引用本文： 陳云慧, 余曙光, 吳巧鳳, 唐勇, 姜岑, 莊志奇, 趙娜, 黃彪, 謝璐霜. BMSCs 條件培養液誘導小膠質細胞分泌精氨酸酶 1 的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(12): 1500-1505. doi: 10.7507/1002-1892.201710038 復制
BMSCs 是一種能夠自我復制和多向分化的非造血多能干細胞[1]。研究證實 BMSCs 移植治療神經系統疾病可有效恢復神經功能，其不僅可替代損傷的神經元、分泌多種神經營養和保護因子促進神經功能的康復[2]，還可作用于神經膠質細胞，調節膠質細胞的功能[3]。小膠質細胞（microglia，MGs）是中樞重要的免疫調控細胞，參與多種急慢性中樞疾病的損傷和修復過程。BMSCs 移植可能通過調節 MGs 介導的免疫炎性反應發揮神經保護作用[4]。精氨酸酶 1（arginase 1，Arg1）是機體氮代謝的關鍵酶，參與調控中樞神經系統功能。Arg1 的表達與膠質細胞的激活密切相關，神經損傷應激時膠質細胞活化后，可分泌 Arg1 參與神經保護功能[5-7]。BMSCs 是否可通過調控 MGs 表達 Arg1，從而影響中樞精氨酸代謝和神經功能，目前鮮見報道。因此，本研究擬采用 BMSCs 條件培養液誘導 MGs 分泌 Arg1，觀察 BMSCs 對 MGs 的激活及對 Arg1 分泌的影響，為探索 BMSCs 移植治療神經系統疾病的機制提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生 3 日內清潔級 SD 大鼠 10 只，體質量 6～12 g，雌雄不限；4 周齡清潔級 SD 大鼠 10 只，體質量 90～100 g，雌雄各半；由成都達碩實驗動物有限公司提供。
DMEM/F12 培養基、DMEM 培養基、FBS、0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO 公司，美國）；青鏈霉素雙抗（HyClone 公司，美國）；山羊抗大鼠 Iba1（ARG 公司，美國）；兔抗大鼠 Arg1、兔抗大鼠 Vimentin、小鼠抗羊二抗、羊抗兔二抗、Alexa Fluor 488 小鼠抗兔二抗、Cy3 兔抗山羊二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；兔抗 β-actin 多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；裂解液、蛋白酶抑制劑、Acr、Tris、EDTA、TEMED、SDS（碧云天生物技術研究所）。
0.2 mm 聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、電泳儀、半干轉膜器、凝膠成像系統（Bio-Rad 公司，美國）；T-75 細胞培養瓶、6 孔或 96 孔培養板、移液槍（Eppendorf 公司，德國）；倒置熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；解剖顯微鏡（Olympus 公司，日本）；LAS-3000 化學發光成像系統（FUJIFILM 公司，日本）；Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 BMSCs 分離培養及鑒定
取 4 周齡 SD 大鼠 10 只，10% 水合氯醛麻醉，斷頸處死，75% 乙醇浸泡 15～20 min，迅速剪開兩側后肢皮膚及肌肉，取出股骨及脛骨，PBS 沖洗 3 遍；移入含 DMEM 培養液的培養皿中，移除兩端骨骺，暴露骨髓腔，1 000 μL 移液槍沖洗，將骨髓沖入培養皿；將培養液移入離心管，以離心半徑 5 cm、1 000 r/min 離心 10 min。棄去上清液，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞，以 100 個/mL 密度接種于 96 孔培養板（每孔 100 μL）和 75 cm2 培養瓶（每瓶 10 mL），37℃、5%CO2 及飽和濕度培養箱培養，每 5～7 天更換 1 次培養基。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和密度，當細胞密度達 1×106個/mL 時，取 96 孔培養板培養細胞，參照文獻[8]方法，采用 Vimentin 免疫熒光染色法鑒定。收集培養瓶內 BMSCs 培養液待用。
1.3 MGs 分離培養及鑒定
