引用本文： 肖志鋒, 林定坤. 骨關節炎軟骨內骨化病理研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(12): 1556-1561. doi: 10.7507/1002-1892.20160320 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是引起中老年人群關節功能障礙的最常見退行性病變，其終末期關節僵直的致殘率高，嚴重影響患者生活質量[1]。因為軟骨破壞是OA最直觀的病理表現，所以傳統觀點認為OA是一種軟骨降解破壞性疾病，并選擇抗炎和抑制軟骨降解藥物治療，但結果顯示此類藥物不能有效阻止OA病情進展。研究發現，OA不僅是軟骨降解，軟骨下骨、滑膜等關節組織均在OA發生發展中具有重要作用[2-4]，且軟骨下骨和滑膜病變均可在未發生軟骨退變的早期發現[3, 5-6]。關節異常機械應力可促使軟骨下骨重塑，并且出現軟骨細胞肥大，進而表達Runx2、基質金屬蛋白酶13、骨鈣素等骨化相關蛋白；OA軟骨和關節液中也常發現磷酸鈣等骨鹽的沉積；提示軟骨降解可能是軟骨內骨化的一種外在表現，軟骨內骨化是OA的重要病理過程，而通過抑制這一過程可能成為治療OA的有效靶點。現對OA軟骨內骨化的相關研究作一綜述，旨在為認識OA病理機制及其治療提供參考。
1 力學失衡促使OA關節的骨化重塑
雖然OA發病因素復雜，但是機械力因素已明確。力學刺激對維持正常骨、軟骨代謝轉換，保證關節組織動態平衡具有重要作用，同時也是OA的主要病因[7-8]。關節面上由透明軟骨、鈣化軟骨、潮線、軟骨下骨板及小梁構成的骨-軟骨復合體是關節承重和潤滑的功能單位[9]，其結構破壞是OA的最終結局。主要參與骨和軟骨重塑的細胞群（骨細胞、成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞）能敏銳感知和響應外部機械信號，并通過一系列分子級聯控制骨、軟骨的代謝轉換[10]。異常的機械刺激會造成軟骨下骨小梁的微骨折，并導致骨、軟骨細胞中一些信號分子通路激活，引起關節的骨化重塑[10-11]。研究顯示，Wnt[12]、TGF-β[13-14]、RANKL/OPG/RANK[15]等多條調控骨、軟骨代謝信號通路的失常及在骨-軟骨間的串話，共同促使OA的進展[16]。前交叉韌帶切斷造成的異常關節面應力可引起軟骨下骨TGF-β1的激活，并招募MSCs導致軟骨下骨重塑，在軟骨破壞區可見軟骨鈣化區明顯增厚，其潮線幾乎延伸到軟骨表面[13]，表明異常應力通過偶聯TGF-β信號通路引起軟骨內骨化。而在純種賽馬的膝關節中，長期高負荷應力引起的軟骨內骨化以及軟骨下骨板的重塑是導致關節髁疲勞（應力）骨折發生的關鍵因素[17]。Pap等[18]通過比較OA與類風濕性關節炎軟骨破壞的異同，發現關節軟骨細胞穩定表型丟失，并開始出現類似胚胎的軟骨內骨化過程是OA的重要特征；與OA不同，類風濕性關節炎與成纖維滑膜細胞的持續性腫瘤樣活化有關，滑膜直接侵襲破壞關節軟骨。因此，軟骨內骨化是OA發生的重要病理過程[19]。在異常機械應力下，多種炎性細胞因子和信號通路參與骨-軟骨間的交互作用[16, 20]，骨-軟骨界面血管長入[21]，破骨細胞、成骨細胞及MSCs等細胞的相繼募集[22]導致了OA骨-軟骨結構單位的軟骨內骨化進程。骨-軟骨結構單位中出現類似生長板的軟骨不斷鈣化，以及鈣化軟骨不斷被軟骨下骨侵蝕替換的重塑過程，可能是促使OA發生發展的關鍵環節[23]。
2 OA軟骨的破壞與骨化重塑
軟骨內骨化是一種發生在胚胎或者長骨骺板的骨的軟骨模型逐漸被骨組織替代的過程。發生軟骨內骨化時，首先軟骨細胞經過增殖、肥大、死亡并分泌出大量基質，隨后血管、成骨細胞、破骨細胞和基質干細胞侵入軟骨基質，最后在殘留的軟骨基質上出現骨沉積，其中軟骨細胞的時序性變化受到全身及局部細胞因子的嚴格調控，這些因子通過跨膜受體信號轉導激活軟骨細胞選擇性轉錄因子[24]。通常情況下，成熟個體的軟骨內骨化出現在生長板中。然而關節軟骨與生長板的相似性，以及OA關節中軟骨代謝和結構轉變，表明OA可能是一種軟骨內骨化性疾病[25]。
