引用本文： 孫妍娜, 張榮明, 毛旭, 張孟姝. 復合脂肪來源干細胞的脫細胞異種神經聯合富血小板血漿修復兔面神經損傷的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(6): 736-744. doi: 10.7507/1002-1892.201711079 復制
由于創傷、炎癥、腫瘤以及醫源性損傷等引起的周圍性面神經損傷，不但嚴重影響患者面部功能，同時也可能引起心理、審美、精神障礙等嚴重疾病[1]。目前修復面神經損傷的方法很多，但自體神經移植仍是修復“金標準”。自體神經移植提供了一個富含神經營養因子、基底膜、雪旺細胞及細胞外基質等成分的理想支架。因自體神經來源有限，且切取后會造成供區不同程度損傷，限制了其臨床應用[2]。而目前臨床其他修復方法仍不能達到滿意的功能恢復效果。因此，面神經修復一直是整形外科領域難題之一。近年來，隨著組織工程學的快速發展，由種子細胞、生長因子和細胞外基質構成的組織工程神經具備了自體神經的生物學特性[3-4]。采用脫細胞同種異體神經修復神經缺損，已初步顯示出良好的應用前景[5-7]，但采用異種神經修復神經缺損的實驗研究較少。本實驗設計負載脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的脫細胞異種神經聯合富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）構建組織工程神經，并用于修復兔面神經缺損，以期探討一種新的神經缺損修復方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4 月齡雌性新西蘭大耳白兔 33 只，體質量 3.0～3.5 kg；3 月齡雌性 SD 大鼠 15 只，體質量 300～350 g；均由錦州醫科大學實驗動物中心提供。
DMEM 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（杭州天杭生物科技有限公司）；陸眠寧Ⅱ（吉林華牧動物保健品有限公司）；0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA、青鏈霉素雙抗（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、油紅 O、茜素紅（北京索萊寶科技有限公司）；甲苯胺藍染色劑、Triton X-100、硫代甜菜堿 10（sulfobetaine 10，SB-10）、SB-16、β-巰基乙醇、維生素 A 酸（Sigma 公司，美國）；抗兔 FITC 免疫熒光試劑盒、MTT 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；血小板稀釋液（北京雷根生物技術有限公司）；兔抗 S-100B（北京博奧森生物技術有限公司）；CM-Dil 活細胞染色劑（上海翔圣生物科技有限公司）；OriCellTM 兔 ADSCs 成骨誘導分化培養基試劑盒、OriCellTM 兔 ADSCs 成脂誘導分化培養基試劑盒（Cyagen 公司，美國）。多功能酶標儀（TECAN 公司，瑞士）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；TS100 熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）；JEM-F200 透射電鏡（日本電子株式會社）。
1.2 大鼠神經脫細胞處理及觀察
取 15 只 SD 大鼠以 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，無菌條件下切除雙側坐骨神經，制成 30 根長 12 mm 的神經移植段。參照 Hudson 等[8]方法，隨機取 28 根置于液氮中 2 min，取出后快速置于 37℃ 恒溫水浴中 2 min，重復 3 次；放入含 125 mmol/L SB-10 的 PBS 中 15 h，PBS 沖洗 15 min；轉入含 0.6 mmol/L SB-16、0.14%Triton X-100 的 PBS 中 24 h，PBS 洗滌，依次置于含 125 mmol/L SB-10 的 PBS 中震蕩 7 h，含 0.6 mmol/L SB-16、0.14%Triton X-100 的 PBS 中 15 h，PBS 洗滌 3 次；置于含 1×青鏈霉素雙抗的 PBS 中，4℃ 保存備用，每周換液 1 次。將剩余 2 根未作處理的新鮮神經段及 2 根脫細胞處理后的神經段石蠟包埋，切片，HE 染色觀察。
1.3 兔 ADSCs 分離培養及鑒定
取新西蘭大耳白兔 1 只，臀大肌注射陸眠寧Ⅱ（0.1～0.2 mL/kg）麻醉后，無菌條件下切除頸背部脂肪墊，采用Ⅰ型膠原酶單獨消化法提取 ADSCs，體外增殖傳代純化，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長特性及形態。取第 3 代 ADSCs，胰蛋白酶消化后制成密度為 2×104 個/L 的單細胞懸液，接種于鋪有細胞爬片的 6 孔板中，分別應用成骨、成脂誘導分化培養基試劑盒誘導分化，行細胞形態學觀察；于成骨誘導 28 d 行茜素紅染色以及成脂誘導 21 d 行油紅 O 染色進行鑒定。
1.4 PRP 對 ADSCs 增殖影響及誘導分化的觀察
1.4.1 PRP 制備
采用兩步離心法制備 PRP[9]。新西蘭大耳白兔切除脂肪墊前，于耳靜脈穿刺采血 10 mL，置于含復方枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管中。留取 0.1 mL 全血進行血小板計數。首次離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 20 min，分 3 層；取上層及交界面下 2 mm 轉入另一離心管中，以離心半徑 10 cm、3 600 r/min 再次離心 10 min，吸棄上層 3/4，剩余為未激活的 PRP，約 2 mL；加入 200 μL 血小板激活劑（10%CaCl2 和 1 000 U 凝血酶），4℃ 冰箱過夜；再以離心半徑 10 cm、4 500 r/min 離心 8 min，吸取上清液 0.22 μm 濾過膜過濾，留取少量 PRP 應用血球計數板計數血小板，其余 PRP 置于 –20℃ 保存備用。
1.4.2 MTT 法檢測 PRP 對 ADSCs 的增殖影響
