引用本文： 雷濤, 權正學, 張圓, 羅小輯, 余暢, 周強. 聯合應用 BMP-2 及細胞分化抑制因子 1 基因延緩兔腰椎間盤退變的動物實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2017, 31(1): 73-79. doi: 10.7507/1002-1892.201609035 復制
腰椎間盤退變相關的下腰痛和/或腰腿痛是脊柱外科常見疾病，該疾病不僅影響患者身心健康，造成大量勞動力喪失，而且帶來了巨大醫療花費，加重社會負擔[1-2]。目前傳統治療方式（非手術治療及手術治療）雖可在一定程度上緩解患者的臨床癥狀，但并不能從病因學上延緩或逆轉椎間盤退變的發生。近年來，隨著對椎間盤退變的分子生物學機制的深入研究，通過促進細胞外基質（蛋白聚糖、Ⅱ 型膠原）的合成或抑制其降解，以期達到延緩或逆轉椎間盤退變成為一種很有前景的治療方案[3]。前期研究表明，BMP-2 能上調椎間盤髓核細胞中蛋白多糖及 Ⅱ 型膠原的 mRNA 表達，且不增加骨鈣素 mRNA 的表達[4]；Kim等[5]研究也同樣證實了 BMP-2 不僅能增加人椎間盤髓核細胞合成蛋白多糖，同時能促進纖維環細胞的有絲分裂并維持其軟骨特性。研究報道 BMP-2 誘導細胞后，細胞分化抑制因子 1（inhibitors of differentiation 1，Id1）基因在早期表達升高[6]；我們課題組前期在體外細胞實驗中證明，通過上調 Id 基因表達，可有效提升 BMP-2 促進椎間盤髓核及終板細胞的細胞外基質合成能力[7-8]。然而，聯合應用 BMP-2 和 Id1 基因的體內實驗尚未見報道。因此，本實驗通過兔椎間盤退變模型中轉染慢病毒攜帶的 BMP-2 和 Id1 基因，基因轉染后分別采用 T2-mapping MRI 技術檢測椎間盤信號改變、ELISA 及實時熒光定量 PCR 技術檢測椎間盤組織 Ⅱ 型膠原及蛋白聚糖的變化，旨在明確這兩種基因在體內實驗中是否能有效緩解椎間盤退變。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
本實驗所有實驗動物及相關實驗方案經重慶醫科大學附屬第一醫院動物實驗倫理委員會批準。4 月齡新西蘭兔 32 只，雌雄不限，體質量 2.0～2.5 kg，購于重慶醫科大學實驗動物中心。
青霉素鈉（華北制藥有限公司）；戊巴比妥鈉[默克化工技術（上海）有限公司]；BMP-2 慢病毒、Id1 慢病毒、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）空載體慢病毒（滴度為 3×108pfu/mL，重慶高圣生物醫藥有限公司）；PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；DEPC（Sigma 公司，美國）；Trizol、RNase 抑制劑、PrimeSTAR?HSDNAPolymerase（Takara 公司，日本）；兔蛋白聚糖、兔 Ⅱ 型膠原 ELISA 試劑盒（Roche 公司，瑞士）。
MAGETOM ESSENIA 1.5T MRI 機（Siemens 公司，德國）；微量 DNA/RNA 定量儀（GeneGuent Pro 公司，美國）；FTC2000 熒光定量 PCR 儀（Funglyn Biotech 公司，加拿大）；CS-15R 低溫高速離心機（Beckman 公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Tek 公司，美國）。
1.2 腰椎間盤退變模型制備
所有實驗動物采用經腹纖維環細針穿刺造模方法，造模前后行腰椎側位 X 線片及 MRI 檢查，明確是否造模成功。術前30 min 肌肉注射青霉素鈉（20 萬 U/kg）預防感染，應用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經兔耳緣靜脈注射麻醉；然后將實驗動物仰臥位固定于操作臺上，腹部備皮，聚維酮碘溶液消毒 3 次；取肋弓下緣至髂棘水平腹部正中切口約 8 cm，逐層切開腹壁，將腸管輕撥至右側，暴露后腹膜，自左側輸尿管及腹主動脈中間剪開后腹膜，以左腎靜脈為標志（左腎靜脈橫跨 L3 椎體），觸診定位 L3、4、L4、5、L5、6 椎間盤，刀柄鈍性分離椎前肌肉，暴露目標椎間盤；應用 18G 穿刺針垂直刺入相應椎間盤，深度約 5 mm，停留 5 s 后拔出；還納腸管，間斷縫合關腹，術后動物放置籠中，任其自由活動。術后連續 3 d 給予肌肉注射青霉素鈉（20 萬 U/kg）抗感染，嚴密觀察動物后肢運動、切口及進食情況。術后 2 只動物死于造模時麻醉。術后 4 周復查腰椎 X 線片及 MRI 示，30 只實驗動物處理節段椎間隙變窄，椎間盤區域 T2 信號降低，提示腰椎間盤退變造模成功。見圖 1。
圖1
造模前后腰椎影像學檢查 a. 造模前側位 X 線片； b. 造模前MRI； c. 造模后 4 周側位 X 線片； d. 造模后 4 周MRI
Figure1.
