引用本文： 楊旅軍, 吳洪娟, 張明君, 謝思田, 葉丹彥, 唐世杰. 人羊膜活性皮膚替代物修復巨痣切除術后創面的可行性及療效研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(12): 1495-1499. doi: 10.7507/1002-1892.201707052 復制
目前，對于病損面積較大、自體皮膚可切取面積有限患者，可采用自體皮膚細胞構建活性皮膚替代物（living skin equivalent，LSE）修復創面[1-2]。常用構建方法為在植入真皮成纖維細胞的Ⅰ型膠原凝膠上接種表皮角化細胞，然后氣液面培養，進行表皮重層分化[3-5]。這種以Ⅰ型膠原為基質的 LSE 具備真皮基質層和重層化分化良好的表皮層，但是基質層為膠凍狀，表皮層和真皮層間連接脆弱[6]。
人羊膜（amniotic membrane，AM）為分娩后的廢棄物，易于采集和加工，并具有低免疫原性和抑制炎癥的特性，是一種良好的生物輔料[7-9]。前期研究中，我們采用去上皮化人 AM 作為基質，在基質面和上皮面分別接種真皮成纖維細胞和表皮角化細胞構建 LSE（AM-LSE），不僅去除了動物來源的膠原，而且韌性好，耐牽拉、切割、縫合，表皮和真皮間的基底膜發育良好，表皮真皮連接緊密，并成功用于裸鼠背部皮膚缺損修復[10]。經汕頭大學醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準，2016 年 7 月我們應用 AM-LSE 治療 1 例頸肩背部先天性巨痣患兒，以探討其臨床應用可行性。報告如下。
1 AM-LSE 的制備
1.1 細胞培養
局麻下，切取患兒腹股溝處大小約 1 cm×1 cm 的正常皮膚，在超凈工作臺上剔除脂肪，修薄真皮部分后放入中性分散酶溶液（0.4 mg/mL）中，4℃ 靜置過夜，分離表皮和真皮。將表皮置于 0.25% 胰蛋白酶溶液中，37℃ 處理 10 min，獲得表皮角化細胞懸液，接種于Ⅰ型膠原涂布的培養皿，添加 Epilife 表皮角化細胞基（Lifescience 公司，美國），于 CO2 細胞培養箱中常規培養，待細胞達 90% 融合時進行傳代。取第 4 代角化細胞構建 AM-LSE。
取真皮切成直徑為 1～2 mm 的組織塊，使其緊密貼附于培養皿底部，添加含 2% 患兒自體血清的低血清間充質細胞培養基（廣州美薩生物科技有限公司），于 CO2 細胞培養箱中常規培養。鏡下觀察見成纖維細胞自真皮組織塊周圍長出并增殖、游走，待組織間的細胞擴展至接近融合時，進行傳代培養。取第 5 代成纖維細胞構建 AM-LSE。患兒皮膚組織切取、細胞培養均經患兒家屬知情同意。
1.2 AM 制備
實驗用 AM 來自 2016 年 5 月汕頭大學醫學院第二附屬醫院足月健康剖宮產產婦自愿捐贈。HIV、HBV、HCV、梅毒等產前傳染病篩查為陰性。于超凈工作臺清洗去除血液、蛻膜等后，將 AM 置于 0.02%EDTA 中，37℃ 孵化 30 min，在解剖顯微鏡下用細胞刮子刮除 AM 上皮，清洗，修剪成 5 cm×5 cm，4℃ 冷藏備用。
1.3 AM-LSE 制備及觀察
1.3.1 制備方法
取成纖維細胞，采用添加 2% 自體血清的低血清間充質細胞培養基調整細胞密度為 5×105 個/mL 后，將細胞懸液以 0.5 mL/cm2 滴注于 AM 基質面，靜置 2 h 待細胞貼壁后，添加上述培養基，置于 CO2 細胞培養箱中培養，AM 基質面向上。2 d 后翻轉使上皮面向上，然后置于嵌入式膜培養皿（Corning 公司，美國），將表皮角化細胞懸液（密度 1×106 個/mL）按照 0.5 mL/cm2 滴注于上皮面。液相下培養 2 d 待細胞達融合后，換氣液面角化培養基[11]，開始氣液面培養，2 d 換液 1 次。氣液面培養 10 d 后收集 AM-LSE。