取生長良好的第 3 代 ADSCs 制成單細胞懸液，以 2 000 個/孔加入 4 塊 96 孔板中，每板 6 組（設為 1～6 組），每組 5 個復孔。24 h 后吸去培養基，1～6 組分別加入無血清 DMEM 培養基及含 5%、10%、15%、20%、25%PRP 的 DMEM 培養基培養，每 24 小時取出 1 板，采用 MTT 法測定吸光度（A）值，連續檢測 4 d。根據檢測結果，選擇促進 ADSCs 增殖效果最顯著的含 PRP 培養基進行下一步實驗。
1.4.3 PRP 誘導 ADSCs 成類雪旺細胞及鑒定
取生長良好的第 3 代 ADSCs，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min，制成密度為 2×104 個/L 的單細胞懸液，接種于預先鋪好細胞爬片的 6 孔板中，每孔約 2 000 個細胞；待細胞融合達 80% 后，去除含 15%FBS 的 DMEM 完全培養基，參照文獻[5]方法，加入預誘導培養液 A（含 1 mmol/L β-巰基乙醇的 DMEM 培養基），37℃ 培養 1 d 后棄去培養基，PBS 洗滌 3 次；加入預誘導培養液 B（含 10%FBS、40 ng/mL 維生素甲酸的 DMEM 培養基），37℃ 培養 3 d，PBS 洗滌 3 次；加入含 20%PRP 的 DMEM 培養基誘導培養 7 d，光鏡下觀察細胞形態。PBS 洗滌 3 次后，每孔加入 1 mL 4% 多聚甲醛固定，依次加入封閉液、兔抗 S-100B（1∶100），4℃ 過夜，洗滌液洗滌后加入 FITC 標記山羊抗兔 IgG 抗體（1∶400），室溫孵育 60 min，避光操作，洗滌 3 次后，取出爬片滴加熒光抗淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察。
1.5 ADSCs 的熒光標記傳代
取第 3 代生長良好的 ADSCs，0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化后，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min；加入濃度為 2 μmol/L 的 CM-Dil 活細胞染色劑，37℃ 孵育 5 min 后，4℃ 孵育 15 min，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min 后，PBS 洗滌 2 次；含 15%FBS 的 DMEM 培養基重懸，調整密度為 1.0×106 個/mL，熒光顯微鏡觀察細胞標記程度，并用于后期復合異種神經移植體；留取部分 CM-Dil-ADSCs 接種并連續傳代，觀察熒光衰減情況。
1.6 兔面神經缺損修復實驗
1.6.1 CM-Dil-ADSCs 與脫細胞異種神經復合
將 1.2 中制備的大鼠脫細胞坐骨神經置于含 10%FBS 的培養基中預處理 8 h，采用 20 μL 微量注射器將標記的 CM-Dil-ADSCs 細胞懸液按四等分點注射入脫細胞神經內，每點 5 μL，盡量避光處理。然后在含 10%FBS 的培養基中繼續培養 24 h，備用。隨機取 1 根復合 CM-Dil-ADSCs 的脫細胞異種神經，多聚甲醛固定，冰凍包埋，切片，片厚 7 μm，熒光顯微鏡下觀察 CM-Dil-ADSCs 的復合情況。
1.6.2 兔面神經缺損模型制備及實驗分組
取 32 只新西蘭大耳白兔禁食水 8 h 后，以陸眠寧Ⅱ（0.1～0.2 mL/kg）臀大肌注射全麻，右側臥位固定于手術臺上。沿瞼下緣 1.5 cm 作橫行直切口，向后沿至耳前，向前沿至口角，剝離咬肌表面筋膜可見面神經主干及上下頰支，將上頰支游離約 2 cm，于中部切斷 0.8 cm，斷端自然回縮后，造成 1 cm 長神經缺損，建立左側面神經缺損模型。按隨機數字表法將兔分成 4 組（n=8），A 組采用 CM-Dil-ADSCs 復合脫細胞異種神經+自體 PRP 修復神經缺損，B 組采用 CM-Dil-ADSCs 復合脫細胞異種神經修復，C 組采用脫細胞異種神經修復，D 組采用自體神經移植修復。各組分別將神經移植體倒置接于斷端，顯微鏡下用 9-0 無損傷醫用絲線縫合神經外膜，每側 3～4 針，慶大霉素噴灑創面后，逐層縫合切口。A 組于神經吻合端對應皮膚間斷縫合點，縫合線留長作為標記點，于術后 1、2、3、5、7 d 注射 0.5 mL 自體 PRP（參照 1.4.1 方法制備）；B 組同樣處理并于各時間點注射等量生理鹽水。術后 3 d 創面局部聚維酮碘消毒，各組分籠飼養。
1.6.3 一般情況
觀察各組實驗動物術后飲食、精神狀態、生活情況、切口情況。術后 1、8 周靜態下測量各組實驗動物雙側上唇與面部正中線所成角度（θ 角），健、患側進行比較。
1.6.4 神經電生理檢測
術后 4、8 周，將 4 組實驗動物同上法全麻后固定于實驗臺上，于原術區切口處切開皮膚及皮下組織，顯露左側面神經上頰支及其對應的肌組織。首先將刺激電極置于移植神經吻合段近端，引導電極刺入同側口輪匝肌（深度 5 mm），以方波進行刺激，記錄口輪匝肌的動作電位潛伏期（t1），同時記錄 2 根電極之間的距離（d1）；然后將刺激電極置于移植神經吻合段遠端，記錄動作電位潛伏期（t2）及 2 根電極之間的距離（d2）；按以下公式計算神經傳導速度：（d1–d2）/（t1–t2）。
1.6.5 組織學及透射電鏡觀察
術后 8 周完整切取各組實驗動物神經移植段（遠、近端均超過吻合口 1 mm）。取各組吻合口處寬 2 mm 的神經組織，行石蠟包埋切片，甲苯胺藍染色，光鏡下觀察，并通過圖像分析儀計算有髓神經纖維密度；另外制作 70 nm 厚超微電鏡切片，檸檬酸鉛及醋酸雙氧鈾染色后，透射電鏡下觀察有髓神經纖維結構；同時對 A、B 組行 OCT 包埋后，7 μm 厚冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察示蹤 CM-Dil-ADSCs 在再生神經內的生長情況。
1.7 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠脫細胞坐骨神經觀察
通過凍融聯合化學處理的大鼠脫細胞坐骨神經呈淡乳白色，略透明，兩端無軸突髓鞘膨出。與未作脫細胞處理的新鮮神經相比，外膜彈性、韌性基本一致，長度與直徑無明顯變化，延展性略有增加。HE 染色示，新鮮神經束膜纖維排列緊密；而脫細胞神經外膜呈紅染波浪狀排列，空隙內無細胞結構和組織碎片。見圖 1。