Lumbar imaging examination before and after modeling a. Lateral X-ray film before modeling; b. MRI before modeling; c. Lateral X-ray film at 4 weeks after modeling; d. MRI at 4 weeks after modeling
1.3 實驗分組
將造模成功的 30 只實驗動物隨機分為 5 組：單獨注射 Lv-BMP-2 病毒組（A 組）、聯合注射 Lv-BMP-2 和 Lv-Id1 病毒組（B 組）、單獨注射 Lv-Id1 病毒組（C 組）、注射 Lv-GFP 空載體病毒組（D 組）及注射 PBS 組（E 組），每組 6 只。造模后 4 周同上法經左側暴露目標椎間盤，應用微量進樣器將 10 μL 各組病毒（滴度為 1×108pfu/mL）注射入椎間盤內，注射時間 3 min，進針深度 5 mm。各組分別于注射后 2、4、8 周隨機取 2 只動物進行以下觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 T2-mapping MRI檢查 采用正中矢狀位 T2-mapping MRI 片，從形態學水平評估基因轉染后效果。具體參數：采用多重回波自旋回波序列，重復時間 1 300 ms；回波時間 11.9、23.8、35.7、47.6、59.5、71.4、83.3、95.2、107.1、119.0 ms；矩陣 256×256；視野 170 mm；激勵次數 2 次；掃描層厚 2 mm，間隔 0.5 mm；總掃描時間 8 min 11 s。原始圖片經儀器自帶 syngo fastView 軟件處理后可獲得準確的 T2 弛豫時間（T2 值）。
1.4.2 實時熒光定量PCR檢測Ⅱ型膠原及蛋白聚糖 mRNA 表達 T2-mapping MRI 檢查后處死動物，無菌條件下獲取轉染病毒的目標椎間盤組織。將液氮保存的組織標本按 50～100 mg 組織加入 1 mL Trizol 試劑比例，在玻璃勻漿器中勻漿，直至組織完全溶化，然后按 Protocol 逐步提取 RNA 備用；反轉錄體系（總體積 20 μL）：2×RT buffer 10 μL，6N 隨機引物（100 pmol/μL）1 μL，RT-mix 1 μL，模板 RNA 5 μL，DEPC 水 3 μL；反轉錄反應條件：25℃、10 min，42℃、50 min，85℃、5 min。熒光定量 PCR 反應體系（總體積 50 μL）：2×PCR buffer 25 μL，引物（25 pmol/μL）1 μL×2，SYBR green Ⅰ 0.5 μL，模板（cDNA）2 μL，DEPC 水 20.5 μL；熒光定量 PCR 擴增條件：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，循環 35 次，72℃ 檢測信號。以β-actin為內參，以 2–ΔΔCt 表示 Ⅱ 型膠原、蛋白聚糖基因的相對表達量。樣本檢測重復 3 次。相關基因引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量PCR相關基因引物序列
Table1.
