引用本文： 孫紅, 張志奇, 黃志宇, 毛谷平, 余寶禧, 張程云, 傅明. 成軟骨相關 miR-4287 調控人軟骨細胞聚蛋白多糖酶-1 表達的研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(12): 1468-1473. doi: 10.7507/1002-1892.201704065 復制
軟骨細胞外基質是關節軟骨的重要組成部分，其進行性丟失是關節軟骨退變的特征性改變[1]。軟骨細胞外基質代謝包括合成代謝和分解代謝，正常軟骨組織中兩者處于動態平衡，而骨關節炎軟骨組織中分解代謝占優勢。聚蛋白多糖酶-1 是軟骨細胞外基質分解代謝的重要酶類，屬于帶有血小板凝血酶敏感蛋白結構域的解聚素與金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS）家族，即 ADAMTS4。ADAMTS4 具有切割、水解作用，廣泛參與軟骨細胞外基質聚蛋白多糖降解[2]。近年來研究發現，miRNA 在骨關節炎軟骨細胞外基質代謝中扮演著重要角色[3]。miRNA 通過負性調控軟骨細胞外基質代謝相關基因表達，從而穩定或打破軟骨基質代謝內環境平衡[4]。miR-320、miR-455-3p、miR-92a 等在軟骨形成過程中具有重要作用，同時這些與軟骨形成相關的 miRNA 也參與了骨關節炎軟骨細胞外基質代謝調控[5-8]。
本課題組前期研究結果表明，miR-4287 在脂肪干細胞誘導成軟骨過程中發生了差異性表達，提示其與軟骨形成密切相關[8]，但目前 miR-4287 在軟骨細胞外基質代謝中的作用尚未見報道。生物信息學提示 ADAMTS4 mRNA 3’ 非翻譯區（untranslated region，UTR）存在 miR-4287 結合位點。因此，我們推測 miR-4287 可能以直接結合方式抑制軟骨細胞 ADAMTS4 表達。本研究應用 IL-1β 處理軟骨細胞，誘導炎癥模型產生，通過實時熒光定量 PCR 檢測 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表達；并進一步轉染 miR-4287 模擬物和抑制物，探討 miR-4287 對軟骨細胞 ADAMTS4 的調控作用及機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗標本
膝關節軟骨組織取自 2016 年 8 月—2017 年 1 月于中山大學附屬第一醫院關節外科或骨腫瘤科住院患者，取材經過中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準以及患者及家屬知情同意。其中，正常軟骨取自 10 例行截肢術或保肢-腫瘤型膝關節假體置換術患者的股骨髁、脛骨平臺；男 7 例，女 3 例；年齡 12～50 歲，平均 23.5 歲。骨關節炎軟骨取自 23 例因骨關節炎行人工全膝關節置換術患者的股骨髁、脛骨平臺；男 7 例，女 15 例；年齡 50～81 歲，平均 69.9 歲。
1.2 主要試劑及儀器
IL-1β（PeproTech 公司，美國）；膠原酶（Sigma 公司，美國）；MAPK 信號通路抑制劑 SP600125、NF-κB 信號通路抑制劑 SN50（Calbiochem 公司，美國）；miR-4287 模擬物及其陰性對照、miR-4287 抑制物及其陰性對照（廣州銳博生物材料有限公司）；轉染試劑 Lipofectamine? 2000、優化培養基 OPTI-MEM（Life Technologies 公司，美國）；兔抗鼠 ADAMTS4 抗體、兔抗鼠 GAPDH 抗體（Millipore 公司，美國）；RIPA 裂解液、絲氨酸蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白定量試劑盒、山羊抗兔二抗（北京康為世紀生物科技有限公司）；熒光素酶報告載體構建由上海和元生物技術有限公司完成。
CO2 恒溫培養箱（Thermo Forma 公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；倒置相差顯微鏡（Thermo Shandn 公司，美國）；低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；超微量紫外分光光度計（BioTek 公司，美國）；普通梯度 PCR 儀（BIAMETRA 公司，德國）；實時熒光定量 PCR 系統 ABI ViiATM7Dx（Applied Biosystems 公司，美國）；超靈敏化學發光成像儀（GE 公司，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 軟骨細胞分離培養
無菌條件下，將正常及骨關節炎軟骨組織分別置于 10 cm 培養皿中，盡量剪碎軟骨組織，并稱重。PBS 清洗后加入 0.25% 胰蛋白酶，于 37℃ 培養箱中振蕩消化 30 min，棄上清，PBS 清洗 3 次；加入 1 ng/mL 膠原酶，于 37℃ 培養箱中振蕩消化 4～6 h，用 70 μm 細胞濾網過濾，1 500×g 離心 5 min，收集細胞。將正常及骨關節炎軟骨細胞分別接種于 25 cm2或 75 cm2培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱中培養，隔天換液 1 次，取第 1 代細胞用于后續實驗。
1.3.2 正常及骨關節炎軟骨組織中 miR-4287 和 ADAMTS4 表達情況
取正常及骨關節炎軟骨組織，盡量剪碎后并置于研磨皿中。加入液氮，快速研磨后加入適量 Trizol 試劑，總 RNA 抽提后使用實時熒光定量 PCR 檢測組織內 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表達量。
1.3.3 IL-1β 對軟骨細胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表達的影響
