引用本文： 王松, 楊函, 楊劍, 康建平, 王清, 宋躍明. 多孔磷酸鈣/骨基質明膠復合骨水泥修復兔腰椎骨缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(12): 1462-1467. doi: 10.7507/1002-1892.201707097 復制
磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）是由磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣配制而成，也稱為羥基磷灰石骨水泥[1]。CPC 具有良好的生物相容性和骨傳導性、可降解性并可以任意塑形，能滿足臨床上骨缺損修復的要求[2-3]。但是，單一的 CPC 脆性大，不具有骨誘導活性，而且骨水泥凝固后孔隙率較小，組織難以長入，生物活性差[4-5]。本研究選取 CPC 作為基體材料，與具有強誘導成骨活性的骨基質明膠（bone matrix gelatin，BMG）復合，并加入聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic）acid，PLGA]空白微球，制備多孔磷酸鈣/骨基質明膠復合骨水泥（以下簡稱多孔復合骨水泥）。然后將此復合材料用于修復兔椎體骨缺損模型，探討其對椎體骨缺損修復重建作用，為下一步臨床試驗奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年新西蘭兔 4 只，雌雄不限，體質量 2.5～3.5 kg； 2 月齡新西蘭兔 30 只，雌雄各半，體質量 1.8～2.2 kg；均由西南醫科大學動物實驗中心提供。
PLGA （聚乳酸∶羥基乙酸=75∶25，特性黏度 0.65～0.75 dL/g，分子量 87 000～106 000；濟南岱罡生物工程有限公司）；異丙醇（天津市科密歐科技有限公司）；CPC（上海瑞邦生物材料有限公司）。高速乳化機（鞏義市予華儀器有限責任公司）；硬組織切片機（Leica 公司，德國）；micro-CT（Siemens 公司，德國）；INSTRON 8874 生物力學試驗機（INSTRON 公司，美國）。
1.2 多孔復合骨水泥制備及檢測
1.2.1 BMG 的制備
參考 Urist 等[6]方法，取 4 只成年新西蘭兔長管狀骨骨干，剔除軟組織、骨膜、干骺端，制成直徑 2～3 mm 骨顆粒，流水沖洗 2 h；液氮冷凍，粉碎機粉碎，經 60～80 目標準分樣篩篩取，得到直徑約 200 μm 的骨粉。24℃，分別加入 1∶1 氯仿甲醇溶液脫脂，0.6 mol/L HCl 溶液脫鈣，再加入氯仿甲醇溶液脫脂后，依次經 2 mol/L CaCl2 溶液、0.5 mol/L EDTA 溶液、8 mol/L LiCl 溶液處理；置于 55℃ 水浴 24 h 后，凍干，環氧已烷滅菌備用。
1.2.2 PLGA 空白微球制備
參考 W/O/W 復乳法[7]，將 1.0 g PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷中；注入 500 μL ddH2O，以 9 000 r/min 高速剪切 1 min 形成初乳；將初乳液快速加入至 20 mL 4% 聚乙烯醇中，在冰浴下以 9 000 r/min 高速剪切 2 min；轉移至裝有 400 mL 2% 異丙醇及 400 mL 0.3% 聚乙烯醇的 1 000 mL 燒杯中，24℃ 低速攪拌 5 h，使有機溶劑揮發；靜置 20 min，棄上清，以離心半徑 13.5 cm，2 000 r/min 離心 5 min；加 5 mL ddH2O 漂洗，棄上清，同上法再次離心 5 min，反復漂洗，收集微球，冷凍干燥。
1.2.3 多孔復合骨水泥制備
根據前期研究結果[8]，將 CPC 與 BMG 以質量比 5∶1 混合制成 CPC/BMG 固相粉末。CPC/BMG 粉末與 PLGA 空白微球混合，微球所占質量百分比為 5%；然后以 1 mol/L PBS 作為液相，按照固液比 1 g∶0.6 mL 添加至固相混合粉末，獲得多孔復合骨水泥。
1.2.4 理化特性測試
將多孔復合骨水泥固相和液相在室溫下混合，攪拌均勻成漿體，注入裝有 37℃PBS 溶液的培養皿中，靜置 30 min 后震蕩液體觀察樣本潰散情況。將骨水泥漿體注入直徑 6 mm、長 12 mm 標準模具（模具由聚四氟乙烯塑料管制成），室溫下干燥后，37℃ 水浴 24 h，再置于 37℃ 烤箱中干燥至恒重，脫模、取樣。取樣本采用阿基米德排水法測量其孔隙率（n=10）；另于生物力學試驗機上行抗壓測試，加載速度為 1 mm/min，測算抗壓強度（n=10）。以上各項檢測均以 CPC 作為對照。