2.2 兔 ADSCs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代培養的細胞于 2 h 內逐漸貼壁，最初為類圓形，后逐漸呈短梭形或多角形；5 d 后細胞呈團簇生長，形成集落；9 d 后細胞貼覆生長緊密，融合達 90% 以上，進行傳代。隨著傳代次數增加，細胞生長速度變快，第 3 代后細胞形態趨于一致，呈漩渦樣生長。第 3 代生長良好的細胞經成骨誘導 7 d 后，細胞逐漸短縮，呈短梭形并趨于方形，周邊可見零星的細胞外基質沉淀；誘導 21 d 細胞體積逐漸增大堆積，細胞外可見大量片狀及斑塊狀基質沉淀；誘導 28 d 茜素紅染色可見細胞內有大量紅色鈣結節。第 3 代生長良好的 ADSCs 經成脂誘導 5 d 時，細胞質內出現細小的脂滴；誘導 12 d 脂滴融合形成大脂泡，細胞體積增大，由長梭形變成圓形或多邊形；誘導 21 d 油紅 O 染色示脂泡染成橘紅色。見圖 2。
2.3 PRP 對 ADSCs 增殖影響及誘導分化觀察
血球板計算顯示，兩步離心法提取的 PRP 中血小板濃度是全血的 4.15 倍。MTT 法檢測示，隨培養時間延長，2～5 組細胞增殖呈逐漸上升趨勢，1 組細胞增殖呈逐漸下降趨勢；6 組細胞則先增殖，2 d 達峰值后下降。培養 2～4 d A 值比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
光鏡觀察示，ADSCs 經成類雪旺細胞預誘導培養基誘導 3 d 后，細胞質收縮，細胞體積逐漸變小；更換成 20%PRP 誘導 7 d 后，細胞體積明顯縮小，細胞質周圍形成凸起，呈雙極或多極樣。行神經細胞特異性蛋白 S-100 免疫熒光染色后，鏡下可觀察到細胞呈綠色熒光。見圖 4。
2.4 兔 ADSCs 熒光標記觀察
ADSCs 經 CM-Dil 標記后于熒光顯微鏡下觀察呈亮紅色，細胞標記率達 90% 以上；標記細胞傳代后細胞增殖良好，傳至第 3 代后熒光稍衰減。見圖 5。
2.5 兔面神經缺損修復觀察
2.5.1 一般情況
術后各組實驗動物均存活，飲食活動正常，術后 1 周切口愈合良好，無感染。健側上唇與面正中線成角 θ 角為（79.9±5.3）°。術后 1 周各組實驗動物左側上唇均明顯偏斜，A、B、C、D 組 θ 角分別為（53.4±2.5）、（54.0±2.6）、（53.7±2.4）、（53.0±2.1）°，與健側比較差異均有統計學意義（P<0.05）；術后 8 周 θ 角分別為（61.9±4.7）、（56.8±4.2）、（54.6±3.8）、（63.8±5.8）°，與健側及術后 1 周比較差異有統計學意義（P<0.05），其中 A、D 組上唇偏斜恢復程度較大，D 組恢復情況最佳且接近健側，B 組部分改善，C 組改善不明顯。術后 8 周大體觀察，各組動物左側面神經上頰支完整性及連續性均好，未形成神經瘤及明顯膨大，移植神經表面均有不同程度血管膜覆蓋，與周圍肌肉無明顯粘連。
2.5.2 神經電生理檢測
術后 4、8 周，各組均可引出動作電位，且與健側相比，潛伏期延長，波幅降低，神經傳導速度隨恢復期延長均增快。A、D 組神經傳導速度均顯著快于 B、C 組，B 組快于 C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后 4、8 周各組神經傳導速度比較（n=8，m/s，
）
Table1.
Comparison of nerve conduction velocity between groups at 4 and 8 weeks after operation (n=8, m/s,
)
2.5.3 組織學及透射電鏡觀察
術后 8 周熒光顯微鏡觀察示，A 組神經移植遠、近端橫斷面均可見大量標記 CM-Dil 的 ADSCs 通過，B 組通過細胞相對較少。見圖 6。甲苯胺藍染色示，A、B、C、D 組有髓神經纖維密度分別為（19 560.125±914.978）、（16 420.5±902.876）、（14 841.875±871.01）、（19 900.75±949.358）個/mm2，A、D 組均顯著高于 B、C 組，B 組高于 C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。透射電鏡觀察示，A 組再生神經內有髓神經纖維髓鞘管腔直徑較大，壁相對較厚，形態較規則；B、C 組髓鞘直徑小，板層壁薄，形態相對不規則，無髓神經纖維較多，B、C 組間無明顯區別；D 組有髓神經纖維較成熟，密集均勻分布，髓鞘直徑大，壁較厚，接近正常神經。見圖 7。
圖1
大鼠脫細胞神經 HE 染色觀察（×200）
a. 脫細胞處理前；b. 脫細胞處理后
Figure1. HE staining observation of acellular sciatic nerve of rats (×200)a. Before decellularized; b. After decellularized
圖2
兔 ADSCs 形態學觀察及成骨、成脂誘導鑒定（倒置相差顯微鏡×200）
a. 原代細胞培養 5 d；b. 第 3 代細胞形態；c. 成骨誘導 21 d 細胞形態；d. 成骨誘導 28 d 茜素紅染色；e. 成脂誘導 12 d 細胞形態；f. 成脂誘導 21 d 油紅 O 染色
Figure2. Morphological observation and osteogenic and adipogenic inductions of rabbit ADSCs (Inverted phase contrast microscope×200)a. Primary cells cultured for 5 days; b. The morphology of the 3rd generation cells; c. The morphology after osteogenic induction for 21 days; d. Alizarin red staining at 28 days after osteogenic induction; e. The morphology after adipogenic induction for 12 days; f. Oil red O staining at 21 days after adipogenic induction
圖3
MTT 法檢測 PRP 對 ADSCs 的增殖影響
Figure3.