Specific primer sequences of real-time fluorescent quantitative PCR
1.4.3 ELISA檢測Ⅱ型膠原、蛋白聚糖含量 采用雙抗夾心法檢測各組各時間點兔腰椎間盤組織的Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量。在酶標包被板上分別設置標準品孔、空白孔（不加樣品及酶標試劑）、待測樣品孔，分別在標準品孔、待測樣品孔加入標準品及待測樣品 50 μL，標準品孔為不同濃度梯度，重復 2 次，待測樣品孔重復 3 次；封板后 37℃溫育30 min后用洗滌液洗滌 5 次；各孔加入酶標試劑 50 μL 后，重復溫育、洗滌步驟；然后先后加入 A、B 顯色劑各50 μL，輕輕振蕩均勻后 37℃ 避光顯色 15 min；每孔加入 50 μL 終止液終止顯色（此時藍色立轉黃色）；最后以空白孔調零，450 nm波長下測量各孔吸光度（A）值。以標準品的濃度梯度為橫坐標，A 值為縱坐標，計算標準曲線的直線回歸方程，將樣品的A 值帶入方程，計算出樣品濃度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 T2-mapping MRI檢查
注射后 0、2 周各組間 T2 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。注射后 4 周，A、B 組 T2 值顯著高于 C、D、E 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間及 C、D、E 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。注射后 8 周，B 組T2值顯著高于其余各組，A 組高于 C、D、E 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C 組 T2 值雖較基因轉染前降低，但仍顯著高于 D、E 組（P<0.05）；D、E 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2、圖 2。
表2
注射后各時間點各組T2值比較（
n
=6，
）
Table2.
Comparison of T2 values among groups at different time points after injection （
n
=6，
）
圖2
注射后 8 周各組典型T2-mapping MRI圖像 a. A組； b. B組； c. C組； d. D組； e. E組
Figure2.
The representative T2-mapping MRI images at 8 weeks after injection a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 實時熒光定量 PCR檢測 Ⅱ 型膠原及蛋白聚糖 mRNA 表達
注射后 2、4、8 周，B 組 Ⅱ 型膠原及蛋白聚糖 mRNA 相對表達量均顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。注射后 2、4 周，A 組蛋白聚糖 mRNA 相對表達量顯著高于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05），但 Ⅱ 型膠原mRNA相對表達量 A、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。注射后 8 周，A 組 Ⅱ 型膠原及蛋白聚糖 mRNA 相對表達量均顯著高于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
實時熒光定量PCR檢測各組各時間點Ⅱ型膠原及蛋白聚糖mRNA相對表達量（
n
=3，
）
Table3.
Expressions of collagen type II and proteoglycan in different groups at different time points （
n
=3，
）
2.3 ELISA 檢測 Ⅱ 型膠原、蛋白聚糖含量
注射后 2、4、8 周，B 組Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量均顯著高于其余各組，A 組顯著高于 C、D、E 組，C 組顯著高于 D、E 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表 4。
表4
ELISA檢測各組各時間點Ⅱ型膠原及蛋白多糖含量（
n=3，μg/L，
）
Table4.
