引用本文： 劉鵬程, 劉寬, 劉俊峰, 夏闊, 陳禮陽, 吳興. 旋轉微重力細胞培養系統下Indianhedgehog轉染兔BMSCs促進成軟骨分化并抑制老化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(7): 892-902. doi: 10.7507/1002-1892.20160180 復制
軟骨組織工程為治療軟骨損傷及缺損提供了新思路，BMSCs是目前公認的軟骨組織工程種子細胞來源[1-3]，但也存在一些不足。通過BMSCs構建的軟骨組織工程組織，較體內正常軟骨組織在組織學形態、生物力學性能上仍存在一定差異[4]；體外利用BMSCs構建的組織工程軟骨細胞或組織容易老化或向成骨細胞發展，并不適用于修復軟骨損傷或缺失[5]。Indianhedgehog（IHH）是hedgehog信號通路中重要的同源蛋白之一，具有調控軟骨肥大和骨形成的作用，IHH基因或蛋白的缺失會導致肢體末端畸形發育，同時伴有軟骨細胞增殖率的下降和肥大軟骨細胞的膨脹[6]。IHH可在軟骨細胞增殖和分化的多個階段發揮調控作用，具有直接和間接的調控途徑。目前認為，IHH可促進關節周圍軟骨細胞增加表達甲狀旁腺素/甲狀旁腺素相關肽受體（parathy r oid hormone/parathyroid hormone-related protein，PTH/PTHrP），后者則通過與其受體PTHR-1結合來促進軟骨細胞的增殖并可抑制其肥大，與此同時，IHH與PTHrP形成負反饋環路，通過cAMP/PKA途徑下調IHH的分泌[7]。有研究發現，無論是用IHH單獨轉染BMSCs，還是聯合BMP-2或TGF-β共同轉染，均可促進初始BMSCs成軟骨細胞分化[8]。這為利用IHH基因轉染構建組織工程軟骨提供了理論依據。
軟骨細胞的生長除了營養支持，還需要特殊生長環境，即細胞生長的微環境。傳統BMSCs體外培養和誘導分化通常局限于二維細胞培養環境中，細胞可能出現類似于去分化現象，使培養的細胞逐漸失去其來源組織的許多生理特征[9]；而且經誘導生成的軟骨組織只能達到組織形態學及生化成分上的類似，不能實現與原有軟骨相同的再生[4]。旋轉微重力細胞培養系統（rotary cell culture system，RCCS）是一種三維空間微重力培養系統，可使培養物在水平軸上建立類似均質液體的懸浮軌道，培養物的重力向量持續隨機分布，因而可保持連續的自由落體狀態；同時使作用于培養物的表觀重力降至約10-2?g，可使細胞克服重力影響易于凝集和黏附于微載體表面[10-11]。RCCS還可提供一定的生物力學刺激，如剪切力、聯合壓縮力、流體靜壓力等，營造類似機體內部微環境，使細胞更均勻地分布于支架材料上，有利于營養物質的傳輸和代謝廢物的排除，從而促進軟骨細胞增殖和軟骨基質合成[10, 12]。研究表明，RCCS可促進BMSCs分化成軟骨細胞，且有利于軟骨細胞表型的維持及生物力學特點的體外模擬[13]。
本研究通過IHH基因腺病毒載體轉染兔BM SCs，探討IHH基因轉染對兔BMSCs成軟骨分化的影響；同時聯合RCCS，探討在模擬體內微重力環境下，利用IHH基因轉染BMSCs構建組織工程軟骨的可能性，為體內實驗修復軟骨缺損提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、儀器
兔BMSCs[賽業（廣州）生物科技有限公司]；含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的腺病毒過表達載體（上海吉滿生物科技有限公司；滴度為1×1011 pfu/mL）。L-DMEM、H-DMEM培養基（HyClone公司，美國）；青霉素/鏈霉素雙抗、FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO公司，美國）；重組人FGF（Proteintech公司，美國）；地塞米松、抗壞血酸、胰島素-轉鐵蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）、丙酮酸鈉、TGF-β、甲苯胺藍（Sigma公司，美國）；膜聯蛋白V（Annexin V）-cy3試劑盒（Enzolife公司，美國）；Trizol、Polybrene（Invitrogen公司，美國）；RT-PCR試劑盒（大連TaKaRa公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（Kapa公司，美國）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；兔IHH蛋白ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；ALP活性檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；兔抗兔Ⅱ型膠原多克隆抗體（Enzolife公司，美國）；鼠抗兔聚集蛋白聚糖（aggrecan，ANCN）單克隆抗體、Cytodex 3（GE公司，美國）；鼠抗兔GAPDH單克隆抗體、羊抗兔免疫熒光二抗、羊抗鼠免疫熒光二抗（Proteintech公司，美國）。
PCR儀（Eppendorf公司，美國）；ABI 7900HT型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；CO2細胞培養箱、超凈工作臺、離心機、酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；Odyssey雙色紅外激光成像系統（LI-COR公司，美國）；倒置相差熒光顯微鏡（Leica Demirb公司，德國）；RCCS（Synthecon公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 IHH基因腺病毒載體的構建
以pDC316-mCMV-EGFP為穿梭質粒構成載體骨架并酶切。設計并合成引物，以擴增兔IHH（基因號：100008942）目的基因片段，并連接至酶切后（酶切位點Xba/Xho）的過表達載體上。將連接產物轉入感受態細胞，并對長出的單克隆菌落進行測序鑒定，序列正確的克隆即為含有目的基因的過表達載體。用構建的腺病毒表達載體和骨架質粒共轉染293細胞，包裝病毒，收集病毒原液，通過紫外分光計量法測定病毒液滴度；然后通過超濾濃縮得到病毒濃縮液，使病毒液滴度達到1×1011～1×1012 pfu/mL。
1.2.2 實驗分組
取第2代BMSCs，分為RCCS組和傳統組2個大組，每個大組進一步分為3個亞組，即IHH基因腺病毒載體轉染組（RCCS 1組和傳統1組）、GFP腺病毒載體轉染組（RCCS 2組和傳統2組）及空白對照組（RCCS 3組和傳統3組）。
1.2.3 實驗方法
①RCCS組：RCCS組細胞均在模擬微重力環境下進行成軟骨細胞誘導分化。當BMSCs長滿至70%～80%時，RCCS 1、2組分別用IHH基因腺病毒載體及GFP腺病毒載體，以預實驗得出的最佳感染復數200轉染兔BMSCs，2 h后更換成新鮮的BMSCs專用完全培養基（含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素雙抗和1 ng/mL重組人FGF的L-DMEM培養基）；轉染24 h后用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液收集各組細胞，并進行細胞計數。RCCS 3組細胞于BMSCs專用完全培養基中培養24?h后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液收集細胞并計數。調整各組細胞懸液密度為1×105個/ mL。參考Wu等[11]的方法進行RCCS處理。取消毒滅菌后的微載體Cytodex 3，用BMSCs完全培養基（含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗的L-DMEM培養基）沖洗后加入適量BMSCs專用完全培養基，調整密度為5 mg/mL。將各組細胞懸液與Cyto dex 3懸液充分混勻，使細胞和微載體的密度分別為4×105個/mL及5?mg/mL，共同接種至50 mL或10?mL RCCS細胞培養容器中，然后安裝于旋轉基座上置于37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養，調整RCCS細胞培養容器的轉速為10～12 r/min，使細胞、微載體可充分接觸；24?h后調整容器轉速為12～14 r/min，直至看到容器內的培養物既不會接觸到容器壁，又可在旋轉過程中呈現自由落體狀態。培養24 h后更換為成軟骨細胞誘導分化培養基（含100 nmol/L地塞米松、0.17 mmol/L抗環血酸、1?mmol/L丙酮酸鈉、0.35 mmol/L L-脯氨酸、1%ITS及10 ng/mL TGF-β的H-DMEM培養基）；以后每2～3天換液1次，共誘導培養21 d。
