引用本文： 黃靜蘭, 康冰瑤, 屈藝, 母得志. 外泌體對缺血再灌注器官損傷的保護作用. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(6): 751-754. doi: 10.7507/1002-1892.201701104 復制
缺血再灌注損傷是指組織發生缺血后，即使恢復供血，組織功能也不能完全恢復[1]。缺血再灌注會導致組織產生大量的氧自由基以及炎性因子等，使細胞發生凋亡或者壞死，造成組織損傷，引起功能障礙，甚至喪失其生理功能[2-4]。研究顯示，減少氧自由基和炎性因子的產生可以減輕缺血再灌注對組織的損傷[5-6]，這也是目前治療此類損傷的主要策略，但治療效果不明顯。因此，進一步探索新藥物及新治療方法具有重要意義。研究發現，胚胎干細胞、MSCs 等多種細胞可以分泌外泌體，而外泌體在干細胞發揮促修復功能中起到重要作用[2-3]。因此，了解外泌體對缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制極為重要。現就外泌體對缺血再灌注器官保護作用方面的研究進行綜述，以期為缺血再灌注的治療提供新思路。
1 外泌體特點
細胞通過內吞作用形成早期核內體，再形成晚期核內體，進而融合成胞內囊泡；胞內囊泡一部分被溶酶體吞噬降解，一部分通過胞吐作用釋放出來，形成胞外囊泡[7]。細胞分泌的胞外囊泡可分為 3 種類型，即凋亡小體、微泡和外泌體[8]。見圖 1。外泌體直徑為 30～200 nm，其中直徑為 30～110 nm 的外泌體具有重要功能，可以通過血腦屏障[8]。外泌體來源細胞不同，其構成成分也不同，可攜帶蛋白質[9]、脂質[10]以及核酸[2]等進入受體細胞，進行信號傳遞，是細胞之間進行交流的重要載體。研究表明，外泌體可作為載藥工具，并且對肝、腎無副作用，可用于治療多種疾病[3, 11]。目前發現外泌體可存在于細胞上清液、尿液[5]、血液、精液、乳汁、唾液、糞便以及腦脊液中[12-13]。
圖1
外泌體產生過程
Figure1.
The production of the exosome
2 外泌體對缺血再灌注器官損傷的保護作用
2.1 心肌
缺血再灌注導致的心肌損傷為不可逆損傷，可能直接引起心力衰竭，甚至死亡。近年來，外泌體對缺血再灌注心肌損傷的保護作用成為研究熱點，研究者對于外泌體發揮作用的機制和信號通路進行了深入探索。研究顯示，人來源 MSCs 可能含有外泌體的分泌物，作用于缺血心肌后能夠改善心室的收縮及舒張功能，而這種分泌物對缺血再灌注心肌的保護作用可能通過減少氧化應激以及抑制 TGF-β 信號傳導來實現[14]。另有研究也發現，MSCs 來源的外泌體可降低心肌纖維化，促進細胞增殖及血管生成，提升心肌干細胞的生存能力，改善心肌梗死后的心功能；該研究提出該保護機制可能和 miRNA 相關，但具體機制尚不明確[15]。Zhao 等[16]的研究也證明了外泌體對心肌的保護作用。他們將含 400 μg 蛋白的人臍帶血 MSCs 來源的外泌體注入急性心肌梗死大鼠尾靜脈，之后連續監測心功能 4 周，結果顯示注入外泌體能明顯加強心肌梗死大鼠的左心室收縮功能，進一步證實其保護機制可能與調控 Bcl-2 家族的表達相關。也有學者認為這種保護機制可能是通過外泌體中 miR-146a 抑制心肌細胞凋亡實現的[17]。Feng 等[18]認為，心肌細胞發生凋亡時，甲基 CpG 結合蛋白 2（methyl CpG binding protein 2，Mecp2）水平升高，而 MSCs 來源的外泌體中包含 miR-22，可抑制 Mecp2，從而保護心肌細胞。