Contents of collagen type II and proteoglycan in different groups at different time points（
n=3，μg/L，
）
3 討論
椎間盤退變最顯著的病理學表現為椎間盤內細胞數目減少和軟骨相關特異基因的產物合成下降（如蛋白聚糖和 Ⅱ 型膠原）[9-10]。基因治療的思路在于促進細胞外基質的合成和/或抑制其降解，從而達到延緩甚至逆轉椎間盤退變的目的[11]。許多細胞因子如 TGF-β、生長分化因子、IGF-1、BMPs、Id 和細胞內信號轉導分子 LIM礦化蛋白 1（LIM mineralization protein 1，LMP1）等均能刺激椎間盤細胞分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，同時促進細胞增殖[12-15]。在眾多刺激椎間盤髓核細胞分泌軟骨特性基質如 Ⅱ 型膠原和蛋白聚糖的生長因子和基因中，成骨誘導因子BMPs引起研究者們濃厚的興趣[16]。既往研究發現，應用BMP-2轉染細胞后，Id1早期表達升高[6]。而我們體外實驗證實，上調 Id1 基因能增強 BMP-2 促進椎間盤合成細胞外基質的能力[7-8]。本研究結果表明，髓核內聯合注射 BMP-2 和 Id1 基因能有效改善椎間盤退變進程，支持基因治療在椎間盤突變疾病的潛在應用價值。
Id分子屬螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）蛋白家族，缺乏與 DNA 堿性蛋白結合的區域，從而可抑制同一家族的堿性HLH轉錄因子的活性，抑制細胞分化，促進細胞增殖，既往 Id1 基因多集中于腫瘤方面研究[17-18]。本課題組前期體外實驗證實，Id1 能單獨或協同 BMP-2 促進椎間盤細胞分泌細胞外基質[7-8]。本實驗則通過體內髓核內轉染 BMP-2 及 Id1 基因發現，BMP-2、Id1 基因亦均能促進椎間盤細胞合成Ⅱ型膠原及蛋白聚糖，且聯合應用兩者效果更佳；而對于 D、E 組，不論 T2 值還是Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的合成能力均隨著觀察時間的延長而降低。正如Moon等[19]報道，在對比TGF-β1、IGF-1 和 BMP-2 的單基因和聯合治療實驗中發現，單生長因子提高蛋白聚糖合成程度為 180%～295%，而兩種生長因子可使蛋白聚糖的合成程度提高至 322%～398%，若以上 3 種因子聯合，則可使蛋白聚糖合成程度提高至471%；因此基因聯合治療可增強基因治療效果，并且可減少每種因子的使用量，減輕載體的毒性反應，為基因治療的一大研究熱點[20]。
T2-mapping MRI 技術是以 T2 值量化椎間盤內水含量及膠原分解情況[21]，與傳統以 T2WI MRI 信號強度變化情況界定椎間盤退變級別相比，能更加客觀地量化椎間盤的退變情況[22]。雖然本實驗在分子水平上證實，聯合應用 BMP-2 及 Id1 基因效果優于髓核內單基因轉染，但 T2-mapping MRI 在影像學上并未證實聯合基因組與 BMP-2 組在早期治療效果上有統計學意義，究其原因，考慮 T2-mapping MRI 雖可連續定量評估退變，然而其對于中重度椎間盤退變分辨能力較差[22]；亦可能基因轉染后觀察時段尚短，還未出現顯著的形態學改善。Inoue 等[23]發現造模后 4 周注射重組人 BMP-2 能顯著改善椎間盤退變的 MRI 級別，但造模后 6、8 周注射重組人 BMP-2 則無效。說明基因治療適用于輕中度椎間盤退變，重度退變可能因椎間盤內髓核細胞損失殆盡而導致基因治療無效[24]。結合本次實驗，提示 T2-mapping MRI 優勢在于早期發現、診斷椎間盤退變，并有可能確定最佳的基因治療時機，而對于評估退變椎間盤治療效果則欠佳。
綜上述，本實驗在體內聯合應用 BMP-2 及Id1，能促進兔腰椎間盤細胞Ⅱ型膠原及蛋白聚糖合成能力，提示基因治療的可操作性，支持基因治療尤其是聯合治療的潛在應用價值，并為椎間盤退變性疾病的基因治療提供了一個新的切入點。Kurooka等[25-26]在小鼠胚胎成纖維細胞和成肌細胞中證實，BMP 通過 Smads 復合體結合 Id2基因轉錄起始位點上游富集 GGCGGC 堿基序列高度保守的 BMP 反應元件，調節 Id2 基因表達，進而影響細胞的增殖、分化。但椎間盤細胞中 BMP-2 及 Id1 具體作用機制及信號通路仍需進一步研究明確。該實驗采用的兔細針穿刺腰椎退變模型，雖在組織學上與人類一致，但兩者生理病理過程是否重復仍不可知，且因種屬不同，因此應用于臨床時應慎重；此外，雖然實驗過程中未觀察到不良反應，但本實驗未對基因治療的安全性進行評估，如載體免疫反應、致癌可能等[27-28]，相關實驗仍有待進一步完善。