當需要從容器中取樣檢測時，先關閉電源，將容器置于生物安全柜中進行操作；傾斜容器，培養物均沉積在容器底部，收集上清液進行相關檢測。當需要收集細胞時，充分混勻容器中的培養物，用注射器抽取適量細胞-微載體-培養基混合液，PBS清洗2～3次，然后用0.25%胰蛋白酶-EDTA將細胞從微載體中消化下來，收集細胞。
②傳統組：傳統組將轉染后的細胞以3×105個/孔密度接種至6孔板中，加入BMSCs專用完全培養基2 mL，“十”字搖勻法使細胞均勻接種，然后置于37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養。24?h后同上法進行成軟骨誘導分化培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 IHH基因腺病毒轉染效率檢測
IHH基因腺病毒載體轉染BMSCs 12 h后，熒光顯微鏡下觀察各組細胞IHH基因腺病毒轉染效率；倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs在微載體Cytodex 3上的貼附情況；熒光顯微鏡下觀察IHH基因腺病毒轉染后BMSCs在微載體Cytodex 3上的熒光表達情況。
1.3.2 IHH蛋白表達及ALP活性檢測
分別于成軟骨誘導分化3、7、14、21 d前1天換液，收集24?h后細胞培養上清液，每組隨機取3個樣本，通過ELISA法[8]測定細胞培養上清液中IHH蛋白濃度。同時，每組隨機取3個樣本，根據ALP活性檢測試劑盒說明書測定細胞培養上清液中ALP活性。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測軟骨及軟骨肥大相關基因表達
分別于成軟骨誘導分化3、7、14、21?d，各組隨機收集3組樣本細胞，采用Trizol法提取RNA并純化，根據分光光度法測定抽提RNA在260 nm處的波長，計算RNA的濃度及純度。每個樣本均取50μg RNA進行RT-PCR反應合成cDNA，分光光度法測定合成cDNA的濃度，按照實時熒光定量PCR說明書操作，分析各樣本中相關基因的表達。軟骨相關基因包括Ⅱ型膠原、ANCN、SOX9，軟骨肥大相關基因包括Ⅹ型膠原、ALP、Annexin V，以GAPDH作為內參。根據美國國家生物技術信息中心（NCBI）中基因序列信息設計并合成引物，見表 1。
表1
各基因引物序列及產物片段大小
Table1.
The primer sequence and product size of the related genes
1.3.4 Wertern blot法檢測Ⅱ型膠原、ANCN蛋白表達
分別于成軟骨誘導分化10、21 d，每組隨機取3個樣本，提取細胞中的蛋白，以GAPDH為內參蛋白，通過Wertern blot方法[13]檢測細胞中Ⅱ型膠原、ANCN蛋白表達情況。其中Ⅱ型膠原檢測一抗采用兔抗兔Ⅱ型膠原多克隆抗體，二抗為山羊抗兔單克隆抗體；ANCN檢測一抗為鼠抗兔ANCN單克隆抗體，二抗為山羊抗鼠單克隆抗體。
1.3.5 甲苯胺藍染色及AnnexinV-cy3免疫熒光染色觀察
分別于成軟骨誘導分化10、21 d，收集各組細胞爬片，常規行甲苯胺藍組織學染色，并參考Annexin V-cy3免疫熒光染色試劑盒操作說明及參考文獻[8]方法行Annexin V-cy3免疫熒光染色觀察。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 IHH基因腺病毒轉染效率檢測
熒光顯微鏡觀察示，IHH基因腺病毒載體轉染BMSCs后12 h即可看到少量綠色熒光，48 h綠色熒光表達最強，病毒轉染效率高達95%以上。倒置相差顯微鏡觀察示，RCCS組BMSCs貼附在球形的微載體Cytodex 3上。熒光顯微鏡觀察示，病毒轉染后的BMSCs可表達GFP，可見到“燈籠狀”的細胞-微載體復合物。見圖 1。
圖1
IHH基因腺病毒轉染效率檢測?IHH基因腺病毒載體轉染后BMSCs形態觀察（熒光顯微鏡×200）?RCCS組BMSCs貼附于微載體Cytodex 3上（倒置相差顯微鏡×200）?RCCS組BMSCs病毒轉染后可見“燈籠狀”細胞-微載體復合物（熒光顯微鏡×200）??圖 2各組成軟骨誘導分化各時間點IHH蛋白表達?傳統組?RCCS組??圖 3各組成軟骨誘導分化各時間點ALP活性檢測?傳統組?RCCS組??圖 4實時熒光定量PCR檢測傳統組成軟骨誘導各時間點各基因表達量?Ⅱ型膠原?ANCN ?SOX9 ?Ⅹ型膠原?ALP ?AnnexinⅤ
Figure1.
Transfection efficiency of IHH gene ?BMSCs morphology after transfection (Fluorescence microscopy×200) ?Adhesion of BMSCs on the surface of the Cytodex 3 micro-carriers in RCCS group (Inverted phase contrast microscopy×200) ?"Lantern-like"cell micro-carrier complexes in RCCS group after transfection (Fluorescence microscopy×200) ??Fig. 2 IHH protein expression in each group at different time points after chondrogenic induction ?Conventional group ?RCCS group ??Fig. 3 ALP activity in each group at different time points after chondrogenic induction ?Conventional group ?RCCS group ??Fig. 4 Expression levels of related genes in the conventional group at different time points after chondrogenic induction by real-time quantitative PCR ?Collagen typeⅡ?ANCN ?SOX9 ?Collagen typeⅩ?ALP ?AnnexinⅤ
2.2 IHH蛋白表達及ALP活性檢測
2.2.1 IHH蛋白表達
ELISA法檢測示，成軟骨誘導分化各時間點RCCS 1組及傳統1組IHH蛋白均呈過表達，均明顯高于RCCS 2、3組和傳統2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）；但隨誘導時間延長，RCCS 1組及傳統1組IHH蛋白表達逐漸減少，各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2。
2.2.2 ALP活性檢測
成軟骨誘導分化各時間點傳統組中各亞組ALP活性均逐漸增高，且傳統1組各時間點ALP活性均高于傳統2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。而RCCS組中，僅誘導分化3、7 d RCCS 1組ALP活性稍高于RCCS 2、3組（P < 0.05），其余時間點各亞組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3。
2.3 實時熒光定量PCR檢測軟骨及軟骨肥大相關基因表達
傳統組中，隨著成軟骨誘導分化時間延長，傳統2、3組軟骨相關基因Ⅱ型膠原、ANCN、SOX9表達逐漸增多，而傳統1組呈先升后降趨勢，誘導分化第7、14 d傳統1組基因表達量稍高于其他兩組，但21 d反而低于其他兩組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。各亞組軟骨肥大相關基因Ⅹ型膠原、ALP、AnnexinⅤ的表達均基本呈現逐漸增多趨勢，且傳統1組基因表達量均高于傳統2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
RCCS組中，隨著成軟骨誘導分化時間延長，各亞組軟骨相關基因Ⅱ型膠原、ANCN、SOX9表達逐漸增多，且RCCS 1組各時間點各基因表達量均明顯高于RCCS 2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。各亞組軟骨肥大相關基因Ⅹ型膠原、ALP、AnnexinⅤ的表達緩慢增加，在誘導分化中期逐漸穩定，Ⅹ型膠原及ALP在最后表達水平出現下降。RCCS 1組各基因表達量在誘導分化早期（7 d前）稍高于其他兩組，差異有統計學意義（P < 0.05）；但在誘導分化后期（14 d后）與其他兩組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
圖5
實時熒光定量PCR檢測RCCS組成軟骨誘導分化各時間點各基因表達量?Ⅱ型膠原?ANCN ?SOX9 ?Ⅹ型膠原?ALP ?AnnexinⅤ??圖 6 Western blot檢測各組成軟骨誘導分化各時間點各蛋白表達1：3組2：2組3：1組?傳統組10?d ?傳統組21?d ?RCCS組10 d ?RCCS組21 d
Figure5.
