引用本文： 張磊, 龔躍昆, 趙學凌, 周厚俊. 低氧與低氧模擬劑對BMSCs成骨分化影響的對比研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(7): 903-908. doi: 10.7507/1002-1892.20160181 復制
低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）介導低氧適應性反應，其可調控一系列轉錄因子和下游基因表達，在細胞低氧反應中發揮重要調控作用[1]。不少研究表明穩定HIF蛋白能夠促進干細胞成骨分化[2-4]，但也有研究報道其能抑制干細胞成骨分化[5-7]。穩定HIF蛋白，可通過降低細胞生存的氧濃度達到，稱為物理性低氧[8]；也可在常氧條件下添加低氧模擬劑，如氯化鈷、去鐵敏、二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）等，阻斷HIF降解而模擬低氧環境，稱為化學性低氧[9-11]。目前尚未見物理性低氧與化學性低氧對MSCs成骨分化影響比較的相關研究報道。本研究對1%低氧條件與常氧條件下DMOG對體外培養的BMSCs成骨分化的影響進行比較，以期為后期動物實驗及臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康3～4周齡昆明小鼠20只，雌雄不限，體質量18～20 g，購于昆明醫科大學實驗動物中心。
DMOG（Cayman公司，美國）；兔RUNX2單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；小鼠抗HIF-1α單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體、兔抗HIF-1α單克隆抗體（Cell Signaling公司，美國）；L-DMEM培養基、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、TGF-β1、甲苯胺藍、油紅O、吲哚美辛、維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松（Sigma公司，美國）；茜素紅（上海晶純生化科技股份有限公司）；ALP定量檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒、SuperScriptTMⅢcDNA合成試劑盒、Trizol裂解液（Invitrogen公司，美國）；Golden Taq PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。流式細胞儀（Beckman-Coulter公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad公司，美國）；ABI prism 7000型實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（ABI公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）。
1.2 BMSCs分離、培養及鑒定
取健康3～4周齡昆明小鼠，采用本課題組前期實驗方法進行BMSCs分離、培養[12]。鑒定：①取第3代BMSCs離心（半徑10 cm、1 000 r/min離心5?min）后去上清，以50μL CD44、CD34、CD90、CD29抗體溶液室溫孵育30 min，用PBS液制備單細胞懸液，流式細胞儀檢測細胞表面標記。②取第3代BMSCs，分別以成骨培養基、成脂培養基、成軟骨培養基[12]進行培養，并分別于14、7、14 d后行茜素紅染色、油紅O染色及甲苯胺藍染色。
1.3 實驗分組
實驗分為對照組（A組）、低氧培養組（B組）及DMOG干預組（C組）。A組于常氧條件下培養BMSCs，B組于低氧條件下（1%O2[2-3, 12]）培養BM SCs，C組于常氧條件下加入0.5 mmol/L DMOG培養BMSCs。
1.4 觀測指標
1.4.1 MTT法檢測BMSCs增殖
取第3代BM SCs，以1×104個/mL密度接種于96孔板內，每孔200?μL。按分組方法分別用常規細胞培養基（含10%FBS的L-DMEM）培養1、2、3、4 d，棄上清，每孔加入含5?mg/mL MTT的常規細胞培養基150μL，繼續孵育4?h，小心吸棄孔內上清液，每孔加入150μL DMSO溶液震蕩，待充分溶解后，于酶聯免疫檢測儀上檢測490 nm波長處吸光度（A）值。每組設6個復孔，取均值。
1.4.2 ALP定量檢測
