引用本文： 張衛東, 謝衛國, 趙超莉, 王輝, 葉子青. 豬膠原膜異種皮下移植遠期轉歸的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 462-467. doi: 10.7507/1002-1892.201708123 復制
上世紀 90 年代 Livesey 等[1]首先開始了同種異體脫細胞真皮的研究，其臨床應用效果佳。之后，學者們研制了豬來源異種脫細胞真皮，近年也逐漸用于臨床[2-3]。其中，豬膠原膜來源于豬內臟膜，經去抗原、抗病毒、滅菌等特殊處理，具有良好的柔韌性、透氣透水性和組織相容性等優點，目前主要用于燒傷創面覆蓋[4-6]等。但有關豬膠原膜在體內的長期組織學轉歸罕見研究報道。為此，我們將豬膠原膜埋植于大鼠皮下，觀察其與周圍組織的相互影響以及在體內遠期轉歸，為豬膠原膜在臨床上進一步應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康普通級 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，體質量 200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2011-0003。豬膠原膜（商品名：無菌生物護創膜），由廣州冠昊生物科技有限公司提供。兔抗鼠 CD31 單克隆抗體（Santa 公司，美國）；羊抗兔 IgG 多克隆抗體（武漢聲諾威醫療設備有限公司）；牛血清白蛋白（Roche 公司，瑞士）。歐米伽能量過濾場發射透射電鏡（日本電子株式會社）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Image-Pro-Plus 6.0 彩色病理圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；透射電鏡（FEI 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將 20 只 SD 大鼠隨機分為實驗組及對照組（n=10）。實驗組大鼠背部皮下植入豬膠原膜。兩組大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/100 g）麻醉后，背部備皮，俯臥位固定四肢。于大鼠脊柱中點前、后相距 5 cm 處各制備一長為 1.5 cm 的橫切口。實驗組用組織剪在深筋膜與肌膜之間鈍性分離至兩切口貫通，并充分分離擴展為能夠平展豬膠原膜的囊腔；從一側切口植入面積為 2.5 cm×2.5 cm 的無菌豬膠原膜，鋪平后用針線將其四角與皮膚縫合固定，打結后留長線作為后期取樣標記；兩切口間斷縫合，聚維酮碘紗布覆蓋并繃帶包扎固定。對照組大鼠僅將背部兩切口原位縫合。術后單籠喂養，自由進食水。
術后 3、7、15 d，1、3、6、12 個月，實驗組大鼠同上法麻醉后按照原切口入路，鈍性分離并切取約 0.5 cm2 埋植組織標本，切口原位縫合。對照組于術后 12 個月時取大鼠背部相同部位皮膚組織觀察。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察實驗組大鼠存活及切口愈合情況，于術后各時間點取材時肉眼觀察豬膠原膜色澤、位置以及與周圍組織關系。
1.3.2 組織學觀察
取植入前豬膠原膜、術后 12 個月對照組以及術后 3、7、15 d，1、3、6、12 個月實驗組標本，置于 10% 甲醛固定，常規石蠟包埋，制備 4 μm 厚切片。取部分切片行 HE 染色，光鏡下觀察豬膠原膜組織學形態。然后將術后 12 個月對照組以及術后 15 d，1、12 個月實驗組切片置于 400 倍鏡下，每張切片隨機選 5 個視野[7]，使用 Image-Pro-Plus 6.0 彩色病理圖像分析軟件，結合圖像數據分析計數炎性細胞（中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞），取均值。