Expression levels of related genes in the RCCS group at different time points after chondrogenic induction by real-time fluorescence quantitative PCR ?Collagen typeⅡ?ANCN ?SOX9 ?Collagen type X ?ALP ?AnnexinⅤ??Fig. 6 Expression of related proteins in each group at different time points after chondrogenic induction by Western blot 1: Group 3 2: Group 2 3: Group 1 ?Conventional group at 10 days ?Conventional group at 21 days ?RCCS group at 10 days ?RCCS gro up at 21 days
2.4 Wertern blot法檢測Ⅱ型膠原、ANCN蛋白表達
傳統組中，成軟骨誘導分化10 d時各亞組Ⅱ型膠原和ANCN蛋白表達水平均較低，傳統1組蛋白表達量稍高于傳統2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。21 d時，傳統1組Ⅱ型膠原蛋白表達量明顯低于傳統2、3組（P < 0.05），但ANCN蛋白表達量各亞組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
RCCS組中，成軟骨誘導分化10、21 d時各亞組Ⅱ型膠原和ANCN蛋白表達水平均較高，且RCCS 1組蛋白表達量均明顯高于RCCS 2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 6、7。
圖7
Western blot檢測各組成軟骨誘導各時間點各蛋白表達量
ⓐ傳統組誘導10 dⅡ型膠原ⓑ傳統組誘導10 d ANCN ⓒ傳統組誘導21 dⅡ型膠原ⓓ傳統組誘導21 d ANCN ⓔRCCS組誘導10 dⅡ型膠原ⓕRCCS組誘導10 d ANCN 𗀂RCCS組誘導21 dⅡ型膠原𗀃RCCS組誘導21 d ANCN
Figure7. Expression levels of related proteins in each group at different time points after chondrogenic induction by Western blotⓐ Collagen typeⅡin conventional group after 10 days of chondrogenic induction ⓑANCN in conventional group after 10 days of chondrogenic induction ⓒCollagen typeⅡin conventional group after 21 days of chondrogenic induction ⓓANCN in conventional group after 21 days of chondrogenic induction ⓔCollagen typeⅡin RCCS group after 10 days of chondrogenic induction ⓕANCN in RCCS group after 10 days of chondrogenic induction 𗀂Collagen typeⅡin RCCS group after 21 days of chondrogenic induction 𗀃ANCN in RCCS group after 21 days of chondrogenic induction
2.5 甲苯胺藍染色及Annexin V-cy3免疫熒光染色觀察
2.5.1 甲苯胺藍染色
傳統組中，成軟骨誘導分化各時間點各亞組染色均呈淺藍色，但10 d時傳統1組染色深于傳統2、3組，21 d時傳統1組染色淺于傳統2、3組。RCCS組中，成軟骨誘導分化10 d，各亞組染色均呈淡藍色，21 d均呈藍色，RCCS 1組染色均明顯深于RCCS 2、3組。見圖 8。
圖8
成軟骨誘導分化各時間點各組甲苯胺藍染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）
ⓐ傳統1組10 d ⓑ傳統2組10 d ⓒ傳統3組10 d ⓓ傳統1組21 d ⓔ傳統2組21 d ⓕ傳統3組21 d ⓖ RCCS 1組10 d ⓗ RCCS 2組10 d ⓘ RCCS 3組10 d ⓙ RCCS 1組21 d ⓚ RCCS 2組21 d ⓛ RCCS 3組21 d
Figure8. Methylene blue staining results in each group at differenct time points after chondrogenic induction (Inverted phase contrast microscopy×100)ⓐConventional 1 group at 10 days ⓑConventional 2 group at 10 days ⓒConventional 3 group at 10 days ⓓConventional 1 group at 21 days ⓔConventional 2 group at 21 days ⓕConventional 3 group at 21 days ⓖRCCS 1 group at 10 days ⓗRCCS 2 group at 10 days ⓘRCCS 3 group at 10 days ⓙRCCS 1 group at 21 days ⓚRCCS 2 group at 21 days ⓛRCCS 3 group at 21 days
2.5.2 AnnexinⅤ-cy3免疫熒光染色
傳統組中，成軟骨誘導分化10 d，各亞組均呈現少量紅色熒光，21 d均有較強紅色熒光，傳統1組紅色熒光均強于傳統2、3組。RCCS組中，成軟骨誘導分化10、21 d，各亞組紅色熒光表達均較弱，組間無明顯差異。見圖 9。
圖9
成軟骨誘導各時間點各組AnnexinⅤ-cy3免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100）
ⓐ傳統1組10 d ⓑ傳統2組10 d ⓒ傳統3組10 d ⓓ傳統1組21 d ⓔ傳統2組21 d ⓕ傳統3組21 d ⓖ RCCS 1組10 d ⓗ RCCS 2組10 d ⓘ RCCS 3組10 d ⓙ RCCS 1組21 d ⓚ RCCS 2組21 d ⓛ RCCS 3組21 d
Figure9. Annexin V-cy3 immunofluorescence staining results in each group at different time points after chondrogenic induction (Fluorescence microscopy×100)ⓐ Conventional 1 group at 10 days ⓑConventional 2 group at 10 days ⓒConventional 3 group at 10 days ⓓConventional 1 group at 21 days ⓔConventional 2 group at 21 days ⓕConventional 3 group at 21 days ⓖRCCS 1 group at 10 days ⓗRCCS 2 group at 1 0 days ⓘRCCS 3 group at 10 days ⓙRCCS 1 group at 21 days ⓚRCCS 2 group at 21 days ⓛRCCS 3 group at 21 days
3 討論
