引用本文： 楊陽, 王亞薇, 馬信龍, 馬劍雄, 邢丹, 朱少文, 陳陽. 長期尼古丁攝入對大鼠骨內微結構及機體氧化應激狀態影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(12): 1493-1497. doi: 10.7507/1002-1892.20160309 復制
骨質疏松癥是單位體積內骨質含量降低、骨微細結構改變、骨組織呈多孔化改變、骨骼脆性增加、易發生骨折的一種代謝性疾病[1]。目前研究認為吸煙與骨質疏松癥發病具有相關性，戒煙可以降低發病風險[2-3]。另外，吸煙不僅會引起氧化應激，還會破壞機體的抗氧化防御系統[4]。尼古丁是煙草的主要成分，但目前對于攝入尼古丁是否會打破機體氧化-抗氧化平衡、升高丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）水平、降低超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）水平仍存在爭議[5-7]，對尼古丁的攝入與骨質疏松關系尚不清楚。本研究以大鼠為實驗對象，經持續灌胃制備長期尼古丁攝入模型，通過觀察骨內微結構的變化，了解長期尼古丁攝入與骨內微結構及機體氧化應激水平的關系。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6周齡雄性SD大鼠36只，體質量160~180 g，由解放軍衛生裝備研究所動物實驗中心提供。大鼠均分籠飼養，飼養條件：溫度（18±4）℃、濕度50%±15%，每日光照12 h，每日提供約50 g標準鼠糧及足量清潔飲水。
尼古丁酒石酸氫（Sigma公司，美國）；ELISA試劑盒（上海酶研生物科技有限公司）。CTAn分析軟件（SKYSCAN公司，比利時）、Endura TEC ELF 3200力學試驗儀（Bose公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
36只大鼠適應性飼養1周后，按照隨機數字表法分為高劑量組、低劑量組和對照組，每組12只。高劑量組每天按照6.0 mg/kg標準攝入尼古丁（尼古丁酒石酸氫33.3 mg/kg），低劑量組每天按照0.4 mg/ kg標準攝入尼古丁（尼古丁酒石酸氫2.22 mg/kg）；將相應劑量尼古丁酒石酸氫混入生理鹽水中進行灌胃，持續12個月[8]。對照組不作處理，正常飼養。
于造模12個月（最后1次灌胃后）采用腹腔注射過量麻醉處死全部大鼠，從左心取動脈血檢測MDA、SOD、CAT含量以及可替寧含量。取左側股骨全長標本及L1椎體，分別行生物力學測試及Micro-CT三維重建評價骨結構；取材后標本用濕鹽水紗布包裹，置于-20℃冰箱中低溫保存，測試前室溫解凍。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
造模期間觀察各組大鼠存活情況，每個月大鼠稱重。
1.3.2 Micro-CT三維重建評價骨結構
取L1椎體樣本置于Micro-CT測試管內，沿標本長軸方向進行掃描，獲取連續的Micro-CT圖像，層間距為26.6 μm，平面圖像分辨率為1 024×1 024，放射劑量為49 kV、795 μA。圖像高斯慮波后，對椎體中心部位進行三維重建。利用CTAn分析軟件分析得到的三維圖像，將圖像灰度值81定為骨組織與非骨組織的分界線。隨機在椎體內部選擇長方形興趣區（range of interest，ROI）。通過ROI的建立，進行相關指標的分析測量，包括：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，TT）、骨小梁數目（trabecular number，TN）、骨小梁間隙（trabecular spacing，TS）。
1.3.3 生物力學測試
取股骨標本使用Endura TEC ELF 3200力學試驗儀進行四點彎曲測試。頂端跨距為8 mm，底端跨距為20 mm，加載速度為1 mm/min。測量時保持各標本位置一致，并保持標本濕潤狀態，實時記錄載荷-位移曲線。將標本斷裂時的載荷作為最大載荷。通過載荷-位移曲線上升段平滑曲線的斜率計算抗彎剛度，將載荷-位移曲線下的面積作為最大斷裂能。見圖 1。
圖1
標本四點彎曲測試??圖 2?3組大鼠實驗期間體質量變化??圖 3?Micro-CT對大鼠L1椎體斷層掃描圖?對照組?低劑量組?高劑量組??圖 4?3組大鼠股骨干最大載荷??圖 5?3組大鼠股骨干抗彎剛度??圖 6?3組大鼠股骨干最大斷裂能
Figure1.