The effect of PRP on the proliferation of ADSCs by MTT
圖4
PRP 對 ADSCs 成類雪旺細胞誘導觀察
a. 誘導 5 d 細胞質呈雙極或多極樣改變（×200）；b. 誘導后 S-100 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
Figure4. Induction of ADSCs to Schwann-like cells by PRPa. The cytoplasm was bipolar or multipolar after 5 days of induction (×200); b. Observation of S-100 immunofluorescence staining after induction (Fluorescence microscope×200)
圖5
ADSCs 經 CM-Dil 標記后熒光顯微鏡觀察（×100）
a. 標記后培養 24 h；b. 標記后細胞傳至第 3 代
Figure5. Fluorescence microscope observation of ADSCs labelled with CM-Dil (×100)a. After 24 hours of labelling; b. After the labelling, the cells passaged to the 3rd generation
圖6
術后 8 周 A、B 組神經移植體吻合處近端橫斷面熒光標記細胞觀察（熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組
Figure6. The fluorescence-labelled cells at the proximal end of the anastomosis of nerve grafts in groups A and B at 8 weeks after operation (Fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B
圖7
術后 8 周各組神經移植段遠端透射電鏡觀察（×20k）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. Transmission electron microscope observation of the distal segments of the nerve grafts at 8 weeks after operation (×20k)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
通過大量實驗及臨床研究證明，自體神經移植修復周圍神經損傷可獲得良好效果。但切取自體神經會造成供區損傷，同時尋找與損傷神經長度、直徑匹配的神經非常困難。所以尋找一種能夠代替自體神經修復神經缺損的材料，是目前該領域研究難點。大量研究顯示，同種異體神經經脫細胞處理后免疫原性低、相容性好，能夠不同程度地修復神經損傷[10]；但同種異體神經來源也有限，所以近年來主要研究方向已由同種異體神經轉至異種神經。異種神經來源廣泛，經化學及凍融等處理后修復神經缺損，可獲得類似同種異體神經修復效果[11]。但處理后的異種神經移植體缺乏神經營養因子、神經再生必需的雪旺細胞和細胞外基質[12-13]。所以為了模擬自體神經修復原理及生物特性，需要采用組織工程學將支持細胞、神經營養因子及細胞外基質與異種神經有效結合，以期更好地發揮修復作用。
Zuk 等[14]最早從人脂肪組織中分離出 ADSCs，在體外培養下該細胞增殖能力強，并具有多向分化能力，在不同誘導條件下可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、心肌細胞、上皮細胞及神經細胞等[15]。PRP 是通過離心全血后得到的血小板濃縮物，含有大量生長因子，如 PDGF、IGF、EGF、VEGF、TGF-β 等，激活后能釋放出大量高濃度生長因子[16-17]。而這些生長因子單獨或聯合應用時能刺激干細胞增殖、分化、組織修復，且 PRP 含有很多抑菌和殺菌蛋白[18-21]，對各種創面起保護作用。所以 PRP 為組織工程修復重建提供了必需的生長因子，同時又創造了有利的微環境。有研究表明，PRP 中的多種生長因子能夠克服外源性神經生長因子的不足，有效促進周圍神經損傷的修復[22-23]。
本研究利用組織工程原理和方法，體外培養了兔 ADSCs 并擴增純化，經多次離心法獲取的自體 PRP 中血小板濃度是全血的 4.15 倍，具有高效活性。通過細胞增殖曲線發現，20% PRP 對 ADSCs 的增殖效果最明顯，應用 PRP 對其誘導可分化成類雪旺細胞；由于 ADSCs 本身攜帶決定雪旺細胞的基因座，所以體外培養是通過去甲基化聯合 PRP 誘導成雪旺細胞[24]。通過對脫細胞異種神經大體及 HE 染色觀察顯示，利用凍融聯合化學萃取的方式處理與兔面神經頰支粗細相配的大鼠坐骨神經，能夠有效去除細胞及細胞成分，同時只保留膠原及纖維構成的神經基膜管，可作為異種神經移植體。CM-Dil 作為一種活細胞染色劑能夠有效地與細胞膜結合，同時保證細胞的活性功能，隨細胞分裂進入子代細胞，熒光效果穩定，具有良好的示蹤性。本實驗將 CM-Dil-ADSCs 進行連續培養后，細胞的增殖能力仍良好，且形態與原代相似，通過微量定點注射的方式與脫細胞異種神經復合后，聯合自體 PRP 共同修復兔 1 cm 面神經缺損。通過比較神經電生理、神經傳導速度、再生神經有髓神經纖維數及結構，以及術后上唇與面正中線成角，發現早期應用 PRP 聯合復合 ADSCs 的脫細胞異種神經移植組與自體神經移植組的各項結果差異無統計學意義，獲得了較好的修復效果。而單純聯合 ADSCs 的脫細胞異種神經移植組及單純脫細胞異種神經移植組雖然也獲得了一定的修復效果，但與前者比較還是存在明顯不足。
綜上述，采用 PRP 注射聯合復合 ADSCs 的脫細胞異種神經修復 1 cm 長兔面神經缺損可獲得較好早期療效，且修復效果與自體神經修復效果相近。但由于 PRP 成分較復雜，各種因子釋放速度較快，持續作用時間有限，活性僅能維持 5～8 d。所以在局部應用 PRP 時，如何保證最有效作用濃度和最優作用時間，達到最佳效果，是需要進一步探討的內容。