BMSCs成軟骨分化是在多種信號通路協同調控下完成的，如TGF-β/BMP、Wnt、FGF、IGF和Hedgehog等通路在此過程中發揮不同的調控作用，Hedgehog信號通路是其中一種重要的信號通路[14-15]。IHH是Hedeghog信號通路中的一個同源蛋白，可通過直接和間接兩條途徑來調控軟骨發育，在促進軟骨細胞增殖的同時抑制軟骨細胞老化，其中IHH和其受體PTHrP形成的負反饋通路發揮重要作用[7]。因此，IHH基因被認為是一個有利于軟骨形成的因子，可用于軟骨組織工程以促進軟骨形成。一些基礎研究也發現[8]，IHH基因無論是單獨轉染BMSCs，還是聯合TGF-β或BMP-2基因共轉染，均可促進BMSCs成軟骨分化。BMSCs生長和分化過程中，Hedgehog信號被激活時將促使IHH基因的表達增加，細胞翻譯、表達出IHH蛋白并分泌到細胞外，與細胞膜上相關受體結合后觸發一系列反應[8]。細胞培養上清液中IHH蛋白的濃度能夠反映IHH信號活性。本研究通過構建IHH基因腺病毒載體轉染兔BMSCs，結果發現IHH基因腺病毒轉染組高表達IHH蛋白，提示IHH基因過表達腺病毒載體轉染成功。但在傳統的細胞培養、誘導條件下，傳統1組中軟骨相關基因的表達呈先高后低的趨勢，且在21?d時明顯低于其他兩組，而軟骨肥大相關基因表達卻逐漸增高且高于其他兩組水平（P < 0.05）。蛋白表達結果也表明，雖然誘導10 dⅡ型膠原和ACNC蛋白表達量高于其他兩組，但21 d卻低于其他兩組。BMSCs經過成軟骨誘導分化，細胞形態由梭形或紡錘形變成橢圓形或圓形，逐漸呈現出類軟骨細胞樣的形態[16]。經甲苯胺藍染色，細胞外基質可被染成淡藍色，細胞核深染；且軟骨細胞外基質合成越多，染色結果越趨向深藍色[8]。當軟骨細胞發生肥大或凋亡時可表達AnnexinⅤ，經AnnexinⅤ-cy3免疫熒光染色在熒光顯微鏡下可呈紅色熒光，且紅光越強，表示AnnexinⅤ表達越多[8]。所以AnnexinⅤ不僅反映細胞凋亡水平，在軟骨組織中也是軟骨細胞肥大和老化的標志[8]。細胞爬片AnnexinⅤ-cy3染色結果顯示，IHH基因腺病毒轉染組有較強紅色熒光表達，說明IHH基因腺病毒轉染組誘導后軟骨細胞肥大或老化嚴重。
以上結果表明，在傳統二維細胞培養、誘導模式下，IHH基因雖然在誘導分化早期利于軟骨分化進程，但同時亦促進軟骨肥大老化，甚至凋亡。分析原因可能是，正常情況下IHH-PTH/PTHrP軸可正向促進PTH及PTHrP的分泌，后者與其受體結合后可加快軟骨細胞的增殖；當有軟骨內成骨信號通路如Wnt/β-catienine等存在時，軟骨細胞隨即向成骨方向發展，或者老化和凋亡；而當IHH信號高表達時會加速軟骨內成骨的進程，使快速增殖的軟骨細胞出現分化、老化，甚至是凋亡[8]。本研究中，傳統1組在誘導分化前期軟骨相關基因及軟骨標志蛋白的表達均優于其他兩組，而在后期卻明顯低于其他兩組，也說明了這個問題。此外，傳統1組高表達AnnexinⅤ紅色熒光蛋白，也提示軟骨細胞出現了老化。Fischer等[17]研究發現，間斷性的PTHrP蛋白刺激可促進MSCs成軟骨細胞分化，軟骨相關的Ⅱ型膠原及ANCN表達明顯增多，但持續的PTHrP蛋白刺激卻可抑制軟骨形成，且軟骨肥大相關標志基因、蛋白無表達增加。這也從另一方面說明，IHH基因轉染后過多的IHH/PTHrP信號積累可能加速了BMSCs至軟骨形成，再到軟骨成熟和肥大及軟骨內成骨的過程。
此外，在BMSCs誘導分化過程中Ⅹ型膠原及ALP基因表達增加，且傳統1組明顯高于其他兩組。說明IHH信號的增加觸發了軟骨肥大或成骨相關基因及信號通路的激活，后者可導致軟骨細胞外的Ⅱ型膠原逐漸變成成骨細胞相關的Ⅹ型膠原，亦可促進ALP的分泌。本研究結果發現，傳統1組在誘導分化過程中ALP表達增多且均高于其他兩組，也反映了相關信號通路的激活。當cAMP/PKA途徑活化劑Forskolin存在時，可有效復制持續性PTHrP刺激時對MSCs成軟骨分化的抑制作用及對軟骨細胞肥大成熟和肥大的促進作用[17]，這說明cAMP/PKA途徑在該過程中發揮重要的中介信號調控作用。
RCCS是一種新型細胞培養生物反應器，由于其可以模擬體內組織細胞生長的微重力環境，因此在軟骨組織工程研究中日益受到重視。RCCS中細胞黏附在三維支架材料上并可隨著基座的旋轉而自由轉動。這可使培養物在水平軸上建立類似均質液體的懸浮軌道，使重力向量持續隨機分布，因此培養物可維持在連續的自由落體狀態有利于細胞聚集，從而加強細胞之間及細胞與基質間的聯系。后者可通過激活SIRT1增強SOX9轉錄，從而增加下游靶基因Ⅱ型膠原的表達[12, 18]。RCCS細胞培養容器具備硅膠換氣膜，可使細胞或組織得到充分的氣體交換。正是這種高效的細胞內外及細胞間物質傳遞效率，使細胞具有較強的增殖和分化能力[10, 19]。此外，RCCS還可提供一定的力學刺激，如剪切力、流體靜壓力、聯合壓縮力等類似機體的微環境，使細胞在支架材料上分布更加均勻，后者有利于營養物質的吸收和代謝產物的排除，從而促進軟骨細胞的增殖分化和基質合成。Cytodex 3是一種球形的細胞培養微載體，直徑25～30μm，其表面包裹著一層膠原蛋白，非常有利于BMSCs黏附。BMSCs貼壁生長于Cytodex 3表面并懸浮于培養基中，增加了細胞與培養基的接觸面積，從而有利于細胞的代謝與生長。我們將兔BMSCs接種至微載體上并在RCCS中培養進行誘導成軟骨分化。結果發現，在RCCS誘導條件下IHH基因腺病毒轉染對BMSCs成軟骨分化的影響不同于傳統模式。表現為在誘導分化過程中，軟骨相關基因Ⅱ型膠原、ANCN、SOX9及相關蛋白的表達逐漸增加，RCCS 1組明顯高于RCCS 2、3組；而軟骨肥大相關標志物的表達水平均較低，各組之間無明顯差異。表明在RCCS誘導條件下。IHH基因過表達可促進BMSCs成軟骨分化，且能有效抑制軟骨細胞肥大。
對于上述結果出現的原因，除了RCCS條件下高效的營養物質傳輸及代謝廢物排除等因素，也可能與一些特殊信號通路的激活有關。RCCS可給予培養物一定的生物力學刺激，這種刺激能介導相關信號通路的改變，從而對BMSCs成軟骨分化產生一定影響。多能干細胞在一定力學刺激下，SOX9、Runx2、p38 MAPK等表達水平增加，這些與軟骨的合成密切相關[20]。整合素（Integrin）、細胞骨架、MAPK信號通路等是細胞接受和傳導力學信號最重要的途徑之一。Integrin能夠感受胞外力學信號后，將其轉化為化學信號并整合成胞內信號，再通過細胞骨架、MAPK等信號通路調節一系列細胞生物學行為[21]。有研究發現[22-23]，在微重力作用下MSCs中Integrinβ1表達增加，但其下游信號FAK及PYK2等表達顯著降低；此外，Ras、ERK的磷酸化也受到抑制，而磷酸化的ERK可直接調節Runx2的轉錄，Runx2與MSCs成骨分化有密切聯系。因此，微重力效應下FAK、PYK2等分子磷酸化水平的降低，以及MAPK/ERK信號通路的紊亂，也許能抑制MSCs向軟骨細胞分化后進一步發展為成骨細胞。此外，BMP、TGF-β、p38及Wnt/β-catenin等信號也可能參與微重力環境下BMSCs成軟骨細胞分化后的調控。實驗中成骨相關基因Ⅹ型膠原及ALP表達水平較低，且各組細胞培養上清液中ALP活性也較低，可能與BMSCs分化成軟骨后進一步向成骨細胞分化受到抑制相關。但具體的信號調控機制仍需進一步探索。
綜上述，體外可成功構建兔IHH基因腺病毒載體，后者可高效轉染兔BMSCs并過表達兔IHH蛋白。在傳統細胞培養、誘導條件下，IHH基因腺病毒轉染BMSCs在誘導分化早期可促進軟骨合成，但隨即亦可導致軟骨肥大老化或向成骨方向分化。而在RCCS培養、誘導條件下，IHH基因腺病毒轉染BMSCs可有效促進軟骨合成并抑制軟骨老化或向成骨發展，適合軟骨組織工程的需要。
軟骨組織工程為治療軟骨損傷及缺損提供了新思路，BMSCs是目前公認的軟骨組織工程種子細胞來源[1-3]，但也存在一些不足。通過BMSCs構建的軟骨組織工程組織，較體內正常軟骨組織在組織學形態、生物力學性能上仍存在一定差異[4]；體外利用BMSCs構建的組織工程軟骨細胞或組織容易老化或向成骨細胞發展，并不適用于修復軟骨損傷或缺失[5]。Indianhedgehog（IHH）是hedgehog信號通路中重要的同源蛋白之一，具有調控軟骨肥大和骨形成的作用，IHH基因或蛋白的缺失會導致肢體末端畸形發育，同時伴有軟骨細胞增殖率的下降和肥大軟骨細胞的膨脹[6]。IHH可在軟骨細胞增殖和分化的多個階段發揮調控作用，具有直接和間接的調控途徑。目前認為，IHH可促進關節周圍軟骨細胞增加表達甲狀旁腺素/甲狀旁腺素相關肽受體（parathy r oid hormone/parathyroid hormone-related protein，PTH/PTHrP），后者則通過與其受體PTHR-1結合來促進軟骨細胞的增殖并可抑制其肥大，與此同時，IHH與PTHrP形成負反饋環路，通過cAMP/PKA途徑下調IHH的分泌[7]。有研究發現，無論是用IHH單獨轉染BMSCs，還是聯合BMP-2或TGF-β共同轉染，均可促進初始BMSCs成軟骨細胞分化[8]。這為利用IHH基因轉染構建組織工程軟骨提供了理論依據。