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取術后 12 個月對照組以及術后 15 d，1、12 個月實驗組切片，常規脫臘、脫水后，過氧化物酶阻斷滅活、抗原熱修復，加入 5% 牛血清白蛋白封閉，加入兔抗鼠 CD31 單克隆一抗（1∶50）4℃ 靜置過夜，加入羊抗兔 IgG 多克隆二抗（1∶200）37℃ 孵育 50 min。PBS 洗滌后，DAB 顯色，蘇木素復染。于 400 倍鏡下觀察血管增生情況，陽性染色呈棕褐色；每張切片隨機選 5 個視野，使用 Image-Pro-Plus 6.0 彩色病理圖像分析軟件行圖像數據分析計數組織中 CD31 陽性表達量，取均值。
1.3.4 透射電鏡觀察
取植入前豬膠原膜及術后 12 個月實驗組標本，置于組織固定液 4℃ 固定 2～4 h，PBS 漂洗 3 次，1% 鋨酸溶液固定樣品 2 h，漂洗 3 次，乙醇溶液梯度脫水處理，純丙酮處理 20 min，包埋劑梯度滲透過夜，Eppendor 管包埋，60～80 nm 超薄切片，鈾鉛雙染色（2% 醋酸鈾飽和水溶液、枸櫞酸鉛，各染色 15 min），室溫干燥過夜。透射電鏡觀察豬膠原膜植入前后膠原結構變化。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，實驗組及對照組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；實驗組組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
實驗組大鼠麻醉蘇醒后活動正常。術后切口無明顯滲出、紅腫等炎性反應發生，均于 7 d 后愈合。埋植處皮膚色澤正常，毛發正常生長。
術后 3、7 d，于體表可明顯觸及豬膠原膜邊緣輪廓；切開見其大小及顏色無明顯改變，與周圍皮下組織黏附良好，無明顯分泌物等炎性反應。術后 15 d，可觸及豬膠原膜邊緣輪廓；切開見豬膠原膜與周圍組織黏附較緊密，并被透明包膜包覆，大小、色澤無明顯改變。術后 1 個月，仍能觸及豬膠原膜邊緣輪廓；切開見豬膠原膜與周圍組織黏附牢固，膜表面有一層新生微細血管網，剪切后有少許出血，但豬膠原膜切面未見出血，顏色、厚度、柔軟度較未植入前無明顯改變，周圍組織無炎性反應。術后 3、6 個月，體表不易觸及植入的豬膠原膜；切開后見豬膠原膜被周圍組織及毛細血管網包裹，但膜片仍保持完整。術后 12 個月，體表觸及較困難，取材時豬膠原膜仍清晰可見且完整，與周圍組織黏附緊密，不易分離，其外周可見包膜及少量毛細血管網。見圖 1。
圖1
實驗組大體觀察
箭頭示新生血管 a. 術后 1 個月；b. 術后 12 個月
Figure1. Gross observation of experimental groupArrow indicated the new capillaries a. At 1 month after operation; b. At 12 months after operation
2.2 組織學觀察
2.2.1 鏡下觀察
植入前豬膠原膜由均質、紅染無結構的膠原纖維組成，粗糙面膠原疏松、短小，排列方向雜亂；光滑面較致密，膠原束平行排列。對照組為正常組織結構，未見明顯炎性細胞浸潤。實驗組術后 3 d，豬膠原膜組織呈均質、紅染膠原，其膠原結構與植入前無改變，粗糙面見大量中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞等炎性細胞浸潤，無血管結構生長。術后 7 d，大量炎性細胞彌漫分布于豬膠原膜全層，且粗糙面較明顯，粗糙面可見少量成纖維細胞及幼稚毛細血管生長。術后 15 d，豬膠原膜結構基本完整，周圍組織黏附緊密，但分界清楚，移植物中炎性細胞消退，僅少量淋巴細胞、漿細胞等彌散分布，成纖維細胞及新生毛細血管將豬膠原膜粗糙面的膠原纖維分割成小巢狀，豬膠原膜周邊與肉芽組織緊密相連，邊界清楚；光滑面與宿主組織黏附緊密，但分界更清楚，無融合。術后 1、3 個月，豬膠原膜中見少量淋巴細胞、漿細胞等浸潤，其周邊為纖維結締組織包繞，邊界清楚，豬膠原膜內毛細血管長入，成纖維細胞增多，有新生膠原纖維，粗糙面較光滑面明顯；但移植物內部基本保持原有性狀，血管及成纖維細胞相對較少。術后 6 個月，豬膠原膜與宿主組織交接處貼附緊密，無明顯融合生長，移植物內血管增生及成纖維細胞較前減少，新生膠原纖維增多，但邊界清晰。術后 12 個月，豬膠原膜結構完整，膠原均質紅染，其邊緣與周邊纖維結締組織融合，但邊界清楚；豬膠原膜內炎性細胞消退，膜內可見血管和成纖維細胞。見圖 2。