Four point bending test of specimen ??Fig. 2 The body weight changes in 3 groups during the experiment ??Fig. 3 Micro-CT scans of the L1 vertebral body ?Control group ?Low dose group ?High dose group ??Fig. 4 The maximal load of the femoral shaft in 3 groups at 12 months after modeling ??Fig. 5 The stiffness of the femoral shaft in 3 groups at 12 months after modeling ??Fig. 6 The maximal fracture energy of the femoral shaft in 3 groups at 12 months after modeling
1.3.4 MDA、SOD及CAT檢測
取動脈血以4℃，離心半徑10 cm，3 000 r/min離心10 min，血漿樣本被分離后儲存于-80℃超低溫冰箱。除去血漿后的紅細胞采用9 g/L NaCl洗滌3次，使紅細胞溶解于蒸餾水中。在紅細胞裂解后的產物中測定MDA、SOD及CAT含量。
1.3.5 血清可替寧含量測定
取動脈血按照ELISA試劑盒說明書測定血清可替寧含量，以ng/mL為單位表示。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗期間，高劑量組死亡2只大鼠，低劑量組死亡1只，均對應補充；對照組大鼠無死亡。隨時間延長，高、低劑量組大鼠體質量逐漸低于對照組；8~12個月時，高、低劑量組與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05）；11、12個月時，高劑量組大鼠體質量明顯低于低劑量組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點各組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 2。
2.2 Micro-CT三維重建評價骨結構
造模12個月時，高劑量組BMD、BVF、TT、TN均顯著低于對照組、低劑量組，TS顯著增高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。低劑量組僅BVF、TN、TS與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3、表 1。
表1
3組大鼠12個月時L1椎體Micro-CT三維重建評價結果（n=12）
Table1.
The results of Micro-CT three-dimensional reconstruction of L1 vertebral body at 12 months (n=12)
2.3 生物力學測試
造模12個月時，高劑量組大鼠股骨干最大載荷、抗彎剛度以及最大斷裂能明顯低于對照組、低劑量組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。低劑量組以上指標明顯低于對照組，比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4~6。
2.4 MDA、SOD、CAT及可替寧含量檢測
造模12個月時，高、低劑量組大鼠血清可替寧含量以及MDA含量均明顯高于對照組，高劑量組高于低劑量組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。高、低劑量組CAT、SOD含量明顯低于對照組，高劑量組低于低劑量組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
3組大鼠MDA、SOD、CAT及可替寧含量比較（n=12）
Table2.
Comparison of MDA, SOD, CAT, and cotinine between groups (n=12)
3 討論