取新生 3 日內 SD 大鼠 10 只，75% 乙醇浸泡 15～20 min，斷頸取頭，取出全腦，解剖顯微鏡下將腦膜及血管剝離干凈，在培養皿內用細胞剪將大腦皮質剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小，加入 10 mL 0.25% 胰蛋白酶，放入 37℃ 孵箱，消化 15 min；300 目篩網過濾，收集細胞濾液，以離心半徑 5 cm、1 000 r/min 離心 10 min。棄去上清液，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞，以 100 個/mL 密度接種于預先涂布多聚賴氨酸的 75 cm2 培養瓶中，37℃、5%CO2 及飽和濕度培養箱培養。每 2～3 天換液 1 次，培養 10～14 d倒置相差顯微鏡觀察細胞出現明顯分層后，將培養瓶置于 200 r/min 搖床上振搖 4 h。收集含 MGs 的培養液，同上法離心 10 min；棄上清，沉淀加入 DMEM/F12 培養液，以 100 個/mL 密度接種于預先涂布多聚賴氨酸的 96 孔或 6 孔培養板，37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和密度，當細胞密度達 1×106 個/mL 時，采用 BMSCs 培養液干預 MGs 48 h。取 96 孔培養板培養 MGs，參照文獻[9]方法，采用 Iba1 免疫熒光染色法鑒定。
1.4 BMSCs 條件培養液的制備及實驗分組
選取對數生長期的 BMSCs，待融合度達 80%～90% 時，血清饑餓 24 h。采用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以 1×106 個/mL 密度接種于 75 cm2 培養瓶中，加入 10 mL 無血清 DMEM/F12 培養液培養 24 h 后收集上清，用 0.22 μm 濾膜過濾，即得 BMSCs 條件培養液，–20℃ 保存。
取細胞融合率為 85% 的原代 MGs 分為兩組，實驗組使用含 1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和 10 μg/L BMSCs 條件培養液的 DMEM/F12 培養基培養，對照組使用不含血清的普通培養基（含 1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基）培養。取密度為100 個/mL的原代MGs懸液，以2 mL/孔接種于 6 孔培養板，按分組添加相應培養基后，置于 37℃、5%CO2 及飽和濕度細胞培養箱中培養 48 h 后，收集培養 MGs 行以下觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 倒置相差顯微鏡下觀察 MGs 生長情況及形態
倒置相差顯微鏡下觀察并比較兩組 MGs 的生長情況及形態。
1.5.2 免疫熒光染色檢測 MGs 中 Iba1 蛋白表達
棄培養液，室溫 PBS 清洗 3 次，10 min/次；37℃、4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；3% H2O2 37℃ 下透膜 15 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；5% 牛血清白蛋白 37℃ 下封閉 30 min，甩干不清洗；加入山羊抗大鼠 Iba1，4℃ 冰箱內孵育過夜；PBS 清洗 3 次，10 min/次；滴加 Cy3 兔抗山羊二抗 100 μL，37℃ 下避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，10 min/次；DAPI 染液復染細胞核 10 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；抗熒光淬滅劑封片處理后，倒置熒光顯微鏡觀察 MGs 中 Iba1 的表達，并在 10×10 倍顯微鏡下隨機選取 5 個視野，計數 Iba1 陽性細胞，取均值。實驗重復 3 次。
1.5.3 免疫熒光染色觀測 MGs 中 Iab1 和 Arg1 雙陽性細胞的表達
棄培養液，方法同前進行封閉后，加入一抗山羊抗大鼠 Iba1、兔抗大鼠 Arg1 100 μL，4℃ 冰箱內孵育過夜；PBS 清洗 3 次，10 min/次；滴加 FITC 標記的 Alexa Fluor 488 小鼠抗兔二抗、Cy3 兔抗山羊二抗 100 μL，37℃ 下避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，10 min/次；DAPI 染液復染細胞核 10 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；抗熒光淬滅劑封片處理后，倒置熒光顯微鏡觀察 Iba1 與 Arg1 兩種蛋白在細胞中的表達情況。其中紅色熒光為 Iba1 陽性細胞（MGs），綠色熒光為 Arg1 陽性細胞，若細胞同時表達紅色和綠色熒光則提示為 Arg1 陽性的 MGs。并在 10 ×10 倍顯微鏡下隨機選取 5 個視野，計數 Iba1 和 Arg1 雙陽性細胞，取均值。實驗重復 3 次。
1.5.4 Western blot 檢測 MGs 中 Arg1 蛋白表達
