引用本文： 任莉榮, 徐永清, 王海, 何曉清, 宋慕國, 陳學秋. 金黃色葡萄球菌脂磷壁酸對破骨細胞分化的影響. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(2): 180-184. doi: 10.7507/1002-1892.201610077 復制
骨組織在生理狀態下會持續進行骨重建，成骨細胞調節骨形成，破骨細胞調節骨吸收，二者動態平衡對骨骼形狀及骨礦代謝維持具有重要作用[1]。這一平衡被破壞會導致骨代謝紊亂，最終導致各種病理性骨病。骨髓炎是一種骨組織感染，以化膿性炎癥、異常骨重建、難控性骨吸收為特征[2]，常導致感染性骨缺損，是骨科治療難題。金黃色葡萄球菌是引起骨髓炎最常見致病菌[3]，但其導致感染性骨缺損的機制尚不明確。金黃色葡萄球菌脂磷壁酸（Staphylococcal lipoteichoic acid，LTA-sa）是金黃色葡萄球菌細胞壁上的一個重要毒力因子[4]，其與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）一樣都有致炎特性及結構相似性[5]。Kishimoto 等[6]研究發現，LPS 能促進破骨細胞分化形成、促進骨吸收，而 LTA-sa 對破骨細胞分化過程的影響國內外研究較少。為此，本研究采用不同濃度的 LTA-sa 作用于 RAW264.7 細胞，以觀察其對破骨細胞分化形成的作用，報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
RAW264.7 細胞（昆明動物研究所）。LTA-sa（Invitrogen 公司，美國），將該粉末用 PBS 配制成濃度為 1 μg/mL 的溶液，再根據實驗所需濃度進行稀釋；PBS 及 H-DMEM 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；鼠 NF-κB 受體活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；R&D Systems 公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma 公司，美國）。
COAS（Corning Osteo Assay Surface）24 孔板（Corning 公司，美國）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；D90 型倒置相差顯微鏡（南京江南光電股份有限公司）；SW-CJ-1F 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗分組
根據培養條件不同，實驗分為 5 組，分別為 LTA-sa 100 ng/mL 組（A 組）、LTA-sa 200 ng/mL 組（B 組）、LTA-sa 400 ng/mL 組（C 組）、陽性對照組（D 組，RANKL 100 ng/mL）、空白對照組（E 組，等體積 PBS）。
1.3 觀測指標
1.3.1 TRAP 染色觀察 取 RAW264.7 細胞根據實驗分組（A～E 組），每組設 6 個復孔。細胞以 5 × 103 個/孔濃度接種于 96 孔板，使用完全培養基（含 15% FBS、1% 青鏈霉素混合溶液的 H-DMEM），于 37 ℃、5% CO2 細胞培養箱內培養過夜后，每組給予對應濃度 LTA-sa、RANKL 及 PBS，然后將培養板置于 37℃、5% CO2 細胞培養箱進行誘導培養，每 3 天換液 1 次，換液后重復加入 LTA-sa、RANKL 及 PBS，誘導培養后第 5 天進行 TRAP 染色。基本操作步驟：① 用枸櫞酸、丙酮及甲醛配制固定液，室溫固定細胞 30～60 s；② 去離子水清洗 3 遍，加入 TRAP 染液，37℃ 避光染色 1 h；③ 去離子水清洗 2 遍，蘇木素染色 1 min；④ 堿性自來水漂洗 3～4 遍，自然晾干。倒置相差顯微鏡下觀察，細胞質內見紅色酒石酸酸性磷酸酶活性顆粒者為 TRAP 陽性細胞。于 200 倍鏡下計數每孔破骨樣細胞（納入標準[7]：TRAP 陽性且細胞核≥3 個）。
1.3.2 骨吸收凹陷觀測 取 RAW264.7 細胞根據實驗分組（A～E 組），每組設 6 個復孔。細胞以 2 × 104 個/孔濃度接種于 COAS 24 孔板，同 1.3.1 方法進行誘導培養。誘導培養后第 5 天，移除培養基，PBS 漂洗 2 次，每孔加入 5% 次氯酸鈉溶液 1 mL，室溫放置 5 min，以移除培養板內細胞；去離子水清洗培養板 3 次，室溫放置 4 h 待其干燥。倒置相差顯微鏡下觀察骨吸收凹陷形成情況，用 Image-Pro Plus 6.0 軟件測量骨吸收凹陷面積及整個視野面積，計算骨吸收凹陷面積占整個視野面積的比值。
1.3.3 MTT 檢測 取 RAW264.7 細胞根據實驗分組（A、B、C、E 組），每組設 10 個復孔。細胞以 5 × 103 個/孔濃度接種于 96 孔板，同 1.3.1 方法進行誘導培養。誘導培養后第 5 天，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，避光條件下繼續培養 4 h，吸棄培養液，每孔加入 150 μL DMSO，避光震蕩 10 min。于酶標儀上用 570 nm 波長檢測吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α = 0.05。
2 結果
2.1 TRAP 染色觀察
誘導培養后第 5 天，各組均可見破骨樣細胞形成（圖 1）。A～E 組破骨樣細胞數分別為（73.15±5.65）、（155.54±5.89）、（238.15±5.13）、（580.85±12.14）、（21.23±4.19）個/孔。A～D 組破骨樣細胞數均多于 E 組；且隨 LTA-sa 濃度增加，A、B、C 組破骨樣細胞數逐漸增加，但均低于 D 組。各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖1
各組 TRAP 染色觀察（倒置相差顯微鏡 ×200） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組； e. E 組
Figure1.