1.3.2 觀察指標
氣液面培養 10 d 后，大體觀察 AM-LSE；取部分 AM-LSE 標本固定于多聚甲醛液中，石蠟包埋，切片，片厚 6 μm，常規 HE 染色，光鏡下觀察 AM-LSE 組織學結構。
1.4 觀察結果
氣液面培養 10 d 后，AM 表面為角化表皮層，呈淡黃色，AM-LSE 質地較韌，可牽拉、不易破損。組織學觀察：表皮角化細胞重層化，基底層細胞排列規整緊密，可見棘細胞層、顆粒細胞層以及角質層。成纖維細胞向 AM 基質內浸潤生長。見圖 1。
圖1
AM-LSE 觀察
a. 大體觀察；b. 組織學觀察（HE×200）
Figure1. The observation of AM-LSEa. Gross observation; b. Histological observation (HE×200)
2 臨床應用
2.1 病例介紹
患兒 男，5 歲。因“頸肩背部先天性巨痣”于 2016 年 7 月入院。患兒出生時即發現頸肩背部大面積黑痣，并全身多處散在小型色素痣，界限清楚，隨年齡增長黑痣面積增大。自 2 歲開始接受巨痣分次切除、自體皮片移植手術，共 3 次。本次入院檢查，頸肩背部仍遺留面積約 30 cm×30 cm 的病變組織，并可見已經切除縫合的散發小型痣、痣內切除縫合以及皮片移植術后表現；組織病理學檢查顯示痣細胞在皮下組織層有浸潤。擬采用分次巨痣切除聯合 AM-LSE 移植修復創面。全麻下，手術切除巨痣（15 cm×10 cm）至深筋膜層，遺留創面面積為 20 cm×15 cm；充分止血后，覆蓋膠原蛋白海綿人工真皮（商品名：皮耐克；Gunze 公司，日本）。2 周后揭除皮耐克硅膠膜，刮除表面水腫肉芽組織后，反復沖洗、止血；將 AM-LSE 切成郵票大小貼敷于肉芽創面，網眼紗固定皮片后，填塞紗布碎片，打包包扎。術后 2 d 拆除敷料，常規換藥至 AM-LSE 完全封閉創面。第 1 次AM-LSE 移植術后 6 個月再次行肩部巨痣切除聯合 AM-LSE 移植術。本次術中經患兒家屬同意用 6 mm 皮膚活檢器切取前次移植術后全層皮膚樣本，行 HE 染色觀察皮膚組織結構。
2.2 結果
第 1 次 AM-LSE 移植術后 2 d，見 AM-LSE 貼敷良好；術后 5 d，揭除網眼紗，見 AM-LSE 紅潤，與創基貼敷牢固，皮片開始向周圍爬行擴展；術后 11、14 d 皮片繼續擴大融合，僅有少量創面殘余。術后 6 個月，移植的 AM-LSE 色澤接近正常皮膚，質地柔軟，皮片間隙為淡紅色瘢痕，高出皮面，質地較硬，植皮區域邊緣見明顯創面收縮。組織學觀察：基底層細胞呈柱狀緊湊排列，棘細胞層、顆粒細胞層以及角質層分化良好。真皮層內分布大量成纖維細胞以及血管，皮下未見黑色素細胞團塊，未見明顯炎性細胞浸潤，真皮下見大量粗大膠原纖維。表皮基底層平坦，未形成乳頭狀結構，未見毛囊、汗腺等皮膚附屬器。見圖 2。
圖2
典型病例
a. 術前設計切除范圍；b. 術中切除巨痣至深筋膜層；c. 采用膠原蛋白海綿人工真皮覆蓋創面；d. 術后 2 周肉芽創面貼敷郵票狀 AM-LSE；e. 以網眼紗固定 AM-LSE；f. AM-LSE 移植術后 5 d ；g. 移植術后 14 d AM-LSE 封閉創面；h. 移植術后6 個月創面大體觀察；i. 移植術后 6 個月組織學觀察（HE ×200）
