀察。
1.5 膜體外降解觀察
使用溶菌酶溶液評價各組膜的體外降解情況。首先配制濃度為 0.004 g/mL 的溶菌酶溶液（溶劑為 PBS 溶液，pH7.4）；配制完成后用針頭濾器過濾，之后分裝，放入–20℃ 中保存。應用時，根據膜的表面積與酶溶液的體積比（10 cm2∶1 mL），將 3 種膜（每種膜每個時間點 3 個樣本）分別浸入上述溶菌酶溶液中，置于 37℃ 烘箱中進行降解。之后每天更換 1 次溶菌酶溶液。實驗前詳細稱量并記錄膜材料樣品凍干后的初始重量（W1）；于降解第 1、2、4、6、8、10 天，分別從溶菌酶溶液中取出膜，初步觀察降解情況后，用蒸餾水徹底洗滌，凍干后稱重并記錄（W2），按以下公式計算膜體外降解率 D=（W1–W2）/W1×100%。
1.6 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 納米 PPy 的表征
2.1.1 傅里葉紅外光譜儀檢測
納米 PPy 紅外光譜圖顯示，在 1 543.4 cm–1 和 1 458.4 cm–1 處出現吸收峰，為納米 PPy C=C 的特征振動吸收峰，前者為非對稱伸縮振動引起的，后者為對稱伸縮振動引起的，說明聚合時吡咯環未改變。1 100～1 300 cm–1范圍內為吡咯環上 C-N 的伸縮振動峰，1 035 cm–1處為吡咯環上 C-H 的搖擺振動峰，785 cm–1 處為C-H 的面外變形振動吸收峰。但并未出現文獻報道的純納米 PPy 在 3 430 cm–1 附近有寬大的 N-H 吸收峰，這與 DBSA 的摻雜有關，在吡咯聚體摻雜復合程度較高時，摻雜物改變了納米 PPy 的結構，在紅外光譜上則觀察不到該峰；間接說明 DBSA 摻雜成功。見圖 1。
圖1
納米 PPy 傅里葉紅外光譜圖
Figure1.
FT-IR spectra of nano-PPy
2.1.2 掃描電鏡觀察
可見納米 PPy 呈球形，堆積緊密，顆粒細致均勻，顆粒間空隙較多。納米 PPy 粒子聚合體直徑為 100～200 nm，且該聚合體是由更細小的直徑 10～20 nm 左右的粒子團聚而成。見圖 2。
圖2
納米 PPy 掃描電鏡觀察（×20 k）
Figure2.
Scanning electron microscope observation of PPy particles (×20 k)
2.2 納米 PPy/N-乙酰化殼聚糖復合膜的制備與表征
2.2.1 傅里葉紅外光譜儀檢測
3 種膜的紅外光譜圖中均可見 1 310 cm–1 左右的酰胺 Ⅲ 譜帶（C-N）和 1 647 cm–1 左右的酰胺 Ⅰ 譜帶（C=O），不同的是 B 組中可見 1 590 cm–1 左右的殼聚糖 NH2 彎曲振動特征峰，A、C 組中由于 1 562 cm–1 左右的酰胺 Ⅱ 譜帶增強，掩蓋了 NH2 彎曲峰。經測定，B 組膜的乙酰度為 9.19%（與商品殼聚糖標示的脫乙酰度相符），A、C 組膜的乙酰度分別為 82.15%、75.60%。上述譜線變化及計算結果說明，經過乙酰化處理，殼聚糖已經乙酰化變成了甲殼素。A、C 組間譜線比較變化不大，因納米 PPy 在復合膜中占比<10%，難以明顯影響紅外光譜中吸收峰的特點。見圖 3。
圖3
3 種膜傅里葉紅外光譜圖
3 條譜線自上而下依次為 B 組、C 組、A 組
Figure3. FT-IR spectra of 3 membranesThe 3 lines from top to bottom for groups B, C, and A respectively
2.2.2 電導率檢測
A 組膜的電導率為（1.259 2±0.005 7）×10–3 S/cm；B、C 組膜均未檢測出電導率。
2.2.3 掃描電鏡觀察
B、C 組膜表面光滑平整；而 A 組膜則因為納米 PPy 的復合，表面可見與納米 PPy 掃描電鏡圖中大小基本一致的納米 PPy 聚合顆粒，致復合膜表面雖平整但不光滑，為有均勻分布顆粒的粗糙面。見圖 4。
圖4