TRAP staining observation in each group (Inverted phase contrast microscopy × 200) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 骨吸收凹陷觀測
誘導培養后第 5 天，各組 COAS 24 孔板內均見骨吸收凹陷形成（圖 2）。A～E 組骨吸收凹陷面積占整個視野面積的比值分別為 0.001 947±0.000 118、0.002 671±0.000 092、0.004 499±0.000 100、0.009 595±0.001 017、0.000 167±0.000 122。A～D 組骨吸收凹陷面積占整個視野面積的比值均高于 E 組；且隨 LTA-sa 濃度增加，A、B、C 組逐漸增高，但均低于 D 組。各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖2
各組骨吸收凹陷觀察（倒置相差顯微鏡 ×200） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組； e. E 組
Figure2.
Bone resorption observation in each group (Inverted phase contrast microscopy × 200) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 MTT 檢測
誘導培養后第 5 天，A、B、C、E 組A 值分別為 0.986±0.051、1.002±0.026、0.981±0.078、0.982±0.076，組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
感染性骨缺損是骨髓炎治療難點之一，由于成骨細胞調節骨形成，既往關于金黃色葡萄球菌引起骨缺損的發生機制，多集中于金黃色葡萄球菌對成骨細胞的作用。相關研究發現，金黃色葡萄球菌能抑制成骨細胞的骨形成能力[8]，并促進其凋亡或壞死[9-10]。破骨細胞是唯一具有骨吸收活性的細胞，但研究發現金黃色葡萄球菌的表面相關蛋白具有促進破骨細胞分化形成及促進骨吸收的作用[11-13]，但起作用的具體活性成分尚未明確。
LTA-sa 是金黃色葡萄球菌細胞壁上的重要毒性因子[4,14]。本研究發現，LTA-sa 作用于 RAW264.7 細胞后，在形態上形成了 TRAP 陽性且多核的破骨樣細胞，破骨樣細胞數隨 LTA-sa 濃度的增加而增多。骨吸收凹陷形成是成熟破骨細胞最重要特征[15]，本研究骨吸收凹陷實驗發現，LTA-sa 作用于 RAW264.7 細胞后，在 COAS24 孔板上見骨吸收凹陷形成，從功能上驗證了形成的破骨樣細胞具有骨吸收活性，表明 LTA-sa 具有促進破骨細胞分化形成的作用。這一結果與 Yang 等[16-17]的研究結果相反，其研究得出 LTA-sa 抑制了 RANKL 所誘導的破骨細胞分化形成。究其原因，可能與采用的破骨細胞前體細胞不同有關。Yang 等采用文獻[18]介紹的骨髓誘導法，用巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及 RANKL 誘導骨髓遠祖細胞獲得破骨細胞前體細胞，但破骨細胞前體細胞的形成率以及破骨細胞前體細胞所處的時期（早期、中期或晚期）明顯受 M-CSF、RANKL 濃度及作用時間影響，而且誘導獲得的破骨細胞前體細胞為多種細胞混合體，因此對結果產生一定影響。本研究選用的 RAW264.7 細胞是處于分化晚期的破骨細胞前體細胞[19]，使用 RANKL 即可促進 RAW264.7 細胞分化形成成熟的破骨細胞[17]，甚至在無 RANKL 作用時，LIGHT、IL-6、IL-8、TNF-α 等即可誘導其分化為成熟的破骨細胞[20]。由于細胞單一，將其作為觀察對象，實驗結果更可靠，目前已廣泛應用于體外研究破骨細胞形成及功能[21]。