目前有關短期尼古丁暴露與骨密度關系的動物研究，通常采用肌肉注射或口服尼古丁方法制備動物模型。Hapidin等[9]按照每天7 mg/kg劑量對SD大鼠進行腹腔內注射尼古丁并持續2~4個月，觀察骨形態學改變。Iwaniec等[10]分別按照每天6 mg/ kg和9 mg/kg劑量對大鼠靜脈持續泵入尼古丁3個月，觀察骨量改變。Ozokutan等[11]在幼年大鼠哺乳期每天給予2 mg/kg尼古丁劑量，持續10 d，進行研究觀察。但靜脈或皮下注射方式不能準確模擬日常生活中吸煙方式，此外由于尼古丁接觸時間有限，使得研究結果穩定性不高。本研究選擇灌胃方式給予尼古丁[8]，同時延長干預期限至12個月。實驗期間給予尼古丁的兩組僅3只大鼠死亡，死亡率較低，提示本研究采用的方法能獲得穩定的動物模型。尼古丁的代謝產物為可替寧，本研究采用ELISA法測量了大鼠血清可替寧含量，該方法測定可替寧體內含量的敏感性為96%~98%，特異性為97%~100%[12]。本研究結果顯示，不同劑量尼古丁灌胃后，大鼠血清可替寧含量亦存在差異，提示本研究采用的造模方法可以達到預期目標，即通過可替寧的變化觀察不同劑量尼古丁攝入后對機體的影響。
有學者認為，尼古丁導致的體質量下降是脂肪組織減少及脂肪組織改變[13-14]。也有學者認為體質量下降與尼古丁導致的食欲降低及能量消耗增加有關[15-16]，尼古丁可能通過激活尼古丁乙酰膽堿受體及突觸前受體，通過下丘腦調節營養能量代謝，直接或間接控制食欲及能量消耗[16-17]。本研究中隨時間延長，高、低劑量組大鼠體質量逐漸低于對照組，且高劑量組大鼠體質量明顯低于低質量組，說明尼古丁攝入量與體質量有關，與上述研究結果一致。
既往評估腸胃外給予尼古丁對機體氧化應激作用的研究顯示，增長的MDA水平表明脂質過氧化程度，而SOD及CAT水平下降能反應抗氧化能力損傷程度。本研究通過持續12個月的尼古丁灌胃干預，發現高劑量組、低劑量組大鼠CAT及SOD含量均顯著低于對照組，且高劑量組低于低劑量組，差異均有統計學意義；而MDA呈相反趨勢；提示口服尼古丁對MDA、SOD及CAT活性均有明顯影響。骨形態計量學是目前各種骨代謝性疾病診斷研究的最有效方法[18]。Walker等[19]通過評估不同劑量尼古丁對成骨細胞增殖的影響，證明高劑量尼古丁具有抗增殖作用；Rothem等[20]的體外研究也證實了上述結果。本研究顯示，與對照組和低劑量組相比，高劑量組骨內結構出現明顯骨質疏松表現，進一步證實了高劑量尼古丁對成骨細胞增殖的抑制作用。
本研究也存在局限性：①缺少骨代謝或骨轉換的相關指標評價結果。②灌胃模型可能與自由攝食模型存在差異。③由于樣本量有限，實驗僅選擇了高、低劑量組進行評價，尚無法確定尼古丁攝入量與骨質疏松程度是否存在相關性。
骨質疏松癥是單位體積內骨質含量降低、骨微細結構改變、骨組織呈多孔化改變、骨骼脆性增加、易發生骨折的一種代謝性疾病[1]。目前研究認為吸煙與骨質疏松癥發病具有相關性，戒煙可以降低發病風險[2-3]。另外，吸煙不僅會引起氧化應激，還會破壞機體的抗氧化防御系統[4]。尼古丁是煙草的主要成分，但目前對于攝入尼古丁是否會打破機體氧化-抗氧化平衡、升高丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）水平、降低超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）水平仍存在爭議[5-7]，對尼古丁的攝入與骨質疏松關系尚不清楚。本研究以大鼠為實驗對象，經持續灌胃制備長期尼古丁攝入模型，通過觀察骨內微結構的變化，了解長期尼古丁攝入與骨內微結構及機體氧化應激水平的關系。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6周齡雄性SD大鼠36只，體質量160~180 g，由解放軍衛生裝備研究所動物實驗中心提供。大鼠均分籠飼養，飼養條件：溫度（18±4）℃、濕度50%±15%，每日光照12 h，每日提供約50 g標準鼠糧及足量清潔飲水。
尼古丁酒石酸氫（Sigma公司，美國）；ELISA試劑盒（上海酶研生物科技有限公司）。CTAn分析軟件（SKYSCAN公司，比利時）、Endura TEC ELF 3200力學試驗儀（Bose公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
36只大鼠適應性飼養1周后，按照隨機數字表法分為高劑量組、低劑量組和對照組，每組12只。高劑量組每天按照6.0 mg/kg標準攝入尼古丁（尼古丁酒石酸氫33.3 mg/kg），低劑量組每天按照0.4 mg/ kg標準攝入尼古丁（尼古丁酒石酸氫2.22 mg/kg）；將相應劑量尼古丁酒石酸氫混入生理鹽水中進行灌胃，持續12個月[8]。對照組不作處理，正常飼養。
于造模12個月（最后1次灌胃后）采用腹腔注射過量麻醉處死全部大鼠，從左心取動脈血檢測MDA、SOD、CAT含量以及可替寧含量。取左側股骨全長標本及L1椎體，分別行生物力學測試及Micro-CT三維重建評價骨結構；取材后標本用濕鹽水紗布包裹，置于-20℃冰箱中低溫保存，測試前室溫解凍。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
