引用本文： 鄧呈亮, 劉志遠, 姚遠鎮, 劉睿池, 魏在榮, 王達利. 人脂肪來源干細胞對小鼠壓瘡愈合影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(6): 726-735. doi: 10.7507/1002-1892.201801031 復制
壓瘡是指在持續外力作用下，皮膚表皮、真皮、皮下脂肪組織、肌肉、骨骼完整性遭到破壞，好發于老年患者或因外傷導致截癱或四肢癱瘓的年輕患者[1]。壓瘡具有經久不愈且易復發的特點，深達骨質的壓瘡還可能繼發感染，引起膿毒癥甚至危及患者生命。缺血損傷后的血管新生障礙和神經功能減退或缺失是壓瘡復發的重要病理生理機制之一[2]。血小板作為一種多功能細胞，在血管發生、組織修復和炎癥過程中扮演著重要角色。目前血小板濃縮制品，如富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），已廣泛用于損傷組織修復領域，包括壓瘡的防治[3-7]。但 PRP 植入體內后，一些關鍵蛋白會在短時間內被宿主免疫系統清除，從而失去活性，影響了治療效果[8]。
目前，干細胞療法被認為是慢性創面最有前景的治療方法[9]。脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）屬于成體間充質干細胞，能分泌多種促血管新生和神經生長的細胞因子，如 VEGF、肝細胞生長因子、NGF 和腦源性神經營養因子等。與血小板濃縮制品相比，ADSCs 還具備多向分化潛能，如體外培養可向內皮細胞、神經細胞方向分化[10-11]。因此，我們分析 ADSCs 局部移植后可通過促進壓瘡創面的血管新生和神經再生，進而促進壓瘡創面愈合，提高壓瘡愈合質量，減少復發。本研究通過建立小鼠壓瘡模型，局部移植人 ADSCs（human ADSCs，hADSCs），觀察壓瘡愈合以及血管新生和神經再生情況，同時與人 PRP 局部移植治療效果進行比較，以期為臨床應用 ADSCs 防治壓瘡提供實驗依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡雌性 C57BL/6 野生型小鼠 51 只，體質量 18～21 g，購于重慶市騰訊實驗動物銷售有限公司，建立壓瘡模型前適應性飼養 1 周；涉及的動物處理均按照遵義醫學院動物實驗中心制定的指導方針進行，并獲得遵義醫學院倫理委員會批準。Ⅰ型膠原蛋白酶（Sigma 公司，美國）；10%FBS、0.25% 胰蛋白酶- EDTA、L-DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；慢病毒（廣州吉賽生物科技有限公司）；CD31、S100、CD90、CD73、CD105、CD34 抗體（Abcam 公司，美國）；三系誘導劑 ［賽業（廣州）生物科技有限公司］。磁鐵（上海琦顥機電有限公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；恒溫培養箱、酶標儀（Thermo 公司，美國）。
1.2 hADSCs 分離培養、鑒定及標記
1.2.1 hADSCs 分離培養
人脂肪組織來源于 2017 年 3 月—7 月于遵義醫學院附屬醫院整形外科行皮瓣移植的患者，患者均知情同意并通過倫理批準。參照文獻[12]報道方法分離培養 hADSCs。無菌條件下，取脂肪組織反復修剪后，加入等體積 0.1%Ⅰ型膠原蛋白酶，37℃ 條件下置于搖床（100 r/min）消化 1 h；過濾后以 800×g 離心 5 min；棄上清，加入紅細胞裂解液，同上法離心后棄上清，加入含 10%FBS、1% 青、鏈霉素雙抗的 L-DMEM 培養液，重懸細胞，接種至 75 mm 培養皿；置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。72 h 后首次換液，常規每隔 3 d 換液 1 次，待細胞生長至 70% 融合時，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化傳代，取第 3 代細胞進行實驗。培養期間于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.2 hADSCs 鑒定
① 誘導分化鑒定：取第 3 代細胞，分別采用成脂誘導分化培養基、成骨誘導培養基及成軟骨誘導培養基進行誘導培養。培養 3 周后，分別行油紅 O 染色、茜素紅染色，觀察成脂及成骨效果；4 周后行阿利新藍染色，觀察成軟骨效果。② 表型鑒定：取第 3 代對數期生長細胞，采用流式細胞儀檢測 CD90、CD105、CD73 及 CD34 表達。
1.2.3 hADSCs 標記
用病毒包被的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）進行細胞轉染，首先進行感染復數（multiplicity of infection，MOI）測定。取第 3 代對數期生長細胞，用含 8 μg/mL Polybrene 的完全培養基換液，分別按 MOI 為 100、75、50、25、10、1 進行病毒轉染，16 h 后更換為完全培養基，繼續培養 48～72 h 進行觀察，以 80% 以上細胞表達 GFP 為最佳 MOI。取最佳 MOI 轉染細胞進行動物實驗。
1.3 人 PRP 制備
參考文獻[13-14]方法制備人 PRP。用裝有枸櫞酸鈉抗凝劑的真空管收集健康志愿者外周血 10 mL，以 900×g 離心 5 min 后試管內全血分為 3 層：上層為上清液，下層為紅細胞，上下層交界處為血小板濃集層，吸取全部上清液以及交界面血小板濃集層后移入另一離心管，搖勻，以 1 500×g 離心 15 min，液體分為 2 層，下層即為 PRP。分別取 0.2 mL 外周血以及 PRP 行血小板計數并比較。按照 1 mL PRP 加入 0.1 mL 10% 葡萄糖酸鈣激活血小板 1 h 后，以 800×g 離心 5 min，0.22 μm 過濾器過濾備用。
1.4 動物模型制備及分組
參考 Strong 等[15]的方法制備小鼠壓瘡模型。首先取 6 只 C57BL/6 野生型小鼠，于背部正中線兩側相距 5 mm 處輕輕拉起背部皮膚，兩側對稱放置直徑 12 mm、厚 5 mm 的強力磁鐵作壓迫處理；24 h 為 1 個循環，其中 12 h 磁鐵壓迫、12 h 去除磁鐵；共 2 個循環。2 個循環處理后每只小鼠背部產生 2 個創面。分別于 2 個循環結束后第 1 天和第 5 天取材行 HE 染色觀察，于第 1 天見正常皮膚結構破壞，出現組織水腫，少量炎性細胞浸潤；第 5 天出現大量炎性細胞浸潤，組織細胞變性壞死，確認壓瘡模型建立成功。見圖 1。
確認壓瘡建模方法可行后，另取 45 只 C57BL/6 野生型小鼠隨機分為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 3 組，每組 15 只。同上法建模后第 1 天，hADSCs 組小鼠每個創面注射 100 μL PBS 重懸的 GFP 標記后的 hADSCs（1×106個），PRP 組注射 100 μL 人 PRP，對照組注射 100 μL PBS。均采用 27 號鎖定注射器注射至創緣及基底，注射完畢后以 3M 組織黏附膠水封閉注射部位。