取第3代BMSCs，以1×105個/孔密度接種于6孔板內，按分組方法分別用成骨培養基（含10%FBS、50μg/mL維生素C、10?mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、1×10-8 mol/L地塞米松的L-DMEM）培養細胞，于培養7、14 d后收集細胞。用4%多聚甲醛液處理2 min，然后使用RIPA buffer裂解液裂解細胞，按ALP定量檢測試劑盒說明操作，酶標儀檢測520 nm波長處ALP含量。每組設6個復孔，取均值。
1.4.3 RT-qPCR法定量檢測RUNX2與Osterix基因表達
同1.4.2方法分組培養細胞3、7 d后，用Trizol提取總RNA，采用A260/A280比值檢測RNA純度與濃度；使用SuperScriptTMⅢ試劑盒合成cDNA。設計RUNX2、Osterix及β-actin基因引物序列，進行擴增。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列：RUNX2上游5'-TTCAACGATCTGAGATTTGTGGG-3'，下游5'-GGATGAGGAATGCGCCCTA-3'；Osterix上游5'-ATGGCGTCCTCTCTGCTTG-3'，下游5'-TGAAAGGTCAGCGTATGGCTT-3'；內參照β-actin上游5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'，下游5'-GCCGGACTCATCGTACTCC-3'。最后使用Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG熒光染料于RT-qPCR儀進行擴增。反應條件：95℃變性2?min；95℃、15 s，54℃、30 s，65℃、20 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。
1.4.4 Western blot檢測HIF-1α蛋白表達
同1.4.2方法分組培養細胞24 h后收集細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，收集細胞總蛋白。以BCA法測定蛋白濃度，每組取20μg蛋白進行電泳轉膜，以5%牛血清白蛋白封閉2 h，加入一抗小鼠抗HIF-1α單克隆抗體（1:200）4℃孵育過夜，二抗兔抗GAPDH單克隆抗體（1:2 000）37℃孵育2 h；GAPDH為內參蛋白。以Image J軟件對蛋白表達條帶進行掃描，以內參蛋白灰度值進行校正，目的蛋白與內參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。
1.4.5 茜素紅染色觀察
同1.4.2方法分組培養細胞，21 d時棄培養基，10%中性甲醛固定30 min，蒸餾水漂洗3次，0.1%茜素紅染液染色10 min，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs鑒定
流式細胞術表面標志鑒定示CD29（+）、CD44（+）、CD90（+）、CD34（-）。見圖 1。
圖1
流式細胞儀檢測BMSCs表面標志?CD29 ?CD44 ?CD90 ?CD34 ??圖 2 BMSCs多向誘導分化鑒定?成骨誘導14?d（茜素紅染色×100）?成脂誘導7 d（油紅O染色×100）?成軟骨誘導14 d（甲苯胺藍染色×100）??圖 3 MTT法檢測各組各時間點BMSCs增殖??圖 4 Western blot檢測各組培養24 h HIF-1α蛋白表達1：A組2：C組3：B組??圖 5各組培養21 d茜素紅染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）?A組?B組?C組
Figure1.
BMSCs surface markers by flow cytometry ?CD29 ?CD44 ?CD90 ?CD34 ??Fig. 2 Identification of multiple differentiation of BMSCs ?Osteogenic induction for 14 days (Alizarin red staining×100) ?Adipogenic?induction for 7 days (Oil red O staining×100) ?Cartilage induction for 14 days (Toluidine blue staining×100) ??Fig. 3BMSCs proliferation by MTT ??Fig. 4HIF-1αprotein expression by Wester n blot at 24 hours after culture 1: Group A 2: Group C 3: Group B ??Fig. 5Alizarin red staining observation at 21 days (Inverted phase contrast microscope×100) ?Group A ?Group B ?Group C