新生兒來源的心肌祖細胞可以分泌外泌體，這些外泌體可以改善缺血再灌注損傷心肌的心肌功能，而與正常心肌祖細胞分泌的外泌體相比，經缺氧處理的心肌祖細胞分泌的外泌體能進一步減小缺血再灌注導致的心肌梗死面積，其保護機制可能與外泌體下調炎性因子 IL-6 和 IL-1α 相關[19]。外泌體表達熱休克蛋白 70（heat shock protein 70，HSP 70），通過與細胞表面的 Toll 樣受體結合，激活下游的胞外信號調節蛋白激酶以及 p38 促分裂原蛋白激酶信號通路，從而起到保護心肌的作用[20]。研究發現，缺血再灌注發生時，具有保護作用的 Nanog 蛋白和缺氧誘導因子 1α 水平升高，進而上調 miR-21 和 miR-210，減少心肌細胞凋亡[2, 21-22]。而誘導多能干細胞分泌的外泌體可抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3 的活化，保護細胞免受氧化應激損傷；進一步研究顯示，誘導多能干細胞來源的外泌體中包含 miR-21 和 miR-210[2]，因此推測其保護作用可能是由 miR-21 和 miR-210 產生。另外，miR-21 還可以通過調節同源性磷酸酶-張力蛋白（phospha-tase and tensin homolog，PTEN）信號通路起到保護心肌的作用[23]。研究發現心肌細胞缺血再灌注損傷時，會發生能量（ATP）損失，而 MSCs 來源的外泌體可以增加信號通路蛋白 Akt 和 GSK-3β 的磷酸化，增加糖酵解和氧化磷酸化，在再灌注 1 h 內快速恢復 ATP 水平，達到保護心肌的作用，這種作用將持續 24 h[24]。還有研究顯示抑制核因子 κB 可減少炎性因子的產生，從而減輕缺血再灌注導致的心肌損傷[25-26]。
2.2 腦組織
由于血腦屏障的存在，藥物難以在腦組織中達到理想濃度[27]，影響缺血再灌注腦損傷的治療效果。缺血再灌注主要通過氧化應激及炎性因子等造成腦組織損傷，而外泌體中包含抑制活性氧和炎癥的物質，并可透過血腦屏障，有望作為治療腦損傷的一種新途徑[3]。目前，已有大量研究發現 MSCs 等來源的外泌體對神經損傷有保護作用。Xin 等[28]的研究顯示，MSCs 來源的外泌體中包含 miR-17-92，對腦卒中導致的神經損傷具有良好的治療效果；其對神經損傷的保護作用可能是通過下調引起損傷的 PTEN 通路，激活神經保護的 PI3K/Akt/mTOR 信號通路，進而抑制 GSK-3β，促進軸突生長來實現。炎癥可以使細胞變性，還可以使神經細胞髓鞘化減少，進而引起嚴重的認知障礙，而 MSCs 來源的胞外囊泡可以抵抗炎癥帶來的損傷，改善長期預后[29]。Xin 等[30-32]的研究認為，外泌體可以促進星型膠質細胞和神經元軸突的塑形和重構，可用于改善腦卒中后受損神經的功能。研究者就這一發現進行了進一步探索，結果顯示外泌體中的 miR-133b 可抑制具有細胞損傷作用的結締組織生長因子和 ras 同源基因家族成員 A，從而在神經保護中起關鍵作用[30-32]。Guitart 等[33]發現，星型膠質細胞分泌的外泌體含有 Prion 蛋白，可以改善缺血條件下神經元的存活能力，這種保護作用可能是通過減少氧化應激導致的神經元死亡來實現的。在缺氧缺血條件下，星型膠質細胞分泌的外泌體中 Prion 蛋白水平升高，可提升對神經元的保護作用。Guitart 等還認為載脂蛋白 E、核糖體蛋白水平的升高及凝聚素/載脂蛋白 J 水平的降低可能參與了外泌體對神經元的保護，但具體機制還需要進一步研究。另外，已有研究證實將載藥外泌體（姜黃素∶外泌體=1∶4）經鼻注入腦室可以提高缺血再灌注腦損傷小鼠的神經行為學評分，縮小病灶面積，保護作用可能是通過減少炎性反應（TNF-α 減少），降低活性氧水平（活性氧減少）而實現[3]。
3 載藥外泌體的制備和用途
外泌體可以裝載藥物，并且被特定靶器官攝取，達到治療疾病的作用。已有研究顯示，外泌體可以攜帶姜黃素穿過血腦屏障治療缺血再灌注腦損傷，改善預后[3]。將藥物加載至外泌體有 4 種方法，包括孵育法、凍融循環、超聲處理以及擠壓法[34]。然而，有研究顯示靶細胞是否攝取外泌體主要取決于外泌體粒子大小[35]，因此在載藥外泌體治療相關疾病的研究中，特別是用于治療腦部疾病時，應將加載藥物后外泌體的直徑納入考慮范疇。
4 總結及展望