由于創傷、炎癥、腫瘤以及醫源性損傷等引起的周圍性面神經損傷，不但嚴重影響患者面部功能，同時也可能引起心理、審美、精神障礙等嚴重疾病[1]。目前修復面神經損傷的方法很多，但自體神經移植仍是修復“金標準”。自體神經移植提供了一個富含神經營養因子、基底膜、雪旺細胞及細胞外基質等成分的理想支架。因自體神經來源有限，且切取后會造成供區不同程度損傷，限制了其臨床應用[2]。而目前臨床其他修復方法仍不能達到滿意的功能恢復效果。因此，面神經修復一直是整形外科領域難題之一。近年來，隨著組織工程學的快速發展，由種子細胞、生長因子和細胞外基質構成的組織工程神經具備了自體神經的生物學特性[3-4]。采用脫細胞同種異體神經修復神經缺損，已初步顯示出良好的應用前景[5-7]，但采用異種神經修復神經缺損的實驗研究較少。本實驗設計負載脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的脫細胞異種神經聯合富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）構建組織工程神經，并用于修復兔面神經缺損，以期探討一種新的神經缺損修復方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4 月齡雌性新西蘭大耳白兔 33 只，體質量 3.0～3.5 kg；3 月齡雌性 SD 大鼠 15 只，體質量 300～350 g；均由錦州醫科大學實驗動物中心提供。
DMEM 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（杭州天杭生物科技有限公司）；陸眠寧Ⅱ（吉林華牧動物保健品有限公司）；0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA、青鏈霉素雙抗（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶、油紅 O、茜素紅（北京索萊寶科技有限公司）；甲苯胺藍染色劑、Triton X-100、硫代甜菜堿 10（sulfobetaine 10，SB-10）、SB-16、β-巰基乙醇、維生素 A 酸（Sigma 公司，美國）；抗兔 FITC 免疫熒光試劑盒、MTT 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；血小板稀釋液（北京雷根生物技術有限公司）；兔抗 S-100B（北京博奧森生物技術有限公司）；CM-Dil 活細胞染色劑（上海翔圣生物科技有限公司）；OriCellTM 兔 ADSCs 成骨誘導分化培養基試劑盒、OriCellTM 兔 ADSCs 成脂誘導分化培養基試劑盒（Cyagen 公司，美國）。多功能酶標儀（TECAN 公司，瑞士）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；TS100 熒光顯微鏡（Nikon 公司，日本）；JEM-F200 透射電鏡（日本電子株式會社）。
1.2 大鼠神經脫細胞處理及觀察
取 15 只 SD 大鼠以 1% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，無菌條件下切除雙側坐骨神經，制成 30 根長 12 mm 的神經移植段。參照 Hudson 等[8]方法，隨機取 28 根置于液氮中 2 min，取出后快速置于 37℃ 恒溫水浴中 2 min，重復 3 次；放入含 125 mmol/L SB-10 的 PBS 中 15 h，PBS 沖洗 15 min；轉入含 0.6 mmol/L SB-16、0.14%Triton X-100 的 PBS 中 24 h，PBS 洗滌，依次置于含 125 mmol/L SB-10 的 PBS 中震蕩 7 h，含 0.6 mmol/L SB-16、0.14%Triton X-100 的 PBS 中 15 h，PBS 洗滌 3 次；置于含 1×青鏈霉素雙抗的 PBS 中，4℃ 保存備用，每周換液 1 次。將剩余 2 根未作處理的新鮮神經段及 2 根脫細胞處理后的神經段石蠟包埋，切片，HE 染色觀察。
1.3 兔 ADSCs 分離培養及鑒定
取新西蘭大耳白兔 1 只，臀大肌注射陸眠寧Ⅱ（0.1～0.2 mL/kg）麻醉后，無菌條件下切除頸背部脂肪墊，采用Ⅰ型膠原酶單獨消化法提取 ADSCs，體外增殖傳代純化，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長特性及形態。取第 3 代 ADSCs，胰蛋白酶消化后制成密度為 2×104 個/L 的單細胞懸液，接種于鋪有細胞爬片的 6 孔板中，分別應用成骨、成脂誘導分化培養基試劑盒誘導分化，行細胞形態學觀察；于成骨誘導 28 d 行茜素紅染色以及成脂誘導 21 d 行油紅 O 染色進行鑒定。
1.4 PRP 對 ADSCs 增殖影響及誘導分化的觀察
1.4.1 PRP 制備
采用兩步離心法制備 PRP[9]。新西蘭大耳白兔切除脂肪墊前，于耳靜脈穿刺采血 10 mL，置于含復方枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管中。留取 0.1 mL 全血進行血小板計數。首次離心半徑 10 cm、1 500 r/min 離心 20 min，分 3 層；取上層及交界面下 2 mm 轉入另一離心管中，以離心半徑 10 cm、3 600 r/min 再次離心 10 min，吸棄上層 3/4，剩余為未激活的 PRP，約 2 mL；加入 200 μL 血小板激活劑（10%CaCl2 和 1 000 U 凝血酶），4℃ 冰箱過夜；再以離心半徑 10 cm、4 500 r/min 離心 8 min，吸取上清液 0.22 μm 濾過膜過濾，留取少量 PRP 應用血球計數板計數血小板，其余 PRP 置于 –20℃ 保存備用。
1.4.2 MTT 法檢測 PRP 對 ADSCs 的增殖影響