Figure2. A typical casea. Skin lesion for excision before operation; b. Nevus excision to deep fasia; c. Wound repairing with artificial skin of collagen sponge; d. Stamp grafts of AM-LSE on granulation tissue at 2 weeks after operation; e. AM-LSE grafts covered with oil gause; f. At 5 days after AM-LSE grafting; g. Wound healing at 14 days after AM-LSE grafting; h. Gross view of the grafting area at 6 months after operation; i. Histological observation of grafted AM-LSE after 6 months (HE ×200)
3 討論
自 1983 年 Bell 等[12]應用表皮角化細胞、真皮成纖維細胞和Ⅰ型膠原成功構建 LSE 以來，LSE 構建技術已逐漸成熟。雖然已有應用不同細胞外基質（如人纖維蛋白、自體血漿、脫細胞真皮等）成功構建 LSE 的報道，但目前仍以Ⅰ型膠原構建 LSE 為主，且獲得了美國食品藥品監督管理局以及中國國家食品藥品監督管理總局的認證。我們前期研究發現，成纖維細胞可在去上皮化人 AM 基質層三維立體生長，另外去上皮化人 AM 上皮面因為保留了基底膜的基本成分，能更好地支持表皮角化細胞的貼附生長；以去上皮人 AM 作為基質構建的 AM-LSE 具有更好的表皮分化特征以及發育良好的基底膜，表皮真皮連接更加緊密，耐牽拉和切割，較Ⅰ型膠原構建的 LSE 更易于操作，并成功移植修復裸鼠背部創面且長期存活[8, 10]。上述以 AM 為基質構建的 LSE 的特性，也得到了其他研究的支持[13]。采用患者自體細胞培養、無動物源成分培養以及去除動物源的膠原成分，使 AM-LSE 可以更好地滿足臨床應用的要求。
先天性巨痣的治療以切除為主[14]。本例患兒病理檢查顯示痣細胞深及皮下組織，病損皮膚切除至深筋膜層。因幼兒無法配合擴張器治療，所以未選擇行減張縫合或自體皮片移植。既往報道，先天性巨痣病損切除后，應用 Integra 等真皮支架覆蓋斷層皮片可以較好支持皮片生長[15]。日本 Gunze 公司生產的皮耐克具有比 Integra 更小的抗原性，覆蓋創面后成纖維細胞和新生血管向皮耐克基質層長入，形成一定厚度的肉芽組織，在肉芽組織上移植薄斷層皮片可以達到較好修復效果[16-17]。但是采用薄斷層皮片也存在一定不足，供皮區雖然大部分可以無瘢痕愈合，但是在術后可能會長期存在皮膚保水功能恢復不完全、紅斑以及色素沉積異常等情況[18]。且本例患兒因頸部和肩背部皮損面積大、并全身散發大量小型皮損，自體供皮區有限。我們應用皮耐克覆蓋創面，2 周后揭去硅膠膜，在肉芽創面移植 AM-LSE。AM-LSE 為半透明膜狀，具有完整的表皮和真皮層，厚度相當于刃厚皮片，但是相比較自體皮片質地較疏松，無免疫細胞，無與受床血管對接的微小血管，故耐受感染侵襲的能力較弱。所以我們將 AM-LSE 裁剪成郵票大小移植，并在移植術后 2 d 即拆包換藥，在網眼紗固定下，按壓清除皮片下積液，術后 5 d 見 AM-LSE 紅潤，術后 11 d 表皮細胞沿皮緣向周邊爬行擴展，最終封閉創面。AM-LSE 移植過程中的表現與自體斷層皮片移植類似。術后 6 個月，AM-LSE 的外觀和柔軟度等表現與自體皮片無明顯差異。