近年來對于胞外囊泡，特別是對于外泌體的研究已成為熱點，目前已經發現外泌體可以介導疾病的發生、發展，并用于疾病的診斷以及治療。值得注意的是，外泌體具有載藥功能，能夠運載藥物到達靶器官，發揮治療作用，另外，外泌體還具有穿透血腦屏障的功能，成為腦部疾病治療的重大突破，可能成為治療腦損傷、腦腫瘤以及神經退行性病變等腦部疾病的主要措施。
缺血再灌注損傷是指組織發生缺血后，即使恢復供血，組織功能也不能完全恢復[1]。缺血再灌注會導致組織產生大量的氧自由基以及炎性因子等，使細胞發生凋亡或者壞死，造成組織損傷，引起功能障礙，甚至喪失其生理功能[2-4]。研究顯示，減少氧自由基和炎性因子的產生可以減輕缺血再灌注對組織的損傷[5-6]，這也是目前治療此類損傷的主要策略，但治療效果不明顯。因此，進一步探索新藥物及新治療方法具有重要意義。研究發現，胚胎干細胞、MSCs 等多種細胞可以分泌外泌體，而外泌體在干細胞發揮促修復功能中起到重要作用[2-3]。因此，了解外泌體對缺血再灌注損傷的保護作用及可能機制極為重要。現就外泌體對缺血再灌注器官保護作用方面的研究進行綜述，以期為缺血再灌注的治療提供新思路。
1 外泌體特點
細胞通過內吞作用形成早期核內體，再形成晚期核內體，進而融合成胞內囊泡；胞內囊泡一部分被溶酶體吞噬降解，一部分通過胞吐作用釋放出來，形成胞外囊泡[7]。細胞分泌的胞外囊泡可分為 3 種類型，即凋亡小體、微泡和外泌體[8]。見圖 1。外泌體直徑為 30～200 nm，其中直徑為 30～110 nm 的外泌體具有重要功能，可以通過血腦屏障[8]。外泌體來源細胞不同，其構成成分也不同，可攜帶蛋白質[9]、脂質[10]以及核酸[2]等進入受體細胞，進行信號傳遞，是細胞之間進行交流的重要載體。研究表明，外泌體可作為載藥工具，并且對肝、腎無副作用，可用于治療多種疾病[3, 11]。目前發現外泌體可存在于細胞上清液、尿液[5]、血液、精液、乳汁、唾液、糞便以及腦脊液中[12-13]。
圖1
外泌體產生過程
Figure1.
The production of the exosome
2 外泌體對缺血再灌注器官損傷的保護作用
2.1 心肌
缺血再灌注導致的心肌損傷為不可逆損傷，可能直接引起心力衰竭，甚至死亡。近年來，外泌體對缺血再灌注心肌損傷的保護作用成為研究熱點，研究者對于外泌體發揮作用的機制和信號通路進行了深入探索。研究顯示，人來源 MSCs 可能含有外泌體的分泌物，作用于缺血心肌后能夠改善心室的收縮及舒張功能，而這種分泌物對缺血再灌注心肌的保護作用可能通過減少氧化應激以及抑制 TGF-β 信號傳導來實現[14]。另有研究也發現，MSCs 來源的外泌體可降低心肌纖維化，促進細胞增殖及血管生成，提升心肌干細胞的生存能力，改善心肌梗死后的心功能；該研究提出該保護機制可能和 miRNA 相關，但具體機制尚不明確[15]。Zhao 等[16]的研究也證明了外泌體對心肌的保護作用。他們將含 400 μg 蛋白的人臍帶血 MSCs 來源的外泌體注入急性心肌梗死大鼠尾靜脈，之后連續監測心功能 4 周，結果顯示注入外泌體能明顯加強心肌梗死大鼠的左心室收縮功能，進一步證實其保護機制可能與調控 Bcl-2 家族的表達相關。也有學者認為這種保護機制可能是通過外泌體中 miR-146a 抑制心肌細胞凋亡實現的[17]。Feng 等[18]認為，心肌細胞發生凋亡時，甲基 CpG 結合蛋白 2（methyl CpG binding protein 2，Mecp2）水平升高，而 MSCs 來源的外泌體中包含 miR-22，可抑制 Mecp2，從而保護心肌細胞。
新生兒來源的心肌祖細胞可以分泌外泌體，這些外泌體可以改善缺血再灌注損傷心肌的心肌功能，而與正常心肌祖細胞分泌的外泌體相比，經缺氧處理的心肌祖細胞分泌的外泌體能進一步減小缺血再灌注導致的心肌梗死面積，其保護機制可能與外泌體下調炎性因子 IL-6 和 IL-1α 相關[19]。外泌體表達熱休克蛋白 70（heat shock protein 70，HSP 70），通過與細胞表面的 Toll 樣受體結合，激活下游的胞外信號調節蛋白激酶以及 p38 促分裂原蛋白激酶信號通路，從而起到保護心肌的作用[20]。