棄培養液，預冷 PBS 清洗 2 次；加入含蛋白酶抑制劑裂解液（50 μL/孔）冰上裂解 30 min，細胞刷掛取細胞；收集細胞裂解液于 1 mL 離心管，冰浴 30 min，4℃ 以離心半徑 5 cm、15 000 r/min 離心 10 min，回收上清蛋白溶液。行 BCA 法蛋白質定量檢測。以 15 μL/孔對蛋白質行 SDS-PAGE 電泳分離，25 V、20 min 半干轉至 PVDF 膜，37℃、5% 脫脂牛奶封閉 1 h，加入一抗兔抗 β-actin、兔抗大鼠 Arg1 300 μL，4℃ 冰箱內孵育過夜；TBST 清洗 3 次，10 min/次；加入羊抗兔二抗 300 μL，室溫孵育 2 h，TBST 清洗 3 次，10 min/次；ECL 反應液孵育 4 min，透明薄膜密封，以 LAS-3000 化學發光成像系統進行曝光檢測。Image Lab 軟件分析吸光度（A）值。實驗重復 3 次。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代 BMSCs 培養 1～3 d 呈圓形，細胞排列疏松；3 d 后細胞呈長梭形，胞體狹窄，胞核區略透光；7 d 后細胞伸出單個或多個細長突起；約 14 d 進入對數生長期。見圖 1a。Vimentin 免疫熒光染色示，98% 以上細胞呈陽性反應，綠色熒光表達于細胞內。見圖 1b。
2.2 MGs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代 MGs 培養 14 d 時呈明顯分層生長狀態。經搖床機械分離后，收集含 MGs 的培養液再接種，培養 1～2 d 后，細胞體積較小，呈圓形；3 d 后細胞體積明顯增大，呈圓形，胞核區略透光；7 d 后細胞伸出單個或多個細長突起；約 21 d 進入對數生長期。見圖 2a。Iba1 免疫熒光染色示，約 80% 細胞呈陽性反應，紅色熒光表達于細胞內。見圖 2b。
2.3 BMSCs 條件培養液刺激后 MGs 激活的觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，實驗組 MGs 較對照組胞體增大、突起變短、呈阿米巴樣變化，提示 BMSCs 可激活 MGs。見圖 3。
2.4 免疫熒光染色檢測 MGs 中 Iba1 和 Arg1 蛋白表達
Iba1 免疫熒光染色示，對照組約 60% 細胞呈 Iba1 染色陽性，實驗組約 99% 以上細胞呈 Iba1 反應陽性。見圖 4。實驗組 Iba1 陽性細胞數為（125.778±7.633）個/視野，顯著高于對照組的（42.444±5.337）個/視野，比較差異有統計學意義（t=0.007，P=0.000）。
免疫熒光雙標染色示，Iba1 和 Arg1 均表達于細胞質中。見圖 5。實驗組 Iba1 和 Arg1 雙陽性細胞數為（72.000±1.764）個/視野，顯著高于對照組的（24.111±1.900）個/視野，比較差異有統計學意義（t=0.007，P=0.000）。
2.5 Western blot 檢測 MGs 中 Arg1 蛋白表達
Western blot 檢測示，實驗組 Arg1 蛋白相對表達量為 1.015±0.048，顯著高于對照組的 0.569±0.061，比較差異有統計學意義（t=0.001，P=0.000）。見圖 6。
圖1
原代 BMSCs 形態學觀察及鑒定
a. 培養 14 d 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×400）；b. Vimentin 免疫熒光染色鑒定（倒置熒光顯微鏡×400）
Figure1. Morphology observation and identification of primary BMSCsa. Morphology observation after 14 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400); b. Identification of Vimentin immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×400)
圖2
原代 MGs 形態學觀察及鑒定
a. 培養 21 d 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×400）；b. Iba1 免疫熒光染色鑒定（倒置熒光顯微鏡×400）
Figure2. Morphology observation and identification of primary MGsa. Morphology observation after 21 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400); b. Identification of Iba1 immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×400)
圖3
BMSCs 條件培養液激活 MGs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure3. Morphology observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted phase contrast microscope×100)a. Control group; b. Experimental group
圖4
