引用本文： 楊曦, 徐永清, 何曉清, 王騰, 王云嬌. 數字化技術制備大鼠跨區穿支皮瓣微小血管模型的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(12): 1485-1489. doi: 10.7507/1002-1892.201705006 復制
穿支血管進入皮膚組織內構成的血管體及其之間起連接作用的 choke 血管是穿支皮瓣的解剖學基礎[1]。穿支血管網絡的形態、營養范圍及血液動力的變化均會影響皮瓣移植的成活[2-4]，一直以來都是研究的重點。借助動物模型建立，通過大體解剖、血管灌注結合影像學技術的應用[5-6]，臨床對穿支血管及 choke 血管的認識不斷深入。目前數字化技術能夠高保真重現血管網絡立體結構，其中具有高空間分辨率及時間分辨率的 micro-CT 已廣泛用于各種動物模型微小結構的重建[7-8]，然而用于皮瓣微小血管網絡重建研究較少。此外，對于血管形態變化的數字化評估研究也相對較少。為了能夠可視化觀察、客觀評估皮瓣微小血管形態變化，本研究擬利用 micro-CT 重建血管結合 Matlable 軟件測量血管相關參數，建立一個數字化穿支皮瓣微小血管模型，并探討其應用價值，以期為皮瓣血管模型研究提供技術支持。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡 SPF 級雌性 SD 大鼠 20 只，體質量 280～300 g，由陸軍軍醫大學動物中心提供。4% 多聚甲醛（北京中杉金橋生物技術有限公司）；10% 水合氯醛（成都金山化學試劑有限公司）；分析純級紅色氧化鉛（上海生工生物工程技術有限公司）；明膠（Sigma 公司，美國）。micro-CT 及掃描成像系統（QuantumFx 公司，美國）；Image-Pro6.0 圖像分析軟件（美國國立衛生研究院）；Matlable7.0 軟件（MathWorks 公司，美國）。
1.2 明膠-氧化鉛溶液制備
取雙蒸水 100 mL，恒溫水溫箱 40℃ 預熱 10 min。稱取明膠粉末 5 g 加入預熱雙蒸水中攪拌至溶解。取 80 g 紅色氧化鉛粉末加入明膠溶液中，迅速攪拌至氧化鉛-明膠溶液均勻混合，底部無沉淀。封口常溫保存，使用時預熱至 40℃。
1.3 實驗方法
由同一術者完成動物模型制備。取 20 只 SD 大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，取俯臥位，背部剃毛、消毒。于背部中線右側旁開 2 cm 為皮瓣左界，頸背肩胛連線為上界，腰骶兩側髂脊連線為下界，近腋后線 1～2 cm 為右界，由近心端至遠心端，沿深筋膜淺層分離皮下組織，游離顯露胸背動脈、肋間下動脈及其分支，逐個結扎其分支后離斷，保留髂腰動脈為單穿支供血，獲取以右側髂腰動脈穿支為血管蒂、面積約 10 cm×3 cm 的跨區皮瓣，包括右側胸背、肋間（后）下、髂腰等動脈血管體區。徹底止血后原位縫合皮瓣。術后單籠喂養。見圖 1。
圖1
跨區穿支皮瓣設計示意圖
a. 黑色箭頭示右髂腰動脈穿支；b. 制備跨區穿支皮瓣；c. 原位縫合皮瓣
Figure1. Schematic design of cross-boundary perforator flapa. Black arrow indicated the perforator of right iliolumbar artery; b. Cross-boundary perforator flap was harvested; c. Flap was sutured in situ
1.4 觀測指標
1.4.1 皮瓣壞死面積測量
術后 3、7 d 各取 10 只大鼠，大體觀察皮瓣壞死情況，照相后將圖像導入 Image-Pro6.0 圖像分析軟件，測量并計算皮瓣壞死面積百分比。
1.4.2 micro-CT 掃描并血管三維重建