將生長狀態良好的骨關節炎軟骨細胞按 3×105個/孔接種于 12 孔板，加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基，置于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱中培養，24 h 后更換含 5 ng/mL IL-1β 的無血清培養基繼續培養。分別于培養 3、6、12 h 收集 2～3 孔細胞，采用實時熒光定量 PCR 檢測 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表達量。以正常培養 3、6、12 h 的骨關節炎軟骨細胞作為對照組。實驗重復 3 次。
1.3.4 IL-1β 介導的信號通路對軟骨細胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表達的影響
取骨關節炎軟骨細胞，按 1×105個/孔接種于 24 孔板，加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基，置于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱中培養。24 h 后分別給予 10 μmol/L MAPK 信號通路抑制劑 SP600125 以及 5 μmol/L NF-κB 信號通路抑制劑 SN50，預處理 2 h；然后加入 1 ng/mL IL-1β 刺激 6 h，取細胞采用實時熒光定量 PCR 檢測 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表達量。以單純 1 ng/mL IL-1β 刺激 6 h 處理的骨關節炎軟骨細胞作為對照。實驗重復 3 次。
1.3.5 miR-4287 調控軟骨細胞 ADAMTS4 表達觀察
取骨關節炎軟骨細胞，按 3×105個/孔接種于 12 孔板，加入不含抗生素的培養基培養 24 h 后，將細胞隨機分為 4 組，參照 Lipofectamine? 2000 說明書，分別采用 50 μmol/L miR-4287 模擬物和陰性對照模擬物、100 μmol/L miR-4287 抑制物和陰性對照抑制物進行轉染。轉染 48 h 后收集各組細胞，采用實時熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測 ADAMTS4 mRNA 及蛋白表達量。
1.4 檢測方法
1.4.1 實時熒光定量 PCR 檢測
取收集的軟骨細胞進行總 RNA 提取及逆轉錄，超微量紫外分光光度計檢測總 RNA 質量和濃度。取 1 μg 總 RNA 按 PrimeScriptTM RT 試劑盒步驟進行逆轉錄。根據 SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒說明書進行實時 PCR 反應。miR-4287 擴增體系共 10 μL：SYBR 5.0 μL，ROX 0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.2 μL，下游引物（10 μmol/L）0.2 μL；擴增程序：95℃ 預變性 10 s；PCR 反應，95℃5 s、60℃20 s，40 個循環。ADAMTS4 mRNA 擴增體系 10 μL：SYBR 5.0 μL，ROX 0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL；稀釋 cDNA 1.0 μL，無酶水 3 μL。擴增程序：95℃ 預變性 2 min；PCR 反應，95℃5 s、60℃34 s，擴增 40 個循環。引物序列：miR-4287，上游5′-CTTGAGGGCACTTTAAAAAAAAA-3′；U6，上游 5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，下游 5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′；ADAMTS4，上游 5′-TTTCCCTGGCAAGGACTATG-3′，下游 5′-GGAGGAGAACTGGACACCAC-3′；GAPDH，上游 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游 5′-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。以 U6 或 GAPDH 作為內參基因，采用 2-ΔΔCt相對定量法分析 miR-4287 及 ADAMTS4 mRNA 相對表達量。
1.4.2 Western blot 檢測
取收集的軟骨細胞，棄培養液，4℃ 預冷 PBS 清洗細胞 3 次，每孔加入 150 μL RIPA 裂解液，在冰上用細胞刮將細胞刮下至離心管中，繼續冰上裂解 30 min。以 14 000×g 離心 10 min，收集取上清，用 BSA 法檢測蛋白質濃度。蛋白液混合上樣緩沖液后煮沸變性，變性蛋白液樣品上樣至 12%SDS-PAGE，電泳后將蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜。5 % 脫脂奶粉封閉 1 h，加入一抗（兔抗鼠 ADAMTS4 抗體、兔抗鼠 GAPDH 抗體）孵育 12 h，TBST 洗滌 3 次，每次 5 min；加入山羊抗兔二抗孵育 2 h，TBST 洗滌 3 次，每次 5 min。加入化學發光液，超靈敏化學發光成像儀采集圖像。
1.5 熒光素酶報告實驗
將野生型或突變型 ADAMTS4 mRNA 3’ UTR 分別克隆至螢火蟲熒光素酶報告載體。分別共轉染 miR-4287 模擬物或模擬物陰性對照、野生型或突變型螢火蟲熒光素酶報告載體、海腎熒光素酶載體至 293T 工具細胞。共轉染 48 h 后裂解細胞，酶標儀檢測各組螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性比值，驗證 miR-4287 是否與 ADAMTS4 mRNA 靶向結合。實驗重復 3 次。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較組織樣本采用 Mann-Whitney 檢驗，細胞樣本采用配對 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；熒光素酶報告采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 正常和骨關節炎軟骨組織 miR-4287 和 ADAMTS4 表達