BMSCs 條件培養液激活 MGs 后 Iba1 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure4. Ibal immunofluorescence staining observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted fluorescence microscope×100)a. Control group; b. Experimental group
圖5
BMSCs 條件培養液激活 MGs 后 Iba1 與 Arg1 免疫熒光雙標染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure5. Ibal and Arg1 double-labelling immunofluorescence staining observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted fluorescence microscope×100)a. Control group; b. Experimental group
圖6
Western blot 檢測 BMSCs 條件培養液激活 MGs 表達 Arg1 蛋白
1：對照組；2：實驗組
Figure6. Arg1 protein expression of MGs activated by BMSCs conditioned medium detected by Western blot1: Control group; 2: Experimental group
3 討論
干細胞具有自我更新和分化的特性，可用于修復多種損傷性疾病，臨床運用前景廣泛。BMSCs 是較早研究并應用于臨床的干細胞，其具有來源廣泛、取材容易、體外易于培養并能長期保持多向分化的能力[10]。目前，研究已證實 BMSCs 除可直接影響神經元的存活和功能外，對膠質細胞也有一定調控作用。Gao 等[11]發現 BMSCs 可降低缺血缺氧性損傷后星形膠質細胞的損傷和凋亡，可釋放 BDNF、VEGF、FGF 等激活 MAPK 信號通路，促進星形膠質細胞的存活和增殖。Shen 等[12]研究表明 BMSCs 在腦損傷局部可激活星形膠質細胞，活化的星形膠質細胞可促進大腦的可塑性和神經元的修復。提示 BMSCs 多方面調控膠質細胞，既可降低星形膠質細胞的損傷，又可增強星形膠質細胞對腦損傷的保護。
MGs 是神經膠質細胞的一種，是中樞神經系統中的第一道也是最主要的一道免疫防線，數量約占中樞細胞的 10%，參與調控多種神經功能。當腦組織發生損傷時，MGs 可向損傷部位募集，突起伸向損傷部位，對損傷部位發揮吞噬作用。激活的 MGs 發生形態改變，呈阿米巴樣變形，胞體增大、突起變短，突起涉及范圍更小，能更好地吞噬清除炎性損傷物質及釋放抗炎因子[13]，并通過清道夫作用及分泌功能消除與重塑神經突觸[14]。Shinozaki 等[15]發現采用 MGs 激活抑制劑，可明顯降低 MGs 促進星形膠質細胞激活的功能，提示 MGs 的激活是其發揮免疫調控和中樞保護作用的重要前提。我們的研究發現，與對照組相比，BMSCs 條件培養液可明顯促進 MGs 的激活，其胞體增大、突起變短、呈阿米巴樣變化，Iba1 陽性細胞數顯著增加，表明激活 MGs 可能是 BMSCs 移植治療腦損傷等中樞神經系統疾病的機制之一。其作用機制與 BMSCs 條件培養液內含細胞因子、趨化因子、神經營養因子、神經遷移因子等相關，這些物質不僅可直接保護神經元，還可通過激活膠質細胞間接支持神經元的活性和功能[16]。
Arg1 存在于細胞質中，是尿素循環的重要參與者，主要在肝組織中表達，也在腦組織中表達。在細胞因子和抗原的刺激下，Arg1 可在多種組織或細胞類型中表達。研究發現 Arg1 參與中樞神經系統多種神經保護作用，分解精氨酸，促進氨等氧化應激產物的分解和排泄；參與環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）調控 BDNF、神經營養因子 3 等神經營養因子表達，影響神經損傷后髓鞘的再生；增強 cAMP/環磷腺苷效應元件結合蛋白復合體誘導的神經軸突延長[17]。Arg1 也參與中樞多種疾病的發生、發展和轉歸。腦缺血性損傷時，L-精氨酸的減少可代償性地導致損傷局部 Arg1 和一氧化碳合成酶的分泌，大量星形膠質細胞和巨噬細胞在損傷局部聚集并分泌 Arg1，而損傷局部 Arg1 的增加是 cAMP 信號環路促進神經再生的重要途徑[7]。MGs 是中樞 Arg1 的重要來源，活化的 MGs 可表達 Arg1，表達 Arg1 的 MGs 在老年癡呆病理性 Aβ 斑塊附近聚集并表達 BDNF、IGF-1 等神經營養因子，促進受損神經元的修復[18]。我們的研究發現，BMSCs 條件培養液可促進活化后的 MGs 表達 Arg1。其作用機制可能與激活的 MGs 在不同刺激因子作用下表現為不同極化狀態有關，激活的 MGs 在 IL-4、IL-10 等細胞因子作用下，通過 TLr4 信號通路向 M2 方向極化而表達 Arg1，發揮神經免疫調控和神經保護作用[19]。