術后 3、7 d 大體觀察后，大鼠行心臟-主動脈穿刺術，以明膠-氧化鉛溶液全身血管灌注；灌注壓力為 10.78 kPa。冷水沖洗標本后，置于 4℃ 冷藏 24 h。按原手術范圍切取皮瓣組織，行 micro-CT 血管三維重建。掃描參數：電壓 90 kV、電流 160 μA、掃描窗 73 mm、掃描時間 2 min、閾值 3 000～3 200；以 Dicom 格式保存原始數據，內置成像系統行三維圖形重建。
將 Dicom 格式原始數據導入 Matlable7.0 軟件，利用閾值分割方法將血管分割出來，在此基礎上計算血管容積；提取血管三維體素，將血管骨架化后進行拓撲結構轉化，在此基礎上計算血管總長度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 皮瓣壞死面積比較
術后 3 d 皮瓣壞死面積百分比為 19.08%±3.64%，顯著低于術后 7 d 的 39.76%±3.76%，比較差異有統計學意義（t=10.361，P=0.029）。見圖 2。
圖2
皮瓣大體觀察
a. 術后 3 d；b. 術后 7 d
Figure2. General observation of flapa. At 3 days after operation; b. At 7 days after operation
2.2 micro-CT 掃描并血管三維重建
明膠-氧化鉛造影后行 micro-CT 血管三維重建，可以清晰顯示皮瓣微小血管網絡形態，以及跨區供血的穿支血管、血管體區所屬的穿支及其之間相互連接的 choke 血管。與術后3 d 相比，術后 7 d 遠離蒂部穿支的“潛在供區”血管體區的血管密集程度低，血管連續程度差。見圖 3。測量顯示，術后 3 d 皮瓣血管容積為（1 240.23±89.71）mm3、血管總長度為（245.94±29.38）mm，與術后 7 d 時的（1 036.96±88.97） mm3、（143.20±30.28） mm 比較，差異均有統計學意義（t=5.088，P=0.000；t=7.701，P=0.000）。
圖3
血管三維重建圖像
a. 術后 3 d Ⅰ：潛在供區、Ⅱ：血流動力學供區、Ⅲ：解剖學供區 黃色箭頭示胸背動脈、藍色箭頭示肋下動脈、紅色箭頭示髂腰動脈；b. 術后 7 d 潛在供區血管變化（箭頭）；c. Matlable7.0 軟件利用閾值分割方法分割血管，計算血管容積；d. Matlable7.0 軟件將血管骨架化，計算血管總長度
Figure3. Images of three-dimensional reconstruction of vesselsa. At 3 days after operation Ⅰ: Potential territory, Ⅱ: Dynamic territory, Ⅲ: Anatomic territory; Yellow arrow indicated thoracodorsal artery, blue arrow indicated subcostal artery, red arrow indicated iliolumbar artery; b. The changes of vessels in potential territory at 7 days after operation (arrow); c. Threshold segmentation via Matlable7.0 software; d. Vessels structuring via Matlable7.0 software
3 討論
3.1 跨區供血皮瓣動物模型血供特點