軟骨細胞的生長除了營養支持，還需要特殊生長環境，即細胞生長的微環境。傳統BMSCs體外培養和誘導分化通常局限于二維細胞培養環境中，細胞可能出現類似于去分化現象，使培養的細胞逐漸失去其來源組織的許多生理特征[9]；而且經誘導生成的軟骨組織只能達到組織形態學及生化成分上的類似，不能實現與原有軟骨相同的再生[4]。旋轉微重力細胞培養系統（rotary cell culture system，RCCS）是一種三維空間微重力培養系統，可使培養物在水平軸上建立類似均質液體的懸浮軌道，培養物的重力向量持續隨機分布，因而可保持連續的自由落體狀態；同時使作用于培養物的表觀重力降至約10-2?g，可使細胞克服重力影響易于凝集和黏附于微載體表面[10-11]。RCCS還可提供一定的生物力學刺激，如剪切力、聯合壓縮力、流體靜壓力等，營造類似機體內部微環境，使細胞更均勻地分布于支架材料上，有利于營養物質的傳輸和代謝廢物的排除，從而促進軟骨細胞增殖和軟骨基質合成[10, 12]。研究表明，RCCS可促進BMSCs分化成軟骨細胞，且有利于軟骨細胞表型的維持及生物力學特點的體外模擬[13]。
本研究通過IHH基因腺病毒載體轉染兔BM SCs，探討IHH基因轉染對兔BMSCs成軟骨分化的影響；同時聯合RCCS，探討在模擬體內微重力環境下，利用IHH基因轉染BMSCs構建組織工程軟骨的可能性，為體內實驗修復軟骨缺損提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑、儀器
兔BMSCs[賽業（廣州）生物科技有限公司]；含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的腺病毒過表達載體（上海吉滿生物科技有限公司；滴度為1×1011 pfu/mL）。L-DMEM、H-DMEM培養基（HyClone公司，美國）；青霉素/鏈霉素雙抗、FBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA（GIBCO公司，美國）；重組人FGF（Proteintech公司，美國）；地塞米松、抗壞血酸、胰島素-轉鐵蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）、丙酮酸鈉、TGF-β、甲苯胺藍（Sigma公司，美國）；膜聯蛋白V（Annexin V）-cy3試劑盒（Enzolife公司，美國）；Trizol、Polybrene（Invitrogen公司，美國）；RT-PCR試劑盒（大連TaKaRa公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（Kapa公司，美國）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；兔IHH蛋白ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；ALP活性檢測試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；兔抗兔Ⅱ型膠原多克隆抗體（Enzolife公司，美國）；鼠抗兔聚集蛋白聚糖（aggrecan，ANCN）單克隆抗體、Cytodex 3（GE公司，美國）；鼠抗兔GAPDH單克隆抗體、羊抗兔免疫熒光二抗、羊抗鼠免疫熒光二抗（Proteintech公司，美國）。
PCR儀（Eppendorf公司，美國）；ABI 7900HT型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；CO2細胞培養箱、超凈工作臺、離心機、酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；Odyssey雙色紅外激光成像系統（LI-COR公司，美國）；倒置相差熒光顯微鏡（Leica Demirb公司，德國）；RCCS（Synthecon公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
1.2.1 IHH基因腺病毒載體的構建
以pDC316-mCMV-EGFP為穿梭質粒構成載體骨架并酶切。設計并合成引物，以擴增兔IHH（基因號：100008942）目的基因片段，并連接至酶切后（酶切位點Xba/Xho）的過表達載體上。將連接產物轉入感受態細胞，并對長出的單克隆菌落進行測序鑒定，序列正確的克隆即為含有目的基因的過表達載體。用構建的腺病毒表達載體和骨架質粒共轉染293細胞，包裝病毒，收集病毒原液，通過紫外分光計量法測定病毒液滴度；然后通過超濾濃縮得到病毒濃縮液，使病毒液滴度達到1×1011～1×1012 pfu/mL。
1.2.2 實驗分組
取第2代BMSCs，分為RCCS組和傳統組2個大組，每個大組進一步分為3個亞組，即IHH基因腺病毒載體轉染組（RCCS 1組和傳統1組）、GFP腺病毒載體轉染組（RCCS 2組和傳統2組）及空白對照組（RCCS 3組和傳統3組）。
1.2.3 實驗方法
①RCCS組：RCCS組細胞均在模擬微重力環境下進行成軟骨細胞誘導分化。當BMSCs長滿至70%～80%時，RCCS 1、2組分別用IHH基因腺病毒載體及GFP腺病毒載體，以預實驗得出的最佳感染復數200轉染兔BMSCs，2 h后更換成新鮮的BMSCs專用完全培養基（含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素雙抗和1 ng/mL重組人FGF的L-DMEM培養基）；轉染24 h后用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液收集各組細胞，并進行細胞計數。RCCS 3組細胞于BMSCs專用完全培養基中培養24?h后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液收集細胞并計數。調整各組細胞懸液密度為1×105個/ mL。參考Wu等[11]的方法進行RCCS處理。取消毒滅菌后的微載體Cytodex 3，用BMSCs完全培養基（含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素雙抗的L-DMEM培養基）沖洗后加入適量BMSCs專用完全培養基，調整密度為5 mg/mL。將各組細胞懸液與Cyto dex 3懸液充分混勻，使細胞和微載體的密度分別為4×105個/mL及5?mg/mL，共同接種至50 mL或10?mL RCCS細胞培養容器中，然后安裝于旋轉基座上置于37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養，調整RCCS細胞培養容器的轉速為10～12 r/min，使細胞、微載體可充分接觸；24?h后調整容器轉速為12～14 r/min，直至看到容器內的培養物既不會接觸到容器壁，又可在旋轉過程中呈現自由落體狀態。培養24 h后更換為成軟骨細胞誘導分化培養基（含100 nmol/L地塞米松、0.17 mmol/L抗環血酸、1?mmol/L丙酮酸鈉、0.35 mmol/L L-脯氨酸、1%ITS及10 ng/mL TGF-β的H-DMEM培養基）；以后每2～3天換液1次，共誘導培養21 d。
當需要從容器中取樣檢測時，先關閉電源，將容器置于生物安全柜中進行操作；傾斜容器，培養物均沉積在容器底部，收集上清液進行相關檢測。當需要收集細胞時，充分混勻容器中的培養物，用注射器抽取適量細胞-微載體-培養基混合液，PBS清洗2～3次，然后用0.25%胰蛋白酶-EDTA將細胞從微載體中消化下來，收集細胞。
②傳統組：傳統組將轉染后的細胞以3×105個/孔密度接種至6孔板中，加入BMSCs專用完全培養基2 mL，“十”字搖勻法使細胞均勻接種，然后置于37℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養。24?h后同上法進行成軟骨誘導分化培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 IHH基因腺病毒轉染效率檢測