此外，LTA-sa 雖然為金黃色葡萄球菌細胞壁上一毒性因子，但在本研究所用濃度下，其對 RAW264.7 細胞增殖活性無顯著影響，提示在慢性低毒性感染條件下，LTA-sa 更多體現其免疫原性而非毒性。LTA-sa 只是金黃色葡萄球菌眾多毒性因子的一種，我們還發現，金黃色葡萄球菌細胞壁上的肽聚糖同樣具有促進破骨細胞分化的作用[22]。而 Mendoza 等[23]研究也發現，金黃色葡萄球菌細胞壁上的蛋白 A 也具有促進破骨細胞分化形成的作用。由此說明，金黃色葡萄球菌細胞壁上的一些成分對破骨細胞分化形成及感染性骨缺損的發生起一定作用。但在感染情況下，金黃色葡萄球菌作為一種活菌，除了細胞壁毒性成分外，其還能合成分泌一些毒性因子。因此，作為一個整體，金黃色葡萄球菌對破骨細胞的誘導分化作用仍需進一步研究證實。而關于破骨細胞分化的信號通路，我們在后期研究發現，NF-κB 信號通路在 LTA-sa 誘導的破骨細胞分化形成中起重要作用[24]，但 LTA-sa 誘導作用下不僅 NF-κB 被激活，IL-6 表達也增高，而 IL-6 也可促進破骨細胞分化形成，LTA-sa 是直接促進破骨細胞分化形成，還是間接通過 IL-6 等細胞因子促進破骨細胞分化形成，有待進一步研究。
綜上述，本研究表明 LTA-sa 可促進破骨細胞分化，進而在金黃色葡萄球菌感染性骨缺損的發生中起一定作用，由此也提示，金黃色葡萄球菌性骨髓炎中感染性骨不連的成因除感染導致的成骨不全外，還存在感染導致破骨細胞活性增加。因此，從成骨不全及破骨增加兩方面對感染性骨不連進行深入機制研究，有望對骨髓炎的治療提供新的理論依據。
骨組織在生理狀態下會持續進行骨重建，成骨細胞調節骨形成，破骨細胞調節骨吸收，二者動態平衡對骨骼形狀及骨礦代謝維持具有重要作用[1]。這一平衡被破壞會導致骨代謝紊亂，最終導致各種病理性骨病。骨髓炎是一種骨組織感染，以化膿性炎癥、異常骨重建、難控性骨吸收為特征[2]，常導致感染性骨缺損，是骨科治療難題。金黃色葡萄球菌是引起骨髓炎最常見致病菌[3]，但其導致感染性骨缺損的機制尚不明確。金黃色葡萄球菌脂磷壁酸（Staphylococcal lipoteichoic acid，LTA-sa）是金黃色葡萄球菌細胞壁上的一個重要毒力因子[4]，其與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）一樣都有致炎特性及結構相似性[5]。Kishimoto 等[6]研究發現，LPS 能促進破骨細胞分化形成、促進骨吸收，而 LTA-sa 對破骨細胞分化過程的影響國內外研究較少。為此，本研究采用不同濃度的 LTA-sa 作用于 RAW264.7 細胞，以觀察其對破骨細胞分化形成的作用，報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
RAW264.7 細胞（昆明動物研究所）。LTA-sa（Invitrogen 公司，美國），將該粉末用 PBS 配制成濃度為 1 μg/mL 的溶液，再根據實驗所需濃度進行稀釋；PBS 及 H-DMEM 培養基（HyClone 公司，美國）；FBS（杭州四季青生物工程有限公司）；鼠 NF-κB 受體活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL；R&D Systems 公司，美國）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（Sigma 公司，美國）。
COAS（Corning Osteo Assay Surface）24 孔板（Corning 公司，美國）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；D90 型倒置相差顯微鏡（南京江南光電股份有限公司）；SW-CJ-1F 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗分組
根據培養條件不同，實驗分為 5 組，分別為 LTA-sa 100 ng/mL 組（A 組）、LTA-sa 200 ng/mL 組（B 組）、LTA-sa 400 ng/mL 組（C 組）、陽性對照組（D 組，RANKL 100 ng/mL）、空白對照組（E 組，等體積 PBS）。
1.3 觀測指標