BMSCs經成骨誘導分化14 d后，茜素紅染色可見紅色結節樣鈣沉積；成脂誘導7 d后，油紅O染色可見紅色圓形脂肪滴；成軟骨誘導14 d后，細胞逐漸由梭形變為多角形，甲苯胺藍染色呈藍色陽性。見圖 2。
2.2 MTT法檢測BMSCs增殖
培養1 d，3組細胞A值比較差異無統計學意義（P > 0.05）。2、3、4 d，與A組比較，C組均抑制細胞增殖，但差異無統計學意義（P > 0.05）；而B組則促進細胞增殖，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。
2.3 ALP定量檢測
培養7 d，A、B、C組ALP含量分別為（1.753±0.077）、（7.222±0.175）、（10.219±0.623）金氏單位/100?mL，14 d分別為（3.412±0.131）、（10.562±0.618）、（15.415±1.521）金氏單位/100 mL。B、C組ALP含量均顯著高于A組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.4 RT-qPCR檢測
培養3 d，A、B、C組RUNX2基因相對表達量分別為1.000±0.061、3.822±0.126、4.051±0.132，Osterix基因相對表達量分別為1.000±0.043、1.856±0.062、2.259±0.093；7 d，A、B、C組RUNX2基因相對表達量分別為1.000±0.055、8.666±0.223、9.505±0.216，Osterix基因相對表達量分別為1.000±0.048、3.179±0.305、3.872±0.105。B、C組兩種基因相對表達量均顯著高于A組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.5 Western blot檢測
培養24 h A組未能檢出HIF-1α蛋白表達；B、C組HIF-1α蛋白相對表達量分別為0.701±0.003、0.549±0.008，均顯著高于A組，且B組高于C組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
2.6 茜素紅染色觀察
培養21 d茜素紅染色示，A組可見少許結節狀紅染物質，B組可見中等量紅染物質，而C組可見大量紅染物質。見圖 5。
3 討論
低氧作為細胞的適應性反應，在細胞生理與病理過程中，如紅細胞生成、鐵代謝、能量代謝、血管生成、血管緊張度、細胞生存與增殖、細胞凋亡、促進與抑制炎性因子生成、激素調節、細胞遷移等方面發揮重要調控作用[13-15]。這一系列低氧反應由HIF介導，使機體適應低氧狀態。HIF在體內幾乎均以HIF-1和HIF-2兩種形式存在。HIF是一個由α和β亞基組成的異源二聚體，相對分子質量為120×103。HIF-β是結構亞基，在細胞內維持恒定水平持續表達。HIF-α由HIF-1α和HIF-2α組成，HIF-1α在機體組織內普遍表達，而HIF-2α僅在特定組織中表達[16]。α亞基是功能亞基，對氧分壓改變極為敏感，其本身半衰期僅為5 min，在常氧條件下迅速被降解，因此常氧條件下細胞內很難檢測出HIF-α[17]。脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）是含鐵的非亞鐵血紅素雙加氧酶，其在氧分子、酮戊二酸、抗壞血酸鹽協同下催化HIF降解，是HIF經泛素化途徑降解中關鍵的限速酶[18-19]。PHD抑制劑（PHD inhibitor，PHI）能夠抑制PHD活性，進而穩定HIF蛋白，其大概分為鐵螯合劑如去鐵敏、氯化鈷[9-10]，2-酮戊二酸類似物如DMOG[11]，及Cu2+、Zn2+和Mn2+等金屬離子[20-21]。由于鐵螯合劑及金屬離子會影響細胞離子代謝，副作用較大而受到限制，因此我們選擇副作用相對較小的酮戊二酸類似物DMOG作為研究對象。本實驗結果也表明，常氧條件下0.5?mmol/ L DMOG均能明顯上調HIF-1α蛋白的表達；同時也表明，相對DMOG組而言，1%低氧能更明顯上調HIF-1α蛋白的表達，我們推測這可能與DMOG在培養過程中降解、不能持續維持有效實驗濃度有關。
目前有關物理性低氧與化學性低氧對MSCs成骨分化影響的研究報道結果并不一致。Jiang等[22]研究表明0.2%O2培養降低人BMSCs的ALP表達，抑制其向成骨分化；Hsu等[5]研究表明1%O2抑制人BMSCs成骨分化；而Ding等[3]研究證實1%O2在成骨分化起始階段能促進大鼠BMSCs成骨分化；Binder等[4]研究顯示5%O2促進人BMSCs成骨分化。Ding等[11]研究表明0.2、0.5、1.0 mmol/L濃度的DMOG均能促進MSCs成骨分化；而Shi等[20]研究表明負載有不同濃度DMOG的氧化硅納米微球對體外培養的人MSCs成骨分化無明顯影響。我們的研究表明，1%O2與0.5 mmol/L DMOG均可上調RUNX2、Osterix mRNA、ALP表達及鈣結節沉積。ALP是成骨標志性酶、促進鈣的沉積，RUNX2與Osterix是干細胞成骨分化重要的轉錄因子，促進成骨分化相關基因（Ⅰ型膠原、骨橋素、骨涎蛋白、骨鈣素等）的合成[23-24]，表明我們的實驗中1%O2與0.5?mmol/L DMOG均能促進BMSCs成骨分化。