3 組膜掃描電鏡觀察（×5 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Scanning electron microscope observation of 3 membranes (×5 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3 膜體外生物相容性觀察
2.3.1 雪旺細胞與膜共培養后形態觀察
倒置顯微鏡觀察示，雪旺細胞在 3 組膜上均能黏附并成功生長，細胞形態從接種初期的類圓形逐漸延伸成梭形，邊緣清晰，胞體透亮有光澤，有較強的立體感，并長出多個突起，相鄰細胞間突起相互連接。見圖 5。
圖5
雪旺細胞在 3 組膜上生長情況觀察（倒置顯微鏡×200）
從左至右依次為 A 組、B 組、C 組膜 a. 培養 1 d；b. 培養 4 d
Figure5. Growth condition observation of Schwann cells co-cultured on 3 membranes (Inverted microscope×200)From left to right for membranes of groups A, B, and C respectively a. Cultured for 1 day; b. Cultured for 4 days
2.3.2 活細胞染色觀察
雪旺細胞與各組膜共培養 2 d，FDA 活細胞染色觀察示雪旺細胞均存活，功能狀態良好，部分細胞已長出明顯突起。見圖 6。
圖6
雪旺細胞與 3 組膜共培養 2 d FDA 活細胞染色觀察（熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure6. FDA living cell staining observation of Schwann cells co-cultured on 3 membranes for 2 days (Fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.3 細胞增殖情況觀察
共培養 2、4 d，雪旺細胞在 3 種膜上均成功黏附、增殖。共培養 2 d 時 A、B、C 組膜上細胞增殖數量分別為（6.026 7±0.201 3）×105、（5.483 3±0.225 5）×105、（4.956 7±0.188 7）×105個/mL，4 d 時分別為（94.620 0±1.697 4）×105、（82.466 7±1.350 3）×105、（81.453 3±1.163 8）×105個/mL。兩個時間點 A 組膜上細胞增殖數量均顯著高于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；共培養 2 d，B 組膜上細胞增殖數量多于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05），但共培養 4 d 時 B、C 組間比較細胞增殖數量，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3.4 細胞免疫熒光染色觀察
雪旺細胞與膜共培養 4 d 后，細胞免疫熒光染色觀察可見 3 組膜上均黏附有 S-100 陽性細胞，胞體呈橢圓形或梭形，可見突起。見圖 7。
圖7
雪旺細胞與 3 組膜共培養 4 d S-100 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure7. S-100 immunocytochemical staining of Schwann cells co-cultured on 3 membranes for 4 days (Fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.4 膜體外降解觀察
隨著降解時間延長，3 組膜均出現不同程度的質量丟失。B 組膜質量變化最小；A、C 組膜在降解第 6 天時質量丟失即達約 45%，以后隨時間延長，基本穩定在近 50% 水平。各時間點 A、C 組膜體外降解率均顯著高于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
各時間點各組膜體外降解率
Figure8.