圖2
豬膠原膜組織學觀察（HE×200）
a. 埋植前； b. 實驗組術后 3 d；c. 實驗組術后 7 d；d. 實驗組術后 15 d；e. 實驗組術后 1 個月；f. 實驗組術后 12 個月
Figure2. Histological staining observation of porcin collagen membrane (HE×200)a. Before xenotransplantation; b. Experimental group at 3 days; c. Experimental group at 7 days; d. Experimental group at 15 days; e. Experimental group at 1 month; f. Experimental group at 12 months
2.2.2 炎性細胞計數
術后 12 個月對照組與術后 15 d，1、12 個月實驗組炎性細胞數分別為（6.10±1.21）、（83.44±9.86）、（32.09±5.03）、（6.92±1.82）個/視野。術后 15 d、1 個月實驗組炎性細胞數明顯多于術后 12 個月對照組，比較差異有統計學意義（t=25.082，P=0.000；t=16.310，P=0.000）；術后 12 個月實驗組與對照組比較，差異無統計學意義（t=1.287，P=0.230）。實驗組間炎性細胞數隨時間延長明顯減少，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.3 免疫組織化學染色觀察
實驗組術后 15 d 可見膜內血管新生，1 個月時膜內、外血管增生明顯，12 個月時 CD31 表達較前明顯減少。見圖 3。對照組及術后 15 d，1、12 個月實驗組 CD31 陽性表達量分別為（30.01±2.75）、（16.72±1.37）、（66.67±9.70）、（24.37±2.06）個/視野。各組間及組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖3
實驗組 CD31 免疫組織化學染色觀察（×200）
箭頭示新生血管 a. 術后 15 d；b. 術后 1 個月；c. 術后 12 個月
Figure3. CD31 immunohistochemical staining observation of experimental group (×200)Arrow indicated the new capillaries a. At 15 days after operation; b. At 1 month after operation; c. At 12 months after operation
2.4 透射電鏡觀察
植入前豬膠原膜內膠原纖維均勻排列，且較緊密。實驗組術后 12 個月豬膠原膜的膠原纖維較植入前變粗，密度較前降低，其他結構無明顯改變；植入物內有成纖維細胞、周細胞。見圖 4。
圖4
豬膠原膜透射電鏡觀察
a. 埋植前（×30 k）；b. 實驗組術后 12 個月（×30 k）；c. 實驗組術后 12 個月（×10 k） 紅箭頭示周細胞，黑箭頭示成纖維細胞
Figure4. Transmission electron microscope observation of porcin collagen membranea. Before transplantation (×30 k); b. Experimental group at 12 months (×30 k); c. Experimental group at 12 months (×10 k) Red arrow indicated the pericytes, black arrow indicated the fibroblasts