綜上述，本研究對 BMSCs 條件培養液影響 MGs 的活化及活化后 MGs 表達 Arg1 的功能進行了初步探索。提示 BMSCs 移植除了直接分化補償損傷的神經元和神經膠質細胞外，還可與 MGs 等神經膠質細胞進行互通，影響 MGs 的功能。但不同濃度梯度的 BMSCs 條件培養液對 MGs 的活化及活化后 MGs 表達 Arg1 的作用效果，有待進一步實驗研究明確。
BMSCs 是一種能夠自我復制和多向分化的非造血多能干細胞[1]。研究證實 BMSCs 移植治療神經系統疾病可有效恢復神經功能，其不僅可替代損傷的神經元、分泌多種神經營養和保護因子促進神經功能的康復[2]，還可作用于神經膠質細胞，調節膠質細胞的功能[3]。小膠質細胞（microglia，MGs）是中樞重要的免疫調控細胞，參與多種急慢性中樞疾病的損傷和修復過程。BMSCs 移植可能通過調節 MGs 介導的免疫炎性反應發揮神經保護作用[4]。精氨酸酶 1（arginase 1，Arg1）是機體氮代謝的關鍵酶，參與調控中樞神經系統功能。Arg1 的表達與膠質細胞的激活密切相關，神經損傷應激時膠質細胞活化后，可分泌 Arg1 參與神經保護功能[5-7]。BMSCs 是否可通過調控 MGs 表達 Arg1，從而影響中樞精氨酸代謝和神經功能，目前鮮見報道。因此，本研究擬采用 BMSCs 條件培養液誘導 MGs 分泌 Arg1，觀察 BMSCs 對 MGs 的激活及對 Arg1 分泌的影響，為探索 BMSCs 移植治療神經系統疾病的機制提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生 3 日內清潔級 SD 大鼠 10 只，體質量 6～12 g，雌雄不限；4 周齡清潔級 SD 大鼠 10 只，體質量 90～100 g，雌雄各半；由成都達碩實驗動物有限公司提供。
DMEM/F12 培養基、DMEM 培養基、FBS、0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO 公司，美國）；青鏈霉素雙抗（HyClone 公司，美國）；山羊抗大鼠 Iba1（ARG 公司，美國）；兔抗大鼠 Arg1、兔抗大鼠 Vimentin、小鼠抗羊二抗、羊抗兔二抗、Alexa Fluor 488 小鼠抗兔二抗、Cy3 兔抗山羊二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；兔抗 β-actin 多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；裂解液、蛋白酶抑制劑、Acr、Tris、EDTA、TEMED、SDS（碧云天生物技術研究所）。
0.2 mm 聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、電泳儀、半干轉膜器、凝膠成像系統（Bio-Rad 公司，美國）；T-75 細胞培養瓶、6 孔或 96 孔培養板、移液槍（Eppendorf 公司，德國）；倒置熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國）；解剖顯微鏡（Olympus 公司，日本）；LAS-3000 化學發光成像系統（FUJIFILM 公司，日本）；Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 BMSCs 分離培養及鑒定
取 4 周齡 SD 大鼠 10 只，10% 水合氯醛麻醉，斷頸處死，75% 乙醇浸泡 15～20 min，迅速剪開兩側后肢皮膚及肌肉，取出股骨及脛骨，PBS 沖洗 3 遍；移入含 DMEM 培養液的培養皿中，移除兩端骨骺，暴露骨髓腔，1 000 μL 移液槍沖洗，將骨髓沖入培養皿；將培養液移入離心管，以離心半徑 5 cm、1 000 r/min 離心 10 min。棄去上清液，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞，以 100 個/mL 密度接種于 96 孔培養板（每孔 100 μL）和 75 cm2 培養瓶（每瓶 10 mL），37℃、5%CO2 及飽和濕度培養箱培養，每 5～7 天更換 1 次培養基。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和密度，當細胞密度達 1×106個/mL 時，取 96 孔培養板培養細胞，參照文獻[8]方法，采用 Vimentin 免疫熒光染色法鑒定。收集培養瓶內 BMSCs 培養液待用。
1.3 MGs 分離培養及鑒定
取新生 3 日內 SD 大鼠 10 只，75% 乙醇浸泡 15～20 min，斷頸取頭，取出全腦，解剖顯微鏡下將腦膜及血管剝離干凈，在培養皿內用細胞剪將大腦皮質剪碎至 1 mm×1 mm×1 mm 大小，加入 10 mL 0.25% 胰蛋白酶，放入 37℃ 孵箱，消化 15 min；300 目篩網過濾，收集細胞濾液，以離心半徑 5 cm、1 000 r/min 離心 10 min。棄去上清液，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基重懸細胞，以 100 個/mL 密度接種于預先涂布多聚賴氨酸的 75 cm2 培養瓶中，37℃、5%CO2 及飽和濕度培養箱培養。每 2～3 天換液 1 次，培養 10～14 d倒置相差顯微鏡觀察細胞出現明顯分層后，將培養瓶置于 200 r/min 搖床上振搖 4 h。收集含 MGs 的培養液，同上法離心 10 min；棄上清，沉淀加入 DMEM/F12 培養液，以 100 個/mL 密度接種于預先涂布多聚賴氨酸的 96 孔或 6 孔培養板，37℃、5% CO2 及飽和濕度培養箱培養。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態和密度，當細胞密度達 1×106 個/mL 時，采用 BMSCs 培養液干預 MGs 48 h。取 96 孔培養板培養 MGs，參照文獻[9]方法，采用 Iba1 免疫熒光染色法鑒定。