1.3.1 TRAP 染色觀察 取 RAW264.7 細胞根據實驗分組（A～E 組），每組設 6 個復孔。細胞以 5 × 103 個/孔濃度接種于 96 孔板，使用完全培養基（含 15% FBS、1% 青鏈霉素混合溶液的 H-DMEM），于 37 ℃、5% CO2 細胞培養箱內培養過夜后，每組給予對應濃度 LTA-sa、RANKL 及 PBS，然后將培養板置于 37℃、5% CO2 細胞培養箱進行誘導培養，每 3 天換液 1 次，換液后重復加入 LTA-sa、RANKL 及 PBS，誘導培養后第 5 天進行 TRAP 染色。基本操作步驟：① 用枸櫞酸、丙酮及甲醛配制固定液，室溫固定細胞 30～60 s；② 去離子水清洗 3 遍，加入 TRAP 染液，37℃ 避光染色 1 h；③ 去離子水清洗 2 遍，蘇木素染色 1 min；④ 堿性自來水漂洗 3～4 遍，自然晾干。倒置相差顯微鏡下觀察，細胞質內見紅色酒石酸酸性磷酸酶活性顆粒者為 TRAP 陽性細胞。于 200 倍鏡下計數每孔破骨樣細胞（納入標準[7]：TRAP 陽性且細胞核≥3 個）。
1.3.2 骨吸收凹陷觀測 取 RAW264.7 細胞根據實驗分組（A～E 組），每組設 6 個復孔。細胞以 2 × 104 個/孔濃度接種于 COAS 24 孔板，同 1.3.1 方法進行誘導培養。誘導培養后第 5 天，移除培養基，PBS 漂洗 2 次，每孔加入 5% 次氯酸鈉溶液 1 mL，室溫放置 5 min，以移除培養板內細胞；去離子水清洗培養板 3 次，室溫放置 4 h 待其干燥。倒置相差顯微鏡下觀察骨吸收凹陷形成情況，用 Image-Pro Plus 6.0 軟件測量骨吸收凹陷面積及整個視野面積，計算骨吸收凹陷面積占整個視野面積的比值。
1.3.3 MTT 檢測 取 RAW264.7 細胞根據實驗分組（A、B、C、E 組），每組設 10 個復孔。細胞以 5 × 103 個/孔濃度接種于 96 孔板，同 1.3.1 方法進行誘導培養。誘導培養后第 5 天，每孔加入 5 mg/mL MTT 20 μL，避光條件下繼續培養 4 h，吸棄培養液，每孔加入 150 μL DMSO，避光震蕩 10 min。于酶標儀上用 570 nm 波長檢測吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準α = 0.05。
2 結果
2.1 TRAP 染色觀察
誘導培養后第 5 天，各組均可見破骨樣細胞形成（圖 1）。A～E 組破骨樣細胞數分別為（73.15±5.65）、（155.54±5.89）、（238.15±5.13）、（580.85±12.14）、（21.23±4.19）個/孔。A～D 組破骨樣細胞數均多于 E 組；且隨 LTA-sa 濃度增加，A、B、C 組破骨樣細胞數逐漸增加，但均低于 D 組。各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖1
各組 TRAP 染色觀察（倒置相差顯微鏡 ×200） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組； e. E 組
Figure1.
TRAP staining observation in each group (Inverted phase contrast microscopy × 200) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 骨吸收凹陷觀測
誘導培養后第 5 天，各組 COAS 24 孔板內均見骨吸收凹陷形成（圖 2）。A～E 組骨吸收凹陷面積占整個視野面積的比值分別為 0.001 947±0.000 118、0.002 671±0.000 092、0.004 499±0.000 100、0.009 595±0.001 017、0.000 167±0.000 122。A～D 組骨吸收凹陷面積占整個視野面積的比值均高于 E 組；且隨 LTA-sa 濃度增加，A、B、C 組逐漸增高，但均低于 D 組。各組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖2
各組骨吸收凹陷觀察（倒置相差顯微鏡 ×200） a. A 組； b. B 組； c. C 組； d. D 組； e. E 組
Figure2.