1.3 實驗分組及方法
將 30 只 2 月齡新西蘭兔隨機分為實驗組及對照組（n=15）。兩組動物經耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，以 L3 棘突為中心，作腰背部脊柱后正中切口，由右側骨膜下剝離椎旁肌，暴露 L3 椎板和上、下關節突關節，暴露 L3 橫突、L3 椎頭側右側前方約 1 cm 可操作區域。以 L3 橫突基底為標志，在椎體右前方用薄椎板咬骨鉗制備 4 mm×3 mm×3 mm（長×寬×高）骨缺損。根據分組分別在骨缺損中填入多孔復合骨水泥（實驗組）和 CPC（對照組），植入量以材料填充滿缺損為宜。間斷縫合切口。手術當天及術后第 1 天各肌肉注射青霉素 20 萬 U 預防感染。術后第 4、8、12 周，每組各取 5 只動物，采用空氣栓塞法處死，切取標本（包括骨水泥填充椎體及遠、近端正常椎體），剔除周圍韌帶及肌肉，修剪成 4 cm 長標準樣本進行觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
觀察手術情況和術后動物飲食、活動、切口愈合情況。
1.4.2 X 線片觀察
取標本攝正側位X線片，觀察植入材料與宿主骨融合情況。曝光條件：電壓80 kV、電流125 mA、曝光時間40 ms、投照距離100 cm。
1.4.3 Micro-CT 檢測
取標本行 micro-CT 掃描，所得圖像經三維可視化重建及自帶骨骼分析軟件后處理，選取椎體內復合材料植入感興趣區域，測算骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. Th.）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N.）和骨小梁分離度（trabecular spacing，Tb. Sp.）。
1.4.4 組織學觀察
將標本置于 4% 多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，過濾及包埋，硬組織切片，片厚 60 μm，甲苯胺藍染色。鏡下觀察植入材料周圍及內部新生骨形成情況。椎體骨為淺藍色，新生骨為深藍色，材料為灰色。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 理化特性觀察
靜置后兩種骨水泥在 PBS 液體中大體形狀完整，無明顯潰散，提示均有較好抗潰散性。見圖 1。多孔復合骨水泥孔隙率為 55.06%±1.18%，抗壓強度為（51.63±6.73） MPa，與 CPC 的孔隙率 49.38%±1.75% 及抗壓強度（63.34±3.27）MPa 相比，差異有統計學意義（t=4.254，P=0.006；t=2.476，P=0.034）。
圖1
骨水泥抗潰散性觀察
a. CPC；b. 多孔復合骨水泥
Figure1. Anti-washout observation of the cementsa. CPC; b. Porous composite cement
2.2 一般情況
兩組動物手術順利完成，手術時間約 60 min，無神經、血管損傷等并發癥。術后無切口感染發生，對照組 2 只動物出現切口裂開再次縫合后愈合。所有動物均存活至實驗完成。
2.3 X 線片觀察
隨時間延長，兩組材料與宿主之間的邊界逐步模糊。對照組第 4、8 周可見材料與椎體有明顯邊界，第 12 周邊界模糊但仍然可見； 實驗組第 4 周材料與椎體邊界變模糊，第 8、12 周材料與宿主邊界逐步消失并融合為一體。見圖 2。
圖2
兩組各時間點 X 線片觀察
箭頭示骨水泥植入部位 從左至右分別為第 4、8、12 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure2. X-ray films at different time points in 2 groupsArrow indicated cement implanting area From left to right for 4, 8, and 12 weeksa. Control group; b. Experimental group
2.4 micro-CT 檢測
隨著時間延長，兩組 BMD、BVF、Tb. Th.和 Tb. N.逐步增大，Tb. Sp.逐步減小。各時間點實驗組以上指標與對照組相比，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
兩組新生骨檢測指標比較（n=5，
）
Table1.