腰椎間盤退變相關的下腰痛和/或腰腿痛是脊柱外科常見疾病，該疾病不僅影響患者身心健康，造成大量勞動力喪失，而且帶來了巨大醫療花費，加重社會負擔[1-2]。目前傳統治療方式（非手術治療及手術治療）雖可在一定程度上緩解患者的臨床癥狀，但并不能從病因學上延緩或逆轉椎間盤退變的發生。近年來，隨著對椎間盤退變的分子生物學機制的深入研究，通過促進細胞外基質（蛋白聚糖、Ⅱ 型膠原）的合成或抑制其降解，以期達到延緩或逆轉椎間盤退變成為一種很有前景的治療方案[3]。前期研究表明，BMP-2 能上調椎間盤髓核細胞中蛋白多糖及 Ⅱ 型膠原的 mRNA 表達，且不增加骨鈣素 mRNA 的表達[4]；Kim等[5]研究也同樣證實了 BMP-2 不僅能增加人椎間盤髓核細胞合成蛋白多糖，同時能促進纖維環細胞的有絲分裂并維持其軟骨特性。研究報道 BMP-2 誘導細胞后，細胞分化抑制因子 1（inhibitors of differentiation 1，Id1）基因在早期表達升高[6]；我們課題組前期在體外細胞實驗中證明，通過上調 Id 基因表達，可有效提升 BMP-2 促進椎間盤髓核及終板細胞的細胞外基質合成能力[7-8]。然而，聯合應用 BMP-2 和 Id1 基因的體內實驗尚未見報道。因此，本實驗通過兔椎間盤退變模型中轉染慢病毒攜帶的 BMP-2 和 Id1 基因，基因轉染后分別采用 T2-mapping MRI 技術檢測椎間盤信號改變、ELISA 及實時熒光定量 PCR 技術檢測椎間盤組織 Ⅱ 型膠原及蛋白聚糖的變化，旨在明確這兩種基因在體內實驗中是否能有效緩解椎間盤退變。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
本實驗所有實驗動物及相關實驗方案經重慶醫科大學附屬第一醫院動物實驗倫理委員會批準。4 月齡新西蘭兔 32 只，雌雄不限，體質量 2.0～2.5 kg，購于重慶醫科大學實驗動物中心。
青霉素鈉（華北制藥有限公司）；戊巴比妥鈉[默克化工技術（上海）有限公司]；BMP-2 慢病毒、Id1 慢病毒、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）空載體慢病毒（滴度為 3×108pfu/mL，重慶高圣生物醫藥有限公司）；PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；DEPC（Sigma 公司，美國）；Trizol、RNase 抑制劑、PrimeSTAR?HSDNAPolymerase（Takara 公司，日本）；兔蛋白聚糖、兔 Ⅱ 型膠原 ELISA 試劑盒（Roche 公司，瑞士）。
MAGETOM ESSENIA 1.5T MRI 機（Siemens 公司，德國）；微量 DNA/RNA 定量儀（GeneGuent Pro 公司，美國）；FTC2000 熒光定量 PCR 儀（Funglyn Biotech 公司，加拿大）；CS-15R 低溫高速離心機（Beckman 公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Tek 公司，美國）。
1.2 腰椎間盤退變模型制備
所有實驗動物采用經腹纖維環細針穿刺造模方法，造模前后行腰椎側位 X 線片及 MRI 檢查，明確是否造模成功。術前30 min 肌肉注射青霉素鈉（20 萬 U/kg）預防感染，應用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經兔耳緣靜脈注射麻醉；然后將實驗動物仰臥位固定于操作臺上，腹部備皮，聚維酮碘溶液消毒 3 次；取肋弓下緣至髂棘水平腹部正中切口約 8 cm，逐層切開腹壁，將腸管輕撥至右側，暴露后腹膜，自左側輸尿管及腹主動脈中間剪開后腹膜，以左腎靜脈為標志（左腎靜脈橫跨 L3 椎體），觸診定位 L3、4、L4、5、L5、6 椎間盤，刀柄鈍性分離椎前肌肉，暴露目標椎間盤；應用 18G 穿刺針垂直刺入相應椎間盤，深度約 5 mm，停留 5 s 后拔出；還納腸管，間斷縫合關腹，術后動物放置籠中，任其自由活動。術后連續 3 d 給予肌肉注射青霉素鈉（20 萬 U/kg）抗感染，嚴密觀察動物后肢運動、切口及進食情況。術后 2 只動物死于造模時麻醉。術后 4 周復查腰椎 X 線片及 MRI 示，30 只實驗動物處理節段椎間隙變窄，椎間盤區域 T2 信號降低，提示腰椎間盤退變造模成功。見圖 1。
圖1
造模前后腰椎影像學檢查 a. 造模前側位 X 線片； b. 造模前MRI； c. 造模后 4 周側位 X 線片； d. 造模后 4 周MRI
Figure1.