miR-4287 在正常和骨關節炎軟骨組織中均有表達。骨關節炎軟骨組織 miR-4287 相對表達量為 0.490±0.237，較正常軟骨組織（1.074±0.507）下降，比較差異有統計學意義（Z=–2.572，P=0.010）。骨關節炎軟骨組織 ADAMTS4 mRNA 相對表達量為 19.138±4.520，較正常軟骨組織（1.864±1.786）上升，比較差異有統計學意義（Z=–2.611，P=0.009）。
2.2 IL-1β 對軟骨細胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表達的影響
IL-1β 下調軟骨細胞 miR-4287 表達。IL-1β 刺激處理 3、6、12 h 后，骨關節炎軟骨細胞 miR-4287 相對表達量分別為 0.680±0.290、0.962±0.277、0.804±0.168，均較對照組（1.010±0.172、1.463±0.215、1.786±0.294）下降，比較差異有統計學意義（t=4.818，P=0.041；t=9.480，P=0.011；t=11.410，P=0.007）；IL-1β 處理組各時間點間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
IL-1β 上調軟骨細胞 ADAMTS4 mRNA 表達。IL-1β 刺激處理 3、6、12 h 后，骨關節炎軟骨細胞 ADAMTS4 mRNA 相對表達量分別為 3.935±1.554、17.973±4.609、24.032±9.275，均較對照組（1.175±0.660、0.536±0.233、1.746±1.400）升高，比較差異均有統計學意義（t=5.340，P=0.033；t=6.261，P=0.025；t=4.901，P=0.039）。隨著 IL-1β 刺激時間延長，ADAMTS4 mRNA 相對表達量逐漸上升，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 IL-1β 介導的信號通路對軟骨細胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表達的影響
SP600125 預處理+IL-1β 刺激組及 SN50 預處理+IL-1β 刺激組 miR-4287 相對表達量分別為 1.557±0.266 和 1.772±0.303，較 IL-1β 刺激組（1.002±0.086）升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
SP600125 預處理+IL-1β 刺激組及 SN50 預處理+IL-1β 刺激組 ADAMTS4 mRNA 相對表達量分別為 0.458±0.109 和 0.634±0.168，較 IL-1β 刺激組（1.004±0.114）降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.4 miR-4287 調控軟骨細胞 ADAMTS4 表達
轉染 48 h 后實時熒光定量 PCR 檢測示，miR-4287 模擬物組 ADAMTS4 mRNA 相對表達量為 0.402±0.353，較 miR-4287 模擬物陰性對照組（1.077±0.525）下降，比較差異有統計學意義（t=4.832，P=0.040）；miR-4287 抑制物組 ADAMTS4 mRNA 相對表達量為 3.698±0.900，較 miR-4287 抑制物陰性對照組（1.0435±0.346）升高，比較差異有統計學意義（t=6.397，P=0.024）。
Western blot 檢測示，miR-4287 模擬物組 ADAMTS4 蛋白相對表達量為 0.400±0.016，較 miR-4287 模擬物陰性對照組（0.572±0.050）下降，差異有統計學意義（t=5.722，P=0.005）。miR-4287 抑制物組 ADAMTS4 蛋白相對表達量為 1.045±0.040，較 miR-4287 抑制物陰性對照組（0.600±0.024）升高，差異有統計學意義（t=–16.469，P=0.000）。見圖 1。
圖1
Western blot 檢測各組轉染后ADAMTS4蛋白表達
1：miR-4287 模擬物陰性對照組；2：miR-4287 模擬物組；3：miR-4287 抑制物陰性對照組；4：miR-4287 抑制物組
Figure1. Expression of ADAMTS4 protein by Western blot after transfection1: miR-4287 mimics negative control group; 2: miR-4287 mimics group; 3: miR-4287 inhibitors negative control group; 4: miR-4287 inhibitors group
2.5 驗證 miR-4287 與 ADAMTS4 mRNA 靶向結合
報告載體攜帶野生型 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 時，miR-4287 模擬物陰性對照組雙螢光素酶活性比值為 1.000±0.113，miR-4287 模擬物組為 0.982±0.085，比較差異無統計學意義（t=0.318，P=0.757）。報告載體攜帶突變型 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 時，miR-4287 模擬物陰性對照組雙螢光素酶活性比值為 1.000±0.046，miR-4287 模擬物組為 0.970±0.085，比較差異無統計學意義（t=0.768，P=0.460）。見圖 2。
圖2
熒光素酶報告實驗驗證 miR-4287 與 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 結合
Figure2.