3 討論
豬膠原膜作為植入性生物材料，植入體內后直接接觸的是宿主體內環境，其生物學轉歸是與機體組織及細胞相互作用的過程[8]。通過體內埋植實驗，可以觀察豬膠原膜植入后對宿主組織的影響，同時了解其物理結構、細胞生長等在體內長期變化及最終轉歸。
本研究采用的膠原膜來自豬腹膜，來源廣泛，成本低廉。組織學觀察顯示，豬膠原膜由均質、紅染無結構的膠原纖維構成[9]。豬膠原膜埋植后宿主創口愈合良好。術后早期組織學觀察見明顯組織炎性反應，1 個月后炎性反應基本消退，這符合異種組織植入動物體內的病理生理過程[10]，是組織再生修復過程中的正常反應。之后未見明顯炎性反應，表明豬膠原膜與宿主組織長期相容性良好。炎性細胞是參與創傷炎性反應的主要細胞[11]，實驗組炎性細胞數隨時間延長逐漸減少，至 12 個月時與對照組比較差異無統計學意義，表明豬膠原膜組織相容性好。但本研究未行遠期炎性細胞計數，為不足之處。
此外，本實驗結果提示，術后 7 d 豬膠原膜內可見成纖維細胞及幼稚毛細血管，與本課題組前期研究觀察一致[9]。術后 15 d 及 1 個月時可見豬膠原膜表面大量血管增生，但內部相對較少。我們認為這可能為豬膠原膜非皮膚來源，其膠原排列及空間結構與皮膚差異較大有關。與豬皮膚來源的脫細胞基質相比[3, 12]，豬膠原膜結構相對較致密，致使宿主血管長入較少，這可能也是其能長期保持自身較完整的原因。由于豬膠原膜結構致密及韌性好、不易被溶解吸收，可用作腦膜、腱膜等低血管化組織的替代或修補[13]，具有一定應用潛力。既往報道的同種異體或異種皮膚來源真皮替代物，多呈疏松網狀結構，有利于宿主毛細血管及細胞的長入[13-14]。如將豬膠原膜用作需早期血管化的植入或覆蓋材料，可考慮進一步改進三維空間結構、復合促血管新生和細胞遷移等物質[15-16]，或者行微孔化處理[17-18]。
綜上述，本實驗首次觀察豬膠原膜植入大鼠體內后 1 年轉歸，與既往同類研究 4 周～6 個月觀察期限[7, 19]相比有所延長。植入大鼠皮下 1 年后，豬膠原膜未見明顯吸收及結構改變，說明與宿主組織相容性良好，有較好的免疫耐受特性及結構穩定性。這一特點可能有助于其在異種及異體移植方面的應用。
上世紀 90 年代 Livesey 等[1]首先開始了同種異體脫細胞真皮的研究，其臨床應用效果佳。之后，學者們研制了豬來源異種脫細胞真皮，近年也逐漸用于臨床[2-3]。其中，豬膠原膜來源于豬內臟膜，經去抗原、抗病毒、滅菌等特殊處理，具有良好的柔韌性、透氣透水性和組織相容性等優點，目前主要用于燒傷創面覆蓋[4-6]等。但有關豬膠原膜在體內的長期組織學轉歸罕見研究報道。為此，我們將豬膠原膜埋植于大鼠皮下，觀察其與周圍組織的相互影響以及在體內遠期轉歸，為豬膠原膜在臨床上進一步應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康普通級 SD 大鼠 20 只，雌雄不限，體質量 200～250 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2011-0003。豬膠原膜（商品名：無菌生物護創膜），由廣州冠昊生物科技有限公司提供。兔抗鼠 CD31 單克隆抗體（Santa 公司，美國）；羊抗兔 IgG 多克隆抗體（武漢聲諾威醫療設備有限公司）；牛血清白蛋白（Roche 公司，瑞士）。歐米伽能量過濾場發射透射電鏡（日本電子株式會社）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Image-Pro-Plus 6.0 彩色病理圖像分析軟件（Media Cybernetics 公司，美國）；透射電鏡（FEI 公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將 20 只 SD 大鼠隨機分為實驗組及對照組（n=10）。實驗組大鼠背部皮下植入豬膠原膜。兩組大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（3 mL/100 g）麻醉后，背部備皮，俯臥位固定四肢。于大鼠脊柱中點前、后相距 5 cm 處各制備一長為 1.5 cm 的橫切口。實驗組用組織剪在深筋膜與肌膜之間鈍性分離至兩切口貫通，并充分分離擴展為能夠平展豬膠原膜的囊腔；從一側切口植入面積為 2.5 cm×2.5 cm 的無菌豬膠原膜，鋪平后用針線將其四角與皮膚縫合固定，打結后留長線作為后期取樣標記；兩切口間斷縫合，聚維酮碘紗布覆蓋并繃帶包扎固定。對照組大鼠僅將背部兩切口原位縫合。術后單籠喂養，自由進食水。