圖1
動物模型制備
a. 磁鐵壓迫處理；b. 小鼠背部創面；c. 建模后第 1 天組織學觀察（HE×40）；d. 建模后第 5 天組織學觀察（HE×40）
Figure1. Animal model preparationa. Magnet compression treatment; b. Mouse wounds; c. Histological observation on the 1st day after modeling (HE×40); d. Histological observation on the 5th day after modeling (HE×40)
1.5 觀測指標
1.5.1 創面愈合觀察
于注射后 1、5、9、13、17、21 d 觀察創面愈合情況。于 5、9、13 d 照相后采用 Image J 軟件測量創面面積，計算創面愈合率，公式為：創面愈合率=（原始創面面積–剩余創面面積）/原始創面面積×100%。
1.5.2 組織學觀察
注射后 5、11、21 d 各組取 5 只小鼠，腹腔麻醉處死后，從距創緣 5 mm 處擴大切取包括整個創面的組織塊，置于 10% 甲醛固定 48 h，石蠟包埋，作 5 μm 厚切片。取部分切片，分別行 HE 染色及 Masson 染色。光鏡下 HE 染色觀察組織結構；Masson 染色觀察膠原沉積情況，鏡下取 5 個視野，采用 Image J 軟件測量膠原表達量。
1.5.3 免疫組織化學染色觀察
于注射后 5、11、21 d 行 CD31 免疫組織化學染色觀察新生血管，注射后 21 d 行 S100 免疫組織化學染色觀察雪旺細胞表達。取 1.5.2 中制備的部分切片，梯度乙醇復水，EDTA 抗原修復，PBS 沖洗，山羊血清室溫封閉，PBS 沖洗后一抗孵育（稀釋比 1∶200）4℃ 過夜，PBS 沖洗后二抗工作液（HRP 標記）孵育 37℃ 30 min，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。鏡下觀察，CD31 陽性染色為紅色，高倍鏡下各組每個樣本取 5 個視野，計數新生血管，表示微血管數目；S100 陽性染色為紅色，高倍鏡下各組每個樣本取 5 個視野，采用 Image J 軟件計算陽性細胞百分比。
1.5.4 熒光示蹤法觀察 hADSCs 定植及成活情況
注射后 11 d，取 hADSCs 組創緣及創面部分組織，冰凍包埋劑固定后制作冰凍切片，PBS 沖洗包埋劑后，DAPI 染細胞核 5 min，PBS 清洗，熒光顯微鏡下觀察，予藍光激發 hADSCs 表達呈綠色熒光。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示。對實驗結果進行正態檢驗及方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；不符合則采用多樣本多重比較的非參數秩和檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hADSCs 形態觀察及鑒定
分離培養 24 h 后少數細胞貼壁，可見單個貼壁的長梭形細胞；72 h 后細胞貼壁完全，較多細胞舒展伸開；6～7 d 時細胞快速增殖，進入對數生長期；10 d 時細胞鋪滿瓶底，細胞融合度達 70%，呈魚群樣排列。傳代培養后，第 3 代細胞以長梭形為主，呈漩渦狀生長。轉染后 48 h，MOI 為 25 時細胞轉染率達 70%，MOI>25 后轉染率無明顯增加；轉染后 72 h，當 MOI 達25及以上時細胞轉染率均達 90% 以上，且細胞形態未見明顯異常。見圖 2。根據觀察結果，確定最佳 MOI 為 25。
圖2
hADSCs 形態觀察
a. 第 3 代 hADSCs 形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b～g. 以 MOI 為 1、10、25、50、75、100 轉染 48 h 后倒置熒光顯微鏡觀察（×100）；h. 以 MOI 為 25 轉染 72 h 后倒置熒光顯微鏡觀察（×100）
Figure2. Morphological observation of hADSCsa. Morphological observation of 3rd generation hADSCs (Inverted phase contrast microscope×100); b-g. Inverted fluorescence microscope observation after 48 hours of transfected with the virus at the multiplicity of infection of 1, 10, 25, 50, 75, and 100, respectively (×100); h. Inverted fluorescence microscope observation after 72 hours of transfected with the virus at the multiplicity of infection of 25 (×100)
成骨誘導培養 3 周，茜素紅染色可見紅色鈣鹽結節；成脂誘導培養 3 周，細胞體積稍增大，細胞內可見大小不等的串珠樣圓形脂滴，油紅 O 染色后呈紅色顆粒樣；成軟骨誘導培養 4 周，阿利新藍染色見軟骨組織中大量酸性黏多糖。上述觀察結果提示分離培養的細胞具有多向分化潛能。流式細胞儀檢測顯示 CD90、CD105、CD73 呈陽性，CD34 呈陰性。鑒定結果表明，分離培養的細胞為 hADSCs。見圖 3。
圖3
hADSCs 鑒定
a. 成骨誘導培養 3 周茜素紅染色（×400）；b. 成脂誘導培養 3 周油紅 O 染色（×400）；c. 成軟骨誘導培養 4 周阿利新藍染色（×400）；d. 流式細胞儀檢測 從左至右分別為 CD90、CD105、CD73、CD34
Figure3. hADSCs identificationa. Alizarin red staining after osteogenic induction for 3 weeks (×400); b. Oil red O staining after adipogenic induction for 3 weeks (×400); c. Alcian blue staining after chondrogenic induction for 4 weeks (×400); d. Flow cytometry detection From left to right for CD90, CD105, CD73, and CD34
2.2 人 PRP 血小板計數
PRP 血小板計數為（641.2±74.4）×109個/L，顯著高于正常外周血的（208.4±68.9）×109個/L，差異有統計學意義（t=5.781，P=0.029）。
2.3 動物實驗觀察
2.3.1 創面愈合觀察