Lumbar imaging examination before and after modeling a. Lateral X-ray film before modeling; b. MRI before modeling; c. Lateral X-ray film at 4 weeks after modeling; d. MRI at 4 weeks after modeling
1.3 實驗分組
將造模成功的 30 只實驗動物隨機分為 5 組：單獨注射 Lv-BMP-2 病毒組（A 組）、聯合注射 Lv-BMP-2 和 Lv-Id1 病毒組（B 組）、單獨注射 Lv-Id1 病毒組（C 組）、注射 Lv-GFP 空載體病毒組（D 組）及注射 PBS 組（E 組），每組 6 只。造模后 4 周同上法經左側暴露目標椎間盤，應用微量進樣器將 10 μL 各組病毒（滴度為 1×108pfu/mL）注射入椎間盤內，注射時間 3 min，進針深度 5 mm。各組分別于注射后 2、4、8 周隨機取 2 只動物進行以下觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 T2-mapping MRI檢查 采用正中矢狀位 T2-mapping MRI 片，從形態學水平評估基因轉染后效果。具體參數：采用多重回波自旋回波序列，重復時間 1 300 ms；回波時間 11.9、23.8、35.7、47.6、59.5、71.4、83.3、95.2、107.1、119.0 ms；矩陣 256×256；視野 170 mm；激勵次數 2 次；掃描層厚 2 mm，間隔 0.5 mm；總掃描時間 8 min 11 s。原始圖片經儀器自帶 syngo fastView 軟件處理后可獲得準確的 T2 弛豫時間（T2 值）。
1.4.2 實時熒光定量PCR檢測Ⅱ型膠原及蛋白聚糖 mRNA 表達 T2-mapping MRI 檢查后處死動物，無菌條件下獲取轉染病毒的目標椎間盤組織。將液氮保存的組織標本按 50～100 mg 組織加入 1 mL Trizol 試劑比例，在玻璃勻漿器中勻漿，直至組織完全溶化，然后按 Protocol 逐步提取 RNA 備用；反轉錄體系（總體積 20 μL）：2×RT buffer 10 μL，6N 隨機引物（100 pmol/μL）1 μL，RT-mix 1 μL，模板 RNA 5 μL，DEPC 水 3 μL；反轉錄反應條件：25℃、10 min，42℃、50 min，85℃、5 min。熒光定量 PCR 反應體系（總體積 50 μL）：2×PCR buffer 25 μL，引物（25 pmol/μL）1 μL×2，SYBR green Ⅰ 0.5 μL，模板（cDNA）2 μL，DEPC 水 20.5 μL；熒光定量 PCR 擴增條件：94℃、4 min，94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，循環 35 次，72℃ 檢測信號。以β-actin為內參，以 2–ΔΔCt 表示 Ⅱ 型膠原、蛋白聚糖基因的相對表達量。樣本檢測重復 3 次。相關基因引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量PCR相關基因引物序列
Table1.