IHH基因腺病毒載體轉染BMSCs 12 h后，熒光顯微鏡下觀察各組細胞IHH基因腺病毒轉染效率；倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs在微載體Cytodex 3上的貼附情況；熒光顯微鏡下觀察IHH基因腺病毒轉染后BMSCs在微載體Cytodex 3上的熒光表達情況。
1.3.2 IHH蛋白表達及ALP活性檢測
分別于成軟骨誘導分化3、7、14、21 d前1天換液，收集24?h后細胞培養上清液，每組隨機取3個樣本，通過ELISA法[8]測定細胞培養上清液中IHH蛋白濃度。同時，每組隨機取3個樣本，根據ALP活性檢測試劑盒說明書測定細胞培養上清液中ALP活性。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測軟骨及軟骨肥大相關基因表達
分別于成軟骨誘導分化3、7、14、21?d，各組隨機收集3組樣本細胞，采用Trizol法提取RNA并純化，根據分光光度法測定抽提RNA在260 nm處的波長，計算RNA的濃度及純度。每個樣本均取50μg RNA進行RT-PCR反應合成cDNA，分光光度法測定合成cDNA的濃度，按照實時熒光定量PCR說明書操作，分析各樣本中相關基因的表達。軟骨相關基因包括Ⅱ型膠原、ANCN、SOX9，軟骨肥大相關基因包括Ⅹ型膠原、ALP、Annexin V，以GAPDH作為內參。根據美國國家生物技術信息中心（NCBI）中基因序列信息設計并合成引物，見表 1。
表1
各基因引物序列及產物片段大小
Table1.
The primer sequence and product size of the related genes
1.3.4 Wertern blot法檢測Ⅱ型膠原、ANCN蛋白表達
分別于成軟骨誘導分化10、21 d，每組隨機取3個樣本，提取細胞中的蛋白，以GAPDH為內參蛋白，通過Wertern blot方法[13]檢測細胞中Ⅱ型膠原、ANCN蛋白表達情況。其中Ⅱ型膠原檢測一抗采用兔抗兔Ⅱ型膠原多克隆抗體，二抗為山羊抗兔單克隆抗體；ANCN檢測一抗為鼠抗兔ANCN單克隆抗體，二抗為山羊抗鼠單克隆抗體。
1.3.5 甲苯胺藍染色及AnnexinV-cy3免疫熒光染色觀察
分別于成軟骨誘導分化10、21 d，收集各組細胞爬片，常規行甲苯胺藍組織學染色，并參考Annexin V-cy3免疫熒光染色試劑盒操作說明及參考文獻[8]方法行Annexin V-cy3免疫熒光染色觀察。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 IHH基因腺病毒轉染效率檢測
熒光顯微鏡觀察示，IHH基因腺病毒載體轉染BMSCs后12 h即可看到少量綠色熒光，48 h綠色熒光表達最強，病毒轉染效率高達95%以上。倒置相差顯微鏡觀察示，RCCS組BMSCs貼附在球形的微載體Cytodex 3上。熒光顯微鏡觀察示，病毒轉染后的BMSCs可表達GFP，可見到“燈籠狀”的細胞-微載體復合物。見圖 1。
圖1
IHH基因腺病毒轉染效率檢測?IHH基因腺病毒載體轉染后BMSCs形態觀察（熒光顯微鏡×200）?RCCS組BMSCs貼附于微載體Cytodex 3上（倒置相差顯微鏡×200）?RCCS組BMSCs病毒轉染后可見“燈籠狀”細胞-微載體復合物（熒光顯微鏡×200）??圖 2各組成軟骨誘導分化各時間點IHH蛋白表達?傳統組?RCCS組??圖 3各組成軟骨誘導分化各時間點ALP活性檢測?傳統組?RCCS組??圖 4實時熒光定量PCR檢測傳統組成軟骨誘導各時間點各基因表達量?Ⅱ型膠原?ANCN ?SOX9 ?Ⅹ型膠原?ALP ?AnnexinⅤ
Figure1.
Transfection efficiency of IHH gene ?BMSCs morphology after transfection (Fluorescence microscopy×200) ?Adhesion of BMSCs on the surface of the Cytodex 3 micro-carriers in RCCS group (Inverted phase contrast microscopy×200) ?"Lantern-like"cell micro-carrier complexes in RCCS group after transfection (Fluorescence microscopy×200) ??Fig. 2 IHH protein expression in each group at different time points after chondrogenic induction ?Conventional group ?RCCS group ??Fig. 3 ALP activity in each group at different time points after chondrogenic induction ?Conventional group ?RCCS group ??Fig. 4 Expression levels of related genes in the conventional group at different time points after chondrogenic induction by real-time quantitative PCR ?Collagen typeⅡ?ANCN ?SOX9 ?Collagen typeⅩ?ALP ?AnnexinⅤ
2.2 IHH蛋白表達及ALP活性檢測
2.2.1 IHH蛋白表達
ELISA法檢測示，成軟骨誘導分化各時間點RCCS 1組及傳統1組IHH蛋白均呈過表達，均明顯高于RCCS 2、3組和傳統2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）；但隨誘導時間延長，RCCS 1組及傳統1組IHH蛋白表達逐漸減少，各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2。
2.2.2 ALP活性檢測
成軟骨誘導分化各時間點傳統組中各亞組ALP活性均逐漸增高，且傳統1組各時間點ALP活性均高于傳統2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。而RCCS組中，僅誘導分化3、7 d RCCS 1組ALP活性稍高于RCCS 2、3組（P < 0.05），其余時間點各亞組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 3。
2.3 實時熒光定量PCR檢測軟骨及軟骨肥大相關基因表達
傳統組中，隨著成軟骨誘導分化時間延長，傳統2、3組軟骨相關基因Ⅱ型膠原、ANCN、SOX9表達逐漸增多，而傳統1組呈先升后降趨勢，誘導分化第7、14 d傳統1組基因表達量稍高于其他兩組，但21 d反而低于其他兩組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。各亞組軟骨肥大相關基因Ⅹ型膠原、ALP、AnnexinⅤ的表達均基本呈現逐漸增多趨勢，且傳統1組基因表達量均高于傳統2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。
RCCS組中，隨著成軟骨誘導分化時間延長，各亞組軟骨相關基因Ⅱ型膠原、ANCN、SOX9表達逐漸增多，且RCCS 1組各時間點各基因表達量均明顯高于RCCS 2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。各亞組軟骨肥大相關基因Ⅹ型膠原、ALP、AnnexinⅤ的表達緩慢增加，在誘導分化中期逐漸穩定，Ⅹ型膠原及ALP在最后表達水平出現下降。RCCS 1組各基因表達量在誘導分化早期（7 d前）稍高于其他兩組，差異有統計學意義（P < 0.05）；但在誘導分化后期（14 d后）與其他兩組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 5。
圖5
實時熒光定量PCR檢測RCCS組成軟骨誘導分化各時間點各基因表達量?Ⅱ型膠原?ANCN ?SOX9 ?Ⅹ型膠原?ALP ?AnnexinⅤ??圖 6 Western blot檢測各組成軟骨誘導分化各時間點各蛋白表達1：3組2：2組3：1組?傳統組10?d ?傳統組21?d ?RCCS組10 d ?RCCS組21 d
Figure5.