取生長良好的第 3 代 ADSCs 制成單細胞懸液，以 2 000 個/孔加入 4 塊 96 孔板中，每板 6 組（設為 1～6 組），每組 5 個復孔。24 h 后吸去培養基，1～6 組分別加入無血清 DMEM 培養基及含 5%、10%、15%、20%、25%PRP 的 DMEM 培養基培養，每 24 小時取出 1 板，采用 MTT 法測定吸光度（A）值，連續檢測 4 d。根據檢測結果，選擇促進 ADSCs 增殖效果最顯著的含 PRP 培養基進行下一步實驗。
1.4.3 PRP 誘導 ADSCs 成類雪旺細胞及鑒定
取生長良好的第 3 代 ADSCs，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min，制成密度為 2×104 個/L 的單細胞懸液，接種于預先鋪好細胞爬片的 6 孔板中，每孔約 2 000 個細胞；待細胞融合達 80% 后，去除含 15%FBS 的 DMEM 完全培養基，參照文獻[5]方法，加入預誘導培養液 A（含 1 mmol/L β-巰基乙醇的 DMEM 培養基），37℃ 培養 1 d 后棄去培養基，PBS 洗滌 3 次；加入預誘導培養液 B（含 10%FBS、40 ng/mL 維生素甲酸的 DMEM 培養基），37℃ 培養 3 d，PBS 洗滌 3 次；加入含 20%PRP 的 DMEM 培養基誘導培養 7 d，光鏡下觀察細胞形態。PBS 洗滌 3 次后，每孔加入 1 mL 4% 多聚甲醛固定，依次加入封閉液、兔抗 S-100B（1∶100），4℃ 過夜，洗滌液洗滌后加入 FITC 標記山羊抗兔 IgG 抗體（1∶400），室溫孵育 60 min，避光操作，洗滌 3 次后，取出爬片滴加熒光抗淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察。
1.5 ADSCs 的熒光標記傳代
取第 3 代生長良好的 ADSCs，0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化后，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min；加入濃度為 2 μmol/L 的 CM-Dil 活細胞染色劑，37℃ 孵育 5 min 后，4℃ 孵育 15 min，以離心半徑 10 cm、1 000 r/min 離心 5 min 后，PBS 洗滌 2 次；含 15%FBS 的 DMEM 培養基重懸，調整密度為 1.0×106 個/mL，熒光顯微鏡觀察細胞標記程度，并用于后期復合異種神經移植體；留取部分 CM-Dil-ADSCs 接種并連續傳代，觀察熒光衰減情況。
1.6 兔面神經缺損修復實驗
1.6.1 CM-Dil-ADSCs 與脫細胞異種神經復合
將 1.2 中制備的大鼠脫細胞坐骨神經置于含 10%FBS 的培養基中預處理 8 h，采用 20 μL 微量注射器將標記的 CM-Dil-ADSCs 細胞懸液按四等分點注射入脫細胞神經內，每點 5 μL，盡量避光處理。然后在含 10%FBS 的培養基中繼續培養 24 h，備用。隨機取 1 根復合 CM-Dil-ADSCs 的脫細胞異種神經，多聚甲醛固定，冰凍包埋，切片，片厚 7 μm，熒光顯微鏡下觀察 CM-Dil-ADSCs 的復合情況。
1.6.2 兔面神經缺損模型制備及實驗分組
取 32 只新西蘭大耳白兔禁食水 8 h 后，以陸眠寧Ⅱ（0.1～0.2 mL/kg）臀大肌注射全麻，右側臥位固定于手術臺上。沿瞼下緣 1.5 cm 作橫行直切口，向后沿至耳前，向前沿至口角，剝離咬肌表面筋膜可見面神經主干及上下頰支，將上頰支游離約 2 cm，于中部切斷 0.8 cm，斷端自然回縮后，造成 1 cm 長神經缺損，建立左側面神經缺損模型。按隨機數字表法將兔分成 4 組（n=8），A 組采用 CM-Dil-ADSCs 復合脫細胞異種神經+自體 PRP 修復神經缺損，B 組采用 CM-Dil-ADSCs 復合脫細胞異種神經修復，C 組采用脫細胞異種神經修復，D 組采用自體神經移植修復。各組分別將神經移植體倒置接于斷端，顯微鏡下用 9-0 無損傷醫用絲線縫合神經外膜，每側 3～4 針，慶大霉素噴灑創面后，逐層縫合切口。A 組于神經吻合端對應皮膚間斷縫合點，縫合線留長作為標記點，于術后 1、2、3、5、7 d 注射 0.5 mL 自體 PRP（參照 1.4.1 方法制備）；B 組同樣處理并于各時間點注射等量生理鹽水。術后 3 d 創面局部聚維酮碘消毒，各組分籠飼養。
1.6.3 一般情況
觀察各組實驗動物術后飲食、精神狀態、生活情況、切口情況。術后 1、8 周靜態下測量各組實驗動物雙側上唇與面部正中線所成角度（θ 角），健、患側進行比較。
1.6.4 神經電生理檢測
術后 4、8 周，將 4 組實驗動物同上法全麻后固定于實驗臺上，于原術區切口處切開皮膚及皮下組織，顯露左側面神經上頰支及其對應的肌組織。首先將刺激電極置于移植神經吻合段近端，引導電極刺入同側口輪匝肌（深度 5 mm），以方波進行刺激，記錄口輪匝肌的動作電位潛伏期（t1），同時記錄 2 根電極之間的距離（d1）；然后將刺激電極置于移植神經吻合段遠端，記錄動作電位潛伏期（t2）及 2 根電極之間的距離（d2）；按以下公式計算神經傳導速度：（d1–d2）/（t1–t2）。
1.6.5 組織學及透射電鏡觀察
術后 8 周完整切取各組實驗動物神經移植段（遠、近端均超過吻合口 1 mm）。取各組吻合口處寬 2 mm 的神經組織，行石蠟包埋切片，甲苯胺藍染色，光鏡下觀察，并通過圖像分析儀計算有髓神經纖維密度；另外制作 70 nm 厚超微電鏡切片，檸檬酸鉛及醋酸雙氧鈾染色后，透射電鏡下觀察有髓神經纖維結構；同時對 A、B 組行 OCT 包埋后，7 μm 厚冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察示蹤 CM-Dil-ADSCs 在再生神經內的生長情況。
1.7 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠脫細胞坐骨神經觀察
通過凍融聯合化學處理的大鼠脫細胞坐骨神經呈淡乳白色，略透明，兩端無軸突髓鞘膨出。與未作脫細胞處理的新鮮神經相比，外膜彈性、韌性基本一致，長度與直徑無明顯變化，延展性略有增加。HE 染色示，新鮮神經束膜纖維排列緊密；而脫細胞神經外膜呈紅染波浪狀排列，空隙內無細胞結構和組織碎片。見圖 1。