Validation the direct interaction of miR-4287 and ADAMTS4 mRNA 3’UTR by luciferase reporter assay
3 討論
miRNA 是一類內源性非編碼蛋白的小 RNA 分子，大小為 19～25 個核苷酸，普遍存在于植物和動物基因組中。miRNA 作用方式較為明確，主要通過與目的基因 mRNA 分子的 3’UTR 互補結合，導致靶基因 mRNA 裂解或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平沉默目的基因 mRNA [9]。隨著對 miRNA 研究的不斷加深，人們逐漸認識到 miRNA 在細胞分化、細胞周期以及凋亡等過程中具有重要作用[10]。眾多證據表明 miRNA 也參與了軟骨細胞的分化、增殖及凋亡等過程，因此與軟骨形成、骨關節炎發生發展息息相關[11-12]。成軟骨相關 miRNA 往往也在骨關節炎疾病進程中扮演著重要角色。據報道，miR-320c[5]、miR-455-3p[6]、miR-92a-3p[7]與成軟骨分化密切相關，同時也能負性調控軟骨細胞外基質代謝相關基因 MMP-13、HDAC2 表達，從而減緩軟骨細胞基質降解、退變。
目前對 miR-4287 的研究主要見于高通量芯片篩選出的疾病相關 miRNA 表達譜[13-15]，尚無 miR-4287 功能鑒定文獻報道。我們前期研究發現，miR-4287 在成軟骨分化過程中差異表達，推測其可能與軟骨退變相關，本次研究旨在初步探索 miR-4287 在人軟骨退變中的作用。結果表明，miR-4287 骨關節炎軟骨組織和軟骨細胞炎癥模型中表達均降低，提示 miR-4287 可能是一種與軟骨退變相關的 miRNA。
致炎因子 IL-1β 介導的軟骨退變相關基因表達、軟骨細胞外基質降解主要依賴 MAPK 信號通路和 NF-κB 信號通路轉導[3, 16]。據報道，MAPK 信號通路和 NF-κB 信號通路也可參與軟骨細胞內 miRNA（如 miR-558、miR-127-5p）的表達調控，而 IL-1β 誘導的 miR-558、miR-127-5p 表達下降作用可被上述通路抑制劑所拮抗[17-18]。本研究中，阻斷 MAPK 通路和 NF-κB 信號通路能抵消 IL-1β 對 miR-4287 表達的抑制效應，說明 IL-1β 介導的下游信號通路在 miR-4287 表達調控中具有重要作用。
miRNA 是一種調節軟骨細胞外代謝的重要因素[19]。據報道，miR-127-5p 在骨關節炎軟骨組織中下調，體外實驗證實 miR-127-5p 可直接與 MMP-13 mRNA 結合，抑制 IL-1β 誘導的 MMP-13 表達，從而減緩 Ⅱ 型膠原降解[18]。miR-125b 也可與 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 特定位點結合，從而抑制后者對聚蛋白多糖的降解[20]。通過查閱 TargerScan miRNAs 靶基因預測工具，我們發現 ADAMTS4 3’UTR 中存在能與 miR-4287 匹配的序列。轉染實驗表明，miR-4287 對 ADAMTS4 表達有明顯的抑制效應。而用 siRNA 抑制 miR-4287 功能，上述抑制效應又可被抵消。因此，我們推測 ADAMTS4 可能是 miR-4287 的靶基因。然而熒光素酶實驗結果顯示，無論該預測結合位點為野生型或突變型，miR-4287 均不能改變與其串聯表達的熒光素酶活性。上述結果提示，雖然 miR-4287 能下調 ADAMTS4 表達，但 ADAMTS4 并不是 miR-4287 的靶基因，其對 ADAMTS4 的表達調控并不是通過與 3’UTR 直接結合的方式發揮作用。
綜上述，本研究初步表明，成軟骨相關 miR-4287 能調控軟骨細胞 ADAMTS4 表達，是一種與軟骨退變密切相關的 miRNA。然而本研究并未能揭示 miR-4287 調控軟骨細胞 ADAMTS4 表達的具體機制。據報道，miRNAs 也可通過其他方式間接調控軟骨 ADAMTS4 表達。有研究證實，ADAMTS4 是轉錄因子 RUNX2 潛在的下游靶標，miR-105 通過抑制 RUNX2 的表達和功能，進而調節 ADAMTS4 表達[21]。HMGB1 是 NF-κB 信號通路的激活劑，miR-142-3p 可靶向抑制 HMGB1 功能，從而抑制 NF-κB 信號通路介導的軟骨細胞凋亡及炎性介質產生[22]。靶基因預測工具提示 RUNX2 和 HMGB1 mRNA 3’UTR 存在 miR-4287 結合位點，miR-4287 對于 ADAMTS4 的調控作用可能是通過 RUNX2 或 HMGB1 等分子來實現的。miR-4287 對 ADAMTS4 的調控是否通過上述兩種途徑發揮作用，還有待進一步研究。
軟骨細胞外基質是關節軟骨的重要組成部分，其進行性丟失是關節軟骨退變的特征性改變[1]。軟骨細胞外基質代謝包括合成代謝和分解代謝，正常軟骨組織中兩者處于動態平衡，而骨關節炎軟骨組織中分解代謝占優勢。聚蛋白多糖酶-1 是軟骨細胞外基質分解代謝的重要酶類，屬于帶有血小板凝血酶敏感蛋白結構域的解聚素與金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS）家族，即 ADAMTS4。ADAMTS4 具有切割、水解作用，廣泛參與軟骨細胞外基質聚蛋白多糖降解[2]。近年來研究發現，miRNA 在骨關節炎軟骨細胞外基質代謝中扮演著重要角色[3]。miRNA 通過負性調控軟骨細胞外基質代謝相關基因表達，從而穩定或打破軟骨基質代謝內環境平衡[4]。miR-320、miR-455-3p、miR-92a 等在軟骨形成過程中具有重要作用，同時這些與軟骨形成相關的 miRNA 也參與了骨關節炎軟骨細胞外基質代謝調控[5-8]。