Comparison of assessment of new-born bone in 2 groups (n=5,
)
2.5 組織學觀察
對照組：第 4 周骨缺損邊緣有極少量新骨生長；第 8 周見新生骨由周圍向中部生長，材料中部無新骨形成；第 12 周新生骨逐步長入至材料中部，并有少量骨橋形成。實驗組：第 4 周材料開始降解吸收，逐步有新生骨長入；第 8 周材料邊緣及中部骨細胞增生活躍，形成顆粒狀或散在骨島；第 12 周，新生骨增多，部分相互連接，由編織骨重塑為板層骨，材料周圍新生骨與宿主骨形成骨性連接，無論是材料與宿主接觸周圍還是材料中部均有大量新生骨。見圖 3。
圖3
兩組各時間點組織學觀察（甲苯胺藍×200）
NB：新生骨，HB：宿主骨，M：骨水泥，F：成纖維細胞 從左至右分別為第 4、8、12 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure3. Histological observation at different time points in 2 groups (Toluidine blue × 200)NB: New-born bone, HB: Host bone, M: Cements, F: Fibroblasts From left to right for 4, 8, and 12 weeks a. Control group; b. Experimental group
3 討論
3.1 多孔復合骨水泥理化性質分析
研究表明，BMG 具有強誘導成骨活性，其成骨能力與自體骨相似[9]。PLGA 空白微球在體內可快速降解，降解產物無毒無害，微球降解后留下的孔隙有利于骨組織和血管長入[10]。同時，PLGA 降解的酸性產物和孔隙中組織液滲入也有助于材料降解[11]。因此，本研究選擇將 BMG 和 PLGA 加入 CPC 固相中，探討制備具有傳導成骨和誘導成骨活性的多孔復合骨水泥的可行性。
結果顯示，本研究構建的多孔復合骨水泥抗潰散較好。與 CPC 相比，材料孔隙率增至 55.06%±1.18%，這有助于體液滲入和新生骨組織長入[10]；但 PLGA 空白微球的加入也使多孔復合骨水泥的抗壓強度明顯降低。文獻報道，人體松質骨的抗壓強度為 4～12 MPa，皮質骨強度為 130～180 MPa[12]。本研究制備的多孔復合骨水泥的抗壓強度為（51.63±6.73）MPa，超過松質骨的強度，可以達到皮質骨 1/4～1/2 強度，提示有望用于承重部位的骨缺損修復[13]。
3.2 動物體內實驗分析
3.2.1 動物模型選擇
脊柱是重要的承重部位，兔腰椎在椎體兩端鄰近椎間盤部位膨大，便于制作骨缺損模型。另外，兔前肢欠發達，生活體位以半直立屈曲位為主，脊柱在此體位處于負重狀態，用腰椎椎體骨缺損模型能模擬人椎體骨折愈合過程[14]。本研究采用兔腰椎椎體作骨缺損模型，手術經后路從 L3 橫突基底剝離至椎體側前方，用統一規格椎板咬骨鉗，制作一致性較好的可重復骨缺損模型，術中未發生神經血管損傷及動物死亡等并發癥。
3.2.2 觀測結果分析
多孔復合骨水泥修復兔腰椎椎體骨缺損模型術后，未出現異物排斥反應。micro-CT 和組織學觀察顯示，材料植入區周圍無組織變性、壞死出現。植入第 4 周，材料與周圍骨組織之間有縫隙，隨著時間延長，在第 8 周時縫隙模糊或消失，在第 12 周時復合材料與周圍骨組織之間形成骨性連接、融合或骨組織已長入材料內部，這表明多孔復合骨水泥與兔椎體骨組織之間有良好的組織相容性。大量 CPC、BMG 與 PLGA 相關研究顯示，單純使用以上材料均具有良好生物相容性[15-18]。本研究結果顯示 CPC、BMG 與 PLGA 復合后，仍具有良好的生物相容性。