我們推測關于物理性低氧與化學性低氧模擬劑對MSCs成骨分化具有不同效應可能基于以下原因：①不同濃度的物理性低氧與不同低氧模擬劑，或不同濃度的同一低氧模擬劑對MSCs的HIF上調程度不同；②物理性低氧或低氧模擬劑作用于MSCs的時間點不同會有不同效應。本實驗結果表明，相對于DMOG，1%O2培養更能上調HIF-1蛋白表達，但0.5?mmol/L DMOG表現出更強的促進BMSCs成骨分化的效應。對于這一相互矛盾的結果，我們推測除低氧反應通路外，還有其他機制參與DMOG對BMSCs成骨分化的調控。Sahai等[25]也發現，1%O2培養抑制人脂肪MSCs成骨分化，但這一抑制效應不依賴于HIF蛋白的介導，表明有其他機制參與上訴調控效應。
綜上述，本研究通過檢測1%O2與0.5?mmol/ L DMOG對BMSCs增殖及成骨分化的影響，發現1%O2能明顯促進BMSCs增殖，0.5 mmol/L DMOG對BMSCs增殖無明顯影響；1%O2與0.5 mmol/L DMOG均能促進BMSCs成骨分化，且0.5 mmol/L DMOG促BMSCs成骨分化能力更強。雖然我們就物理性低氧與化學性低氧對BMSCs成骨分化影響做了初步對比，但下一步還需要對不同濃度及不同作用時間點進行對比研究，并進一步研究具體分子機制。
低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）介導低氧適應性反應，其可調控一系列轉錄因子和下游基因表達，在細胞低氧反應中發揮重要調控作用[1]。不少研究表明穩定HIF蛋白能夠促進干細胞成骨分化[2-4]，但也有研究報道其能抑制干細胞成骨分化[5-7]。穩定HIF蛋白，可通過降低細胞生存的氧濃度達到，稱為物理性低氧[8]；也可在常氧條件下添加低氧模擬劑，如氯化鈷、去鐵敏、二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）等，阻斷HIF降解而模擬低氧環境，稱為化學性低氧[9-11]。目前尚未見物理性低氧與化學性低氧對MSCs成骨分化影響比較的相關研究報道。本研究對1%低氧條件與常氧條件下DMOG對體外培養的BMSCs成骨分化的影響進行比較，以期為后期動物實驗及臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康3～4周齡昆明小鼠20只，雌雄不限，體質量18～20 g，購于昆明醫科大學實驗動物中心。
DMOG（Cayman公司，美國）；兔RUNX2單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；小鼠抗HIF-1α單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體、兔抗HIF-1α單克隆抗體（Cell Signaling公司，美國）；L-DMEM培養基、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、TGF-β1、甲苯胺藍、油紅O、吲哚美辛、維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松（Sigma公司，美國）；茜素紅（上海晶純生化科技股份有限公司）；ALP定量檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒、SuperScriptTMⅢcDNA合成試劑盒、Trizol裂解液（Invitrogen公司，美國）；Golden Taq PCR試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。流式細胞儀（Beckman-Coulter公司，美國）；酶聯免疫檢測儀（Bio-Rad公司，美國）；ABI prism 7000型實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（ABI公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）。
1.2 BMSCs分離、培養及鑒定
取健康3～4周齡昆明小鼠，采用本課題組前期實驗方法進行BMSCs分離、培養[12]。鑒定：①取第3代BMSCs離心（半徑10 cm、1 000 r/min離心5?min）后去上清，以50μL CD44、CD34、CD90、CD29抗體溶液室溫孵育30 min，用PBS液制備單細胞懸液，流式細胞儀檢測細胞表面標記。②取第3代BMSCs，分別以成骨培養基、成脂培養基、成軟骨培養基[12]進行培養，并分別于14、7、14 d后行茜素紅染色、油紅O染色及甲苯胺藍染色。