本課題組前期研究結果表明，miR-4287 在脂肪干細胞誘導成軟骨過程中發生了差異性表達，提示其與軟骨形成密切相關[8]，但目前 miR-4287 在軟骨細胞外基質代謝中的作用尚未見報道。生物信息學提示 ADAMTS4 mRNA 3’ 非翻譯區（untranslated region，UTR）存在 miR-4287 結合位點。因此，我們推測 miR-4287 可能以直接結合方式抑制軟骨細胞 ADAMTS4 表達。本研究應用 IL-1β 處理軟骨細胞，誘導炎癥模型產生，通過實時熒光定量 PCR 檢測 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表達；并進一步轉染 miR-4287 模擬物和抑制物，探討 miR-4287 對軟骨細胞 ADAMTS4 的調控作用及機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗標本
膝關節軟骨組織取自 2016 年 8 月—2017 年 1 月于中山大學附屬第一醫院關節外科或骨腫瘤科住院患者，取材經過中山大學附屬第一醫院倫理委員會批準以及患者及家屬知情同意。其中，正常軟骨取自 10 例行截肢術或保肢-腫瘤型膝關節假體置換術患者的股骨髁、脛骨平臺；男 7 例，女 3 例；年齡 12～50 歲，平均 23.5 歲。骨關節炎軟骨取自 23 例因骨關節炎行人工全膝關節置換術患者的股骨髁、脛骨平臺；男 7 例，女 15 例；年齡 50～81 歲，平均 69.9 歲。
1.2 主要試劑及儀器
IL-1β（PeproTech 公司，美國）；膠原酶（Sigma 公司，美國）；MAPK 信號通路抑制劑 SP600125、NF-κB 信號通路抑制劑 SN50（Calbiochem 公司，美國）；miR-4287 模擬物及其陰性對照、miR-4287 抑制物及其陰性對照（廣州銳博生物材料有限公司）；轉染試劑 Lipofectamine? 2000、優化培養基 OPTI-MEM（Life Technologies 公司，美國）；兔抗鼠 ADAMTS4 抗體、兔抗鼠 GAPDH 抗體（Millipore 公司，美國）；RIPA 裂解液、絲氨酸蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白定量試劑盒、山羊抗兔二抗（北京康為世紀生物科技有限公司）；熒光素酶報告載體構建由上海和元生物技術有限公司完成。
CO2 恒溫培養箱（Thermo Forma 公司，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；倒置相差顯微鏡（Thermo Shandn 公司，美國）；低溫高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；超微量紫外分光光度計（BioTek 公司，美國）；普通梯度 PCR 儀（BIAMETRA 公司，德國）；實時熒光定量 PCR 系統 ABI ViiATM7Dx（Applied Biosystems 公司，美國）；超靈敏化學發光成像儀（GE 公司，美國）。
1.3 實驗方法
1.3.1 軟骨細胞分離培養
無菌條件下，將正常及骨關節炎軟骨組織分別置于 10 cm 培養皿中，盡量剪碎軟骨組織，并稱重。PBS 清洗后加入 0.25% 胰蛋白酶，于 37℃ 培養箱中振蕩消化 30 min，棄上清，PBS 清洗 3 次；加入 1 ng/mL 膠原酶，于 37℃ 培養箱中振蕩消化 4～6 h，用 70 μm 細胞濾網過濾，1 500×g 離心 5 min，收集細胞。將正常及骨關節炎軟骨細胞分別接種于 25 cm2或 75 cm2培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱中培養，隔天換液 1 次，取第 1 代細胞用于后續實驗。
1.3.2 正常及骨關節炎軟骨組織中 miR-4287 和 ADAMTS4 表達情況
取正常及骨關節炎軟骨組織，盡量剪碎后并置于研磨皿中。加入液氮，快速研磨后加入適量 Trizol 試劑，總 RNA 抽提后使用實時熒光定量 PCR 檢測組織內 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表達量。
1.3.3 IL-1β 對軟骨細胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表達的影響
將生長狀態良好的骨關節炎軟骨細胞按 3×105個/孔接種于 12 孔板，加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基，置于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱中培養，24 h 后更換含 5 ng/mL IL-1β 的無血清培養基繼續培養。分別于培養 3、6、12 h 收集 2～3 孔細胞，采用實時熒光定量 PCR 檢測 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表達量。以正常培養 3、6、12 h 的骨關節炎軟骨細胞作為對照組。實驗重復 3 次。
1.3.4 IL-1β 介導的信號通路對軟骨細胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表達的影響