研究發現，缺血再灌注發生時，具有保護作用的 Nanog 蛋白和缺氧誘導因子 1α 水平升高，進而上調 miR-21 和 miR-210，減少心肌細胞凋亡[2, 21-22]。而誘導多能干細胞分泌的外泌體可抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3 的活化，保護細胞免受氧化應激損傷；進一步研究顯示，誘導多能干細胞來源的外泌體中包含 miR-21 和 miR-210[2]，因此推測其保護作用可能是由 miR-21 和 miR-210 產生。另外，miR-21 還可以通過調節同源性磷酸酶-張力蛋白（phospha-tase and tensin homolog，PTEN）信號通路起到保護心肌的作用[23]。研究發現心肌細胞缺血再灌注損傷時，會發生能量（ATP）損失，而 MSCs 來源的外泌體可以增加信號通路蛋白 Akt 和 GSK-3β 的磷酸化，增加糖酵解和氧化磷酸化，在再灌注 1 h 內快速恢復 ATP 水平，達到保護心肌的作用，這種作用將持續 24 h[24]。還有研究顯示抑制核因子 κB 可減少炎性因子的產生，從而減輕缺血再灌注導致的心肌損傷[25-26]。
2.2 腦組織
由于血腦屏障的存在，藥物難以在腦組織中達到理想濃度[27]，影響缺血再灌注腦損傷的治療效果。缺血再灌注主要通過氧化應激及炎性因子等造成腦組織損傷，而外泌體中包含抑制活性氧和炎癥的物質，并可透過血腦屏障，有望作為治療腦損傷的一種新途徑[3]。目前，已有大量研究發現 MSCs 等來源的外泌體對神經損傷有保護作用。Xin 等[28]的研究顯示，MSCs 來源的外泌體中包含 miR-17-92，對腦卒中導致的神經損傷具有良好的治療效果；其對神經損傷的保護作用可能是通過下調引起損傷的 PTEN 通路，激活神經保護的 PI3K/Akt/mTOR 信號通路，進而抑制 GSK-3β，促進軸突生長來實現。炎癥可以使細胞變性，還可以使神經細胞髓鞘化減少，進而引起嚴重的認知障礙，而 MSCs 來源的胞外囊泡可以抵抗炎癥帶來的損傷，改善長期預后[29]。Xin 等[30-32]的研究認為，外泌體可以促進星型膠質細胞和神經元軸突的塑形和重構，可用于改善腦卒中后受損神經的功能。研究者就這一發現進行了進一步探索，結果顯示外泌體中的 miR-133b 可抑制具有細胞損傷作用的結締組織生長因子和 ras 同源基因家族成員 A，從而在神經保護中起關鍵作用[30-32]。Guitart 等[33]發現，星型膠質細胞分泌的外泌體含有 Prion 蛋白，可以改善缺血條件下神經元的存活能力，這種保護作用可能是通過減少氧化應激導致的神經元死亡來實現的。在缺氧缺血條件下，星型膠質細胞分泌的外泌體中 Prion 蛋白水平升高，可提升對神經元的保護作用。Guitart 等還認為載脂蛋白 E、核糖體蛋白水平的升高及凝聚素/載脂蛋白 J 水平的降低可能參與了外泌體對神經元的保護，但具體機制還需要進一步研究。另外，已有研究證實將載藥外泌體（姜黃素∶外泌體=1∶4）經鼻注入腦室可以提高缺血再灌注腦損傷小鼠的神經行為學評分，縮小病灶面積，保護作用可能是通過減少炎性反應（TNF-α 減少），降低活性氧水平（活性氧減少）而實現[3]。
3 載藥外泌體的制備和用途
外泌體可以裝載藥物，并且被特定靶器官攝取，達到治療疾病的作用。已有研究顯示，外泌體可以攜帶姜黃素穿過血腦屏障治療缺血再灌注腦損傷，改善預后[3]。將藥物加載至外泌體有 4 種方法，包括孵育法、凍融循環、超聲處理以及擠壓法[34]。然而，有研究顯示靶細胞是否攝取外泌體主要取決于外泌體粒子大小[35]，因此在載藥外泌體治療相關疾病的研究中，特別是用于治療腦部疾病時，應將加載藥物后外泌體的直徑納入考慮范疇。
4 總結及展望
近年來對于胞外囊泡，特別是對于外泌體的研究已成為熱點，目前已經發現外泌體可以介導疾病的發生、發展，并用于疾病的診斷以及治療。值得注意的是，外泌體具有載藥功能，能夠運載藥物到達靶器官，發揮治療作用，另外，外泌體還具有穿透血腦屏障的功能，成為腦部疾病治療的重大突破，可能成為治療腦損傷、腦腫瘤以及神經退行性病變等腦部疾病的主要措施。