1.3 實驗分組
實驗分為對照組（A組）、低氧培養組（B組）及DMOG干預組（C組）。A組于常氧條件下培養BMSCs，B組于低氧條件下（1%O2[2-3, 12]）培養BM SCs，C組于常氧條件下加入0.5 mmol/L DMOG培養BMSCs。
1.4 觀測指標
1.4.1 MTT法檢測BMSCs增殖
取第3代BM SCs，以1×104個/mL密度接種于96孔板內，每孔200?μL。按分組方法分別用常規細胞培養基（含10%FBS的L-DMEM）培養1、2、3、4 d，棄上清，每孔加入含5?mg/mL MTT的常規細胞培養基150μL，繼續孵育4?h，小心吸棄孔內上清液，每孔加入150μL DMSO溶液震蕩，待充分溶解后，于酶聯免疫檢測儀上檢測490 nm波長處吸光度（A）值。每組設6個復孔，取均值。
1.4.2 ALP定量檢測
取第3代BMSCs，以1×105個/孔密度接種于6孔板內，按分組方法分別用成骨培養基（含10%FBS、50μg/mL維生素C、10?mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、1×10-8 mol/L地塞米松的L-DMEM）培養細胞，于培養7、14 d后收集細胞。用4%多聚甲醛液處理2 min，然后使用RIPA buffer裂解液裂解細胞，按ALP定量檢測試劑盒說明操作，酶標儀檢測520 nm波長處ALP含量。每組設6個復孔，取均值。
1.4.3 RT-qPCR法定量檢測RUNX2與Osterix基因表達
同1.4.2方法分組培養細胞3、7 d后，用Trizol提取總RNA，采用A260/A280比值檢測RNA純度與濃度；使用SuperScriptTMⅢ試劑盒合成cDNA。設計RUNX2、Osterix及β-actin基因引物序列，進行擴增。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列：RUNX2上游5'-TTCAACGATCTGAGATTTGTGGG-3'，下游5'-GGATGAGGAATGCGCCCTA-3'；Osterix上游5'-ATGGCGTCCTCTCTGCTTG-3'，下游5'-TGAAAGGTCAGCGTATGGCTT-3'；內參照β-actin上游5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'，下游5'-GCCGGACTCATCGTACTCC-3'。最后使用Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG熒光染料于RT-qPCR儀進行擴增。反應條件：95℃變性2?min；95℃、15 s，54℃、30 s，65℃、20 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。
1.4.4 Western blot檢測HIF-1α蛋白表達
同1.4.2方法分組培養細胞24 h后收集細胞，用RIPA裂解液裂解細胞，收集細胞總蛋白。以BCA法測定蛋白濃度，每組取20μg蛋白進行電泳轉膜，以5%牛血清白蛋白封閉2 h，加入一抗小鼠抗HIF-1α單克隆抗體（1:200）4℃孵育過夜，二抗兔抗GAPDH單克隆抗體（1:2 000）37℃孵育2 h；GAPDH為內參蛋白。以Image J軟件對蛋白表達條帶進行掃描，以內參蛋白灰度值進行校正，目的蛋白與內參蛋白灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。
1.4.5 茜素紅染色觀察
同1.4.2方法分組培養細胞，21 d時棄培養基，10%中性甲醛固定30 min，蒸餾水漂洗3次，0.1%茜素紅染液染色10 min，倒置相差顯微鏡下觀察。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs鑒定
流式細胞術表面標志鑒定示CD29（+）、CD44（+）、CD90（+）、CD34（-）。見圖 1。
圖1
流式細胞儀檢測BMSCs表面標志?CD29 ?CD44 ?CD90 ?CD34 ??圖 2 BMSCs多向誘導分化鑒定?成骨誘導14?d（茜素紅染色×100）?成脂誘導7 d（油紅O染色×100）?成軟骨誘導14 d（甲苯胺藍染色×100）??圖 3 MTT法檢測各組各時間點BMSCs增殖??圖 4 Western blot檢測各組培養24 h HIF-1α蛋白表達1：A組2：C組3：B組??圖 5各組培養21 d茜素紅染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）?A組?B組?C組
Figure1.