1.4 BMSCs 條件培養液的制備及實驗分組
選取對數生長期的 BMSCs，待融合度達 80%～90% 時，血清饑餓 24 h。采用胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以 1×106 個/mL 密度接種于 75 cm2 培養瓶中，加入 10 mL 無血清 DMEM/F12 培養液培養 24 h 后收集上清，用 0.22 μm 濾膜過濾，即得 BMSCs 條件培養液，–20℃ 保存。
取細胞融合率為 85% 的原代 MGs 分為兩組，實驗組使用含 1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和 10 μg/L BMSCs 條件培養液的 DMEM/F12 培養基培養，對照組使用不含血清的普通培養基（含 1×105 U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基）培養。取密度為100 個/mL的原代MGs懸液，以2 mL/孔接種于 6 孔培養板，按分組添加相應培養基后，置于 37℃、5%CO2 及飽和濕度細胞培養箱中培養 48 h 后，收集培養 MGs 行以下觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 倒置相差顯微鏡下觀察 MGs 生長情況及形態
倒置相差顯微鏡下觀察并比較兩組 MGs 的生長情況及形態。
1.5.2 免疫熒光染色檢測 MGs 中 Iba1 蛋白表達
棄培養液，室溫 PBS 清洗 3 次，10 min/次；37℃、4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；3% H2O2 37℃ 下透膜 15 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；5% 牛血清白蛋白 37℃ 下封閉 30 min，甩干不清洗；加入山羊抗大鼠 Iba1，4℃ 冰箱內孵育過夜；PBS 清洗 3 次，10 min/次；滴加 Cy3 兔抗山羊二抗 100 μL，37℃ 下避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，10 min/次；DAPI 染液復染細胞核 10 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；抗熒光淬滅劑封片處理后，倒置熒光顯微鏡觀察 MGs 中 Iba1 的表達，并在 10×10 倍顯微鏡下隨機選取 5 個視野，計數 Iba1 陽性細胞，取均值。實驗重復 3 次。
1.5.3 免疫熒光染色觀測 MGs 中 Iab1 和 Arg1 雙陽性細胞的表達
棄培養液，方法同前進行封閉后，加入一抗山羊抗大鼠 Iba1、兔抗大鼠 Arg1 100 μL，4℃ 冰箱內孵育過夜；PBS 清洗 3 次，10 min/次；滴加 FITC 標記的 Alexa Fluor 488 小鼠抗兔二抗、Cy3 兔抗山羊二抗 100 μL，37℃ 下避光孵育 1 h；PBS 清洗 3 次，10 min/次；DAPI 染液復染細胞核 10 min，PBS 清洗 3 次，10 min/次；抗熒光淬滅劑封片處理后，倒置熒光顯微鏡觀察 Iba1 與 Arg1 兩種蛋白在細胞中的表達情況。其中紅色熒光為 Iba1 陽性細胞（MGs），綠色熒光為 Arg1 陽性細胞，若細胞同時表達紅色和綠色熒光則提示為 Arg1 陽性的 MGs。并在 10 ×10 倍顯微鏡下隨機選取 5 個視野，計數 Iba1 和 Arg1 雙陽性細胞，取均值。實驗重復 3 次。
1.5.4 Western blot 檢測 MGs 中 Arg1 蛋白表達
棄培養液，預冷 PBS 清洗 2 次；加入含蛋白酶抑制劑裂解液（50 μL/孔）冰上裂解 30 min，細胞刷掛取細胞；收集細胞裂解液于 1 mL 離心管，冰浴 30 min，4℃ 以離心半徑 5 cm、15 000 r/min 離心 10 min，回收上清蛋白溶液。行 BCA 法蛋白質定量檢測。以 15 μL/孔對蛋白質行 SDS-PAGE 電泳分離，25 V、20 min 半干轉至 PVDF 膜，37℃、5% 脫脂牛奶封閉 1 h，加入一抗兔抗 β-actin、兔抗大鼠 Arg1 300 μL，4℃ 冰箱內孵育過夜；TBST 清洗 3 次，10 min/次；加入羊抗兔二抗 300 μL，室溫孵育 2 h，TBST 清洗 3 次，10 min/次；ECL 反應液孵育 4 min，透明薄膜密封，以 LAS-3000 化學發光成像系統進行曝光檢測。Image Lab 軟件分析吸光度（A）值。實驗重復 3 次。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代 BMSCs 培養 1～3 d 呈圓形，細胞排列疏松；3 d 后細胞呈長梭形，胞體狹窄，胞核區略透光；7 d 后細胞伸出單個或多個細長突起；約 14 d 進入對數生長期。見圖 1a。Vimentin 免疫熒光染色示，98% 以上細胞呈陽性反應，綠色熒光表達于細胞內。見圖 1b。