造模期間觀察各組大鼠存活情況，每個月大鼠稱重。
1.3.2 Micro-CT三維重建評價骨結構
取L1椎體樣本置于Micro-CT測試管內，沿標本長軸方向進行掃描，獲取連續的Micro-CT圖像，層間距為26.6 μm，平面圖像分辨率為1 024×1 024，放射劑量為49 kV、795 μA。圖像高斯慮波后，對椎體中心部位進行三維重建。利用CTAn分析軟件分析得到的三維圖像，將圖像灰度值81定為骨組織與非骨組織的分界線。隨機在椎體內部選擇長方形興趣區（range of interest，ROI）。通過ROI的建立，進行相關指標的分析測量，包括：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積分數（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，TT）、骨小梁數目（trabecular number，TN）、骨小梁間隙（trabecular spacing，TS）。
1.3.3 生物力學測試
取股骨標本使用Endura TEC ELF 3200力學試驗儀進行四點彎曲測試。頂端跨距為8 mm，底端跨距為20 mm，加載速度為1 mm/min。測量時保持各標本位置一致，并保持標本濕潤狀態，實時記錄載荷-位移曲線。將標本斷裂時的載荷作為最大載荷。通過載荷-位移曲線上升段平滑曲線的斜率計算抗彎剛度，將載荷-位移曲線下的面積作為最大斷裂能。見圖 1。
圖1
標本四點彎曲測試??圖 2?3組大鼠實驗期間體質量變化??圖 3?Micro-CT對大鼠L1椎體斷層掃描圖?對照組?低劑量組?高劑量組??圖 4?3組大鼠股骨干最大載荷??圖 5?3組大鼠股骨干抗彎剛度??圖 6?3組大鼠股骨干最大斷裂能
Figure1.
Four point bending test of specimen ??Fig. 2 The body weight changes in 3 groups during the experiment ??Fig. 3 Micro-CT scans of the L1 vertebral body ?Control group ?Low dose group ?High dose group ??Fig. 4 The maximal load of the femoral shaft in 3 groups at 12 months after modeling ??Fig. 5 The stiffness of the femoral shaft in 3 groups at 12 months after modeling ??Fig. 6 The maximal fracture energy of the femoral shaft in 3 groups at 12 months after modeling
1.3.4 MDA、SOD及CAT檢測
取動脈血以4℃，離心半徑10 cm，3 000 r/min離心10 min，血漿樣本被分離后儲存于-80℃超低溫冰箱。除去血漿后的紅細胞采用9 g/L NaCl洗滌3次，使紅細胞溶解于蒸餾水中。在紅細胞裂解后的產物中測定MDA、SOD及CAT含量。
1.3.5 血清可替寧含量測定
取動脈血按照ELISA試劑盒說明書測定血清可替寧含量，以ng/mL為單位表示。
1.4 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗期間，高劑量組死亡2只大鼠，低劑量組死亡1只，均對應補充；對照組大鼠無死亡。隨時間延長，高、低劑量組大鼠體質量逐漸低于對照組；8~12個月時，高、低劑量組與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05）；11、12個月時，高劑量組大鼠體質量明顯低于低劑量組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點各組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 2。
2.2 Micro-CT三維重建評價骨結構
造模12個月時，高劑量組BMD、BVF、TT、TN均顯著低于對照組、低劑量組，TS顯著增高，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。低劑量組僅BVF、TN、TS與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3、表 1。
表1
3組大鼠12個月時L1椎體Micro-CT三維重建評價結果（n=12）
Table1.