穿支血管跨區供血可劃分為“解剖學供區、血流動力學供區和潛在供區”[9]。各供區之間由 choke 血管相連，當皮瓣切取后由于通過該血管阻力逐漸增大，血供無法向更遠端的“潛在供區”延伸發生壞死[10-11]，使得穿支皮瓣的切取范圍受到限制。因此建立由單穿支供血、跨 3 個血管體區皮瓣是研究 choke 血管及皮瓣成活的理想模型。既往研究表明[12]，以單一穿支血管蒂為中心可放射性地完整帶動其周圍多個第 2 血管供區，在一個方向上血供能到達的最遠距離是第 3 血管供區的穿支入皮點。依據皮瓣解剖學的特點，本實驗選擇的跨區穿支皮瓣模型包含以髂腰動脈為解剖學供區、肋下動脈為血流動力學供區、胸背動脈為潛在供區的 3 個血管體區，以及其間 2 個 choke 血管區。手術切斷胸背動脈、肋下動脈及其分支，僅保留髂腰動脈為單穿支血管蒂作為跨區穿支皮瓣的唯一血供來源；在不同干預條件下，胸背動脈區與肋下動脈區之間的 choke 血管開放與否均可影響潛在供區皮瓣組織的成活。測量結果顯示，術后 3 d 皮瓣壞死面積百分比顯著小于 7 d 時，提示該模型在無任何干預下，隨時間延長皮瓣逐漸出現恒定壞死，與跨區穿支皮瓣“潛在供區”常發生壞死現象相符。因此，該跨區穿支皮瓣是理想的研究模型。
3.2 數字化模型的可行性及應用價值
micro-CT 采用錐形 X 線束，可提高射線采集速度及利用率，分辨率可達到微米級別[13-14]，目前已成功運用于各類器官組織微小血管的成像中，并獲得良好的可視化結果[15-17]。明膠-氧化鉛血管灌注是用于血管成像經典有效方法[18]，本研究利用 micro-CT 的成像優勢，利用 Matlable7.0 軟件計算提取血管參數，建立了數字化大鼠跨區穿支皮瓣血管三維重建模型。通過獲得的圖像，能夠更清晰觀察皮瓣血管網絡的變化，同時進行客觀評估。在圖像重建中，閾值決定了造影劑顯影的清晰度。閾值較低時可顯示較細的血管，其周圍非血管部分的體素也會顯影，但是大血管顯影可能失真；反之，微小血管可能無法顯影。在 QuantumFX PE 型 micro-CT 中，我們通過篩選，發現在閾值 3 000～3 200 范圍內，可獲得模型 3 個血管體區、2 個 choke 血管區血管形態的圖像，同既往的二維血管造影觀察不同，micro-CT 的重建還能夠更清晰顯示兩時間點間模型血管形態差異。
既往學者們通過排水計量法、灰度谷峰比計算、激光多普勒等對血管營養范圍、choke 血管變化及皮瓣術后血流動力的變化進行了研究[10, 19-20]，但是利用數字化技術測算血管計量參數的方法較少。本研究采用 Matlable7.0 軟件計算血管總長度及容積，量化微小血管的形態學變化，從而起到更加精確、客觀評估作用。利用 Matlable 軟件閾值分割方法，能夠將血管從 CT 閾值中提取；在此基礎上，根據體積=體素×圖像分辨率×層間距值，計算血管網的體積；對提取出的血管從三維中去除冗余的點，用單像素連接保持原有的三維形態進行骨架化，轉化為分支和鄰接點的表示方式，同時去噪音；在此基礎上，根據血管網長度=所有連接點及分支節點的總數，計算血管網的總長度。血管容積分數是血管容量的直接反應，表示整體微血管網絡中所能容納的血容量，可間接反應皮瓣微血管的擴張程度及血管的通暢度。血管總長度是在整體掃描窗內提取連續性穿支主干及其分支網絡血管中心軸線，將其長度累計相加所得，能間接反映皮瓣微血管網絡的連續性以及密集程度，即血管連接密度。本研究觀測結果顯示，術后 7 d 時“潛在供區”的皮瓣壞死，三維圖像上顯示血管連接度及密度均下降，同時血管容積和血管總長度降低，Matlable 軟件提取的血管參數與大體標本上皮瓣壞死、micro-CT 血管形態變化相符合。
綜上述，以髂腰動脈為單穿支血管蒂的跨 3 個血管體區的大鼠背部皮瓣模型是理想的跨區穿支皮瓣模型。明膠-氧化鉛灌注結合 micro-CT 三維血管重建技術，可以清晰觀察到離體皮瓣微小血管形態，Matlable7.0 軟件提取血管計量參數與大體標本上皮瓣壞死、micro-CT 血管形態變化相符合。數字化技術能夠可視化觀察、客觀化評估皮瓣微小血管形態變化，為皮瓣血管模型研究提供技術支持。然而，由于實驗技術的限制，本研究未能實現在體模型的血管重建。不同個體的離體標本在一定程度上會影響實驗對象的同質性，不能夠連續、動態觀察血管形態變化。因此，在下一步實驗中我們將探尋活體血管造影，并以 micro-CT 及 Matlable 軟件為技術支持開發出更多客觀、全面的血管評估參數，以期建立一個更加理想的數字化皮瓣血管模型，應用于穿支皮瓣切取及成活的基礎與臨床研究。