2.2 MGs 形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代 MGs 培養 14 d 時呈明顯分層生長狀態。經搖床機械分離后，收集含 MGs 的培養液再接種，培養 1～2 d 后，細胞體積較小，呈圓形；3 d 后細胞體積明顯增大，呈圓形，胞核區略透光；7 d 后細胞伸出單個或多個細長突起；約 21 d 進入對數生長期。見圖 2a。Iba1 免疫熒光染色示，約 80% 細胞呈陽性反應，紅色熒光表達于細胞內。見圖 2b。
2.3 BMSCs 條件培養液刺激后 MGs 激活的觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，實驗組 MGs 較對照組胞體增大、突起變短、呈阿米巴樣變化，提示 BMSCs 可激活 MGs。見圖 3。
2.4 免疫熒光染色檢測 MGs 中 Iba1 和 Arg1 蛋白表達
Iba1 免疫熒光染色示，對照組約 60% 細胞呈 Iba1 染色陽性，實驗組約 99% 以上細胞呈 Iba1 反應陽性。見圖 4。實驗組 Iba1 陽性細胞數為（125.778±7.633）個/視野，顯著高于對照組的（42.444±5.337）個/視野，比較差異有統計學意義（t=0.007，P=0.000）。
免疫熒光雙標染色示，Iba1 和 Arg1 均表達于細胞質中。見圖 5。實驗組 Iba1 和 Arg1 雙陽性細胞數為（72.000±1.764）個/視野，顯著高于對照組的（24.111±1.900）個/視野，比較差異有統計學意義（t=0.007，P=0.000）。
2.5 Western blot 檢測 MGs 中 Arg1 蛋白表達
Western blot 檢測示，實驗組 Arg1 蛋白相對表達量為 1.015±0.048，顯著高于對照組的 0.569±0.061，比較差異有統計學意義（t=0.001，P=0.000）。見圖 6。
圖1
原代 BMSCs 形態學觀察及鑒定
a. 培養 14 d 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×400）；b. Vimentin 免疫熒光染色鑒定（倒置熒光顯微鏡×400）
Figure1. Morphology observation and identification of primary BMSCsa. Morphology observation after 14 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400); b. Identification of Vimentin immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×400)
圖2
原代 MGs 形態學觀察及鑒定
a. 培養 21 d 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×400）；b. Iba1 免疫熒光染色鑒定（倒置熒光顯微鏡×400）
Figure2. Morphology observation and identification of primary MGsa. Morphology observation after 21 days of culture (Inverted phase contrast microscope×400); b. Identification of Iba1 immunofluorescence staining (Inverted fluorescence microscope×400)
圖3
BMSCs 條件培養液激活 MGs 形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure3. Morphology observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted phase contrast microscope×100)a. Control group; b. Experimental group
圖4
BMSCs 條件培養液激活 MGs 后 Iba1 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure4. Ibal immunofluorescence staining observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted fluorescence microscope×100)a. Control group; b. Experimental group