取骨關節炎軟骨細胞，按 1×105個/孔接種于 24 孔板，加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基，置于 37℃、5%CO2 恒溫培養箱中培養。24 h 后分別給予 10 μmol/L MAPK 信號通路抑制劑 SP600125 以及 5 μmol/L NF-κB 信號通路抑制劑 SN50，預處理 2 h；然后加入 1 ng/mL IL-1β 刺激 6 h，取細胞采用實時熒光定量 PCR 檢測 miR-4287 和 ADAMTS4 mRNA 表達量。以單純 1 ng/mL IL-1β 刺激 6 h 處理的骨關節炎軟骨細胞作為對照。實驗重復 3 次。
1.3.5 miR-4287 調控軟骨細胞 ADAMTS4 表達觀察
取骨關節炎軟骨細胞，按 3×105個/孔接種于 12 孔板，加入不含抗生素的培養基培養 24 h 后，將細胞隨機分為 4 組，參照 Lipofectamine? 2000 說明書，分別采用 50 μmol/L miR-4287 模擬物和陰性對照模擬物、100 μmol/L miR-4287 抑制物和陰性對照抑制物進行轉染。轉染 48 h 后收集各組細胞，采用實時熒光定量 PCR 和 Western blot 檢測 ADAMTS4 mRNA 及蛋白表達量。
1.4 檢測方法
1.4.1 實時熒光定量 PCR 檢測
取收集的軟骨細胞進行總 RNA 提取及逆轉錄，超微量紫外分光光度計檢測總 RNA 質量和濃度。取 1 μg 總 RNA 按 PrimeScriptTM RT 試劑盒步驟進行逆轉錄。根據 SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 試劑盒說明書進行實時 PCR 反應。miR-4287 擴增體系共 10 μL：SYBR 5.0 μL，ROX 0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.2 μL，下游引物（10 μmol/L）0.2 μL；擴增程序：95℃ 預變性 10 s；PCR 反應，95℃5 s、60℃20 s，40 個循環。ADAMTS4 mRNA 擴增體系 10 μL：SYBR 5.0 μL，ROX 0.2 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL；稀釋 cDNA 1.0 μL，無酶水 3 μL。擴增程序：95℃ 預變性 2 min；PCR 反應，95℃5 s、60℃34 s，擴增 40 個循環。引物序列：miR-4287，上游5′-CTTGAGGGCACTTTAAAAAAAAA-3′；U6，上游 5′-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3′，下游 5′-TGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3′；ADAMTS4，上游 5′-TTTCCCTGGCAAGGACTATG-3′，下游 5′-GGAGGAGAACTGGACACCAC-3′；GAPDH，上游 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游 5′-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。以 U6 或 GAPDH 作為內參基因，采用 2-ΔΔCt相對定量法分析 miR-4287 及 ADAMTS4 mRNA 相對表達量。
1.4.2 Western blot 檢測
取收集的軟骨細胞，棄培養液，4℃ 預冷 PBS 清洗細胞 3 次，每孔加入 150 μL RIPA 裂解液，在冰上用細胞刮將細胞刮下至離心管中，繼續冰上裂解 30 min。以 14 000×g 離心 10 min，收集取上清，用 BSA 法檢測蛋白質濃度。蛋白液混合上樣緩沖液后煮沸變性，變性蛋白液樣品上樣至 12%SDS-PAGE，電泳后將蛋白轉印至聚偏氟乙烯膜。5 % 脫脂奶粉封閉 1 h，加入一抗（兔抗鼠 ADAMTS4 抗體、兔抗鼠 GAPDH 抗體）孵育 12 h，TBST 洗滌 3 次，每次 5 min；加入山羊抗兔二抗孵育 2 h，TBST 洗滌 3 次，每次 5 min。加入化學發光液，超靈敏化學發光成像儀采集圖像。
1.5 熒光素酶報告實驗
將野生型或突變型 ADAMTS4 mRNA 3’ UTR 分別克隆至螢火蟲熒光素酶報告載體。分別共轉染 miR-4287 模擬物或模擬物陰性對照、野生型或突變型螢火蟲熒光素酶報告載體、海腎熒光素酶載體至 293T 工具細胞。共轉染 48 h 后裂解細胞，酶標儀檢測各組螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，計算螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶活性比值，驗證 miR-4287 是否與 ADAMTS4 mRNA 靶向結合。實驗重復 3 次。
1.6 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較組織樣本采用 Mann-Whitney 檢驗，細胞樣本采用配對 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；熒光素酶報告采用獨立樣本 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 正常和骨關節炎軟骨組織 miR-4287 和 ADAMTS4 表達