本例臨床應用提示應用自體細胞構建的 AM-LSE 修復創面可行，適合于自體可用供皮區有限、且需要反復多次進行皮膚移植手術的患者。但 AM 雖然具有低免疫原性，考慮到多次 AM-LSE 移植治療，仍具有激活機體抗原抗體免疫系統的可能性，因此需要增加病例進一步研究多次采用 AM-LSE 移植治療的可行性及適用性。
目前，對于病損面積較大、自體皮膚可切取面積有限患者，可采用自體皮膚細胞構建活性皮膚替代物（living skin equivalent，LSE）修復創面[1-2]。常用構建方法為在植入真皮成纖維細胞的Ⅰ型膠原凝膠上接種表皮角化細胞，然后氣液面培養，進行表皮重層分化[3-5]。這種以Ⅰ型膠原為基質的 LSE 具備真皮基質層和重層化分化良好的表皮層，但是基質層為膠凍狀，表皮層和真皮層間連接脆弱[6]。
人羊膜（amniotic membrane，AM）為分娩后的廢棄物，易于采集和加工，并具有低免疫原性和抑制炎癥的特性，是一種良好的生物輔料[7-9]。前期研究中，我們采用去上皮化人 AM 作為基質，在基質面和上皮面分別接種真皮成纖維細胞和表皮角化細胞構建 LSE（AM-LSE），不僅去除了動物來源的膠原，而且韌性好，耐牽拉、切割、縫合，表皮和真皮間的基底膜發育良好，表皮真皮連接緊密，并成功用于裸鼠背部皮膚缺損修復[10]。經汕頭大學醫學院第二附屬醫院倫理委員會批準，2016 年 7 月我們應用 AM-LSE 治療 1 例頸肩背部先天性巨痣患兒，以探討其臨床應用可行性。報告如下。
1 AM-LSE 的制備
1.1 細胞培養
局麻下，切取患兒腹股溝處大小約 1 cm×1 cm 的正常皮膚，在超凈工作臺上剔除脂肪，修薄真皮部分后放入中性分散酶溶液（0.4 mg/mL）中，4℃ 靜置過夜，分離表皮和真皮。將表皮置于 0.25% 胰蛋白酶溶液中，37℃ 處理 10 min，獲得表皮角化細胞懸液，接種于Ⅰ型膠原涂布的培養皿，添加 Epilife 表皮角化細胞基（Lifescience 公司，美國），于 CO2 細胞培養箱中常規培養，待細胞達 90% 融合時進行傳代。取第 4 代角化細胞構建 AM-LSE。
取真皮切成直徑為 1～2 mm 的組織塊，使其緊密貼附于培養皿底部，添加含 2% 患兒自體血清的低血清間充質細胞培養基（廣州美薩生物科技有限公司），于 CO2 細胞培養箱中常規培養。鏡下觀察見成纖維細胞自真皮組織塊周圍長出并增殖、游走，待組織間的細胞擴展至接近融合時，進行傳代培養。取第 5 代成纖維細胞構建 AM-LSE。患兒皮膚組織切取、細胞培養均經患兒家屬知情同意。
1.2 AM 制備
實驗用 AM 來自 2016 年 5 月汕頭大學醫學院第二附屬醫院足月健康剖宮產產婦自愿捐贈。HIV、HBV、HCV、梅毒等產前傳染病篩查為陰性。于超凈工作臺清洗去除血液、蛻膜等后，將 AM 置于 0.02%EDTA 中，37℃ 孵化 30 min，在解剖顯微鏡下用細胞刮子刮除 AM 上皮，清洗，修剪成 5 cm×5 cm，4℃ 冷藏備用。
1.3 AM-LSE 制備及觀察
1.3.1 制備方法
取成纖維細胞，采用添加 2% 自體血清的低血清間充質細胞培養基調整細胞密度為 5×105 個/mL 后，將細胞懸液以 0.5 mL/cm2 滴注于 AM 基質面，靜置 2 h 待細胞貼壁后，添加上述培養基，置于 CO2 細胞培養箱中培養，AM 基質面向上。2 d 后翻轉使上皮面向上，然后置于嵌入式膜培養皿（Corning 公司，美國），將表皮角化細胞懸液（密度 1×106 個/mL）按照 0.5 mL/cm2 滴注于上皮面。液相下培養 2 d 待細胞達融合后，換氣液面角化培養基[11]，開始氣液面培養，2 d 換液 1 次。氣液面培養 10 d 后收集 AM-LSE。
1.3.2 觀察指標