In vitro degradation rate of each film at each time point
3 討論
納米 PPy 的聚合方法較多，包括電化學聚合、化學氧化、模板法、靜電紡絲法等，其中又以模板法較為常用。本研究采用的是被譽為制備納米粒子的“萬能方法”—微乳液聚合法，制備出的納米 PPy 經掃描電鏡測定尺寸達到納米級，經紅外光譜儀鑒定符合納米 PPy 的紅外光譜特點，且 DBSA 成功摻雜，為通過改變 PPy 的尺寸實現導電高聚物的降解創造了條件。對于納米 PPy 的尺寸，文獻報道微乳液聚合法所能得到的聚合物尺寸最低可達到直徑幾納米的超細粒子[13-15]，本研究中掃描電鏡下亦觀察到直徑 10～20 nm 的粒子，但因納米粒子的團聚效應，聚合成了較大的顆粒。因此如何進一步優化制備工藝，降低納米粒子的團聚效應，應是下一步研究需要解決的問題。
對于殼聚糖的乙酰化改性研究，方法比較成熟，一般認為在甲醇或乙醇體系中，以乙酸酐作為酰化劑，可以較為方便地對殼聚糖進行 N-酰化改性；另外，由于氨基的反應活性比羥基大，乙酰化反應首先在氨基上發生，要想得到 O-酰化的殼聚糖反而是較為困難的[16]。本研究中乙酰化反應后膜的紅外光譜圖中未觀察到 O-酰基的特征吸收峰，說明酸酐與殼聚糖的氨基發生了乙酰化反應，得到了研究需要的甲殼素。A 組膜的紅外光譜圖中因納米 PPy 含量較低，未能在光譜圖中反映出混合物的特性，但掃描電鏡表面可見到與納米 PPy 掃描電鏡圖中大小基本一致的納米 PPy 聚合顆粒，分布均勻，致復合膜表面呈現出有均勻分布顆粒的粗糙面，與 B、C 組光滑平整的表面區別明顯，間接說明納米 PPy 成功混合入甲殼素膜中。
雪旺細胞是周圍神經系統膠質細胞，在周圍神經的發生發育、髓鞘形成、損傷再生中均發揮著關鍵作用[6]。甲殼素膜在既往研究中已被證實具有較好的細胞相容性[6, 17]。因此，本研究采用雪旺細胞與制備的納米 PPy/甲殼素復合膜共培養，以殼聚糖、甲殼素膜為對照。共培養實驗中，觀察到雪旺細胞在 3 組膜上均能成功黏附、增殖，且培養的細胞經 S-100 免疫熒光細胞染色鑒定為陽性，說明 A 組膜與 B、C 組類似，均有著良好的生物安全性，納米 PPy 的加入未影響膜的生物安全性。殼聚糖經 N-乙酰化改性后，乙酰化本身并不會影響材料的生物安全性，但研究認為，乙酰度增加，氨基含量減少，細胞黏附能力和分化增殖能力有下降趨勢[17-18]。本研究中觀察到殼聚糖膜上共培養的細胞增殖能力稍強于 N-乙酰化改性后的甲殼素膜，與文獻報道相符。
對于納米 PPy，多數研究認為，其作為一種新型共軛結構導電聚合物材料，在離子檢測、超電容、防靜電材料及電化學生物傳感器等方面廣泛應用，也是重要的組織工程材料，報道顯示納米 PPy 具有生物活性的表面，且可為神經細胞、內皮細胞、心肌細胞等提供黏附與增殖的錨點[19-21]，以支持貼壁性細胞的生長。本研究在甲殼素膜中引入高聚物納米 PPy 后，膜表面形態平整，但出現有均勻分布納米 PPy 顆粒的粗糙面，膜的光整度雖受一定程度的影響，但納米 PPy 顆粒形成的粗糙面有可能提供了細胞黏附與增殖的錨點，從而表現出在 A 組膜上培養的細胞增殖能力優于 B、C 組。
本研究所獲得的納米 PPy/甲殼素復合膜經檢測具備導電性能，其電導率與文獻報道的納米 PPy 濃度對應的電導率相符[12, 22]。增加納米 PPy 在復合材料中的濃度固然可以獲得更好的導電性能，但考慮到納米 PPy 本身尚未發現可被體內某種酶降解，目前方案也只是利用其納米尺寸的優勢，以期能被排泄器官排出體外，但納米尺寸的粒子團聚問題尚未得到滿意解決，因而需要在導電和降解之間合理選擇，以獲得需要的導電能力及最佳的降解性能。至于殼聚糖、甲殼素的降解性能，一般認為二者均具備降解性能，但在一定脫乙酰度范圍內，殼聚糖的降解性能與其脫乙酰度成負相關[17, 23]。本研究制備的 3 種膜的降解性能變化規律與文獻報道一致[23-24]，但納米 PPy/甲殼素復合膜與 Wan 等[12, 22]制備的納米 PPy/殼聚糖復合材料（同樣采用凍干干燥法）相比，導電性能類似，降解性更好，符合組織工程材料對降解性能的要求。
綜上述，本研究制備的納米 PPy/甲殼素復合材料膜具備較好的生物安全性，適宜外周神經膠質細胞的黏附、增殖，具備良好的體外生物相容性、導電性，同等條件下降解性能優于殼聚糖膜。下一步將圍繞優化制備工藝，降低納米粒子的團聚效應，復合膜的降解性能與神經再生時間之間的匹配等方面展開進一步研究，為構建新型導電可降解組織工程支架復合材料提供依據。