Expression levels of related genes in the RCCS group at different time points after chondrogenic induction by real-time fluorescence quantitative PCR ?Collagen typeⅡ?ANCN ?SOX9 ?Collagen type X ?ALP ?AnnexinⅤ??Fig. 6 Expression of related proteins in each group at different time points after chondrogenic induction by Western blot 1: Group 3 2: Group 2 3: Group 1 ?Conventional group at 10 days ?Conventional group at 21 days ?RCCS group at 10 days ?RCCS gro up at 21 days
2.4 Wertern blot法檢測Ⅱ型膠原、ANCN蛋白表達
傳統組中，成軟骨誘導分化10 d時各亞組Ⅱ型膠原和ANCN蛋白表達水平均較低，傳統1組蛋白表達量稍高于傳統2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。21 d時，傳統1組Ⅱ型膠原蛋白表達量明顯低于傳統2、3組（P < 0.05），但ANCN蛋白表達量各亞組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。
RCCS組中，成軟骨誘導分化10、21 d時各亞組Ⅱ型膠原和ANCN蛋白表達水平均較高，且RCCS 1組蛋白表達量均明顯高于RCCS 2、3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖 6、7。
圖7
Western blot檢測各組成軟骨誘導各時間點各蛋白表達量
ⓐ傳統組誘導10 dⅡ型膠原ⓑ傳統組誘導10 d ANCN ⓒ傳統組誘導21 dⅡ型膠原ⓓ傳統組誘導21 d ANCN ⓔRCCS組誘導10 dⅡ型膠原ⓕRCCS組誘導10 d ANCN 𗀂RCCS組誘導21 dⅡ型膠原𗀃RCCS組誘導21 d ANCN
Figure7. Expression levels of related proteins in each group at different time points after chondrogenic induction by Western blotⓐ Collagen typeⅡin conventional group after 10 days of chondrogenic induction ⓑANCN in conventional group after 10 days of chondrogenic induction ⓒCollagen typeⅡin conventional group after 21 days of chondrogenic induction ⓓANCN in conventional group after 21 days of chondrogenic induction ⓔCollagen typeⅡin RCCS group after 10 days of chondrogenic induction ⓕANCN in RCCS group after 10 days of chondrogenic induction 𗀂Collagen typeⅡin RCCS group after 21 days of chondrogenic induction 𗀃ANCN in RCCS group after 21 days of chondrogenic induction
2.5 甲苯胺藍染色及Annexin V-cy3免疫熒光染色觀察
2.5.1 甲苯胺藍染色
傳統組中，成軟骨誘導分化各時間點各亞組染色均呈淺藍色，但10 d時傳統1組染色深于傳統2、3組，21 d時傳統1組染色淺于傳統2、3組。RCCS組中，成軟骨誘導分化10 d，各亞組染色均呈淡藍色，21 d均呈藍色，RCCS 1組染色均明顯深于RCCS 2、3組。見圖 8。
圖8
成軟骨誘導分化各時間點各組甲苯胺藍染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）
ⓐ傳統1組10 d ⓑ傳統2組10 d ⓒ傳統3組10 d ⓓ傳統1組21 d ⓔ傳統2組21 d ⓕ傳統3組21 d ⓖ RCCS 1組10 d ⓗ RCCS 2組10 d ⓘ RCCS 3組10 d ⓙ RCCS 1組21 d ⓚ RCCS 2組21 d ⓛ RCCS 3組21 d
Figure8. Methylene blue staining results in each group at differenct time points after chondrogenic induction (Inverted phase contrast microscopy×100)ⓐConventional 1 group at 10 days ⓑConventional 2 group at 10 days ⓒConventional 3 group at 10 days ⓓConventional 1 group at 21 days ⓔConventional 2 group at 21 days ⓕConventional 3 group at 21 days ⓖRCCS 1 group at 10 days ⓗRCCS 2 group at 10 days ⓘRCCS 3 group at 10 days ⓙRCCS 1 group at 21 days ⓚRCCS 2 group at 21 days ⓛRCCS 3 group at 21 days
2.5.2 AnnexinⅤ-cy3免疫熒光染色
傳統組中，成軟骨誘導分化10 d，各亞組均呈現少量紅色熒光，21 d均有較強紅色熒光，傳統1組紅色熒光均強于傳統2、3組。RCCS組中，成軟骨誘導分化10、21 d，各亞組紅色熒光表達均較弱，組間無明顯差異。見圖 9。
圖9
成軟骨誘導各時間點各組AnnexinⅤ-cy3免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100）
ⓐ傳統1組10 d ⓑ傳統2組10 d ⓒ傳統3組10 d ⓓ傳統1組21 d ⓔ傳統2組21 d ⓕ傳統3組21 d ⓖ RCCS 1組10 d ⓗ RCCS 2組10 d ⓘ RCCS 3組10 d ⓙ RCCS 1組21 d ⓚ RCCS 2組21 d ⓛ RCCS 3組21 d
Figure9. Annexin V-cy3 immunofluorescence staining results in each group at different time points after chondrogenic induction (Fluorescence microscopy×100)ⓐ Conventional 1 group at 10 days ⓑConventional 2 group at 10 days ⓒConventional 3 group at 10 days ⓓConventional 1 group at 21 days ⓔConventional 2 group at 21 days ⓕConventional 3 group at 21 days ⓖRCCS 1 group at 10 days ⓗRCCS 2 group at 1 0 days ⓘRCCS 3 group at 10 days ⓙRCCS 1 group at 21 days ⓚRCCS 2 group at 21 days ⓛRCCS 3 group at 21 days