2.1 關節軟骨與生長板組成和結構的相似性
2.1.1 關節軟骨與生長板的發育
骨、關節軟骨、生長板的形成均起源于胚胎發育時期間葉細胞的凝集，部分間葉細胞直接分化為成骨細胞開始膜內成骨，其余大部分則分化形成軟骨祖細胞形成軟骨原基，然后進一步發生軟骨內骨化[26]。這是一個復雜且精細的調控過程，在時間和空間上受到多種分子機制和信號通路的調控[27]。
原始的軟骨原基是關節軟骨、骺軟骨、生長板發育的母體。關節發育過程中，軟骨原基在將要發生關節的部位出現軟骨祖細胞的凝集，形成一個橫向的關節間帶區（細胞密集區），Noggin（BMP拮抗劑）在這些細胞中表達，以維持細胞在一種相對未分化狀態，隨后間帶區的中間部分出現透明質酸的分泌，導致組織松散，細胞死亡，周圍細胞向兩側聚集，關節間隙形成，間隙邊緣貼近骺軟骨的軟骨細胞最后形成關節軟骨覆蓋上、下骨端[28-30]。總結上述研究，滑膜關節形成開始于軟骨原基上關節特異部位的定位和規劃，隨之發生關節腔形成。生長板同樣由軟骨原基發育而來，當發育到一定時期，骺軟骨內出現次級骨化中心，將生長板與關節軟骨分隔開來，次級與初級骨化中心之間的軟骨結構即為生長板。生長板靠近骨骺端的部分因為軟骨祖細胞的凝聚而呈現相對未分化狀態，靠近骨干的一側則細胞肥大發生軟骨內骨化[31-32]。關節軟骨與生長板最終維持不同的細胞特征，Noggin在調控中起著關鍵作用。關節軟骨的形成依靠特定部位Noggin表達抑制軟骨原基的軟骨內骨化實現；而缺少Noggin時，軟骨細胞的凝集也能正常發生，但是發展為增生性肥大，關節形成失敗，沒有Noggin的拮抗會導致BMP過度激活，募集大量細胞形成軟骨，最后在本該形成關節的部位發展為過度肥大的生長板[30, 33]。因此，生長板與關節軟骨是受不同因子調控下軟骨細胞的兩種狀態。在軟骨原基發育形成的關節、骨骺、生長板結構中，關節軟骨與骺軟骨交界處有一層過渡的肥大細胞層，不同層次關節軟骨細胞依次覆在上面，形成一種與生長板非常類似的結構[24, 34]。一旦關節軟骨細胞的內環境發生轉變導致細胞調控出現異常，其有可能由靜息狀態重新轉變為與生長板軟骨細胞類似的特性，進而發生軟骨內骨化。
2.1.2 關節軟骨與生長板的結構特征
關節軟骨不但與生長板共同起源于軟骨原基，而且發育成相似的結構。形態學上，生長板可分為數層結構，不同種類和功能的軟骨細胞有序排列在形態不同的區域。其大致可分為4區：離骨面最遠的表層是靜息軟骨區，此區軟骨細胞具有很強的增殖潛力，可看作干細胞區；鄰近靜息軟骨區的是增殖軟骨區，可見小圓形的增殖細胞變為扁平狀集聚成簇，增殖區的細胞由靜息區增殖轉變而來；在增殖區下方出現一種細胞的過渡態，稱為前肥大軟骨細胞，細胞排列由平行轉為縱向，隨后其轉變為肥大軟骨細胞并分泌大量基質，此為肥大軟骨細胞區；在最底層，肥大軟骨細胞死亡，圍繞軟骨基質的軟骨橫隔膜破碎，血管、巨噬細胞、前成骨細胞侵入，殘留的軟骨基質上出現骨沉積，此為軟骨礦化區[24]。
成熟關節軟骨也具有與生長板類似的層級結構，可有序分成數層（表層、過渡層、放射層、鈣化層），不同層次的軟骨表現相應的結構和功能特性，隨著軟骨不同層面基質特性的變化，基質中軟骨細胞也出現深度依賴性改變[35]。關節軟骨表層由細長而扁平的干細胞/前體細胞[29]與大量膠原基質結合在一起，構成與關節面平行的軟骨表層，其含有相對未分化的靜息軟骨干細胞，是軟骨其他區域細胞的來源；關節軟骨的中層軟骨細胞為圓形，呈縱向排列，并產生Ⅱ型膠原和蛋白多糖維持軟骨基質平衡，是維持軟骨生物力學特性即彈性的關鍵；軟骨底層區的細胞形態變大并繼續分泌基質，細胞到達軟骨與礦化區的邊界，此層存在潮線結構；潮線下方軟骨細胞凋亡/消失，為一層鈣化軟骨[36]。因此，關節軟骨在形態結構和軟骨細胞特征上非常相似。