氣液面培養 10 d 后，大體觀察 AM-LSE；取部分 AM-LSE 標本固定于多聚甲醛液中，石蠟包埋，切片，片厚 6 μm，常規 HE 染色，光鏡下觀察 AM-LSE 組織學結構。
1.4 觀察結果
氣液面培養 10 d 后，AM 表面為角化表皮層，呈淡黃色，AM-LSE 質地較韌，可牽拉、不易破損。組織學觀察：表皮角化細胞重層化，基底層細胞排列規整緊密，可見棘細胞層、顆粒細胞層以及角質層。成纖維細胞向 AM 基質內浸潤生長。見圖 1。
圖1
AM-LSE 觀察
a. 大體觀察；b. 組織學觀察（HE×200）
Figure1. The observation of AM-LSEa. Gross observation; b. Histological observation (HE×200)
2 臨床應用
2.1 病例介紹
患兒 男，5 歲。因“頸肩背部先天性巨痣”于 2016 年 7 月入院。患兒出生時即發現頸肩背部大面積黑痣，并全身多處散在小型色素痣，界限清楚，隨年齡增長黑痣面積增大。自 2 歲開始接受巨痣分次切除、自體皮片移植手術，共 3 次。本次入院檢查，頸肩背部仍遺留面積約 30 cm×30 cm 的病變組織，并可見已經切除縫合的散發小型痣、痣內切除縫合以及皮片移植術后表現；組織病理學檢查顯示痣細胞在皮下組織層有浸潤。擬采用分次巨痣切除聯合 AM-LSE 移植修復創面。全麻下，手術切除巨痣（15 cm×10 cm）至深筋膜層，遺留創面面積為 20 cm×15 cm；充分止血后，覆蓋膠原蛋白海綿人工真皮（商品名：皮耐克；Gunze 公司，日本）。2 周后揭除皮耐克硅膠膜，刮除表面水腫肉芽組織后，反復沖洗、止血；將 AM-LSE 切成郵票大小貼敷于肉芽創面，網眼紗固定皮片后，填塞紗布碎片，打包包扎。術后 2 d 拆除敷料，常規換藥至 AM-LSE 完全封閉創面。第 1 次AM-LSE 移植術后 6 個月再次行肩部巨痣切除聯合 AM-LSE 移植術。本次術中經患兒家屬同意用 6 mm 皮膚活檢器切取前次移植術后全層皮膚樣本，行 HE 染色觀察皮膚組織結構。
2.2 結果
第 1 次 AM-LSE 移植術后 2 d，見 AM-LSE 貼敷良好；術后 5 d，揭除網眼紗，見 AM-LSE 紅潤，與創基貼敷牢固，皮片開始向周圍爬行擴展；術后 11、14 d 皮片繼續擴大融合，僅有少量創面殘余。術后 6 個月，移植的 AM-LSE 色澤接近正常皮膚，質地柔軟，皮片間隙為淡紅色瘢痕，高出皮面，質地較硬，植皮區域邊緣見明顯創面收縮。組織學觀察：基底層細胞呈柱狀緊湊排列，棘細胞層、顆粒細胞層以及角質層分化良好。真皮層內分布大量成纖維細胞以及血管，皮下未見黑色素細胞團塊，未見明顯炎性細胞浸潤，真皮下見大量粗大膠原纖維。表皮基底層平坦，未形成乳頭狀結構，未見毛囊、汗腺等皮膚附屬器。見圖 2。
圖2
典型病例
a. 術前設計切除范圍；b. 術中切除巨痣至深筋膜層；c. 采用膠原蛋白海綿人工真皮覆蓋創面；d. 術后 2 周肉芽創面貼敷郵票狀 AM-LSE；e. 以網眼紗固定 AM-LSE；f. AM-LSE 移植術后 5 d ；g. 移植術后 14 d AM-LSE 封閉創面；h. 移植術后6 個月創面大體觀察；i. 移植術后 6 個月組織學觀察（HE ×200）