注射后 1 d，各組創面未見明顯差異。5 d 時，hADSCs 組痂皮部分脫落；PRP 組創緣少量痂皮形成；對照組創面發紅，出現炎性反應。9 d 時，hADSCs 組痂皮已脫落，殘余創面最小；PRP 組和對照組痂皮附著。13 d 時，hADSCs 組創面已基本愈合；PRP 組和對照組仍有殘余創面。17 d 時，hADSCs 組原創面部位有毛發生長；PRP 組壓瘡創面瘢痕愈合，未見毛發生長；對照組創面瘢痕愈合，無毛發生長范圍大于 PRP 組。21 d 時，hADSCs 組原創面部位毛發生長茂盛，PRP 組創面仍有小面積瘢痕愈合區域無毛發生長，對照組無毛發生長區域與 PRP 組比較更明顯。見圖 4。注射后 5、9、13 d，hADSCs 組創面愈合率明顯高于 PRP 組及對照組，PRP 組高于對照組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖4
各組小鼠創面愈合大體觀察
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 a. 注射后 5 d；b.注射后 13 d；c. 注射后 21 d
Figure4. Gross observation of wound healing in each groupFrom left to right for hADSCs group, PRP group, and control group a. On the 5th day after injection; b. On the 13th day after injection; c. On the 21st day after injection
圖5
注射后各時間點各組創面愈合率
Figure5.
Wound healing rate of each group on 5th, 9th, and 13th days after injection
2.3.2 組織學觀察
① HE 染色：注射后 5 d，各組可見痂皮殘留，真皮層大量炎性細胞浸潤，其中 hADSCs 組炎性細胞浸潤相對較輕，可見部分表皮再生。11 d 時，hADSCs 組炎性細胞浸潤明顯較 5 d 時減少，PRP 組次之，對照組仍可見大量炎性細胞浸潤。21 d 時，hADSCs 組表皮層較厚，表皮與真皮連接致密，真皮內大量的皮膚附屬器再生；PRP 組表皮層較厚，表皮與真皮連接致密，真皮淺層較厚，深層稀松，未見皮膚附屬器；對照組表皮層和真皮層均較薄，真皮斷裂，未見皮膚附屬結構等形成。見圖 6。
圖6
注射后各時間點各組 HE 染色觀察（×40）
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 a. 注射后 5 d；b. 注射后 11 d；c. 注射后 21 d
Figure6. HE staining of each group at each time point after injection (×40)From left to right for hADSCs group, PRP group, and control groupa. On the 5th day after injection; b. On the 11th day after injection; c. On the 21st day after injection
② Masson 染色：注射后 5 d 時，hADSCs 組膠原沉積較 PRP 組、對照組明顯。11 d 時，hADSCs 組膠原沉積明顯，PRP 組真皮層可見少量膠原沉積，對照組仍可見大量炎性細胞浸潤，膠原沉積量少，真皮層膠原沉積少。21 d 時，hADSCs 組表皮層較厚，膠原染色較深，排列有序；PRP 組真皮層較厚，可見較多膠原沉積，膠原排列致密；對照組膠原沉積較少，膠原排列稀松。見圖 7。注射后各時間點，hADSCs 組膠原表達量均顯著高于 PRP 組及對照組，PRP 組高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 8。
圖7
注射后各時間點各組 Masson 染色觀察（×40）
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 a. 注射后 5 d；b. 注射后 11 d；c. 注射后 21 d
Figure7. Masson staining of each group at each time point after injection(×40)From left to right for hADSCs group, PRP group, and control group a. On the 5th day after injection; b. On the 11th day after injection; c. On the 21st day after injection
圖8
注射后各時間點各組創面膠原表達量
Figure8.
Expression of collagen in each group on the 5th, 11th, 21st days after injection
2.3.3 免疫組織化學染色觀察
① CD31：注射后 5 d，hADSCs 組和 PRP 組可見血管大量增生，周圍大量炎性細胞浸潤，而對照組新生血管較 hADSCs 組和 PRP 組減少（P<0.05），hADSCs 組較 PRP 組明顯增多（P<0.05）。11 d 時，hADSCs 組血管較 5 d 時明顯增多、炎性細胞減少，PRP 組血管較前減少；各組新生血管數目比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。21 d 時，3 組新生血管以及血管周圍炎性細胞均明顯減少，其中 PRP 組和對照組新生血管數均低于 hADSCs 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；PRP 組和對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 9、10。
圖9
注射后各時間點各組 CD31 免疫組織染色觀察（×200）
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 a. 注射后 5 d；b. 注射后 11 d；c. 注射后 21 d
Figure9. Immunohistochemical staining of CD31 in each group at each time point after injection (×200)From left to right for hADSCs group, PRP group, and control group a. On the 5th day after injection; b. On the 11th day after injection; c. On the 21st day after injection
圖10
注射后各時間點各組新生血管數
Figure10.