關節軟骨表層對應為生長板靜息區和增殖區，過渡層和放射層分別為生長板的細胞前肥大與肥大區，鈣化軟骨層則為生長板的軟骨礦化區，而關節軟骨中透明軟骨與骨的分界標志潮線對應為生長板中的軟骨模型發生骨替換前的基質橫隔膜。提示關節軟骨保留了生長板類似的結構，它們在結構排列上的高度相似性，表明關節軟骨其實是一種靜息狀態下的生長板。
2.2 OA軟骨內骨化的病理表現
生長板的軟骨內骨化分為兩個階段，首先軟骨細胞增殖分化形成軟骨模型，隨后軟骨模型發生軟骨內骨化而成骨。關節透明軟骨是一種低轉換的永久組織結構，這種結構是經過長期生物進化的結果，優于其他任何形式[37]。研究顯示Ⅱ型膠原纖維的半衰期為117年，蛋白聚糖的代謝周期約為3.4年，因此關節軟骨細胞必須維持在一種“靜息”但又代謝相對活躍的狀態，以完成基質的緩慢轉換，保證有序和穩定的軟骨結構[38]。OA關節軟骨中軟骨細胞特征發生改變（增殖、肥大）[39]，并出現血管侵蝕等病理改變，表明軟骨細胞與基質平衡被打破，出現向軟骨內骨化的轉變[40-41]，這可能是OA軟骨破壞的主要原因。
2.2.1 OA軟骨的血管侵蝕
血管侵入是發生軟骨內骨化最重要的特征之一。軟骨內表達VEGF會刺激靜息狀態的軟骨細胞重新進入增殖肥大狀態，并開始軟骨內骨化，阻斷VEGF會抑制軟骨向骨的轉變[41-43]。鈣化軟骨、軟骨下骨血管侵入是OA常見病理特征[16, 21]，提示軟骨內骨化是OA發生發展的重要原因。研究證實缺氧能促使血管生成。在組織缺氧條件下，Sasaki等[44]利用MSCs誘導形成了軟骨球，進而發生軟骨內骨化，形成了中心為礦化骨且表面覆蓋軟骨的三維組織結構，在此過程中，MSCs細胞球出現了細胞、基質分層，而檢測發現HIF-1α的表達也只對應于內部的肥大細胞層。這種混合組織中的血管活性與軟骨細胞的特征相關，起初軟骨細胞表達一種抗血管生成因子軟骨調節素Ⅰ（chondromodulinⅠ，ChM-Ⅰ），隨著中心軟骨細胞成熟肥大，ChM-Ⅰ表達降低，軟骨內血管活性增高，最后骨化，印證了軟骨的血管新生與骨化密切相關。研究證實HIF-1α在OA關節軟骨中呈高表達，且與OA軟骨細胞增殖肥大、聚集成簇有關，而通常在正常軟骨中只有接近鈣化區的深層軟骨細胞才有HIF-1α表達[45-46]，表明OA關節軟骨可能發生類似的軟骨內骨化。缺氧誘導因子的另一亞型HIF-2α在OA軟骨中升高，Saito等[47]的研究表明HIF-2α在介導OA發生及骨骼生長的軟骨內骨化進程中有重要作用，其特異的與缺氧反應元件結合促使COL10A1、基質金屬蛋白酶13及VEGF-a的活化增強，而這是軟骨內骨化進程中發生軟骨細胞肥大和血管侵入該中心環節的標志。
2.2.2 OA軟骨細胞的肥大
軟骨細胞肥大是軟骨內骨化一種特異性表現，OA除了出現關節軟骨血管侵入，關節軟骨中靜息的軟骨細胞重新增殖肥大、聚集[39, 48]、凋亡[49-50]是另一個與生長板相似的特征，也是OA發生軟骨內骨化證據之一。值得注意的是，OA軟骨細胞的增殖肥大可能是軟骨損傷后的代償修復反應，然而軟骨細胞的這種改變并不能完成自我修復，最終促進基質破壞和軟骨內骨化[51]。肥大的軟骨細胞已經不是正常功能的軟骨細胞，最近一項研究發現，鈣化與軟骨細胞的肥大性分化密切相關[52]，OA軟骨細胞增殖肥大，以及分泌基質金屬蛋白酶13及Runx2等是關節軟骨發生軟骨內骨化的開始。大量研究表明，重新活化的軟骨細胞不再分泌正常軟骨基質，如Ⅱ型膠原、蛋白多糖，但分泌基質金屬蛋白酶、ADAMTS（ADAMTS-4、ADAMTS-5）、Ⅹ型膠原，導致基質降解和結構紊亂[16, 20, 53-54]，進而造成基質通透性增高，軟骨下骨和滑膜炎癥產生的細胞因子滲透至軟骨基質中，進一步促使軟骨細胞改變，并為血管和成骨干細胞的侵入提供條件。