術后 3、7、15 d，1、3、6、12 個月，實驗組大鼠同上法麻醉后按照原切口入路，鈍性分離并切取約 0.5 cm2 埋植組織標本，切口原位縫合。對照組于術后 12 個月時取大鼠背部相同部位皮膚組織觀察。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察實驗組大鼠存活及切口愈合情況，于術后各時間點取材時肉眼觀察豬膠原膜色澤、位置以及與周圍組織關系。
1.3.2 組織學觀察
取植入前豬膠原膜、術后 12 個月對照組以及術后 3、7、15 d，1、3、6、12 個月實驗組標本，置于 10% 甲醛固定，常規石蠟包埋，制備 4 μm 厚切片。取部分切片行 HE 染色，光鏡下觀察豬膠原膜組織學形態。然后將術后 12 個月對照組以及術后 15 d，1、12 個月實驗組切片置于 400 倍鏡下，每張切片隨機選 5 個視野[7]，使用 Image-Pro-Plus 6.0 彩色病理圖像分析軟件，結合圖像數據分析計數炎性細胞（中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞），取均值。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取術后 12 個月對照組以及術后 15 d，1、12 個月實驗組切片，常規脫臘、脫水后，過氧化物酶阻斷滅活、抗原熱修復，加入 5% 牛血清白蛋白封閉，加入兔抗鼠 CD31 單克隆一抗（1∶50）4℃ 靜置過夜，加入羊抗兔 IgG 多克隆二抗（1∶200）37℃ 孵育 50 min。PBS 洗滌后，DAB 顯色，蘇木素復染。于 400 倍鏡下觀察血管增生情況，陽性染色呈棕褐色；每張切片隨機選 5 個視野，使用 Image-Pro-Plus 6.0 彩色病理圖像分析軟件行圖像數據分析計數組織中 CD31 陽性表達量，取均值。
1.3.4 透射電鏡觀察
取植入前豬膠原膜及術后 12 個月實驗組標本，置于組織固定液 4℃ 固定 2～4 h，PBS 漂洗 3 次，1% 鋨酸溶液固定樣品 2 h，漂洗 3 次，乙醇溶液梯度脫水處理，純丙酮處理 20 min，包埋劑梯度滲透過夜，Eppendor 管包埋，60～80 nm 超薄切片，鈾鉛雙染色（2% 醋酸鈾飽和水溶液、枸櫞酸鉛，各染色 15 min），室溫干燥過夜。透射電鏡觀察豬膠原膜植入前后膠原結構變化。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，實驗組及對照組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；實驗組組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
實驗組大鼠麻醉蘇醒后活動正常。術后切口無明顯滲出、紅腫等炎性反應發生，均于 7 d 后愈合。埋植處皮膚色澤正常，毛發正常生長。
術后 3、7 d，于體表可明顯觸及豬膠原膜邊緣輪廓；切開見其大小及顏色無明顯改變，與周圍皮下組織黏附良好，無明顯分泌物等炎性反應。術后 15 d，可觸及豬膠原膜邊緣輪廓；切開見豬膠原膜與周圍組織黏附較緊密，并被透明包膜包覆，大小、色澤無明顯改變。術后 1 個月，仍能觸及豬膠原膜邊緣輪廓；切開見豬膠原膜與周圍組織黏附牢固，膜表面有一層新生微細血管網，剪切后有少許出血，但豬膠原膜切面未見出血，顏色、厚度、柔軟度較未植入前無明顯改變，周圍組織無炎性反應。術后 3、6 個月，體表不易觸及植入的豬膠原膜；切開后見豬膠原膜被周圍組織及毛細血管網包裹，但膜片仍保持完整。術后 12 個月，體表觸及較困難，取材時豬膠原膜仍清晰可見且完整，與周圍組織黏附緊密，不易分離，其外周可見包膜及少量毛細血管網。見圖 1。