Number of neovascularization in each group at each time point after injection
② S100：注射后 21 d，鏡下觀察示 hADSCs 組陽性表達區域最大，并覆蓋皮膚全層，PRP 組僅在真皮層見散在陽性表達，對照組陽性表達區域極少。見圖 11。hADSCs 組、PRP 組以及對照組 S100 陽性細胞百分比分別為 3.6%±0.8%、0.8%±0.4%、0.2%±0.4%，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖11
注射后 21 d 各組 S100 免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組
Figure11. Immunohistochemical staining of S100 in each group on the 21st day after injection (×100)From left to right for hADSCs group, PRP group, and control group
2.3.4 hADSCs 定植及成活觀察
hADSCs 組注射 hADSCs 后 11 d，鏡下可見表皮下方大量局部移植細胞，呈綠色熒光。見圖 12。
圖12
注射后 11 d hADSCs 組熒光顯微鏡觀察（×200）
a. 藍光照射時脂肪細胞表達綠色熒光；b. DAPI 染色；c. 復合顯色
Figure12. Fluorescence microscopy observation on the 11th day in hADSCs group (×200)a. Blue light stimulated tissue blocks expressed green;b. After DAPI staining, nuclei expressed blue light; c. Merge
3 討論
壓瘡治療方法包括外科清創術、封閉式負壓引流治療、皮瓣移植、高壓氧治療、應用生物工程皮膚替代品等，各有優缺點[16]。MSCs 具有低免疫原性，成為慢性創面干細胞療法研究的熱點種子細胞[17]。MSCs 根據來源可分為 BMSCs、ADSCs 和羊膜 MSCs 等。最早應用于慢性創面治療的是 BMSCs，臨床和基礎研究均表明 BMSCs 可以促進創面愈合[18-19]。Motegi 等[20]研究發現，同種異體 BMSCs 移植至鼠缺血再灌注損傷模型后，能通過減少血管損傷、減輕氧化應激和減少細胞凋亡，有效預防壓瘡的發生。與 BMSCs 相比，ADSCs 具有易大量獲取、更易促血管新生等優勢，是理想的種子細胞[21]。因此，本研究選擇 hADSCs 作為研究靶細胞。
Strong 等[15]采用同種異體 ADSCs 移植治療鼠壓瘡創面，結果創面均順利愈合，他們認為這可能與 ADSCs 移植能增強上皮化和成熟脂肪細胞再生有關。有研究表明，外源性 ADSCs 局部移植能促進壓瘡愈合，主要與 ADSCs 旁分泌和分化潛能有關[22]。ADSCs 能分泌多種生長因子，包括 VEGF 及 NGF 等，這些生長因子具有促新生血管作用，能促進成纖維細胞、表皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞的生長，發揮組織再生、促進創面上皮化、促進神經及血管修復的作用[11]。ADSCs 還可分化為表皮細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞和神經細胞，直接參與創面愈合[10]。此外，ADSCs 局部移植易分化為成熟脂肪細胞，而成熟的脂肪細胞又能調控成纖維細胞功能參與創面修復[23]，ADSCs 移植后釋放成脂信號以及分化為成熟脂肪細胞，可能是 ADSCs 治療創面的獨特優勢。Marangi 等[24]將自體脂肪移植至早期壓瘡患者，通過臨床觀察和超聲檢查發現移植自體脂肪能促進壓瘡愈合。本研究采用強力磁鐵壓迫方法成功制備小鼠壓瘡模型，然后將 hADSCs 局部移植至壓瘡處，觀察 hADSCs 對壓瘡愈合的影響。組織學觀察顯示，相對于 PRP 組和對照組，hADSCs 組炎性細胞浸潤較少、膠原沉積和再生皮膚附屬器較多；免疫組織化學染色觀察顯示，hADSCs 能促進壓瘡愈合，同時提高愈合質量，分析這與血管新生和神經再生更多有關。
此外，本研究也進一步證實了 PRP 局部移植可促進壓瘡愈合、提高愈合質量，與既往報道[6-7]一致。然而，PRP 釋放生長因子可能具有時效性，移植至創面后 PRP 中的關鍵蛋白在短時間內會很快被清除，從而失去生物活性[8]，導致其促進創面愈合能力下降。因此，Zhou 等[25]將 PRP 結合緩釋載體，結果顯示其作用較單純 PRP 明顯增強。本研究中，PRP 組 5 d 和 11 d 可見大量血管生長，21 d 時血管明顯減少，并且與 hADSCs 組相比，后期 PRP 的促血管新生潛能明顯下降，進一步表明可能與 PRP 釋放生長因子的時效性有關。
綜上述，hADSCs 移植能促進小鼠壓瘡愈合，皮膚全層結構恢復更快，膠原形成、血管新生和周圍神經再生更多。但本研究也存在一些不足：ADSCs 來源于臨床患者，而 PRP 來源于健康捐贈者，兩者不是來源于同一供體；其次有文獻報道 ADSCs 聯合 PRP 移植可促進豬放射性創面愈合[26]，對于壓瘡，ADSCs 和 PRP 是否有聯合效應，需要進一步研究；此外還缺少 ADSCs 最終轉歸的證據，下一步我們將追蹤 ADSCs 在局部的遠期存活情況以及是否分化為創面修復的功能細胞。
壓瘡是指在持續外力作用下，皮膚表皮、真皮、皮下脂肪組織、肌肉、骨骼完整性遭到破壞，好發于老年患者或因外傷導致截癱或四肢癱瘓的年輕患者[1]。壓瘡具有經久不愈且易復發的特點，深達骨質的壓瘡還可能繼發感染，引起膿毒癥甚至危及患者生命。缺血損傷后的血管新生障礙和神經功能減退或缺失是壓瘡復發的重要病理生理機制之一[2]。血小板作為一種多功能細胞，在血管發生、組織修復和炎癥過程中扮演著重要角色。目前血小板濃縮制品，如富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），已廣泛用于損傷組織修復領域，包括壓瘡的防治[3-7]。但 PRP 植入體內后，一些關鍵蛋白會在短時間內被宿主免疫系統清除，從而失去活性，影響了治療效果[8]。