此外，OA中維持靜息關節軟骨細胞表征的SOX9表達下降，BMP-2[55]、骨橋蛋白[56-58]、Runx2[59]等多種成骨相關調控因子在OA肥大軟骨細胞中的表達明顯增加，這些成骨因子可以促使關節軟骨發生軟骨內骨化[60-61]。OA中分裂的軟骨細胞高表達縫隙連接蛋白，促進軟骨細胞聚集成簇，導致軟骨動態平衡被打破[62]，軟骨結構中有序的細胞排列同時發生重組，出現軟骨細胞的雙鏈狀排列以及環形簇擁集聚[35, 63]，這些都是類似于生長板軟骨細胞的特征。生長板中肥大層向鈣化層轉變時，肥大的軟骨細胞發生凋亡被骨替換，關節軟骨中在潮線附近出現軟骨細胞凋亡[64]，可能與關節軟骨的骨化過程有關[24, 65-66]。在OA不斷進展中，會出現軟骨細胞的增殖、聚集成簇，最后細胞減少、消失，這是Mankin評分系統評價OA軟骨退變嚴重程度的標準，表層前體軟骨干細胞的逐漸破壞和深部鈣化層軟骨細胞的肥大凋亡可能是OA軟骨出現這種改變的機制。
2.2.3 OA軟骨的鈣化
OA是一種軟骨內骨化病理的最直觀表現就是鈣化軟骨層不斷增厚[13, 18, 20, 52]，因此OA關節軟骨變薄的主要原因為軟骨不斷骨化。King等[67]通過反復屈伸兔掌指關節并施加循環載荷制作OA模型，模擬了人類OA發病過程，結果軟骨細胞中出現骨橋蛋白的表達，并伴隨軟骨變薄，但是鈣化軟骨層無明顯增厚且表層軟骨完整，作者認為發生以上變化的原因為潮線上移同時，骨-軟骨界面也重塑上移。這些變化表明關節軟骨礦化的步驟類似于軟骨內骨化。Fuerst等[68]發現關節軟骨鈣化是髖關節OA的常見表現，鈣化灶的數量與臨床癥狀和組織學分級相關。此外，軟骨內鈣化同樣可見于膝關節[69]和非負重的手部關節[70]，軟骨鈣化是OA關節常見表現且與軟骨細胞增殖、肥大密切相關[52]，表明OA是一種軟骨內骨化的病理過程。正常老年人軟骨與青年人相比明顯變薄[71]，但關節軟骨表面完整，沒有結構破壞[72]，Ⅱ型膠原纖維的半衰期是117年，說明軟骨的變薄不是因為表層破壞引起，而是由于深層軟骨的不斷骨化，提示正常關節軟骨在骨-軟骨交界處也在緩慢發生軟骨內骨化。Mitsuyama等[69]的研究發現年齡是促使膝關節軟骨內骨化的首要因素，支持該結論，也解釋了OA多發于中老年人的原因。
2.2.4 OA潮線的復制
潮線是透明軟骨與鈣化軟骨的分界線，同時也是阻斷軟骨下骨對透明軟骨影響的一層天然屏障。Fawns and Landells對它的原始描述是潮線就像浪潮過后在海灘上留下的一條不規則垃圾碎片線[73]，這比擬了軟骨下骨（潮水）不斷侵蝕透明軟骨（海灘）的過程，OA的關節軟骨中也存在該現象。潮線的復制和上移是OA的常見病理表現，其造成鈣化軟骨的增厚、透明軟骨變薄，并且常伴隨著血管侵入[74]，是一種典型的軟骨內骨化表現。軟骨表面的異常應力可以促使潮線的復制，潮線附近可見成簇的肥大軟骨細胞逐漸被潮線吞噬[75]。透明軟骨鈣化時，大量軟骨細胞凋亡產生的DNA和磷脂碎片是形成潮線的主要物質來源[64]。作為鈣化的前線，OA潮線復制的特征是軟骨鈣化區不斷推進的軟骨內鈣化過程，以及鈣化軟骨逐漸被骨-軟骨界面新骨替換的重塑過程，是真正意義上的軟骨內骨化，體現了OA軟骨內骨化病理的重要一面。
3 總結與展望
軟骨破壞是OA發生的最直觀病理表現，然而基于抑制軟骨基質降解酶的治療未能有效延緩OA的病情進展，說明OA軟骨的破壞并不主要是軟骨基質的酶解過程，可能存在更為關鍵的病理機制。近年來，關節面由透明軟骨、鈣化軟骨、軟骨下骨板、部分小梁骨組成的關節骨-軟骨復合單位在OA發病中的作用越來越受到重視，其結構的骨化重塑可能是OA關節病損的主要原因。在異常應力刺激下，OA中出現軟骨內血管侵入，軟骨細胞增殖、肥大、排列紊亂，軟骨細胞高表達Runx2、骨橋蛋白等成骨因子，潮線的復制和推進，鈣化軟骨的增厚等多種病理表現，提示OA軟骨破壞是軟骨內骨化的結果。已有研究發現雙磷酸鹽可以抑制OA骨-軟骨重塑而保護軟骨，這為進一步認識OA病理機制以及為OA治療提供了可行性靶點。