2.2 兔 ADSCs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代培養的細胞于 2 h 內逐漸貼壁，最初為類圓形，后逐漸呈短梭形或多角形；5 d 后細胞呈團簇生長，形成集落；9 d 后細胞貼覆生長緊密，融合達 90% 以上，進行傳代。隨著傳代次數增加，細胞生長速度變快，第 3 代后細胞形態趨于一致，呈漩渦樣生長。第 3 代生長良好的細胞經成骨誘導 7 d 后，細胞逐漸短縮，呈短梭形并趨于方形，周邊可見零星的細胞外基質沉淀；誘導 21 d 細胞體積逐漸增大堆積，細胞外可見大量片狀及斑塊狀基質沉淀；誘導 28 d 茜素紅染色可見細胞內有大量紅色鈣結節。第 3 代生長良好的 ADSCs 經成脂誘導 5 d 時，細胞質內出現細小的脂滴；誘導 12 d 脂滴融合形成大脂泡，細胞體積增大，由長梭形變成圓形或多邊形；誘導 21 d 油紅 O 染色示脂泡染成橘紅色。見圖 2。
2.3 PRP 對 ADSCs 增殖影響及誘導分化觀察
血球板計算顯示，兩步離心法提取的 PRP 中血小板濃度是全血的 4.15 倍。MTT 法檢測示，隨培養時間延長，2～5 組細胞增殖呈逐漸上升趨勢，1 組細胞增殖呈逐漸下降趨勢；6 組細胞則先增殖，2 d 達峰值后下降。培養 2～4 d A 值比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
光鏡觀察示，ADSCs 經成類雪旺細胞預誘導培養基誘導 3 d 后，細胞質收縮，細胞體積逐漸變小；更換成 20%PRP 誘導 7 d 后，細胞體積明顯縮小，細胞質周圍形成凸起，呈雙極或多極樣。行神經細胞特異性蛋白 S-100 免疫熒光染色后，鏡下可觀察到細胞呈綠色熒光。見圖 4。
2.4 兔 ADSCs 熒光標記觀察
ADSCs 經 CM-Dil 標記后于熒光顯微鏡下觀察呈亮紅色，細胞標記率達 90% 以上；標記細胞傳代后細胞增殖良好，傳至第 3 代后熒光稍衰減。見圖 5。
2.5 兔面神經缺損修復觀察
2.5.1 一般情況
術后各組實驗動物均存活，飲食活動正常，術后 1 周切口愈合良好，無感染。健側上唇與面正中線成角 θ 角為（79.9±5.3）°。術后 1 周各組實驗動物左側上唇均明顯偏斜，A、B、C、D 組 θ 角分別為（53.4±2.5）、（54.0±2.6）、（53.7±2.4）、（53.0±2.1）°，與健側比較差異均有統計學意義（P<0.05）；術后 8 周 θ 角分別為（61.9±4.7）、（56.8±4.2）、（54.6±3.8）、（63.8±5.8）°，與健側及術后 1 周比較差異有統計學意義（P<0.05），其中 A、D 組上唇偏斜恢復程度較大，D 組恢復情況最佳且接近健側，B 組部分改善，C 組改善不明顯。術后 8 周大體觀察，各組動物左側面神經上頰支完整性及連續性均好，未形成神經瘤及明顯膨大，移植神經表面均有不同程度血管膜覆蓋，與周圍肌肉無明顯粘連。
2.5.2 神經電生理檢測
術后 4、8 周，各組均可引出動作電位，且與健側相比，潛伏期延長，波幅降低，神經傳導速度隨恢復期延長均增快。A、D 組神經傳導速度均顯著快于 B、C 組，B 組快于 C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后 4、8 周各組神經傳導速度比較（n=8，m/s，
）
Table1.
Comparison of nerve conduction velocity between groups at 4 and 8 weeks after operation (n=8, m/s,
)
2.5.3 組織學及透射電鏡觀察
術后 8 周熒光顯微鏡觀察示，A 組神經移植遠、近端橫斷面均可見大量標記 CM-Dil 的 ADSCs 通過，B 組通過細胞相對較少。見圖 6。甲苯胺藍染色示，A、B、C、D 組有髓神經纖維密度分別為（19 560.125±914.978）、（16 420.5±902.876）、（14 841.875±871.01）、（19 900.75±949.358）個/mm2，A、D 組均顯著高于 B、C 組，B 組高于 C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。透射電鏡觀察示，A 組再生神經內有髓神經纖維髓鞘管腔直徑較大，壁相對較厚，形態較規則；B、C 組髓鞘直徑小，板層壁薄，形態相對不規則，無髓神經纖維較多，B、C 組間無明顯區別；D 組有髓神經纖維較成熟，密集均勻分布，髓鞘直徑大，壁較厚，接近正常神經。見圖 7。
圖1
大鼠脫細胞神經 HE 染色觀察（×200）
a. 脫細胞處理前；b. 脫細胞處理后
Figure1. HE staining observation of acellular sciatic nerve of rats (×200)a. Before decellularized; b. After decellularized
圖2
兔 ADSCs 形態學觀察及成骨、成脂誘導鑒定（倒置相差顯微鏡×200）
a. 原代細胞培養 5 d；b. 第 3 代細胞形態；c. 成骨誘導 21 d 細胞形態；d. 成骨誘導 28 d 茜素紅染色；e. 成脂誘導 12 d 細胞形態；f. 成脂誘導 21 d 油紅 O 染色
Figure2. Morphological observation and osteogenic and adipogenic inductions of rabbit ADSCs (Inverted phase contrast microscope×200)a. Primary cells cultured for 5 days; b. The morphology of the 3rd generation cells; c. The morphology after osteogenic induction for 21 days; d. Alizarin red staining at 28 days after osteogenic induction; e. The morphology after adipogenic induction for 12 days; f. Oil red O staining at 21 days after adipogenic induction
圖3
MTT 法檢測 PRP 對 ADSCs 的增殖影響
Figure3.