BMSCs surface markers by flow cytometry ?CD29 ?CD44 ?CD90 ?CD34 ??Fig. 2 Identification of multiple differentiation of BMSCs ?Osteogenic induction for 14 days (Alizarin red staining×100) ?Adipogenic?induction for 7 days (Oil red O staining×100) ?Cartilage induction for 14 days (Toluidine blue staining×100) ??Fig. 3BMSCs proliferation by MTT ??Fig. 4HIF-1αprotein expression by Wester n blot at 24 hours after culture 1: Group A 2: Group C 3: Group B ??Fig. 5Alizarin red staining observation at 21 days (Inverted phase contrast microscope×100) ?Group A ?Group B ?Group C
BMSCs經成骨誘導分化14 d后，茜素紅染色可見紅色結節樣鈣沉積；成脂誘導7 d后，油紅O染色可見紅色圓形脂肪滴；成軟骨誘導14 d后，細胞逐漸由梭形變為多角形，甲苯胺藍染色呈藍色陽性。見圖 2。
2.2 MTT法檢測BMSCs增殖
培養1 d，3組細胞A值比較差異無統計學意義（P > 0.05）。2、3、4 d，與A組比較，C組均抑制細胞增殖，但差異無統計學意義（P > 0.05）；而B組則促進細胞增殖，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。
2.3 ALP定量檢測
培養7 d，A、B、C組ALP含量分別為（1.753±0.077）、（7.222±0.175）、（10.219±0.623）金氏單位/100?mL，14 d分別為（3.412±0.131）、（10.562±0.618）、（15.415±1.521）金氏單位/100 mL。B、C組ALP含量均顯著高于A組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.4 RT-qPCR檢測
培養3 d，A、B、C組RUNX2基因相對表達量分別為1.000±0.061、3.822±0.126、4.051±0.132，Osterix基因相對表達量分別為1.000±0.043、1.856±0.062、2.259±0.093；7 d，A、B、C組RUNX2基因相對表達量分別為1.000±0.055、8.666±0.223、9.505±0.216，Osterix基因相對表達量分別為1.000±0.048、3.179±0.305、3.872±0.105。B、C組兩種基因相對表達量均顯著高于A組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。
2.5 Western blot檢測
培養24 h A組未能檢出HIF-1α蛋白表達；B、C組HIF-1α蛋白相對表達量分別為0.701±0.003、0.549±0.008，均顯著高于A組，且B組高于C組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
2.6 茜素紅染色觀察
培養21 d茜素紅染色示，A組可見少許結節狀紅染物質，B組可見中等量紅染物質，而C組可見大量紅染物質。見圖 5。
3 討論