抑制軟骨細胞的增殖肥大、軟骨下骨血管侵蝕、軟骨下骨的重塑等軟骨內骨化關鍵環節可能成為治療OA的有效方法，研發特異性靶向抗OA軟骨內骨化的藥物可能成為OA治療新方向。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是引起中老年人群關節功能障礙的最常見退行性病變，其終末期關節僵直的致殘率高，嚴重影響患者生活質量[1]。因為軟骨破壞是OA最直觀的病理表現，所以傳統觀點認為OA是一種軟骨降解破壞性疾病，并選擇抗炎和抑制軟骨降解藥物治療，但結果顯示此類藥物不能有效阻止OA病情進展。研究發現，OA不僅是軟骨降解，軟骨下骨、滑膜等關節組織均在OA發生發展中具有重要作用[2-4]，且軟骨下骨和滑膜病變均可在未發生軟骨退變的早期發現[3, 5-6]。關節異常機械應力可促使軟骨下骨重塑，并且出現軟骨細胞肥大，進而表達Runx2、基質金屬蛋白酶13、骨鈣素等骨化相關蛋白；OA軟骨和關節液中也常發現磷酸鈣等骨鹽的沉積；提示軟骨降解可能是軟骨內骨化的一種外在表現，軟骨內骨化是OA的重要病理過程，而通過抑制這一過程可能成為治療OA的有效靶點。現對OA軟骨內骨化的相關研究作一綜述，旨在為認識OA病理機制及其治療提供參考。
1 力學失衡促使OA關節的骨化重塑
雖然OA發病因素復雜，但是機械力因素已明確。力學刺激對維持正常骨、軟骨代謝轉換，保證關節組織動態平衡具有重要作用，同時也是OA的主要病因[7-8]。關節面上由透明軟骨、鈣化軟骨、潮線、軟骨下骨板及小梁構成的骨-軟骨復合體是關節承重和潤滑的功能單位[9]，其結構破壞是OA的最終結局。主要參與骨和軟骨重塑的細胞群（骨細胞、成骨細胞、破骨細胞和軟骨細胞）能敏銳感知和響應外部機械信號，并通過一系列分子級聯控制骨、軟骨的代謝轉換[10]。異常的機械刺激會造成軟骨下骨小梁的微骨折，并導致骨、軟骨細胞中一些信號分子通路激活，引起關節的骨化重塑[10-11]。研究顯示，Wnt[12]、TGF-β[13-14]、RANKL/OPG/RANK[15]等多條調控骨、軟骨代謝信號通路的失常及在骨-軟骨間的串話，共同促使OA的進展[16]。前交叉韌帶切斷造成的異常關節面應力可引起軟骨下骨TGF-β1的激活，并招募MSCs導致軟骨下骨重塑，在軟骨破壞區可見軟骨鈣化區明顯增厚，其潮線幾乎延伸到軟骨表面[13]，表明異常應力通過偶聯TGF-β信號通路引起軟骨內骨化。而在純種賽馬的膝關節中，長期高負荷應力引起的軟骨內骨化以及軟骨下骨板的重塑是導致關節髁疲勞（應力）骨折發生的關鍵因素[17]。Pap等[18]通過比較OA與類風濕性關節炎軟骨破壞的異同，發現關節軟骨細胞穩定表型丟失，并開始出現類似胚胎的軟骨內骨化過程是OA的重要特征；與OA不同，類風濕性關節炎與成纖維滑膜細胞的持續性腫瘤樣活化有關，滑膜直接侵襲破壞關節軟骨。因此，軟骨內骨化是OA發生的重要病理過程[19]。在異常機械應力下，多種炎性細胞因子和信號通路參與骨-軟骨間的交互作用[16, 20]，骨-軟骨界面血管長入[21]，破骨細胞、成骨細胞及MSCs等細胞的相繼募集[22]導致了OA骨-軟骨結構單位的軟骨內骨化進程。骨-軟骨結構單位中出現類似生長板的軟骨不斷鈣化，以及鈣化軟骨不斷被軟骨下骨侵蝕替換的重塑過程，可能是促使OA發生發展的關鍵環節[23]。
2 OA軟骨的破壞與骨化重塑
軟骨內骨化是一種發生在胚胎或者長骨骺板的骨的軟骨模型逐漸被骨組織替代的過程。發生軟骨內骨化時，首先軟骨細胞經過增殖、肥大、死亡并分泌出大量基質，隨后血管、成骨細胞、破骨細胞和基質干細胞侵入軟骨基質，最后在殘留的軟骨基質上出現骨沉積，其中軟骨細胞的時序性變化受到全身及局部細胞因子的嚴格調控，這些因子通過跨膜受體信號轉導激活軟骨細胞選擇性轉錄因子[24]。通常情況下，成熟個體的軟骨內骨化出現在生長板中。然而關節軟骨與生長板的相似性，以及OA關節中軟骨代謝和結構轉變，表明OA可能是一種軟骨內骨化性疾病[25]。