目前，干細胞療法被認為是慢性創面最有前景的治療方法[9]。脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）屬于成體間充質干細胞，能分泌多種促血管新生和神經生長的細胞因子，如 VEGF、肝細胞生長因子、NGF 和腦源性神經營養因子等。與血小板濃縮制品相比，ADSCs 還具備多向分化潛能，如體外培養可向內皮細胞、神經細胞方向分化[10-11]。因此，我們分析 ADSCs 局部移植后可通過促進壓瘡創面的血管新生和神經再生，進而促進壓瘡創面愈合，提高壓瘡愈合質量，減少復發。本研究通過建立小鼠壓瘡模型，局部移植人 ADSCs（human ADSCs，hADSCs），觀察壓瘡愈合以及血管新生和神經再生情況，同時與人 PRP 局部移植治療效果進行比較，以期為臨床應用 ADSCs 防治壓瘡提供實驗依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8 周齡雌性 C57BL/6 野生型小鼠 51 只，體質量 18～21 g，購于重慶市騰訊實驗動物銷售有限公司，建立壓瘡模型前適應性飼養 1 周；涉及的動物處理均按照遵義醫學院動物實驗中心制定的指導方針進行，并獲得遵義醫學院倫理委員會批準。Ⅰ型膠原蛋白酶（Sigma 公司，美國）；10%FBS、0.25% 胰蛋白酶- EDTA、L-DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；慢病毒（廣州吉賽生物科技有限公司）；CD31、S100、CD90、CD73、CD105、CD34 抗體（Abcam 公司，美國）；三系誘導劑 ［賽業（廣州）生物科技有限公司］。磁鐵（上海琦顥機電有限公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；恒溫培養箱、酶標儀（Thermo 公司，美國）。
1.2 hADSCs 分離培養、鑒定及標記
1.2.1 hADSCs 分離培養
人脂肪組織來源于 2017 年 3 月—7 月于遵義醫學院附屬醫院整形外科行皮瓣移植的患者，患者均知情同意并通過倫理批準。參照文獻[12]報道方法分離培養 hADSCs。無菌條件下，取脂肪組織反復修剪后，加入等體積 0.1%Ⅰ型膠原蛋白酶，37℃ 條件下置于搖床（100 r/min）消化 1 h；過濾后以 800×g 離心 5 min；棄上清，加入紅細胞裂解液，同上法離心后棄上清，加入含 10%FBS、1% 青、鏈霉素雙抗的 L-DMEM 培養液，重懸細胞，接種至 75 mm 培養皿；置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。72 h 后首次換液，常規每隔 3 d 換液 1 次，待細胞生長至 70% 融合時，用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化傳代，取第 3 代細胞進行實驗。培養期間于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.2 hADSCs 鑒定
① 誘導分化鑒定：取第 3 代細胞，分別采用成脂誘導分化培養基、成骨誘導培養基及成軟骨誘導培養基進行誘導培養。培養 3 周后，分別行油紅 O 染色、茜素紅染色，觀察成脂及成骨效果；4 周后行阿利新藍染色，觀察成軟骨效果。② 表型鑒定：取第 3 代對數期生長細胞，采用流式細胞儀檢測 CD90、CD105、CD73 及 CD34 表達。
1.2.3 hADSCs 標記
用病毒包被的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）進行細胞轉染，首先進行感染復數（multiplicity of infection，MOI）測定。取第 3 代對數期生長細胞，用含 8 μg/mL Polybrene 的完全培養基換液，分別按 MOI 為 100、75、50、25、10、1 進行病毒轉染，16 h 后更換為完全培養基，繼續培養 48～72 h 進行觀察，以 80% 以上細胞表達 GFP 為最佳 MOI。取最佳 MOI 轉染細胞進行動物實驗。
1.3 人 PRP 制備
參考文獻[13-14]方法制備人 PRP。用裝有枸櫞酸鈉抗凝劑的真空管收集健康志愿者外周血 10 mL，以 900×g 離心 5 min 后試管內全血分為 3 層：上層為上清液，下層為紅細胞，上下層交界處為血小板濃集層，吸取全部上清液以及交界面血小板濃集層后移入另一離心管，搖勻，以 1 500×g 離心 15 min，液體分為 2 層，下層即為 PRP。分別取 0.2 mL 外周血以及 PRP 行血小板計數并比較。按照 1 mL PRP 加入 0.1 mL 10% 葡萄糖酸鈣激活血小板 1 h 后，以 800×g 離心 5 min，0.22 μm 過濾器過濾備用。
1.4 動物模型制備及分組
參考 Strong 等[15]的方法制備小鼠壓瘡模型。首先取 6 只 C57BL/6 野生型小鼠，于背部正中線兩側相距 5 mm 處輕輕拉起背部皮膚，兩側對稱放置直徑 12 mm、厚 5 mm 的強力磁鐵作壓迫處理；24 h 為 1 個循環，其中 12 h 磁鐵壓迫、12 h 去除磁鐵；共 2 個循環。2 個循環處理后每只小鼠背部產生 2 個創面。分別于 2 個循環結束后第 1 天和第 5 天取材行 HE 染色觀察，于第 1 天見正常皮膚結構破壞，出現組織水腫，少量炎性細胞浸潤；第 5 天出現大量炎性細胞浸潤，組織細胞變性壞死，確認壓瘡模型建立成功。見圖 1。
確認壓瘡建模方法可行后，另取 45 只 C57BL/6 野生型小鼠隨機分為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 3 組，每組 15 只。同上法建模后第 1 天，hADSCs 組小鼠每個創面注射 100 μL PBS 重懸的 GFP 標記后的 hADSCs（1×106個），PRP 組注射 100 μL 人 PRP，對照組注射 100 μL PBS。均采用 27 號鎖定注射器注射至創緣及基底，注射完畢后以 3M 組織黏附膠水封閉注射部位。
圖1
動物模型制備
a. 磁鐵壓迫處理；b. 小鼠背部創面；c. 建模后第 1 天組織學觀察（HE×40）；d. 建模后第 5 天組織學觀察（HE×40）
Figure1. Animal model preparationa. Magnet compression treatment; b. Mouse wounds; c. Histological observation on the 1st day after modeling (HE×40); d. Histological observation on the 5th day after modeling (HE×40)
1.5 觀測指標