骨移植替代材料修復骨缺損的主要機制包括骨傳導和骨誘導。骨傳導是以材料為支架，新生血管、新生骨沿著孔隙長入材料內部，破骨細胞導致材料的逐步降解吸收，成骨細胞形成新骨不斷修復骨缺損，最終完成材料的降解和骨缺損的重建[19-20]。骨誘導是通過人工復合材料攜帶的生長因子對 MSCs 趨化、誘導，使其分化為成軟骨細胞和成骨細胞，從而完成骨組織的再生與修復[21-22]。BMP、MSCs、骨生長環境是誘導成骨的關鍵要素，BMP 作為誘導刺激物作用于 MSCs，在有利于骨生長的血液環境中，誘導刺激骨形成[23-25]。異種骨或同種異體骨經過脫脂、脫鈣、脫蛋白處理后制成 BMG，去掉了除 BMP 以外 95% 的非膠原蛋白和具有阻滯作用的脂質成分。因此，BMG 具有一定強度和孔隙，免疫原性低，生物相容性好，在體內可誘導成骨前體細胞，產生骨原細胞，經成骨細胞形成新骨，并逐漸吸收，被新骨所替代[6]。
本研究發現，CPC 植入后，新生骨自周圍長入，隨著時間延長，逐步向材料中部生長，CPC 材料在兔椎體骨缺損部位起骨傳導作用，CPC 降解的同時，新生骨逐步長入，與文獻報道一致[26-27]；加入 PLGA 空白微球的多孔復合骨水泥顯示了優越的生物活性，材料周圍及中部均有大量新生骨長入。結果表明，多孔材料同時具有骨傳導和骨誘導活性。早期以 CPC 材料為支架，周圍新生血管、新生骨長入[28]；隨著 PLGA 空白微球的迅速降解，降解后留下的大孔有助于組織液的滲入、血管與新生骨長入，材料內部的 BMG 與之充分接觸，BMG 內的 BMP 發揮作用，誘導 MSCs 分化為成軟骨細胞和成骨細胞[24-25, 29]。本研究結果顯示，多孔復合骨水泥材料植入后，可在椎體骨缺損周圍及中部發現有成骨細胞，提示材料周圍及中央新骨同步形成，多孔復合骨水泥兼具骨誘導活性和骨傳導作用，可以有效修復兔椎體骨缺損，為臨床應用該骨水泥提供了實驗依據。
磷酸鈣骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）是由磷酸四鈣和無水磷酸氫鈣配制而成，也稱為羥基磷灰石骨水泥[1]。CPC 具有良好的生物相容性和骨傳導性、可降解性并可以任意塑形，能滿足臨床上骨缺損修復的要求[2-3]。但是，單一的 CPC 脆性大，不具有骨誘導活性，而且骨水泥凝固后孔隙率較小，組織難以長入，生物活性差[4-5]。本研究選取 CPC 作為基體材料，與具有強誘導成骨活性的骨基質明膠（bone matrix gelatin，BMG）復合，并加入聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic）acid，PLGA]空白微球，制備多孔磷酸鈣/骨基質明膠復合骨水泥（以下簡稱多孔復合骨水泥）。然后將此復合材料用于修復兔椎體骨缺損模型，探討其對椎體骨缺損修復重建作用，為下一步臨床試驗奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年新西蘭兔 4 只，雌雄不限，體質量 2.5～3.5 kg； 2 月齡新西蘭兔 30 只，雌雄各半，體質量 1.8～2.2 kg；均由西南醫科大學動物實驗中心提供。
PLGA （聚乳酸∶羥基乙酸=75∶25，特性黏度 0.65～0.75 dL/g，分子量 87 000～106 000；濟南岱罡生物工程有限公司）；異丙醇（天津市科密歐科技有限公司）；CPC（上海瑞邦生物材料有限公司）。高速乳化機（鞏義市予華儀器有限責任公司）；硬組織切片機（Leica 公司，德國）；micro-CT（Siemens 公司，德國）；INSTRON 8874 生物力學試驗機（INSTRON 公司，美國）。
1.2 多孔復合骨水泥制備及檢測
1.2.1 BMG 的制備
參考 Urist 等[6]方法，取 4 只成年新西蘭兔長管狀骨骨干，剔除軟組織、骨膜、干骺端，制成直徑 2～3 mm 骨顆粒，流水沖洗 2 h；液氮冷凍，粉碎機粉碎，經 60～80 目標準分樣篩篩取，得到直徑約 200 μm 的骨粉。24℃，分別加入 1∶1 氯仿甲醇溶液脫脂，0.6 mol/L HCl 溶液脫鈣，再加入氯仿甲醇溶液脫脂后，依次經 2 mol/L CaCl2 溶液、0.5 mol/L EDTA 溶液、8 mol/L LiCl 溶液處理；置于 55℃ 水浴 24 h 后，凍干，環氧已烷滅菌備用。