miR-4287 在正常和骨關節炎軟骨組織中均有表達。骨關節炎軟骨組織 miR-4287 相對表達量為 0.490±0.237，較正常軟骨組織（1.074±0.507）下降，比較差異有統計學意義（Z=–2.572，P=0.010）。骨關節炎軟骨組織 ADAMTS4 mRNA 相對表達量為 19.138±4.520，較正常軟骨組織（1.864±1.786）上升，比較差異有統計學意義（Z=–2.611，P=0.009）。
2.2 IL-1β 對軟骨細胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表達的影響
IL-1β 下調軟骨細胞 miR-4287 表達。IL-1β 刺激處理 3、6、12 h 后，骨關節炎軟骨細胞 miR-4287 相對表達量分別為 0.680±0.290、0.962±0.277、0.804±0.168，均較對照組（1.010±0.172、1.463±0.215、1.786±0.294）下降，比較差異有統計學意義（t=4.818，P=0.041；t=9.480，P=0.011；t=11.410，P=0.007）；IL-1β 處理組各時間點間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。
IL-1β 上調軟骨細胞 ADAMTS4 mRNA 表達。IL-1β 刺激處理 3、6、12 h 后，骨關節炎軟骨細胞 ADAMTS4 mRNA 相對表達量分別為 3.935±1.554、17.973±4.609、24.032±9.275，均較對照組（1.175±0.660、0.536±0.233、1.746±1.400）升高，比較差異均有統計學意義（t=5.340，P=0.033；t=6.261，P=0.025；t=4.901，P=0.039）。隨著 IL-1β 刺激時間延長，ADAMTS4 mRNA 相對表達量逐漸上升，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.3 IL-1β 介導的信號通路對軟骨細胞 miR-4287 和 ADAMTS4 表達的影響
SP600125 預處理+IL-1β 刺激組及 SN50 預處理+IL-1β 刺激組 miR-4287 相對表達量分別為 1.557±0.266 和 1.772±0.303，較 IL-1β 刺激組（1.002±0.086）升高，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
SP600125 預處理+IL-1β 刺激組及 SN50 預處理+IL-1β 刺激組 ADAMTS4 mRNA 相對表達量分別為 0.458±0.109 和 0.634±0.168，較 IL-1β 刺激組（1.004±0.114）降低，比較差異有統計學意義（P<0.05）。
2.4 miR-4287 調控軟骨細胞 ADAMTS4 表達
轉染 48 h 后實時熒光定量 PCR 檢測示，miR-4287 模擬物組 ADAMTS4 mRNA 相對表達量為 0.402±0.353，較 miR-4287 模擬物陰性對照組（1.077±0.525）下降，比較差異有統計學意義（t=4.832，P=0.040）；miR-4287 抑制物組 ADAMTS4 mRNA 相對表達量為 3.698±0.900，較 miR-4287 抑制物陰性對照組（1.0435±0.346）升高，比較差異有統計學意義（t=6.397，P=0.024）。
Western blot 檢測示，miR-4287 模擬物組 ADAMTS4 蛋白相對表達量為 0.400±0.016，較 miR-4287 模擬物陰性對照組（0.572±0.050）下降，差異有統計學意義（t=5.722，P=0.005）。miR-4287 抑制物組 ADAMTS4 蛋白相對表達量為 1.045±0.040，較 miR-4287 抑制物陰性對照組（0.600±0.024）升高，差異有統計學意義（t=–16.469，P=0.000）。見圖 1。
圖1
Western blot 檢測各組轉染后ADAMTS4蛋白表達
1：miR-4287 模擬物陰性對照組；2：miR-4287 模擬物組；3：miR-4287 抑制物陰性對照組；4：miR-4287 抑制物組
Figure1. Expression of ADAMTS4 protein by Western blot after transfection1: miR-4287 mimics negative control group; 2: miR-4287 mimics group; 3: miR-4287 inhibitors negative control group; 4: miR-4287 inhibitors group
2.5 驗證 miR-4287 與 ADAMTS4 mRNA 靶向結合
報告載體攜帶野生型 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 時，miR-4287 模擬物陰性對照組雙螢光素酶活性比值為 1.000±0.113，miR-4287 模擬物組為 0.982±0.085，比較差異無統計學意義（t=0.318，P=0.757）。報告載體攜帶突變型 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 時，miR-4287 模擬物陰性對照組雙螢光素酶活性比值為 1.000±0.046，miR-4287 模擬物組為 0.970±0.085，比較差異無統計學意義（t=0.768，P=0.460）。見圖 2。
圖2
熒光素酶報告實驗驗證 miR-4287 與 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 結合
Figure2.