穿支血管進入皮膚組織內構成的血管體及其之間起連接作用的 choke 血管是穿支皮瓣的解剖學基礎[1]。穿支血管網絡的形態、營養范圍及血液動力的變化均會影響皮瓣移植的成活[2-4]，一直以來都是研究的重點。借助動物模型建立，通過大體解剖、血管灌注結合影像學技術的應用[5-6]，臨床對穿支血管及 choke 血管的認識不斷深入。目前數字化技術能夠高保真重現血管網絡立體結構，其中具有高空間分辨率及時間分辨率的 micro-CT 已廣泛用于各種動物模型微小結構的重建[7-8]，然而用于皮瓣微小血管網絡重建研究較少。此外，對于血管形態變化的數字化評估研究也相對較少。為了能夠可視化觀察、客觀評估皮瓣微小血管形態變化，本研究擬利用 micro-CT 重建血管結合 Matlable 軟件測量血管相關參數，建立一個數字化穿支皮瓣微小血管模型，并探討其應用價值，以期為皮瓣血管模型研究提供技術支持。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
8 周齡 SPF 級雌性 SD 大鼠 20 只，體質量 280～300 g，由陸軍軍醫大學動物中心提供。4% 多聚甲醛（北京中杉金橋生物技術有限公司）；10% 水合氯醛（成都金山化學試劑有限公司）；分析純級紅色氧化鉛（上海生工生物工程技術有限公司）；明膠（Sigma 公司，美國）。micro-CT 及掃描成像系統（QuantumFx 公司，美國）；Image-Pro6.0 圖像分析軟件（美國國立衛生研究院）；Matlable7.0 軟件（MathWorks 公司，美國）。
1.2 明膠-氧化鉛溶液制備
取雙蒸水 100 mL，恒溫水溫箱 40℃ 預熱 10 min。稱取明膠粉末 5 g 加入預熱雙蒸水中攪拌至溶解。取 80 g 紅色氧化鉛粉末加入明膠溶液中，迅速攪拌至氧化鉛-明膠溶液均勻混合，底部無沉淀。封口常溫保存，使用時預熱至 40℃。
1.3 實驗方法
由同一術者完成動物模型制備。取 20 只 SD 大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，取俯臥位，背部剃毛、消毒。于背部中線右側旁開 2 cm 為皮瓣左界，頸背肩胛連線為上界，腰骶兩側髂脊連線為下界，近腋后線 1～2 cm 為右界，由近心端至遠心端，沿深筋膜淺層分離皮下組織，游離顯露胸背動脈、肋間下動脈及其分支，逐個結扎其分支后離斷，保留髂腰動脈為單穿支供血，獲取以右側髂腰動脈穿支為血管蒂、面積約 10 cm×3 cm 的跨區皮瓣，包括右側胸背、肋間（后）下、髂腰等動脈血管體區。徹底止血后原位縫合皮瓣。術后單籠喂養。見圖 1。
圖1
跨區穿支皮瓣設計示意圖
a. 黑色箭頭示右髂腰動脈穿支；b. 制備跨區穿支皮瓣；c. 原位縫合皮瓣
Figure1. Schematic design of cross-boundary perforator flapa. Black arrow indicated the perforator of right iliolumbar artery; b. Cross-boundary perforator flap was harvested; c. Flap was sutured in situ
1.4 觀測指標
1.4.1 皮瓣壞死面積測量
術后 3、7 d 各取 10 只大鼠，大體觀察皮瓣壞死情況，照相后將圖像導入 Image-Pro6.0 圖像分析軟件，測量并計算皮瓣壞死面積百分比。
1.4.2 micro-CT 掃描并血管三維重建
術后 3、7 d 大體觀察后，大鼠行心臟-主動脈穿刺術，以明膠-氧化鉛溶液全身血管灌注；灌注壓力為 10.78 kPa。冷水沖洗標本后，置于 4℃ 冷藏 24 h。按原手術范圍切取皮瓣組織，行 micro-CT 血管三維重建。掃描參數：電壓 90 kV、電流 160 μA、掃描窗 73 mm、掃描時間 2 min、閾值 3 000～3 200；以 Dicom 格式保存原始數據，內置成像系統行三維圖形重建。