2.1 關節軟骨與生長板組成和結構的相似性
2.1.1 關節軟骨與生長板的發育
骨、關節軟骨、生長板的形成均起源于胚胎發育時期間葉細胞的凝集，部分間葉細胞直接分化為成骨細胞開始膜內成骨，其余大部分則分化形成軟骨祖細胞形成軟骨原基，然后進一步發生軟骨內骨化[26]。這是一個復雜且精細的調控過程，在時間和空間上受到多種分子機制和信號通路的調控[27]。
原始的軟骨原基是關節軟骨、骺軟骨、生長板發育的母體。關節發育過程中，軟骨原基在將要發生關節的部位出現軟骨祖細胞的凝集，形成一個橫向的關節間帶區（細胞密集區），Noggin（BMP拮抗劑）在這些細胞中表達，以維持細胞在一種相對未分化狀態，隨后間帶區的中間部分出現透明質酸的分泌，導致組織松散，細胞死亡，周圍細胞向兩側聚集，關節間隙形成，間隙邊緣貼近骺軟骨的軟骨細胞最后形成關節軟骨覆蓋上、下骨端[28-30]。總結上述研究，滑膜關節形成開始于軟骨原基上關節特異部位的定位和規劃，隨之發生關節腔形成。生長板同樣由軟骨原基發育而來，當發育到一定時期，骺軟骨內出現次級骨化中心，將生長板與關節軟骨分隔開來，次級與初級骨化中心之間的軟骨結構即為生長板。生長板靠近骨骺端的部分因為軟骨祖細胞的凝聚而呈現相對未分化狀態，靠近骨干的一側則細胞肥大發生軟骨內骨化[31-32]。關節軟骨與生長板最終維持不同的細胞特征，Noggin在調控中起著關鍵作用。關節軟骨的形成依靠特定部位Noggin表達抑制軟骨原基的軟骨內骨化實現；而缺少Noggin時，軟骨細胞的凝集也能正常發生，但是發展為增生性肥大，關節形成失敗，沒有Noggin的拮抗會導致BMP過度激活，募集大量細胞形成軟骨，最后在本該形成關節的部位發展為過度肥大的生長板[30, 33]。因此，生長板與關節軟骨是受不同因子調控下軟骨細胞的兩種狀態。在軟骨原基發育形成的關節、骨骺、生長板結構中，關節軟骨與骺軟骨交界處有一層過渡的肥大細胞層，不同層次關節軟骨細胞依次覆在上面，形成一種與生長板非常類似的結構[24, 34]。一旦關節軟骨細胞的內環境發生轉變導致細胞調控出現異常，其有可能由靜息狀態重新轉變為與生長板軟骨細胞類似的特性，進而發生軟骨內骨化。
2.1.2 關節軟骨與生長板的結構特征
關節軟骨不但與生長板共同起源于軟骨原基，而且發育成相似的結構。形態學上，生長板可分為數層結構，不同種類和功能的軟骨細胞有序排列在形態不同的區域。其大致可分為4區：離骨面最遠的表層是靜息軟骨區，此區軟骨細胞具有很強的增殖潛力，可看作干細胞區；鄰近靜息軟骨區的是增殖軟骨區，可見小圓形的增殖細胞變為扁平狀集聚成簇，增殖區的細胞由靜息區增殖轉變而來；在增殖區下方出現一種細胞的過渡態，稱為前肥大軟骨細胞，細胞排列由平行轉為縱向，隨后其轉變為肥大軟骨細胞并分泌大量基質，此為肥大軟骨細胞區；在最底層，肥大軟骨細胞死亡，圍繞軟骨基質的軟骨橫隔膜破碎，血管、巨噬細胞、前成骨細胞侵入，殘留的軟骨基質上出現骨沉積，此為軟骨礦化區[24]。
成熟關節軟骨也具有與生長板類似的層級結構，可有序分成數層（表層、過渡層、放射層、鈣化層），不同層次的軟骨表現相應的結構和功能特性，隨著軟骨不同層面基質特性的變化，基質中軟骨細胞也出現深度依賴性改變[35]。關節軟骨表層由細長而扁平的干細胞/前體細胞[29]與大量膠原基質結合在一起，構成與關節面平行的軟骨表層，其含有相對未分化的靜息軟骨干細胞，是軟骨其他區域細胞的來源；關節軟骨的中層軟骨細胞為圓形，呈縱向排列，并產生Ⅱ型膠原和蛋白多糖維持軟骨基質平衡，是維持軟骨生物力學特性即彈性的關鍵；軟骨底層區的細胞形態變大并繼續分泌基質，細胞到達軟骨與礦化區的邊界，此層存在潮線結構；潮線下方軟骨細胞凋亡/消失，為一層鈣化軟骨[36]。因此，關節軟骨在形態結構和軟骨細胞特征上非常相似。