低氧作為細胞的適應性反應，在細胞生理與病理過程中，如紅細胞生成、鐵代謝、能量代謝、血管生成、血管緊張度、細胞生存與增殖、細胞凋亡、促進與抑制炎性因子生成、激素調節、細胞遷移等方面發揮重要調控作用[13-15]。這一系列低氧反應由HIF介導，使機體適應低氧狀態。HIF在體內幾乎均以HIF-1和HIF-2兩種形式存在。HIF是一個由α和β亞基組成的異源二聚體，相對分子質量為120×103。HIF-β是結構亞基，在細胞內維持恒定水平持續表達。HIF-α由HIF-1α和HIF-2α組成，HIF-1α在機體組織內普遍表達，而HIF-2α僅在特定組織中表達[16]。α亞基是功能亞基，對氧分壓改變極為敏感，其本身半衰期僅為5 min，在常氧條件下迅速被降解，因此常氧條件下細胞內很難檢測出HIF-α[17]。脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）是含鐵的非亞鐵血紅素雙加氧酶，其在氧分子、酮戊二酸、抗壞血酸鹽協同下催化HIF降解，是HIF經泛素化途徑降解中關鍵的限速酶[18-19]。PHD抑制劑（PHD inhibitor，PHI）能夠抑制PHD活性，進而穩定HIF蛋白，其大概分為鐵螯合劑如去鐵敏、氯化鈷[9-10]，2-酮戊二酸類似物如DMOG[11]，及Cu2+、Zn2+和Mn2+等金屬離子[20-21]。由于鐵螯合劑及金屬離子會影響細胞離子代謝，副作用較大而受到限制，因此我們選擇副作用相對較小的酮戊二酸類似物DMOG作為研究對象。本實驗結果也表明，常氧條件下0.5?mmol/ L DMOG均能明顯上調HIF-1α蛋白的表達；同時也表明，相對DMOG組而言，1%低氧能更明顯上調HIF-1α蛋白的表達，我們推測這可能與DMOG在培養過程中降解、不能持續維持有效實驗濃度有關。
目前有關物理性低氧與化學性低氧對MSCs成骨分化影響的研究報道結果并不一致。Jiang等[22]研究表明0.2%O2培養降低人BMSCs的ALP表達，抑制其向成骨分化；Hsu等[5]研究表明1%O2抑制人BMSCs成骨分化；而Ding等[3]研究證實1%O2在成骨分化起始階段能促進大鼠BMSCs成骨分化；Binder等[4]研究顯示5%O2促進人BMSCs成骨分化。Ding等[11]研究表明0.2、0.5、1.0 mmol/L濃度的DMOG均能促進MSCs成骨分化；而Shi等[20]研究表明負載有不同濃度DMOG的氧化硅納米微球對體外培養的人MSCs成骨分化無明顯影響。我們的研究表明，1%O2與0.5 mmol/L DMOG均可上調RUNX2、Osterix mRNA、ALP表達及鈣結節沉積。ALP是成骨標志性酶、促進鈣的沉積，RUNX2與Osterix是干細胞成骨分化重要的轉錄因子，促進成骨分化相關基因（Ⅰ型膠原、骨橋素、骨涎蛋白、骨鈣素等）的合成[23-24]，表明我們的實驗中1%O2與0.5?mmol/L DMOG均能促進BMSCs成骨分化。
我們推測關于物理性低氧與化學性低氧模擬劑對MSCs成骨分化具有不同效應可能基于以下原因：①不同濃度的物理性低氧與不同低氧模擬劑，或不同濃度的同一低氧模擬劑對MSCs的HIF上調程度不同；②物理性低氧或低氧模擬劑作用于MSCs的時間點不同會有不同效應。本實驗結果表明，相對于DMOG，1%O2培養更能上調HIF-1蛋白表達，但0.5?mmol/L DMOG表現出更強的促進BMSCs成骨分化的效應。對于這一相互矛盾的結果，我們推測除低氧反應通路外，還有其他機制參與DMOG對BMSCs成骨分化的調控。Sahai等[25]也發現，1%O2培養抑制人脂肪MSCs成骨分化，但這一抑制效應不依賴于HIF蛋白的介導，表明有其他機制參與上訴調控效應。
綜上述，本研究通過檢測1%O2與0.5?mmol/ L DMOG對BMSCs增殖及成骨分化的影響，發現1%O2能明顯促進BMSCs增殖，0.5 mmol/L DMOG對BMSCs增殖無明顯影響；1%O2與0.5 mmol/L DMOG均能促進BMSCs成骨分化，且0.5 mmol/L DMOG促BMSCs成骨分化能力更強。雖然我們就物理性低氧與化學性低氧對BMSCs成骨分化影響做了初步對比，但下一步還需要對不同濃度及不同作用時間點進行對比研究，并進一步研究具體分子機制。