將 Dicom 格式原始數據導入 Matlable7.0 軟件，利用閾值分割方法將血管分割出來，在此基礎上計算血管容積；提取血管三維體素，將血管骨架化后進行拓撲結構轉化，在此基礎上計算血管總長度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 皮瓣壞死面積比較
術后 3 d 皮瓣壞死面積百分比為 19.08%±3.64%，顯著低于術后 7 d 的 39.76%±3.76%，比較差異有統計學意義（t=10.361，P=0.029）。見圖 2。
圖2
皮瓣大體觀察
a. 術后 3 d；b. 術后 7 d
Figure2. General observation of flapa. At 3 days after operation; b. At 7 days after operation
2.2 micro-CT 掃描并血管三維重建
明膠-氧化鉛造影后行 micro-CT 血管三維重建，可以清晰顯示皮瓣微小血管網絡形態，以及跨區供血的穿支血管、血管體區所屬的穿支及其之間相互連接的 choke 血管。與術后3 d 相比，術后 7 d 遠離蒂部穿支的“潛在供區”血管體區的血管密集程度低，血管連續程度差。見圖 3。測量顯示，術后 3 d 皮瓣血管容積為（1 240.23±89.71）mm3、血管總長度為（245.94±29.38）mm，與術后 7 d 時的（1 036.96±88.97） mm3、（143.20±30.28） mm 比較，差異均有統計學意義（t=5.088，P=0.000；t=7.701，P=0.000）。
圖3
血管三維重建圖像
a. 術后 3 d Ⅰ：潛在供區、Ⅱ：血流動力學供區、Ⅲ：解剖學供區 黃色箭頭示胸背動脈、藍色箭頭示肋下動脈、紅色箭頭示髂腰動脈；b. 術后 7 d 潛在供區血管變化（箭頭）；c. Matlable7.0 軟件利用閾值分割方法分割血管，計算血管容積；d. Matlable7.0 軟件將血管骨架化，計算血管總長度
Figure3. Images of three-dimensional reconstruction of vesselsa. At 3 days after operation Ⅰ: Potential territory, Ⅱ: Dynamic territory, Ⅲ: Anatomic territory; Yellow arrow indicated thoracodorsal artery, blue arrow indicated subcostal artery, red arrow indicated iliolumbar artery; b. The changes of vessels in potential territory at 7 days after operation (arrow); c. Threshold segmentation via Matlable7.0 software; d. Vessels structuring via Matlable7.0 software
3 討論
3.1 跨區供血皮瓣動物模型血供特點