關節軟骨表層對應為生長板靜息區和增殖區，過渡層和放射層分別為生長板的細胞前肥大與肥大區，鈣化軟骨層則為生長板的軟骨礦化區，而關節軟骨中透明軟骨與骨的分界標志潮線對應為生長板中的軟骨模型發生骨替換前的基質橫隔膜。提示關節軟骨保留了生長板類似的結構，它們在結構排列上的高度相似性，表明關節軟骨其實是一種靜息狀態下的生長板。
2.2 OA軟骨內骨化的病理表現
生長板的軟骨內骨化分為兩個階段，首先軟骨細胞增殖分化形成軟骨模型，隨后軟骨模型發生軟骨內骨化而成骨。關節透明軟骨是一種低轉換的永久組織結構，這種結構是經過長期生物進化的結果，優于其他任何形式[37]。研究顯示Ⅱ型膠原纖維的半衰期為117年，蛋白聚糖的代謝周期約為3.4年，因此關節軟骨細胞必須維持在一種“靜息”但又代謝相對活躍的狀態，以完成基質的緩慢轉換，保證有序和穩定的軟骨結構[38]。OA關節軟骨中軟骨細胞特征發生改變（增殖、肥大）[39]，并出現血管侵蝕等病理改變，表明軟骨細胞與基質平衡被打破，出現向軟骨內骨化的轉變[40-41]，這可能是OA軟骨破壞的主要原因。
2.2.1 OA軟骨的血管侵蝕
血管侵入是發生軟骨內骨化最重要的特征之一。軟骨內表達VEGF會刺激靜息狀態的軟骨細胞重新進入增殖肥大狀態，并開始軟骨內骨化，阻斷VEGF會抑制軟骨向骨的轉變[41-43]。鈣化軟骨、軟骨下骨血管侵入是OA常見病理特征[16, 21]，提示軟骨內骨化是OA發生發展的重要原因。研究證實缺氧能促使血管生成。在組織缺氧條件下，Sasaki等[44]利用MSCs誘導形成了軟骨球，進而發生軟骨內骨化，形成了中心為礦化骨且表面覆蓋軟骨的三維組織結構，在此過程中，MSCs細胞球出現了細胞、基質分層，而檢測發現HIF-1α的表達也只對應于內部的肥大細胞層。這種混合組織中的血管活性與軟骨細胞的特征相關，起初軟骨細胞表達一種抗血管生成因子軟骨調節素Ⅰ（chondromodulinⅠ，ChM-Ⅰ），隨著中心軟骨細胞成熟肥大，ChM-Ⅰ表達降低，軟骨內血管活性增高，最后骨化，印證了軟骨的血管新生與骨化密切相關。研究證實HIF-1α在OA關節軟骨中呈高表達，且與OA軟骨細胞增殖肥大、聚集成簇有關，而通常在正常軟骨中只有接近鈣化區的深層軟骨細胞才有HIF-1α表達[45-46]，表明OA關節軟骨可能發生類似的軟骨內骨化。缺氧誘導因子的另一亞型HIF-2α在OA軟骨中升高，Saito等[47]的研究表明HIF-2α在介導OA發生及骨骼生長的軟骨內骨化進程中有重要作用，其特異的與缺氧反應元件結合促使COL10A1、基質金屬蛋白酶13及VEGF-a的活化增強，而這是軟骨內骨化進程中發生軟骨細胞肥大和血管侵入該中心環節的標志。
2.2.2 OA軟骨細胞的肥大
軟骨細胞肥大是軟骨內骨化一種特異性表現，OA除了出現關節軟骨血管侵入，關節軟骨中靜息的軟骨細胞重新增殖肥大、聚集[39, 48]、凋亡[49-50]是另一個與生長板相似的特征，也是OA發生軟骨內骨化證據之一。值得注意的是，OA軟骨細胞的增殖肥大可能是軟骨損傷后的代償修復反應，然而軟骨細胞的這種改變并不能完成自我修復，最終促進基質破壞和軟骨內骨化[51]。肥大的軟骨細胞已經不是正常功能的軟骨細胞，最近一項研究發現，鈣化與軟骨細胞的肥大性分化密切相關[52]，OA軟骨細胞增殖肥大，以及分泌基質金屬蛋白酶13及Runx2等是關節軟骨發生軟骨內骨化的開始。大量研究表明，重新活化的軟骨細胞不再分泌正常軟骨基質，如Ⅱ型膠原、蛋白多糖，但分泌基質金屬蛋白酶、ADAMTS（ADAMTS-4、ADAMTS-5）、Ⅹ型膠原，導致基質降解和結構紊亂[16, 20, 53-54]，進而造成基質通透性增高，軟骨下骨和滑膜炎癥產生的細胞因子滲透至軟骨基質中，進一步促使軟骨細胞改變，并為血管和成骨干細胞的侵入提供條件。此外，OA中維持靜息關節軟骨細胞表征的SOX9表達下降，BMP-2[55]、骨橋蛋白[56-58]、Runx2[59]等多種成骨相關調控因子在OA肥大軟骨細胞中的表達明顯增加，這些成骨因子可以促使關節軟骨發生軟骨內骨化[60-61]。