3 討論
BMSCs成軟骨分化是在多種信號通路協同調控下完成的，如TGF-β/BMP、Wnt、FGF、IGF和Hedgehog等通路在此過程中發揮不同的調控作用，Hedgehog信號通路是其中一種重要的信號通路[14-15]。IHH是Hedeghog信號通路中的一個同源蛋白，可通過直接和間接兩條途徑來調控軟骨發育，在促進軟骨細胞增殖的同時抑制軟骨細胞老化，其中IHH和其受體PTHrP形成的負反饋通路發揮重要作用[7]。因此，IHH基因被認為是一個有利于軟骨形成的因子，可用于軟骨組織工程以促進軟骨形成。一些基礎研究也發現[8]，IHH基因無論是單獨轉染BMSCs，還是聯合TGF-β或BMP-2基因共轉染，均可促進BMSCs成軟骨分化。BMSCs生長和分化過程中，Hedgehog信號被激活時將促使IHH基因的表達增加，細胞翻譯、表達出IHH蛋白并分泌到細胞外，與細胞膜上相關受體結合后觸發一系列反應[8]。細胞培養上清液中IHH蛋白的濃度能夠反映IHH信號活性。本研究通過構建IHH基因腺病毒載體轉染兔BMSCs，結果發現IHH基因腺病毒轉染組高表達IHH蛋白，提示IHH基因過表達腺病毒載體轉染成功。但在傳統的細胞培養、誘導條件下，傳統1組中軟骨相關基因的表達呈先高后低的趨勢，且在21?d時明顯低于其他兩組，而軟骨肥大相關基因表達卻逐漸增高且高于其他兩組水平（P < 0.05）。蛋白表達結果也表明，雖然誘導10 dⅡ型膠原和ACNC蛋白表達量高于其他兩組，但21 d卻低于其他兩組。BMSCs經過成軟骨誘導分化，細胞形態由梭形或紡錘形變成橢圓形或圓形，逐漸呈現出類軟骨細胞樣的形態[16]。經甲苯胺藍染色，細胞外基質可被染成淡藍色，細胞核深染；且軟骨細胞外基質合成越多，染色結果越趨向深藍色[8]。當軟骨細胞發生肥大或凋亡時可表達AnnexinⅤ，經AnnexinⅤ-cy3免疫熒光染色在熒光顯微鏡下可呈紅色熒光，且紅光越強，表示AnnexinⅤ表達越多[8]。所以AnnexinⅤ不僅反映細胞凋亡水平，在軟骨組織中也是軟骨細胞肥大和老化的標志[8]。細胞爬片AnnexinⅤ-cy3染色結果顯示，IHH基因腺病毒轉染組有較強紅色熒光表達，說明IHH基因腺病毒轉染組誘導后軟骨細胞肥大或老化嚴重。
以上結果表明，在傳統二維細胞培養、誘導模式下，IHH基因雖然在誘導分化早期利于軟骨分化進程，但同時亦促進軟骨肥大老化，甚至凋亡。分析原因可能是，正常情況下IHH-PTH/PTHrP軸可正向促進PTH及PTHrP的分泌，后者與其受體結合后可加快軟骨細胞的增殖；當有軟骨內成骨信號通路如Wnt/β-catienine等存在時，軟骨細胞隨即向成骨方向發展，或者老化和凋亡；而當IHH信號高表達時會加速軟骨內成骨的進程，使快速增殖的軟骨細胞出現分化、老化，甚至是凋亡[8]。本研究中，傳統1組在誘導分化前期軟骨相關基因及軟骨標志蛋白的表達均優于其他兩組，而在后期卻明顯低于其他兩組，也說明了這個問題。此外，傳統1組高表達AnnexinⅤ紅色熒光蛋白，也提示軟骨細胞出現了老化。Fischer等[17]研究發現，間斷性的PTHrP蛋白刺激可促進MSCs成軟骨細胞分化，軟骨相關的Ⅱ型膠原及ANCN表達明顯增多，但持續的PTHrP蛋白刺激卻可抑制軟骨形成，且軟骨肥大相關標志基因、蛋白無表達增加。這也從另一方面說明，IHH基因轉染后過多的IHH/PTHrP信號積累可能加速了BMSCs至軟骨形成，再到軟骨成熟和肥大及軟骨內成骨的過程。
此外，在BMSCs誘導分化過程中Ⅹ型膠原及ALP基因表達增加，且傳統1組明顯高于其他兩組。說明IHH信號的增加觸發了軟骨肥大或成骨相關基因及信號通路的激活，后者可導致軟骨細胞外的Ⅱ型膠原逐漸變成成骨細胞相關的Ⅹ型膠原，亦可促進ALP的分泌。本研究結果發現，傳統1組在誘導分化過程中ALP表達增多且均高于其他兩組，也反映了相關信號通路的激活。當cAMP/PKA途徑活化劑Forskolin存在時，可有效復制持續性PTHrP刺激時對MSCs成軟骨分化的抑制作用及對軟骨細胞肥大成熟和肥大的促進作用[17]，這說明cAMP/PKA途徑在該過程中發揮重要的中介信號調控作用。
RCCS是一種新型細胞培養生物反應器，由于其可以模擬體內組織細胞生長的微重力環境，因此在軟骨組織工程研究中日益受到重視。RCCS中細胞黏附在三維支架材料上并可隨著基座的旋轉而自由轉動。這可使培養物在水平軸上建立類似均質液體的懸浮軌道，使重力向量持續隨機分布，因此培養物可維持在連續的自由落體狀態有利于細胞聚集，從而加強細胞之間及細胞與基質間的聯系。后者可通過激活SIRT1增強SOX9轉錄，從而增加下游靶基因Ⅱ型膠原的表達[12, 18]。RCCS細胞培養容器具備硅膠換氣膜，可使細胞或組織得到充分的氣體交換。正是這種高效的細胞內外及細胞間物質傳遞效率，使細胞具有較強的增殖和分化能力[10, 19]。此外，RCCS還可提供一定的力學刺激，如剪切力、流體靜壓力、聯合壓縮力等類似機體的微環境，使細胞在支架材料上分布更加均勻，后者有利于營養物質的吸收和代謝產物的排除，從而促進軟骨細胞的增殖分化和基質合成。Cytodex 3是一種球形的細胞培養微載體，直徑25～30μm，其表面包裹著一層膠原蛋白，非常有利于BMSCs黏附。BMSCs貼壁生長于Cytodex 3表面并懸浮于培養基中，增加了細胞與培養基的接觸面積，從而有利于細胞的代謝與生長。我們將兔BMSCs接種至微載體上并在RCCS中培養進行誘導成軟骨分化。結果發現，在RCCS誘導條件下IHH基因腺病毒轉染對BMSCs成軟骨分化的影響不同于傳統模式。表現為在誘導分化過程中，軟骨相關基因Ⅱ型膠原、ANCN、SOX9及相關蛋白的表達逐漸增加，RCCS 1組明顯高于RCCS 2、3組；而軟骨肥大相關標志物的表達水平均較低，各組之間無明顯差異。表明在RCCS誘導條件下。IHH基因過表達可促進BMSCs成軟骨分化，且能有效抑制軟骨細胞肥大。
對于上述結果出現的原因，除了RCCS條件下高效的營養物質傳輸及代謝廢物排除等因素，也可能與一些特殊信號通路的激活有關。RCCS可給予培養物一定的生物力學刺激，這種刺激能介導相關信號通路的改變，從而對BMSCs成軟骨分化產生一定影響。多能干細胞在一定力學刺激下，SOX9、Runx2、p38 MAPK等表達水平增加，這些與軟骨的合成密切相關[20]。整合素（Integrin）、細胞骨架、MAPK信號通路等是細胞接受和傳導力學信號最重要的途徑之一。Integrin能夠感受胞外力學信號后，將其轉化為化學信號并整合成胞內信號，再通過細胞骨架、MAPK等信號通路調節一系列細胞生物學行為[21]。有研究發現[22-23]，在微重力作用下MSCs中Integrinβ1表達增加，但其下游信號FAK及PYK2等表達顯著降低；此外，Ras、ERK的磷酸化也受到抑制，而磷酸化的ERK可直接調節Runx2的轉錄，Runx2與MSCs成骨分化有密切聯系。因此，微重力效應下FAK、PYK2等分子磷酸化水平的降低，以及MAPK/ERK信號通路的紊亂，也許能抑制MSCs向軟骨細胞分化后進一步發展為成骨細胞。此外，BMP、TGF-β、p38及Wnt/β-catenin等信號也可能參與微重力環境下BMSCs成軟骨細胞分化后的調控。實驗中成骨相關基因Ⅹ型膠原及ALP表達水平較低，且各組細胞培養上清液中ALP活性也較低，可能與BMSCs分化成軟骨后進一步向成骨細胞分化受到抑制相關。但具體的信號調控機制仍需進一步探索。
綜上述，體外可成功構建兔IHH基因腺病毒載體，后者可高效轉染兔BMSCs并過表達兔IHH蛋白。在傳統細胞培養、誘導條件下，IHH基因腺病毒轉染BMSCs在誘導分化早期可促進軟骨合成，但隨即亦可導致軟骨肥大老化或向成骨方向分化。而在RCCS培養、誘導條件下，IHH基因腺病毒轉染BMSCs可有效促進軟骨合成并抑制軟骨老化或向成骨發展，適合軟骨組織工程的需要。