Bone resorption observation in each group (Inverted phase contrast microscopy × 200) a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 MTT 檢測
誘導培養后第 5 天，A、B、C、E 組A 值分別為 0.986±0.051、1.002±0.026、0.981±0.078、0.982±0.076，組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
3 討論
感染性骨缺損是骨髓炎治療難點之一，由于成骨細胞調節骨形成，既往關于金黃色葡萄球菌引起骨缺損的發生機制，多集中于金黃色葡萄球菌對成骨細胞的作用。相關研究發現，金黃色葡萄球菌能抑制成骨細胞的骨形成能力[8]，并促進其凋亡或壞死[9-10]。破骨細胞是唯一具有骨吸收活性的細胞，但研究發現金黃色葡萄球菌的表面相關蛋白具有促進破骨細胞分化形成及促進骨吸收的作用[11-13]，但起作用的具體活性成分尚未明確。
LTA-sa 是金黃色葡萄球菌細胞壁上的重要毒性因子[4,14]。本研究發現，LTA-sa 作用于 RAW264.7 細胞后，在形態上形成了 TRAP 陽性且多核的破骨樣細胞，破骨樣細胞數隨 LTA-sa 濃度的增加而增多。骨吸收凹陷形成是成熟破骨細胞最重要特征[15]，本研究骨吸收凹陷實驗發現，LTA-sa 作用于 RAW264.7 細胞后，在 COAS24 孔板上見骨吸收凹陷形成，從功能上驗證了形成的破骨樣細胞具有骨吸收活性，表明 LTA-sa 具有促進破骨細胞分化形成的作用。這一結果與 Yang 等[16-17]的研究結果相反，其研究得出 LTA-sa 抑制了 RANKL 所誘導的破骨細胞分化形成。究其原因，可能與采用的破骨細胞前體細胞不同有關。Yang 等采用文獻[18]介紹的骨髓誘導法，用巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及 RANKL 誘導骨髓遠祖細胞獲得破骨細胞前體細胞，但破骨細胞前體細胞的形成率以及破骨細胞前體細胞所處的時期（早期、中期或晚期）明顯受 M-CSF、RANKL 濃度及作用時間影響，而且誘導獲得的破骨細胞前體細胞為多種細胞混合體，因此對結果產生一定影響。本研究選用的 RAW264.7 細胞是處于分化晚期的破骨細胞前體細胞[19]，使用 RANKL 即可促進 RAW264.7 細胞分化形成成熟的破骨細胞[17]，甚至在無 RANKL 作用時，LIGHT、IL-6、IL-8、TNF-α 等即可誘導其分化為成熟的破骨細胞[20]。由于細胞單一，將其作為觀察對象，實驗結果更可靠，目前已廣泛應用于體外研究破骨細胞形成及功能[21]。
此外，LTA-sa 雖然為金黃色葡萄球菌細胞壁上一毒性因子，但在本研究所用濃度下，其對 RAW264.7 細胞增殖活性無顯著影響，提示在慢性低毒性感染條件下，LTA-sa 更多體現其免疫原性而非毒性。LTA-sa 只是金黃色葡萄球菌眾多毒性因子的一種，我們還發現，金黃色葡萄球菌細胞壁上的肽聚糖同樣具有促進破骨細胞分化的作用[22]。而 Mendoza 等[23]研究也發現，金黃色葡萄球菌細胞壁上的蛋白 A 也具有促進破骨細胞分化形成的作用。由此說明，金黃色葡萄球菌細胞壁上的一些成分對破骨細胞分化形成及感染性骨缺損的發生起一定作用。但在感染情況下，金黃色葡萄球菌作為一種活菌，除了細胞壁毒性成分外，其還能合成分泌一些毒性因子。因此，作為一個整體，金黃色葡萄球菌對破骨細胞的誘導分化作用仍需進一步研究證實。而關于破骨細胞分化的信號通路，我們在后期研究發現，NF-κB 信號通路在 LTA-sa 誘導的破骨細胞分化形成中起重要作用[24]，但 LTA-sa 誘導作用下不僅 NF-κB 被激活，IL-6 表達也增高，而 IL-6 也可促進破骨細胞分化形成，LTA-sa 是直接促進破骨細胞分化形成，還是間接通過 IL-6 等細胞因子促進破骨細胞分化形成，有待進一步研究。
綜上述，本研究表明 LTA-sa 可促進破骨細胞分化，進而在金黃色葡萄球菌感染性骨缺損的發生中起一定作用，由此也提示，金黃色葡萄球菌性骨髓炎中感染性骨不連的成因除感染導致的成骨不全外，還存在感染導致破骨細胞活性增加。因此，從成骨不全及破骨增加兩方面對感染性骨不連進行深入機制研究，有望對骨髓炎的治療提供新的理論依據。