OA中分裂的軟骨細胞高表達縫隙連接蛋白，促進軟骨細胞聚集成簇，導致軟骨動態平衡被打破[62]，軟骨結構中有序的細胞排列同時發生重組，出現軟骨細胞的雙鏈狀排列以及環形簇擁集聚[35, 63]，這些都是類似于生長板軟骨細胞的特征。生長板中肥大層向鈣化層轉變時，肥大的軟骨細胞發生凋亡被骨替換，關節軟骨中在潮線附近出現軟骨細胞凋亡[64]，可能與關節軟骨的骨化過程有關[24, 65-66]。在OA不斷進展中，會出現軟骨細胞的增殖、聚集成簇，最后細胞減少、消失，這是Mankin評分系統評價OA軟骨退變嚴重程度的標準，表層前體軟骨干細胞的逐漸破壞和深部鈣化層軟骨細胞的肥大凋亡可能是OA軟骨出現這種改變的機制。
2.2.3 OA軟骨的鈣化
OA是一種軟骨內骨化病理的最直觀表現就是鈣化軟骨層不斷增厚[13, 18, 20, 52]，因此OA關節軟骨變薄的主要原因為軟骨不斷骨化。King等[67]通過反復屈伸兔掌指關節并施加循環載荷制作OA模型，模擬了人類OA發病過程，結果軟骨細胞中出現骨橋蛋白的表達，并伴隨軟骨變薄，但是鈣化軟骨層無明顯增厚且表層軟骨完整，作者認為發生以上變化的原因為潮線上移同時，骨-軟骨界面也重塑上移。這些變化表明關節軟骨礦化的步驟類似于軟骨內骨化。Fuerst等[68]發現關節軟骨鈣化是髖關節OA的常見表現，鈣化灶的數量與臨床癥狀和組織學分級相關。此外，軟骨內鈣化同樣可見于膝關節[69]和非負重的手部關節[70]，軟骨鈣化是OA關節常見表現且與軟骨細胞增殖、肥大密切相關[52]，表明OA是一種軟骨內骨化的病理過程。正常老年人軟骨與青年人相比明顯變薄[71]，但關節軟骨表面完整，沒有結構破壞[72]，Ⅱ型膠原纖維的半衰期是117年，說明軟骨的變薄不是因為表層破壞引起，而是由于深層軟骨的不斷骨化，提示正常關節軟骨在骨-軟骨交界處也在緩慢發生軟骨內骨化。Mitsuyama等[69]的研究發現年齡是促使膝關節軟骨內骨化的首要因素，支持該結論，也解釋了OA多發于中老年人的原因。
2.2.4 OA潮線的復制
潮線是透明軟骨與鈣化軟骨的分界線，同時也是阻斷軟骨下骨對透明軟骨影響的一層天然屏障。Fawns and Landells對它的原始描述是潮線就像浪潮過后在海灘上留下的一條不規則垃圾碎片線[73]，這比擬了軟骨下骨（潮水）不斷侵蝕透明軟骨（海灘）的過程，OA的關節軟骨中也存在該現象。潮線的復制和上移是OA的常見病理表現，其造成鈣化軟骨的增厚、透明軟骨變薄，并且常伴隨著血管侵入[74]，是一種典型的軟骨內骨化表現。軟骨表面的異常應力可以促使潮線的復制，潮線附近可見成簇的肥大軟骨細胞逐漸被潮線吞噬[75]。透明軟骨鈣化時，大量軟骨細胞凋亡產生的DNA和磷脂碎片是形成潮線的主要物質來源[64]。作為鈣化的前線，OA潮線復制的特征是軟骨鈣化區不斷推進的軟骨內鈣化過程，以及鈣化軟骨逐漸被骨-軟骨界面新骨替換的重塑過程，是真正意義上的軟骨內骨化，體現了OA軟骨內骨化病理的重要一面。
3 總結與展望
軟骨破壞是OA發生的最直觀病理表現，然而基于抑制軟骨基質降解酶的治療未能有效延緩OA的病情進展，說明OA軟骨的破壞并不主要是軟骨基質的酶解過程，可能存在更為關鍵的病理機制。近年來，關節面由透明軟骨、鈣化軟骨、軟骨下骨板、部分小梁骨組成的關節骨-軟骨復合單位在OA發病中的作用越來越受到重視，其結構的骨化重塑可能是OA關節病損的主要原因。在異常應力刺激下，OA中出現軟骨內血管侵入，軟骨細胞增殖、肥大、排列紊亂，軟骨細胞高表達Runx2、骨橋蛋白等成骨因子，潮線的復制和推進，鈣化軟骨的增厚等多種病理表現，提示OA軟骨破壞是軟骨內骨化的結果。已有研究發現雙磷酸鹽可以抑制OA骨-軟骨重塑而保護軟骨，這為進一步認識OA病理機制以及為OA治療提供了可行性靶點。抑制軟骨細胞的增殖肥大、軟骨下骨血管侵蝕、軟骨下骨的重塑等軟骨內骨化關鍵環節可能成為治療OA的有效方法，研發特異性靶向抗OA軟骨內骨化的藥物可能成為OA治療新方向。