圖5
BMSCs 條件培養液激活 MGs 后 Iba1 與 Arg1 免疫熒光雙標染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
a. 對照組；b. 實驗組
Figure5. Ibal and Arg1 double-labelling immunofluorescence staining observation of MGs activated by BMSCs conditioned medium (Inverted fluorescence microscope×100)a. Control group; b. Experimental group
圖6
Western blot 檢測 BMSCs 條件培養液激活 MGs 表達 Arg1 蛋白
1：對照組；2：實驗組
Figure6. Arg1 protein expression of MGs activated by BMSCs conditioned medium detected by Western blot1: Control group; 2: Experimental group
3 討論
干細胞具有自我更新和分化的特性，可用于修復多種損傷性疾病，臨床運用前景廣泛。BMSCs 是較早研究并應用于臨床的干細胞，其具有來源廣泛、取材容易、體外易于培養并能長期保持多向分化的能力[10]。目前，研究已證實 BMSCs 除可直接影響神經元的存活和功能外，對膠質細胞也有一定調控作用。Gao 等[11]發現 BMSCs 可降低缺血缺氧性損傷后星形膠質細胞的損傷和凋亡，可釋放 BDNF、VEGF、FGF 等激活 MAPK 信號通路，促進星形膠質細胞的存活和增殖。Shen 等[12]研究表明 BMSCs 在腦損傷局部可激活星形膠質細胞，活化的星形膠質細胞可促進大腦的可塑性和神經元的修復。提示 BMSCs 多方面調控膠質細胞，既可降低星形膠質細胞的損傷，又可增強星形膠質細胞對腦損傷的保護。
MGs 是神經膠質細胞的一種，是中樞神經系統中的第一道也是最主要的一道免疫防線，數量約占中樞細胞的 10%，參與調控多種神經功能。當腦組織發生損傷時，MGs 可向損傷部位募集，突起伸向損傷部位，對損傷部位發揮吞噬作用。激活的 MGs 發生形態改變，呈阿米巴樣變形，胞體增大、突起變短，突起涉及范圍更小，能更好地吞噬清除炎性損傷物質及釋放抗炎因子[13]，并通過清道夫作用及分泌功能消除與重塑神經突觸[14]。Shinozaki 等[15]發現采用 MGs 激活抑制劑，可明顯降低 MGs 促進星形膠質細胞激活的功能，提示 MGs 的激活是其發揮免疫調控和中樞保護作用的重要前提。我們的研究發現，與對照組相比，BMSCs 條件培養液可明顯促進 MGs 的激活，其胞體增大、突起變短、呈阿米巴樣變化，Iba1 陽性細胞數顯著增加，表明激活 MGs 可能是 BMSCs 移植治療腦損傷等中樞神經系統疾病的機制之一。其作用機制與 BMSCs 條件培養液內含細胞因子、趨化因子、神經營養因子、神經遷移因子等相關，這些物質不僅可直接保護神經元，還可通過激活膠質細胞間接支持神經元的活性和功能[16]。
Arg1 存在于細胞質中，是尿素循環的重要參與者，主要在肝組織中表達，也在腦組織中表達。在細胞因子和抗原的刺激下，Arg1 可在多種組織或細胞類型中表達。研究發現 Arg1 參與中樞神經系統多種神經保護作用，分解精氨酸，促進氨等氧化應激產物的分解和排泄；參與環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）調控 BDNF、神經營養因子 3 等神經營養因子表達，影響神經損傷后髓鞘的再生；增強 cAMP/環磷腺苷效應元件結合蛋白復合體誘導的神經軸突延長[17]。Arg1 也參與中樞多種疾病的發生、發展和轉歸。腦缺血性損傷時，L-精氨酸的減少可代償性地導致損傷局部 Arg1 和一氧化碳合成酶的分泌，大量星形膠質細胞和巨噬細胞在損傷局部聚集并分泌 Arg1，而損傷局部 Arg1 的增加是 cAMP 信號環路促進神經再生的重要途徑[7]。MGs 是中樞 Arg1 的重要來源，活化的 MGs 可表達 Arg1，表達 Arg1 的 MGs 在老年癡呆病理性 Aβ 斑塊附近聚集并表達 BDNF、IGF-1 等神經營養因子，促進受損神經元的修復[18]。我們的研究發現，BMSCs 條件培養液可促進活化后的 MGs 表達 Arg1。其作用機制可能與激活的 MGs 在不同刺激因子作用下表現為不同極化狀態有關，激活的 MGs 在 IL-4、IL-10 等細胞因子作用下，通過 TLr4 信號通路向 M2 方向極化而表達 Arg1，發揮神經免疫調控和神經保護作用[19]。
綜上述，本研究對 BMSCs 條件培養液影響 MGs 的活化及活化后 MGs 表達 Arg1 的功能進行了初步探索。提示 BMSCs 移植除了直接分化補償損傷的神經元和神經膠質細胞外，還可與 MGs 等神經膠質細胞進行互通，影響 MGs 的功能。但不同濃度梯度的 BMSCs 條件培養液對 MGs 的活化及活化后 MGs 表達 Arg1 的作用效果，有待進一步實驗研究明確。