Specific primer sequences of real-time fluorescent quantitative PCR
1.4.3 ELISA檢測Ⅱ型膠原、蛋白聚糖含量 采用雙抗夾心法檢測各組各時間點兔腰椎間盤組織的Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量。在酶標包被板上分別設置標準品孔、空白孔（不加樣品及酶標試劑）、待測樣品孔，分別在標準品孔、待測樣品孔加入標準品及待測樣品 50 μL，標準品孔為不同濃度梯度，重復 2 次，待測樣品孔重復 3 次；封板后 37℃溫育30 min后用洗滌液洗滌 5 次；各孔加入酶標試劑 50 μL 后，重復溫育、洗滌步驟；然后先后加入 A、B 顯色劑各50 μL，輕輕振蕩均勻后 37℃ 避光顯色 15 min；每孔加入 50 μL 終止液終止顯色（此時藍色立轉黃色）；最后以空白孔調零，450 nm波長下測量各孔吸光度（A）值。以標準品的濃度梯度為橫坐標，A 值為縱坐標，計算標準曲線的直線回歸方程，將樣品的A 值帶入方程，計算出樣品濃度。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 T2-mapping MRI檢查
注射后 0、2 周各組間 T2 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。注射后 4 周，A、B 組 T2 值顯著高于 C、D、E 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B 組間及 C、D、E 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。注射后 8 周，B 組T2值顯著高于其余各組，A 組高于 C、D、E 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C 組 T2 值雖較基因轉染前降低，但仍顯著高于 D、E 組（P<0.05）；D、E 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2、圖 2。
表2
注射后各時間點各組T2值比較（
n
=6，
）
Table2.
Comparison of T2 values among groups at different time points after injection （
n
=6，
）
圖2
注射后 8 周各組典型T2-mapping MRI圖像 a. A組； b. B組； c. C組； d. D組； e. E組
Figure2.
The representative T2-mapping MRI images at 8 weeks after injection a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 實時熒光定量 PCR檢測 Ⅱ 型膠原及蛋白聚糖 mRNA 表達
注射后 2、4、8 周，B 組 Ⅱ 型膠原及蛋白聚糖 mRNA 相對表達量均顯著高于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。注射后 2、4 周，A 組蛋白聚糖 mRNA 相對表達量顯著高于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05），但 Ⅱ 型膠原mRNA相對表達量 A、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。注射后 8 周，A 組 Ⅱ 型膠原及蛋白聚糖 mRNA 相對表達量均顯著高于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
實時熒光定量PCR檢測各組各時間點Ⅱ型膠原及蛋白聚糖mRNA相對表達量（
n
=3，
）
Table3.
Expressions of collagen type II and proteoglycan in different groups at different time points （
n
=3，
）
2.3 ELISA 檢測 Ⅱ 型膠原、蛋白聚糖含量
注射后 2、4、8 周，B 組Ⅱ型膠原及蛋白聚糖含量均顯著高于其余各組，A 組顯著高于 C、D、E 組，C 組顯著高于 D、E 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；D、E 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表 4。
表4
ELISA檢測各組各時間點Ⅱ型膠原及蛋白多糖含量（
n=3，μg/L，
）
Table4.