穿支血管跨區供血可劃分為“解剖學供區、血流動力學供區和潛在供區”[9]。各供區之間由 choke 血管相連，當皮瓣切取后由于通過該血管阻力逐漸增大，血供無法向更遠端的“潛在供區”延伸發生壞死[10-11]，使得穿支皮瓣的切取范圍受到限制。因此建立由單穿支供血、跨 3 個血管體區皮瓣是研究 choke 血管及皮瓣成活的理想模型。既往研究表明[12]，以單一穿支血管蒂為中心可放射性地完整帶動其周圍多個第 2 血管供區，在一個方向上血供能到達的最遠距離是第 3 血管供區的穿支入皮點。依據皮瓣解剖學的特點，本實驗選擇的跨區穿支皮瓣模型包含以髂腰動脈為解剖學供區、肋下動脈為血流動力學供區、胸背動脈為潛在供區的 3 個血管體區，以及其間 2 個 choke 血管區。手術切斷胸背動脈、肋下動脈及其分支，僅保留髂腰動脈為單穿支血管蒂作為跨區穿支皮瓣的唯一血供來源；在不同干預條件下，胸背動脈區與肋下動脈區之間的 choke 血管開放與否均可影響潛在供區皮瓣組織的成活。測量結果顯示，術后 3 d 皮瓣壞死面積百分比顯著小于 7 d 時，提示該模型在無任何干預下，隨時間延長皮瓣逐漸出現恒定壞死，與跨區穿支皮瓣“潛在供區”常發生壞死現象相符。因此，該跨區穿支皮瓣是理想的研究模型。
3.2 數字化模型的可行性及應用價值
micro-CT 采用錐形 X 線束，可提高射線采集速度及利用率，分辨率可達到微米級別[13-14]，目前已成功運用于各類器官組織微小血管的成像中，并獲得良好的可視化結果[15-17]。明膠-氧化鉛血管灌注是用于血管成像經典有效方法[18]，本研究利用 micro-CT 的成像優勢，利用 Matlable7.0 軟件計算提取血管參數，建立了數字化大鼠跨區穿支皮瓣血管三維重建模型。通過獲得的圖像，能夠更清晰觀察皮瓣血管網絡的變化，同時進行客觀評估。在圖像重建中，閾值決定了造影劑顯影的清晰度。閾值較低時可顯示較細的血管，其周圍非血管部分的體素也會顯影，但是大血管顯影可能失真；反之，微小血管可能無法顯影。在 QuantumFX PE 型 micro-CT 中，我們通過篩選，發現在閾值 3 000～3 200 范圍內，可獲得模型 3 個血管體區、2 個 choke 血管區血管形態的圖像，同既往的二維血管造影觀察不同，micro-CT 的重建還能夠更清晰顯示兩時間點間模型血管形態差異。
既往學者們通過排水計量法、灰度谷峰比計算、激光多普勒等對血管營養范圍、choke 血管變化及皮瓣術后血流動力的變化進行了研究[10, 19-20]，但是利用數字化技術測算血管計量參數的方法較少。本研究采用 Matlable7.0 軟件計算血管總長度及容積，量化微小血管的形態學變化，從而起到更加精確、客觀評估作用。利用 Matlable 軟件閾值分割方法，能夠將血管從 CT 閾值中提取；在此基礎上，根據體積=體素×圖像分辨率×層間距值，計算血管網的體積；對提取出的血管從三維中去除冗余的點，用單像素連接保持原有的三維形態進行骨架化，轉化為分支和鄰接點的表示方式，同時去噪音；在此基礎上，根據血管網長度=所有連接點及分支節點的總數，計算血管網的總長度。血管容積分數是血管容量的直接反應，表示整體微血管網絡中所能容納的血容量，可間接反應皮瓣微血管的擴張程度及血管的通暢度。血管總長度是在整體掃描窗內提取連續性穿支主干及其分支網絡血管中心軸線，將其長度累計相加所得，能間接反映皮瓣微血管網絡的連續性以及密集程度，即血管連接密度。本研究觀測結果顯示，術后 7 d 時“潛在供區”的皮瓣壞死，三維圖像上顯示血管連接度及密度均下降，同時血管容積和血管總長度降低，Matlable 軟件提取的血管參數與大體標本上皮瓣壞死、micro-CT 血管形態變化相符合。
綜上述，以髂腰動脈為單穿支血管蒂的跨 3 個血管體區的大鼠背部皮瓣模型是理想的跨區穿支皮瓣模型。明膠-氧化鉛灌注結合 micro-CT 三維血管重建技術，可以清晰觀察到離體皮瓣微小血管形態，Matlable7.0 軟件提取血管計量參數與大體標本上皮瓣壞死、micro-CT 血管形態變化相符合。數字化技術能夠可視化觀察、客觀化評估皮瓣微小血管形態變化，為皮瓣血管模型研究提供技術支持。然而，由于實驗技術的限制，本研究未能實現在體模型的血管重建。不同個體的離體標本在一定程度上會影響實驗對象的同質性，不能夠連續、動態觀察血管形態變化。因此，在下一步實驗中我們將探尋活體血管造影，并以 micro-CT 及 Matlable 軟件為技術支持開發出更多客觀、全面的血管評估參數，以期建立一個更加理想的數字化皮瓣血管模型，應用于穿支皮瓣切取及成活的基礎與臨床研究。