圖1
實驗組大體觀察
箭頭示新生血管 a. 術后 1 個月；b. 術后 12 個月
Figure1. Gross observation of experimental groupArrow indicated the new capillaries a. At 1 month after operation; b. At 12 months after operation
2.2 組織學觀察
2.2.1 鏡下觀察
植入前豬膠原膜由均質、紅染無結構的膠原纖維組成，粗糙面膠原疏松、短小，排列方向雜亂；光滑面較致密，膠原束平行排列。對照組為正常組織結構，未見明顯炎性細胞浸潤。實驗組術后 3 d，豬膠原膜組織呈均質、紅染膠原，其膠原結構與植入前無改變，粗糙面見大量中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞等炎性細胞浸潤，無血管結構生長。術后 7 d，大量炎性細胞彌漫分布于豬膠原膜全層，且粗糙面較明顯，粗糙面可見少量成纖維細胞及幼稚毛細血管生長。術后 15 d，豬膠原膜結構基本完整，周圍組織黏附緊密，但分界清楚，移植物中炎性細胞消退，僅少量淋巴細胞、漿細胞等彌散分布，成纖維細胞及新生毛細血管將豬膠原膜粗糙面的膠原纖維分割成小巢狀，豬膠原膜周邊與肉芽組織緊密相連，邊界清楚；光滑面與宿主組織黏附緊密，但分界更清楚，無融合。術后 1、3 個月，豬膠原膜中見少量淋巴細胞、漿細胞等浸潤，其周邊為纖維結締組織包繞，邊界清楚，豬膠原膜內毛細血管長入，成纖維細胞增多，有新生膠原纖維，粗糙面較光滑面明顯；但移植物內部基本保持原有性狀，血管及成纖維細胞相對較少。術后 6 個月，豬膠原膜與宿主組織交接處貼附緊密，無明顯融合生長，移植物內血管增生及成纖維細胞較前減少，新生膠原纖維增多，但邊界清晰。術后 12 個月，豬膠原膜結構完整，膠原均質紅染，其邊緣與周邊纖維結締組織融合，但邊界清楚；豬膠原膜內炎性細胞消退，膜內可見血管和成纖維細胞。見圖 2。
圖2
豬膠原膜組織學觀察（HE×200）
a. 埋植前； b. 實驗組術后 3 d；c. 實驗組術后 7 d；d. 實驗組術后 15 d；e. 實驗組術后 1 個月；f. 實驗組術后 12 個月
Figure2. Histological staining observation of porcin collagen membrane (HE×200)a. Before xenotransplantation; b. Experimental group at 3 days; c. Experimental group at 7 days; d. Experimental group at 15 days; e. Experimental group at 1 month; f. Experimental group at 12 months
2.2.2 炎性細胞計數
術后 12 個月對照組與術后 15 d，1、12 個月實驗組炎性細胞數分別為（6.10±1.21）、（83.44±9.86）、（32.09±5.03）、（6.92±1.82）個/視野。術后 15 d、1 個月實驗組炎性細胞數明顯多于術后 12 個月對照組，比較差異有統計學意義（t=25.082，P=0.000；t=16.310，P=0.000）；術后 12 個月實驗組與對照組比較，差異無統計學意義（t=1.287，P=0.230）。實驗組間炎性細胞數隨時間延長明顯減少，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.3 免疫組織化學染色觀察
實驗組術后 15 d 可見膜內血管新生，1 個月時膜內、外血管增生明顯，12 個月時 CD31 表達較前明顯減少。見圖 3。對照組及術后 15 d，1、12 個月實驗組 CD31 陽性表達量分別為（30.01±2.75）、（16.72±1.37）、（66.67±9.70）、（24.37±2.06）個/視野。各組間及組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖3