1.5.1 創面愈合觀察
于注射后 1、5、9、13、17、21 d 觀察創面愈合情況。于 5、9、13 d 照相后采用 Image J 軟件測量創面面積，計算創面愈合率，公式為：創面愈合率=（原始創面面積–剩余創面面積）/原始創面面積×100%。
1.5.2 組織學觀察
注射后 5、11、21 d 各組取 5 只小鼠，腹腔麻醉處死后，從距創緣 5 mm 處擴大切取包括整個創面的組織塊，置于 10% 甲醛固定 48 h，石蠟包埋，作 5 μm 厚切片。取部分切片，分別行 HE 染色及 Masson 染色。光鏡下 HE 染色觀察組織結構；Masson 染色觀察膠原沉積情況，鏡下取 5 個視野，采用 Image J 軟件測量膠原表達量。
1.5.3 免疫組織化學染色觀察
于注射后 5、11、21 d 行 CD31 免疫組織化學染色觀察新生血管，注射后 21 d 行 S100 免疫組織化學染色觀察雪旺細胞表達。取 1.5.2 中制備的部分切片，梯度乙醇復水，EDTA 抗原修復，PBS 沖洗，山羊血清室溫封閉，PBS 沖洗后一抗孵育（稀釋比 1∶200）4℃ 過夜，PBS 沖洗后二抗工作液（HRP 標記）孵育 37℃ 30 min，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。鏡下觀察，CD31 陽性染色為紅色，高倍鏡下各組每個樣本取 5 個視野，計數新生血管，表示微血管數目；S100 陽性染色為紅色，高倍鏡下各組每個樣本取 5 個視野，采用 Image J 軟件計算陽性細胞百分比。
1.5.4 熒光示蹤法觀察 hADSCs 定植及成活情況
注射后 11 d，取 hADSCs 組創緣及創面部分組織，冰凍包埋劑固定后制作冰凍切片，PBS 沖洗包埋劑后，DAPI 染細胞核 5 min，PBS 清洗，熒光顯微鏡下觀察，予藍光激發 hADSCs 表達呈綠色熒光。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示。對實驗結果進行正態檢驗及方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；不符合則采用多樣本多重比較的非參數秩和檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 hADSCs 形態觀察及鑒定
分離培養 24 h 后少數細胞貼壁，可見單個貼壁的長梭形細胞；72 h 后細胞貼壁完全，較多細胞舒展伸開；6～7 d 時細胞快速增殖，進入對數生長期；10 d 時細胞鋪滿瓶底，細胞融合度達 70%，呈魚群樣排列。傳代培養后，第 3 代細胞以長梭形為主，呈漩渦狀生長。轉染后 48 h，MOI 為 25 時細胞轉染率達 70%，MOI>25 后轉染率無明顯增加；轉染后 72 h，當 MOI 達25及以上時細胞轉染率均達 90% 以上，且細胞形態未見明顯異常。見圖 2。根據觀察結果，確定最佳 MOI 為 25。
圖2
hADSCs 形態觀察
a. 第 3 代 hADSCs 形態觀察（倒置相差顯微鏡×100）；b～g. 以 MOI 為 1、10、25、50、75、100 轉染 48 h 后倒置熒光顯微鏡觀察（×100）；h. 以 MOI 為 25 轉染 72 h 后倒置熒光顯微鏡觀察（×100）
Figure2. Morphological observation of hADSCsa. Morphological observation of 3rd generation hADSCs (Inverted phase contrast microscope×100); b-g. Inverted fluorescence microscope observation after 48 hours of transfected with the virus at the multiplicity of infection of 1, 10, 25, 50, 75, and 100, respectively (×100); h. Inverted fluorescence microscope observation after 72 hours of transfected with the virus at the multiplicity of infection of 25 (×100)
成骨誘導培養 3 周，茜素紅染色可見紅色鈣鹽結節；成脂誘導培養 3 周，細胞體積稍增大，細胞內可見大小不等的串珠樣圓形脂滴，油紅 O 染色后呈紅色顆粒樣；成軟骨誘導培養 4 周，阿利新藍染色見軟骨組織中大量酸性黏多糖。上述觀察結果提示分離培養的細胞具有多向分化潛能。流式細胞儀檢測顯示 CD90、CD105、CD73 呈陽性，CD34 呈陰性。鑒定結果表明，分離培養的細胞為 hADSCs。見圖 3。
圖3
hADSCs 鑒定
a. 成骨誘導培養 3 周茜素紅染色（×400）；b. 成脂誘導培養 3 周油紅 O 染色（×400）；c. 成軟骨誘導培養 4 周阿利新藍染色（×400）；d. 流式細胞儀檢測 從左至右分別為 CD90、CD105、CD73、CD34
Figure3. hADSCs identificationa. Alizarin red staining after osteogenic induction for 3 weeks (×400); b. Oil red O staining after adipogenic induction for 3 weeks (×400); c. Alcian blue staining after chondrogenic induction for 4 weeks (×400); d. Flow cytometry detection From left to right for CD90, CD105, CD73, and CD34
2.2 人 PRP 血小板計數
PRP 血小板計數為（641.2±74.4）×109個/L，顯著高于正常外周血的（208.4±68.9）×109個/L，差異有統計學意義（t=5.781，P=0.029）。
2.3 動物實驗觀察
2.3.1 創面愈合觀察