1.2.2 PLGA 空白微球制備
參考 W/O/W 復乳法[7]，將 1.0 g PLGA 溶于 4 mL 二氯甲烷中；注入 500 μL ddH2O，以 9 000 r/min 高速剪切 1 min 形成初乳；將初乳液快速加入至 20 mL 4% 聚乙烯醇中，在冰浴下以 9 000 r/min 高速剪切 2 min；轉移至裝有 400 mL 2% 異丙醇及 400 mL 0.3% 聚乙烯醇的 1 000 mL 燒杯中，24℃ 低速攪拌 5 h，使有機溶劑揮發；靜置 20 min，棄上清，以離心半徑 13.5 cm，2 000 r/min 離心 5 min；加 5 mL ddH2O 漂洗，棄上清，同上法再次離心 5 min，反復漂洗，收集微球，冷凍干燥。
1.2.3 多孔復合骨水泥制備
根據前期研究結果[8]，將 CPC 與 BMG 以質量比 5∶1 混合制成 CPC/BMG 固相粉末。CPC/BMG 粉末與 PLGA 空白微球混合，微球所占質量百分比為 5%；然后以 1 mol/L PBS 作為液相，按照固液比 1 g∶0.6 mL 添加至固相混合粉末，獲得多孔復合骨水泥。
1.2.4 理化特性測試
將多孔復合骨水泥固相和液相在室溫下混合，攪拌均勻成漿體，注入裝有 37℃PBS 溶液的培養皿中，靜置 30 min 后震蕩液體觀察樣本潰散情況。將骨水泥漿體注入直徑 6 mm、長 12 mm 標準模具（模具由聚四氟乙烯塑料管制成），室溫下干燥后，37℃ 水浴 24 h，再置于 37℃ 烤箱中干燥至恒重，脫模、取樣。取樣本采用阿基米德排水法測量其孔隙率（n=10）；另于生物力學試驗機上行抗壓測試，加載速度為 1 mm/min，測算抗壓強度（n=10）。以上各項檢測均以 CPC 作為對照。
1.3 實驗分組及方法
將 30 只 2 月齡新西蘭兔隨機分為實驗組及對照組（n=15）。兩組動物經耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，以 L3 棘突為中心，作腰背部脊柱后正中切口，由右側骨膜下剝離椎旁肌，暴露 L3 椎板和上、下關節突關節，暴露 L3 橫突、L3 椎頭側右側前方約 1 cm 可操作區域。以 L3 橫突基底為標志，在椎體右前方用薄椎板咬骨鉗制備 4 mm×3 mm×3 mm（長×寬×高）骨缺損。根據分組分別在骨缺損中填入多孔復合骨水泥（實驗組）和 CPC（對照組），植入量以材料填充滿缺損為宜。間斷縫合切口。手術當天及術后第 1 天各肌肉注射青霉素 20 萬 U 預防感染。術后第 4、8、12 周，每組各取 5 只動物，采用空氣栓塞法處死，切取標本（包括骨水泥填充椎體及遠、近端正常椎體），剔除周圍韌帶及肌肉，修剪成 4 cm 長標準樣本進行觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
觀察手術情況和術后動物飲食、活動、切口愈合情況。
1.4.2 X 線片觀察
取標本攝正側位X線片，觀察植入材料與宿主骨融合情況。曝光條件：電壓80 kV、電流125 mA、曝光時間40 ms、投照距離100 cm。
1.4.3 Micro-CT 檢測
取標本行 micro-CT 掃描，所得圖像經三維可視化重建及自帶骨骼分析軟件后處理，選取椎體內復合材料植入感興趣區域，測算骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb. Th.）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N.）和骨小梁分離度（trabecular spacing，Tb. Sp.）。
1.4.4 組織學觀察
將標本置于 4% 多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，過濾及包埋，硬組織切片，片厚 60 μm，甲苯胺藍染色。鏡下觀察植入材料周圍及內部新生骨形成情況。椎體骨為淺藍色，新生骨為深藍色，材料為灰色。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 理化特性觀察