Validation the direct interaction of miR-4287 and ADAMTS4 mRNA 3’UTR by luciferase reporter assay
3 討論
miRNA 是一類內源性非編碼蛋白的小 RNA 分子，大小為 19～25 個核苷酸，普遍存在于植物和動物基因組中。miRNA 作用方式較為明確，主要通過與目的基因 mRNA 分子的 3’UTR 互補結合，導致靶基因 mRNA 裂解或抑制其翻譯，從而在轉錄后水平沉默目的基因 mRNA [9]。隨著對 miRNA 研究的不斷加深，人們逐漸認識到 miRNA 在細胞分化、細胞周期以及凋亡等過程中具有重要作用[10]。眾多證據表明 miRNA 也參與了軟骨細胞的分化、增殖及凋亡等過程，因此與軟骨形成、骨關節炎發生發展息息相關[11-12]。成軟骨相關 miRNA 往往也在骨關節炎疾病進程中扮演著重要角色。據報道，miR-320c[5]、miR-455-3p[6]、miR-92a-3p[7]與成軟骨分化密切相關，同時也能負性調控軟骨細胞外基質代謝相關基因 MMP-13、HDAC2 表達，從而減緩軟骨細胞基質降解、退變。
目前對 miR-4287 的研究主要見于高通量芯片篩選出的疾病相關 miRNA 表達譜[13-15]，尚無 miR-4287 功能鑒定文獻報道。我們前期研究發現，miR-4287 在成軟骨分化過程中差異表達，推測其可能與軟骨退變相關，本次研究旨在初步探索 miR-4287 在人軟骨退變中的作用。結果表明，miR-4287 骨關節炎軟骨組織和軟骨細胞炎癥模型中表達均降低，提示 miR-4287 可能是一種與軟骨退變相關的 miRNA。
致炎因子 IL-1β 介導的軟骨退變相關基因表達、軟骨細胞外基質降解主要依賴 MAPK 信號通路和 NF-κB 信號通路轉導[3, 16]。據報道，MAPK 信號通路和 NF-κB 信號通路也可參與軟骨細胞內 miRNA（如 miR-558、miR-127-5p）的表達調控，而 IL-1β 誘導的 miR-558、miR-127-5p 表達下降作用可被上述通路抑制劑所拮抗[17-18]。本研究中，阻斷 MAPK 通路和 NF-κB 信號通路能抵消 IL-1β 對 miR-4287 表達的抑制效應，說明 IL-1β 介導的下游信號通路在 miR-4287 表達調控中具有重要作用。
miRNA 是一種調節軟骨細胞外代謝的重要因素[19]。據報道，miR-127-5p 在骨關節炎軟骨組織中下調，體外實驗證實 miR-127-5p 可直接與 MMP-13 mRNA 結合，抑制 IL-1β 誘導的 MMP-13 表達，從而減緩 Ⅱ 型膠原降解[18]。miR-125b 也可與 ADAMTS4 mRNA 3’UTR 特定位點結合，從而抑制后者對聚蛋白多糖的降解[20]。通過查閱 TargerScan miRNAs 靶基因預測工具，我們發現 ADAMTS4 3’UTR 中存在能與 miR-4287 匹配的序列。轉染實驗表明，miR-4287 對 ADAMTS4 表達有明顯的抑制效應。而用 siRNA 抑制 miR-4287 功能，上述抑制效應又可被抵消。因此，我們推測 ADAMTS4 可能是 miR-4287 的靶基因。然而熒光素酶實驗結果顯示，無論該預測結合位點為野生型或突變型，miR-4287 均不能改變與其串聯表達的熒光素酶活性。上述結果提示，雖然 miR-4287 能下調 ADAMTS4 表達，但 ADAMTS4 并不是 miR-4287 的靶基因，其對 ADAMTS4 的表達調控并不是通過與 3’UTR 直接結合的方式發揮作用。
綜上述，本研究初步表明，成軟骨相關 miR-4287 能調控軟骨細胞 ADAMTS4 表達，是一種與軟骨退變密切相關的 miRNA。然而本研究并未能揭示 miR-4287 調控軟骨細胞 ADAMTS4 表達的具體機制。據報道，miRNAs 也可通過其他方式間接調控軟骨 ADAMTS4 表達。有研究證實，ADAMTS4 是轉錄因子 RUNX2 潛在的下游靶標，miR-105 通過抑制 RUNX2 的表達和功能，進而調節 ADAMTS4 表達[21]。HMGB1 是 NF-κB 信號通路的激活劑，miR-142-3p 可靶向抑制 HMGB1 功能，從而抑制 NF-κB 信號通路介導的軟骨細胞凋亡及炎性介質產生[22]。靶基因預測工具提示 RUNX2 和 HMGB1 mRNA 3’UTR 存在 miR-4287 結合位點，miR-4287 對于 ADAMTS4 的調控作用可能是通過 RUNX2 或 HMGB1 等分子來實現的。miR-4287 對 ADAMTS4 的調控是否通過上述兩種途徑發揮作用，還有待進一步研究。