Contents of collagen type II and proteoglycan in different groups at different time points（
n=3，μg/L，
）
3 討論
椎間盤退變最顯著的病理學表現為椎間盤內細胞數目減少和軟骨相關特異基因的產物合成下降（如蛋白聚糖和 Ⅱ 型膠原）[9-10]。基因治療的思路在于促進細胞外基質的合成和/或抑制其降解，從而達到延緩甚至逆轉椎間盤退變的目的[11]。許多細胞因子如 TGF-β、生長分化因子、IGF-1、BMPs、Id 和細胞內信號轉導分子 LIM礦化蛋白 1（LIM mineralization protein 1，LMP1）等均能刺激椎間盤細胞分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，同時促進細胞增殖[12-15]。在眾多刺激椎間盤髓核細胞分泌軟骨特性基質如 Ⅱ 型膠原和蛋白聚糖的生長因子和基因中，成骨誘導因子BMPs引起研究者們濃厚的興趣[16]。既往研究發現，應用BMP-2轉染細胞后，Id1早期表達升高[6]。而我們體外實驗證實，上調 Id1 基因能增強 BMP-2 促進椎間盤合成細胞外基質的能力[7-8]。本研究結果表明，髓核內聯合注射 BMP-2 和 Id1 基因能有效改善椎間盤退變進程，支持基因治療在椎間盤突變疾病的潛在應用價值。
Id分子屬螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix，HLH）蛋白家族，缺乏與 DNA 堿性蛋白結合的區域，從而可抑制同一家族的堿性HLH轉錄因子的活性，抑制細胞分化，促進細胞增殖，既往 Id1 基因多集中于腫瘤方面研究[17-18]。本課題組前期體外實驗證實，Id1 能單獨或協同 BMP-2 促進椎間盤細胞分泌細胞外基質[7-8]。本實驗則通過體內髓核內轉染 BMP-2 及 Id1 基因發現，BMP-2、Id1 基因亦均能促進椎間盤細胞合成Ⅱ型膠原及蛋白聚糖，且聯合應用兩者效果更佳；而對于 D、E 組，不論 T2 值還是Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的合成能力均隨著觀察時間的延長而降低。正如Moon等[19]報道，在對比TGF-β1、IGF-1 和 BMP-2 的單基因和聯合治療實驗中發現，單生長因子提高蛋白聚糖合成程度為 180%～295%，而兩種生長因子可使蛋白聚糖的合成程度提高至 322%～398%，若以上 3 種因子聯合，則可使蛋白聚糖合成程度提高至471%；因此基因聯合治療可增強基因治療效果，并且可減少每種因子的使用量，減輕載體的毒性反應，為基因治療的一大研究熱點[20]。
T2-mapping MRI 技術是以 T2 值量化椎間盤內水含量及膠原分解情況[21]，與傳統以 T2WI MRI 信號強度變化情況界定椎間盤退變級別相比，能更加客觀地量化椎間盤的退變情況[22]。雖然本實驗在分子水平上證實，聯合應用 BMP-2 及 Id1 基因效果優于髓核內單基因轉染，但 T2-mapping MRI 在影像學上并未證實聯合基因組與 BMP-2 組在早期治療效果上有統計學意義，究其原因，考慮 T2-mapping MRI 雖可連續定量評估退變，然而其對于中重度椎間盤退變分辨能力較差[22]；亦可能基因轉染后觀察時段尚短，還未出現顯著的形態學改善。Inoue 等[23]發現造模后 4 周注射重組人 BMP-2 能顯著改善椎間盤退變的 MRI 級別，但造模后 6、8 周注射重組人 BMP-2 則無效。說明基因治療適用于輕中度椎間盤退變，重度退變可能因椎間盤內髓核細胞損失殆盡而導致基因治療無效[24]。結合本次實驗，提示 T2-mapping MRI 優勢在于早期發現、診斷椎間盤退變，并有可能確定最佳的基因治療時機，而對于評估退變椎間盤治療效果則欠佳。
綜上述，本實驗在體內聯合應用 BMP-2 及Id1，能促進兔腰椎間盤細胞Ⅱ型膠原及蛋白聚糖合成能力，提示基因治療的可操作性，支持基因治療尤其是聯合治療的潛在應用價值，并為椎間盤退變性疾病的基因治療提供了一個新的切入點。Kurooka等[25-26]在小鼠胚胎成纖維細胞和成肌細胞中證實，BMP 通過 Smads 復合體結合 Id2基因轉錄起始位點上游富集 GGCGGC 堿基序列高度保守的 BMP 反應元件，調節 Id2 基因表達，進而影響細胞的增殖、分化。但椎間盤細胞中 BMP-2 及 Id1 具體作用機制及信號通路仍需進一步研究明確。該實驗采用的兔細針穿刺腰椎退變模型，雖在組織學上與人類一致，但兩者生理病理過程是否重復仍不可知，且因種屬不同，因此應用于臨床時應慎重；此外，雖然實驗過程中未觀察到不良反應，但本實驗未對基因治療的安全性進行評估，如載體免疫反應、致癌可能等[27-28]，相關實驗仍有待進一步完善。