靜置后兩種骨水泥在 PBS 液體中大體形狀完整，無明顯潰散，提示均有較好抗潰散性。見圖 1。多孔復合骨水泥孔隙率為 55.06%±1.18%，抗壓強度為（51.63±6.73） MPa，與 CPC 的孔隙率 49.38%±1.75% 及抗壓強度（63.34±3.27）MPa 相比，差異有統計學意義（t=4.254，P=0.006；t=2.476，P=0.034）。
圖1
骨水泥抗潰散性觀察
a. CPC；b. 多孔復合骨水泥
Figure1. Anti-washout observation of the cementsa. CPC; b. Porous composite cement
2.2 一般情況
兩組動物手術順利完成，手術時間約 60 min，無神經、血管損傷等并發癥。術后無切口感染發生，對照組 2 只動物出現切口裂開再次縫合后愈合。所有動物均存活至實驗完成。
2.3 X 線片觀察
隨時間延長，兩組材料與宿主之間的邊界逐步模糊。對照組第 4、8 周可見材料與椎體有明顯邊界，第 12 周邊界模糊但仍然可見； 實驗組第 4 周材料與椎體邊界變模糊，第 8、12 周材料與宿主邊界逐步消失并融合為一體。見圖 2。
圖2
兩組各時間點 X 線片觀察
箭頭示骨水泥植入部位 從左至右分別為第 4、8、12 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure2. X-ray films at different time points in 2 groupsArrow indicated cement implanting area From left to right for 4, 8, and 12 weeksa. Control group; b. Experimental group
2.4 micro-CT 檢測
隨著時間延長，兩組 BMD、BVF、Tb. Th.和 Tb. N.逐步增大，Tb. Sp.逐步減小。各時間點實驗組以上指標與對照組相比，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
兩組新生骨檢測指標比較（n=5，
）
Table1.
Comparison of assessment of new-born bone in 2 groups (n=5,
)
2.5 組織學觀察
對照組：第 4 周骨缺損邊緣有極少量新骨生長；第 8 周見新生骨由周圍向中部生長，材料中部無新骨形成；第 12 周新生骨逐步長入至材料中部，并有少量骨橋形成。實驗組：第 4 周材料開始降解吸收，逐步有新生骨長入；第 8 周材料邊緣及中部骨細胞增生活躍，形成顆粒狀或散在骨島；第 12 周，新生骨增多，部分相互連接，由編織骨重塑為板層骨，材料周圍新生骨與宿主骨形成骨性連接，無論是材料與宿主接觸周圍還是材料中部均有大量新生骨。見圖 3。
圖3
兩組各時間點組織學觀察（甲苯胺藍×200）
NB：新生骨，HB：宿主骨，M：骨水泥，F：成纖維細胞 從左至右分別為第 4、8、12 周 a. 對照組；b. 實驗組
Figure3. Histological observation at different time points in 2 groups (Toluidine blue × 200)NB: New-born bone, HB: Host bone, M: Cements, F: Fibroblasts From left to right for 4, 8, and 12 weeks a. Control group; b. Experimental group
3 討論
3.1 多孔復合骨水泥理化性質分析