The effect of PRP on the proliferation of ADSCs by MTT
圖4
PRP 對 ADSCs 成類雪旺細胞誘導觀察
a. 誘導 5 d 細胞質呈雙極或多極樣改變（×200）；b. 誘導后 S-100 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200）
Figure4. Induction of ADSCs to Schwann-like cells by PRPa. The cytoplasm was bipolar or multipolar after 5 days of induction (×200); b. Observation of S-100 immunofluorescence staining after induction (Fluorescence microscope×200)
圖5
ADSCs 經 CM-Dil 標記后熒光顯微鏡觀察（×100）
a. 標記后培養 24 h；b. 標記后細胞傳至第 3 代
Figure5. Fluorescence microscope observation of ADSCs labelled with CM-Dil (×100)a. After 24 hours of labelling; b. After the labelling, the cells passaged to the 3rd generation
圖6
術后 8 周 A、B 組神經移植體吻合處近端橫斷面熒光標記細胞觀察（熒光顯微鏡×200）
a. A 組；b. B 組
Figure6. The fluorescence-labelled cells at the proximal end of the anastomosis of nerve grafts in groups A and B at 8 weeks after operation (Fluorescence microscope×200)a. Group A; b. Group B
圖7
術后 8 周各組神經移植段遠端透射電鏡觀察（×20k）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure7. Transmission electron microscope observation of the distal segments of the nerve grafts at 8 weeks after operation (×20k)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
3 討論
通過大量實驗及臨床研究證明，自體神經移植修復周圍神經損傷可獲得良好效果。但切取自體神經會造成供區損傷，同時尋找與損傷神經長度、直徑匹配的神經非常困難。所以尋找一種能夠代替自體神經修復神經缺損的材料，是目前該領域研究難點。大量研究顯示，同種異體神經經脫細胞處理后免疫原性低、相容性好，能夠不同程度地修復神經損傷[10]；但同種異體神經來源也有限，所以近年來主要研究方向已由同種異體神經轉至異種神經。異種神經來源廣泛，經化學及凍融等處理后修復神經缺損，可獲得類似同種異體神經修復效果[11]。但處理后的異種神經移植體缺乏神經營養因子、神經再生必需的雪旺細胞和細胞外基質[12-13]。所以為了模擬自體神經修復原理及生物特性，需要采用組織工程學將支持細胞、神經營養因子及細胞外基質與異種神經有效結合，以期更好地發揮修復作用。
Zuk 等[14]最早從人脂肪組織中分離出 ADSCs，在體外培養下該細胞增殖能力強，并具有多向分化能力，在不同誘導條件下可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、心肌細胞、上皮細胞及神經細胞等[15]。PRP 是通過離心全血后得到的血小板濃縮物，含有大量生長因子，如 PDGF、IGF、EGF、VEGF、TGF-β 等，激活后能釋放出大量高濃度生長因子[16-17]。而這些生長因子單獨或聯合應用時能刺激干細胞增殖、分化、組織修復，且 PRP 含有很多抑菌和殺菌蛋白[18-21]，對各種創面起保護作用。所以 PRP 為組織工程修復重建提供了必需的生長因子，同時又創造了有利的微環境。有研究表明，PRP 中的多種生長因子能夠克服外源性神經生長因子的不足，有效促進周圍神經損傷的修復[22-23]。
本研究利用組織工程原理和方法，體外培養了兔 ADSCs 并擴增純化，經多次離心法獲取的自體 PRP 中血小板濃度是全血的 4.15 倍，具有高效活性。通過細胞增殖曲線發現，20% PRP 對 ADSCs 的增殖效果最明顯，應用 PRP 對其誘導可分化成類雪旺細胞；由于 ADSCs 本身攜帶決定雪旺細胞的基因座，所以體外培養是通過去甲基化聯合 PRP 誘導成雪旺細胞[24]。通過對脫細胞異種神經大體及 HE 染色觀察顯示，利用凍融聯合化學萃取的方式處理與兔面神經頰支粗細相配的大鼠坐骨神經，能夠有效去除細胞及細胞成分，同時只保留膠原及纖維構成的神經基膜管，可作為異種神經移植體。CM-Dil 作為一種活細胞染色劑能夠有效地與細胞膜結合，同時保證細胞的活性功能，隨細胞分裂進入子代細胞，熒光效果穩定，具有良好的示蹤性。本實驗將 CM-Dil-ADSCs 進行連續培養后，細胞的增殖能力仍良好，且形態與原代相似，通過微量定點注射的方式與脫細胞異種神經復合后，聯合自體 PRP 共同修復兔 1 cm 面神經缺損。通過比較神經電生理、神經傳導速度、再生神經有髓神經纖維數及結構，以及術后上唇與面正中線成角，發現早期應用 PRP 聯合復合 ADSCs 的脫細胞異種神經移植組與自體神經移植組的各項結果差異無統計學意義，獲得了較好的修復效果。而單純聯合 ADSCs 的脫細胞異種神經移植組及單純脫細胞異種神經移植組雖然也獲得了一定的修復效果，但與前者比較還是存在明顯不足。
綜上述，采用 PRP 注射聯合復合 ADSCs 的脫細胞異種神經修復 1 cm 長兔面神經缺損可獲得較好早期療效，且修復效果與自體神經修復效果相近。但由于 PRP 成分較復雜，各種因子釋放速度較快，持續作用時間有限，活性僅能維持 5～8 d。所以在局部應用 PRP 時，如何保證最有效作用濃度和最優作用時間，達到最佳效果，是需要進一步探討的內容。