注射后 1 d，各組創面未見明顯差異。5 d 時，hADSCs 組痂皮部分脫落；PRP 組創緣少量痂皮形成；對照組創面發紅，出現炎性反應。9 d 時，hADSCs 組痂皮已脫落，殘余創面最小；PRP 組和對照組痂皮附著。13 d 時，hADSCs 組創面已基本愈合；PRP 組和對照組仍有殘余創面。17 d 時，hADSCs 組原創面部位有毛發生長；PRP 組壓瘡創面瘢痕愈合，未見毛發生長；對照組創面瘢痕愈合，無毛發生長范圍大于 PRP 組。21 d 時，hADSCs 組原創面部位毛發生長茂盛，PRP 組創面仍有小面積瘢痕愈合區域無毛發生長，對照組無毛發生長區域與 PRP 組比較更明顯。見圖 4。注射后 5、9、13 d，hADSCs 組創面愈合率明顯高于 PRP 組及對照組，PRP 組高于對照組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖4
各組小鼠創面愈合大體觀察
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 a. 注射后 5 d；b.注射后 13 d；c. 注射后 21 d
Figure4. Gross observation of wound healing in each groupFrom left to right for hADSCs group, PRP group, and control group a. On the 5th day after injection; b. On the 13th day after injection; c. On the 21st day after injection
圖5
注射后各時間點各組創面愈合率
Figure5.
Wound healing rate of each group on 5th, 9th, and 13th days after injection
2.3.2 組織學觀察
① HE 染色：注射后 5 d，各組可見痂皮殘留，真皮層大量炎性細胞浸潤，其中 hADSCs 組炎性細胞浸潤相對較輕，可見部分表皮再生。11 d 時，hADSCs 組炎性細胞浸潤明顯較 5 d 時減少，PRP 組次之，對照組仍可見大量炎性細胞浸潤。21 d 時，hADSCs 組表皮層較厚，表皮與真皮連接致密，真皮內大量的皮膚附屬器再生；PRP 組表皮層較厚，表皮與真皮連接致密，真皮淺層較厚，深層稀松，未見皮膚附屬器；對照組表皮層和真皮層均較薄，真皮斷裂，未見皮膚附屬結構等形成。見圖 6。
圖6
注射后各時間點各組 HE 染色觀察（×40）
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 a. 注射后 5 d；b. 注射后 11 d；c. 注射后 21 d
Figure6. HE staining of each group at each time point after injection (×40)From left to right for hADSCs group, PRP group, and control groupa. On the 5th day after injection; b. On the 11th day after injection; c. On the 21st day after injection
② Masson 染色：注射后 5 d 時，hADSCs 組膠原沉積較 PRP 組、對照組明顯。11 d 時，hADSCs 組膠原沉積明顯，PRP 組真皮層可見少量膠原沉積，對照組仍可見大量炎性細胞浸潤，膠原沉積量少，真皮層膠原沉積少。21 d 時，hADSCs 組表皮層較厚，膠原染色較深，排列有序；PRP 組真皮層較厚，可見較多膠原沉積，膠原排列致密；對照組膠原沉積較少，膠原排列稀松。見圖 7。注射后各時間點，hADSCs 組膠原表達量均顯著高于 PRP 組及對照組，PRP 組高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 8。
圖7
注射后各時間點各組 Masson 染色觀察（×40）
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 a. 注射后 5 d；b. 注射后 11 d；c. 注射后 21 d
Figure7. Masson staining of each group at each time point after injection(×40)From left to right for hADSCs group, PRP group, and control group a. On the 5th day after injection; b. On the 11th day after injection; c. On the 21st day after injection
圖8
注射后各時間點各組創面膠原表達量
Figure8.
Expression of collagen in each group on the 5th, 11th, 21st days after injection
2.3.3 免疫組織化學染色觀察
① CD31：注射后 5 d，hADSCs 組和 PRP 組可見血管大量增生，周圍大量炎性細胞浸潤，而對照組新生血管較 hADSCs 組和 PRP 組減少（P<0.05），hADSCs 組較 PRP 組明顯增多（P<0.05）。11 d 時，hADSCs 組血管較 5 d 時明顯增多、炎性細胞減少，PRP 組血管較前減少；各組新生血管數目比較，差異具有統計學意義（P<0.05）。21 d 時，3 組新生血管以及血管周圍炎性細胞均明顯減少，其中 PRP 組和對照組新生血管數均低于 hADSCs 組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；PRP 組和對照組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 9、10。
圖9
注射后各時間點各組 CD31 免疫組織染色觀察（×200）
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組 a. 注射后 5 d；b. 注射后 11 d；c. 注射后 21 d
Figure9. Immunohistochemical staining of CD31 in each group at each time point after injection (×200)From left to right for hADSCs group, PRP group, and control group a. On the 5th day after injection; b. On the 11th day after injection; c. On the 21st day after injection
圖10
注射后各時間點各組新生血管數
Figure10.