研究表明，BMG 具有強誘導成骨活性，其成骨能力與自體骨相似[9]。PLGA 空白微球在體內可快速降解，降解產物無毒無害，微球降解后留下的孔隙有利于骨組織和血管長入[10]。同時，PLGA 降解的酸性產物和孔隙中組織液滲入也有助于材料降解[11]。因此，本研究選擇將 BMG 和 PLGA 加入 CPC 固相中，探討制備具有傳導成骨和誘導成骨活性的多孔復合骨水泥的可行性。
結果顯示，本研究構建的多孔復合骨水泥抗潰散較好。與 CPC 相比，材料孔隙率增至 55.06%±1.18%，這有助于體液滲入和新生骨組織長入[10]；但 PLGA 空白微球的加入也使多孔復合骨水泥的抗壓強度明顯降低。文獻報道，人體松質骨的抗壓強度為 4～12 MPa，皮質骨強度為 130～180 MPa[12]。本研究制備的多孔復合骨水泥的抗壓強度為（51.63±6.73）MPa，超過松質骨的強度，可以達到皮質骨 1/4～1/2 強度，提示有望用于承重部位的骨缺損修復[13]。
3.2 動物體內實驗分析
3.2.1 動物模型選擇
脊柱是重要的承重部位，兔腰椎在椎體兩端鄰近椎間盤部位膨大，便于制作骨缺損模型。另外，兔前肢欠發達，生活體位以半直立屈曲位為主，脊柱在此體位處于負重狀態，用腰椎椎體骨缺損模型能模擬人椎體骨折愈合過程[14]。本研究采用兔腰椎椎體作骨缺損模型，手術經后路從 L3 橫突基底剝離至椎體側前方，用統一規格椎板咬骨鉗，制作一致性較好的可重復骨缺損模型，術中未發生神經血管損傷及動物死亡等并發癥。
3.2.2 觀測結果分析
多孔復合骨水泥修復兔腰椎椎體骨缺損模型術后，未出現異物排斥反應。micro-CT 和組織學觀察顯示，材料植入區周圍無組織變性、壞死出現。植入第 4 周，材料與周圍骨組織之間有縫隙，隨著時間延長，在第 8 周時縫隙模糊或消失，在第 12 周時復合材料與周圍骨組織之間形成骨性連接、融合或骨組織已長入材料內部，這表明多孔復合骨水泥與兔椎體骨組織之間有良好的組織相容性。大量 CPC、BMG 與 PLGA 相關研究顯示，單純使用以上材料均具有良好生物相容性[15-18]。本研究結果顯示 CPC、BMG 與 PLGA 復合后，仍具有良好的生物相容性。
骨移植替代材料修復骨缺損的主要機制包括骨傳導和骨誘導。骨傳導是以材料為支架，新生血管、新生骨沿著孔隙長入材料內部，破骨細胞導致材料的逐步降解吸收，成骨細胞形成新骨不斷修復骨缺損，最終完成材料的降解和骨缺損的重建[19-20]。骨誘導是通過人工復合材料攜帶的生長因子對 MSCs 趨化、誘導，使其分化為成軟骨細胞和成骨細胞，從而完成骨組織的再生與修復[21-22]。BMP、MSCs、骨生長環境是誘導成骨的關鍵要素，BMP 作為誘導刺激物作用于 MSCs，在有利于骨生長的血液環境中，誘導刺激骨形成[23-25]。異種骨或同種異體骨經過脫脂、脫鈣、脫蛋白處理后制成 BMG，去掉了除 BMP 以外 95% 的非膠原蛋白和具有阻滯作用的脂質成分。因此，BMG 具有一定強度和孔隙，免疫原性低，生物相容性好，在體內可誘導成骨前體細胞，產生骨原細胞，經成骨細胞形成新骨，并逐漸吸收，被新骨所替代[6]。
本研究發現，CPC 植入后，新生骨自周圍長入，隨著時間延長，逐步向材料中部生長，CPC 材料在兔椎體骨缺損部位起骨傳導作用，CPC 降解的同時，新生骨逐步長入，與文獻報道一致[26-27]；加入 PLGA 空白微球的多孔復合骨水泥顯示了優越的生物活性，材料周圍及中部均有大量新生骨長入。結果表明，多孔材料同時具有骨傳導和骨誘導活性。早期以 CPC 材料為支架，周圍新生血管、新生骨長入[28]；隨著 PLGA 空白微球的迅速降解，降解后留下的大孔有助于組織液的滲入、血管與新生骨長入，材料內部的 BMG 與之充分接觸，BMG 內的 BMP 發揮作用，誘導 MSCs 分化為成軟骨細胞和成骨細胞[24-25, 29]。本研究結果顯示，多孔復合骨水泥材料植入后，可在椎體骨缺損周圍及中部發現有成骨細胞，提示材料周圍及中央新骨同步形成，多孔復合骨水泥兼具骨誘導活性和骨傳導作用，可以有效修復兔椎體骨缺損，為臨床應用該骨水泥提供了實驗依據。