Figure2. A typical casea. Skin lesion for excision before operation; b. Nevus excision to deep fasia; c. Wound repairing with artificial skin of collagen sponge; d. Stamp grafts of AM-LSE on granulation tissue at 2 weeks after operation; e. AM-LSE grafts covered with oil gause; f. At 5 days after AM-LSE grafting; g. Wound healing at 14 days after AM-LSE grafting; h. Gross view of the grafting area at 6 months after operation; i. Histological observation of grafted AM-LSE after 6 months (HE ×200)
3 討論
自 1983 年 Bell 等[12]應用表皮角化細胞、真皮成纖維細胞和Ⅰ型膠原成功構建 LSE 以來，LSE 構建技術已逐漸成熟。雖然已有應用不同細胞外基質（如人纖維蛋白、自體血漿、脫細胞真皮等）成功構建 LSE 的報道，但目前仍以Ⅰ型膠原構建 LSE 為主，且獲得了美國食品藥品監督管理局以及中國國家食品藥品監督管理總局的認證。我們前期研究發現，成纖維細胞可在去上皮化人 AM 基質層三維立體生長，另外去上皮化人 AM 上皮面因為保留了基底膜的基本成分，能更好地支持表皮角化細胞的貼附生長；以去上皮人 AM 作為基質構建的 AM-LSE 具有更好的表皮分化特征以及發育良好的基底膜，表皮真皮連接更加緊密，耐牽拉和切割，較Ⅰ型膠原構建的 LSE 更易于操作，并成功移植修復裸鼠背部創面且長期存活[8, 10]。上述以 AM 為基質構建的 LSE 的特性，也得到了其他研究的支持[13]。采用患者自體細胞培養、無動物源成分培養以及去除動物源的膠原成分，使 AM-LSE 可以更好地滿足臨床應用的要求。
先天性巨痣的治療以切除為主[14]。本例患兒病理檢查顯示痣細胞深及皮下組織，病損皮膚切除至深筋膜層。因幼兒無法配合擴張器治療，所以未選擇行減張縫合或自體皮片移植。既往報道，先天性巨痣病損切除后，應用 Integra 等真皮支架覆蓋斷層皮片可以較好支持皮片生長[15]。日本 Gunze 公司生產的皮耐克具有比 Integra 更小的抗原性，覆蓋創面后成纖維細胞和新生血管向皮耐克基質層長入，形成一定厚度的肉芽組織，在肉芽組織上移植薄斷層皮片可以達到較好修復效果[16-17]。但是采用薄斷層皮片也存在一定不足，供皮區雖然大部分可以無瘢痕愈合，但是在術后可能會長期存在皮膚保水功能恢復不完全、紅斑以及色素沉積異常等情況[18]。且本例患兒因頸部和肩背部皮損面積大、并全身散發大量小型皮損，自體供皮區有限。我們應用皮耐克覆蓋創面，2 周后揭去硅膠膜，在肉芽創面移植 AM-LSE。AM-LSE 為半透明膜狀，具有完整的表皮和真皮層，厚度相當于刃厚皮片，但是相比較自體皮片質地較疏松，無免疫細胞，無與受床血管對接的微小血管，故耐受感染侵襲的能力較弱。所以我們將 AM-LSE 裁剪成郵票大小移植，并在移植術后 2 d 即拆包換藥，在網眼紗固定下，按壓清除皮片下積液，術后 5 d 見 AM-LSE 紅潤，術后 11 d 表皮細胞沿皮緣向周邊爬行擴展，最終封閉創面。AM-LSE 移植過程中的表現與自體斷層皮片移植類似。術后 6 個月，AM-LSE 的外觀和柔軟度等表現與自體皮片無明顯差異。
本例臨床應用提示應用自體細胞構建的 AM-LSE 修復創面可行，適合于自體可用供皮區有限、且需要反復多次進行皮膚移植手術的患者。但 AM 雖然具有低免疫原性，考慮到多次 AM-LSE 移植治療，仍具有激活機體抗原抗體免疫系統的可能性，因此需要增加病例進一步研究多次采用 AM-LSE 移植治療的可行性及適用性。