實驗組 CD31 免疫組織化學染色觀察（×200）
箭頭示新生血管 a. 術后 15 d；b. 術后 1 個月；c. 術后 12 個月
Figure3. CD31 immunohistochemical staining observation of experimental group (×200)Arrow indicated the new capillaries a. At 15 days after operation; b. At 1 month after operation; c. At 12 months after operation
2.4 透射電鏡觀察
植入前豬膠原膜內膠原纖維均勻排列，且較緊密。實驗組術后 12 個月豬膠原膜的膠原纖維較植入前變粗，密度較前降低，其他結構無明顯改變；植入物內有成纖維細胞、周細胞。見圖 4。
圖4
豬膠原膜透射電鏡觀察
a. 埋植前（×30 k）；b. 實驗組術后 12 個月（×30 k）；c. 實驗組術后 12 個月（×10 k） 紅箭頭示周細胞，黑箭頭示成纖維細胞
Figure4. Transmission electron microscope observation of porcin collagen membranea. Before transplantation (×30 k); b. Experimental group at 12 months (×30 k); c. Experimental group at 12 months (×10 k) Red arrow indicated the pericytes, black arrow indicated the fibroblasts
3 討論
豬膠原膜作為植入性生物材料，植入體內后直接接觸的是宿主體內環境，其生物學轉歸是與機體組織及細胞相互作用的過程[8]。通過體內埋植實驗，可以觀察豬膠原膜植入后對宿主組織的影響，同時了解其物理結構、細胞生長等在體內長期變化及最終轉歸。
本研究采用的膠原膜來自豬腹膜，來源廣泛，成本低廉。組織學觀察顯示，豬膠原膜由均質、紅染無結構的膠原纖維構成[9]。豬膠原膜埋植后宿主創口愈合良好。術后早期組織學觀察見明顯組織炎性反應，1 個月后炎性反應基本消退，這符合異種組織植入動物體內的病理生理過程[10]，是組織再生修復過程中的正常反應。之后未見明顯炎性反應，表明豬膠原膜與宿主組織長期相容性良好。炎性細胞是參與創傷炎性反應的主要細胞[11]，實驗組炎性細胞數隨時間延長逐漸減少，至 12 個月時與對照組比較差異無統計學意義，表明豬膠原膜組織相容性好。但本研究未行遠期炎性細胞計數，為不足之處。
此外，本實驗結果提示，術后 7 d 豬膠原膜內可見成纖維細胞及幼稚毛細血管，與本課題組前期研究觀察一致[9]。術后 15 d 及 1 個月時可見豬膠原膜表面大量血管增生，但內部相對較少。我們認為這可能為豬膠原膜非皮膚來源，其膠原排列及空間結構與皮膚差異較大有關。與豬皮膚來源的脫細胞基質相比[3, 12]，豬膠原膜結構相對較致密，致使宿主血管長入較少，這可能也是其能長期保持自身較完整的原因。由于豬膠原膜結構致密及韌性好、不易被溶解吸收，可用作腦膜、腱膜等低血管化組織的替代或修補[13]，具有一定應用潛力。既往報道的同種異體或異種皮膚來源真皮替代物，多呈疏松網狀結構，有利于宿主毛細血管及細胞的長入[13-14]。如將豬膠原膜用作需早期血管化的植入或覆蓋材料，可考慮進一步改進三維空間結構、復合促血管新生和細胞遷移等物質[15-16]，或者行微孔化處理[17-18]。
綜上述，本實驗首次觀察豬膠原膜植入大鼠體內后 1 年轉歸，與既往同類研究 4 周～6 個月觀察期限[7, 19]相比有所延長。植入大鼠皮下 1 年后，豬膠原膜未見明顯吸收及結構改變，說明與宿主組織相容性良好，有較好的免疫耐受特性及結構穩定性。這一特點可能有助于其在異種及異體移植方面的應用。