The results of Micro-CT three-dimensional reconstruction of L1 vertebral body at 12 months (n=12)
2.3 生物力學測試
造模12個月時，高劑量組大鼠股骨干最大載荷、抗彎剛度以及最大斷裂能明顯低于對照組、低劑量組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。低劑量組以上指標明顯低于對照組，比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4~6。
2.4 MDA、SOD、CAT及可替寧含量檢測
造模12個月時，高、低劑量組大鼠血清可替寧含量以及MDA含量均明顯高于對照組，高劑量組高于低劑量組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。高、低劑量組CAT、SOD含量明顯低于對照組，高劑量組低于低劑量組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 2。
表2
3組大鼠MDA、SOD、CAT及可替寧含量比較（n=12）
Table2.
Comparison of MDA, SOD, CAT, and cotinine between groups (n=12)
3 討論
目前有關短期尼古丁暴露與骨密度關系的動物研究，通常采用肌肉注射或口服尼古丁方法制備動物模型。Hapidin等[9]按照每天7 mg/kg劑量對SD大鼠進行腹腔內注射尼古丁并持續2~4個月，觀察骨形態學改變。Iwaniec等[10]分別按照每天6 mg/ kg和9 mg/kg劑量對大鼠靜脈持續泵入尼古丁3個月，觀察骨量改變。Ozokutan等[11]在幼年大鼠哺乳期每天給予2 mg/kg尼古丁劑量，持續10 d，進行研究觀察。但靜脈或皮下注射方式不能準確模擬日常生活中吸煙方式，此外由于尼古丁接觸時間有限，使得研究結果穩定性不高。本研究選擇灌胃方式給予尼古丁[8]，同時延長干預期限至12個月。實驗期間給予尼古丁的兩組僅3只大鼠死亡，死亡率較低，提示本研究采用的方法能獲得穩定的動物模型。尼古丁的代謝產物為可替寧，本研究采用ELISA法測量了大鼠血清可替寧含量，該方法測定可替寧體內含量的敏感性為96%~98%，特異性為97%~100%[12]。本研究結果顯示，不同劑量尼古丁灌胃后，大鼠血清可替寧含量亦存在差異，提示本研究采用的造模方法可以達到預期目標，即通過可替寧的變化觀察不同劑量尼古丁攝入后對機體的影響。
有學者認為，尼古丁導致的體質量下降是脂肪組織減少及脂肪組織改變[13-14]。也有學者認為體質量下降與尼古丁導致的食欲降低及能量消耗增加有關[15-16]，尼古丁可能通過激活尼古丁乙酰膽堿受體及突觸前受體，通過下丘腦調節營養能量代謝，直接或間接控制食欲及能量消耗[16-17]。本研究中隨時間延長，高、低劑量組大鼠體質量逐漸低于對照組，且高劑量組大鼠體質量明顯低于低質量組，說明尼古丁攝入量與體質量有關，與上述研究結果一致。
既往評估腸胃外給予尼古丁對機體氧化應激作用的研究顯示，增長的MDA水平表明脂質過氧化程度，而SOD及CAT水平下降能反應抗氧化能力損傷程度。本研究通過持續12個月的尼古丁灌胃干預，發現高劑量組、低劑量組大鼠CAT及SOD含量均顯著低于對照組，且高劑量組低于低劑量組，差異均有統計學意義；而MDA呈相反趨勢；提示口服尼古丁對MDA、SOD及CAT活性均有明顯影響。骨形態計量學是目前各種骨代謝性疾病診斷研究的最有效方法[18]。Walker等[19]通過評估不同劑量尼古丁對成骨細胞增殖的影響，證明高劑量尼古丁具有抗增殖作用；Rothem等[20]的體外研究也證實了上述結果。本研究顯示，與對照組和低劑量組相比，高劑量組骨內結構出現明顯骨質疏松表現，進一步證實了高劑量尼古丁對成骨細胞增殖的抑制作用。
本研究也存在局限性：①缺少骨代謝或骨轉換的相關指標評價結果。②灌胃模型可能與自由攝食模型存在差異。③由于樣本量有限，實驗僅選擇了高、低劑量組進行評價，尚無法確定尼古丁攝入量與骨質疏松程度是否存在相關性。