Number of neovascularization in each group at each time point after injection
② S100：注射后 21 d，鏡下觀察示 hADSCs 組陽性表達區域最大，并覆蓋皮膚全層，PRP 組僅在真皮層見散在陽性表達，對照組陽性表達區域極少。見圖 11。hADSCs 組、PRP 組以及對照組 S100 陽性細胞百分比分別為 3.6%±0.8%、0.8%±0.4%、0.2%±0.4%，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。
圖11
注射后 21 d 各組 S100 免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右分別為 hADSCs 組、PRP 組、對照組
Figure11. Immunohistochemical staining of S100 in each group on the 21st day after injection (×100)From left to right for hADSCs group, PRP group, and control group
2.3.4 hADSCs 定植及成活觀察
hADSCs 組注射 hADSCs 后 11 d，鏡下可見表皮下方大量局部移植細胞，呈綠色熒光。見圖 12。
圖12
注射后 11 d hADSCs 組熒光顯微鏡觀察（×200）
a. 藍光照射時脂肪細胞表達綠色熒光；b. DAPI 染色；c. 復合顯色
Figure12. Fluorescence microscopy observation on the 11th day in hADSCs group (×200)a. Blue light stimulated tissue blocks expressed green;b. After DAPI staining, nuclei expressed blue light; c. Merge
3 討論
壓瘡治療方法包括外科清創術、封閉式負壓引流治療、皮瓣移植、高壓氧治療、應用生物工程皮膚替代品等，各有優缺點[16]。MSCs 具有低免疫原性，成為慢性創面干細胞療法研究的熱點種子細胞[17]。MSCs 根據來源可分為 BMSCs、ADSCs 和羊膜 MSCs 等。最早應用于慢性創面治療的是 BMSCs，臨床和基礎研究均表明 BMSCs 可以促進創面愈合[18-19]。Motegi 等[20]研究發現，同種異體 BMSCs 移植至鼠缺血再灌注損傷模型后，能通過減少血管損傷、減輕氧化應激和減少細胞凋亡，有效預防壓瘡的發生。與 BMSCs 相比，ADSCs 具有易大量獲取、更易促血管新生等優勢，是理想的種子細胞[21]。因此，本研究選擇 hADSCs 作為研究靶細胞。
Strong 等[15]采用同種異體 ADSCs 移植治療鼠壓瘡創面，結果創面均順利愈合，他們認為這可能與 ADSCs 移植能增強上皮化和成熟脂肪細胞再生有關。有研究表明，外源性 ADSCs 局部移植能促進壓瘡愈合，主要與 ADSCs 旁分泌和分化潛能有關[22]。ADSCs 能分泌多種生長因子，包括 VEGF 及 NGF 等，這些生長因子具有促新生血管作用，能促進成纖維細胞、表皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞的生長，發揮組織再生、促進創面上皮化、促進神經及血管修復的作用[11]。ADSCs 還可分化為表皮細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞和神經細胞，直接參與創面愈合[10]。此外，ADSCs 局部移植易分化為成熟脂肪細胞，而成熟的脂肪細胞又能調控成纖維細胞功能參與創面修復[23]，ADSCs 移植后釋放成脂信號以及分化為成熟脂肪細胞，可能是 ADSCs 治療創面的獨特優勢。Marangi 等[24]將自體脂肪移植至早期壓瘡患者，通過臨床觀察和超聲檢查發現移植自體脂肪能促進壓瘡愈合。本研究采用強力磁鐵壓迫方法成功制備小鼠壓瘡模型，然后將 hADSCs 局部移植至壓瘡處，觀察 hADSCs 對壓瘡愈合的影響。組織學觀察顯示，相對于 PRP 組和對照組，hADSCs 組炎性細胞浸潤較少、膠原沉積和再生皮膚附屬器較多；免疫組織化學染色觀察顯示，hADSCs 能促進壓瘡愈合，同時提高愈合質量，分析這與血管新生和神經再生更多有關。
此外，本研究也進一步證實了 PRP 局部移植可促進壓瘡愈合、提高愈合質量，與既往報道[6-7]一致。然而，PRP 釋放生長因子可能具有時效性，移植至創面后 PRP 中的關鍵蛋白在短時間內會很快被清除，從而失去生物活性[8]，導致其促進創面愈合能力下降。因此，Zhou 等[25]將 PRP 結合緩釋載體，結果顯示其作用較單純 PRP 明顯增強。本研究中，PRP 組 5 d 和 11 d 可見大量血管生長，21 d 時血管明顯減少，并且與 hADSCs 組相比，后期 PRP 的促血管新生潛能明顯下降，進一步表明可能與 PRP 釋放生長因子的時效性有關。
綜上述，hADSCs 移植能促進小鼠壓瘡愈合，皮膚全層結構恢復更快，膠原形成、血管新生和周圍神經再生更多。但本研究也存在一些不足：ADSCs 來源于臨床患者，而 PRP 來源于健康捐贈者，兩者不是來源于同一供體；其次有文獻報道 ADSCs 聯合 PRP 移植可促進豬放射性創面愈合[26]，對于壓瘡，ADSCs 和 PRP 是否有聯合效應，需要進一步研究；此外還缺少 ADSCs 最終轉歸的證據，下一步我們將追蹤 ADSCs 在局部的遠期存活情況以及是否分化為創面修復的功能細胞。
