引用本文： 張逸凌, 劉星宇, 季欣然, 張立海, 唐佩福. 雙光子顯微鏡活體脊髓成像的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(6): 772-775. doi: 10.7507/1002-1892.20160157 復制
目前，雙光子顯微鏡（two-photon microscopy，TPM）已廣泛應用于神經科學領域。通過結合特定細胞類型表達熒光蛋白的轉基因動物模型，TPM能在長時間內對活體動物神經系統進行多次三維結構與功能的動態成像[1-2]。與彌散張量成像與MRI成像技術相比，TPM活體成像技術能在時間與空間上提供細胞水平的高分辨率三維重構圖像，有利于研究神經元的突觸可塑性以及神經細胞與膠質細胞的相互作用關系[3-7]，更直觀地提供脊髓損傷的病理生理過程與評估藥物干預的治療效果。本文就近年來TPM活體脊髓成像的研究進展進行綜述。
1 TPM活體成像技術的發展
20世紀90年代，美國康奈爾大學科學家Winfried Denk將雙光子激發技術與激光掃描共聚焦顯微鏡相結合，研發出了TPM[8]。TPM對生物樣品成像具備光漂白性小、光毒性小、穿透性強等優點，一經問世即很快應用于活體動物神經科學領域的研究中。TPM尤其適用于對小型動物模型（如斑馬魚、果蠅、小鼠、大鼠）進行活體成像，實現了更深層次、低激光、低熱損傷、高信噪比的活體成像，能對同一動物在長時間內進行反復多次動態成像[9-13]。為了研究中樞神經系統突觸的可塑性，Grutzendler等[14]應用TPM對轉基因小鼠的大腦皮層進行長時間結構成像，發現樹突棘在發育過程中保持著高度穩定性。在TPM成像過程中，應用磨薄顱骨技術對小鼠大腦皮層進行活體成像，能有效降低因開顱手術造成的出血與炎性反應，避免暴露大腦組織，進而研究大腦皮層樹突棘在生理條件下的穩定性與可塑性[15]。TPM活體成像技術的發展，為研究神經疾病細胞水平結構與功能的變化開辟了新途徑。
2 TPM活體脊髓成像技術的發展
Kerschensteiner等[16]應用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記神經細胞的轉基因小鼠，對單根軸突進行針刺損傷后，采用TPM持續觀察活體內單根軸突的退變與瓦勒變性的動態過程，此研究開辟了TPM活體脊髓成像的新領域。不同于大腦皮層與顱骨固定術，固定脊柱與脊髓是活體成像的一大難點；并且脊髓位于軀體深部，動物的呼吸與心跳對脊髓帶來的活動會嚴重影響TPM活體脊髓成像的質量，斷層掃描圖片需經過復雜的后期處理與重建才能得到清晰圖片[17]。Davalos等[18]應用小鼠懸吊與脊柱鉗夾固定法，有效降低了呼吸與心跳給成像帶來的干擾，使成像質量更加穩定。
為了對小鼠同一脊髓區域進行多次TPM成像，每次成像完畢后，需要縫合小鼠背部肌肉與皮膚，下次成像時再打開皮膚和肌肉，重新暴露脊髓節段[19]。這種重復手術雖然操作簡便，但也存在很多問題，如增加動物感染風險，造成脊髓局部損傷，激活脊髓局部的免疫反應，對動物造成長期疼痛。這些問題都會對動物TPM活體脊髓成像造成很大干擾，因此研發出一種長期的活體內動態成像觀察窗口意義重大。Farrar等[20] 發明了一種小鼠脊柱脊髓固定觀察裝置，通過將觀察窗口植入小鼠腰段脊柱，在暴露的脊髓節段上涂生物硅膠，用玻璃片封閉裝置，從而使小鼠能夠長期攜帶觀察裝置生存，每次成像時將小鼠麻醉后放入外固定架上即可，避免了重復手術對成像帶來的干擾。此項發明開辟了長期TPM活體脊髓成像的新途徑。隨著長期觀察窗口理念的提出，各種改進的觀察窗口相繼出現，更有利于應用TPM對活體脊髓進行長時間動態觀察[21-22]。
3 TPM活體軸突與髓鞘成像
脊髓損傷后軸突的再生與功能重建一直是神經科學領域研究的熱點與難點。當前基于脊髓損傷的研究主要應用各種離體手段，如使用生物素葡聚糖胺順行示蹤技術標記皮質脊髓束軸突和免疫組織化學方法標記軸突，這些方法需要處死動物提取脊髓組織進行染色[23-25]，無法提供脊髓損傷后軸突在活體內的動態變化信息。黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）H-line小鼠是一種神經系統特異性表達YFP的轉基因小鼠，其神經細胞的胞體、樹突、軸突特異性表達YFP，非神經細胞不表達YFP[26]，是應用TPM進行活體軸突成像的理想動物模型。對YFP H-line小鼠背側脊髓進行軸突橫斷損傷后，可應用TPM在損傷后不同時間點對單根軸突的再生過程進行持續成像，研究脊髓背側感覺神經再生的動態過程[27-28]。近期TPM活體軸突成像研究報道，在脊髓損傷后3 d內軸突會發生進行性退變與壞死，使用甲潑尼龍沖擊治療能有效緩解軸突的進行性退變，減少脊髓繼發性損傷[29-30]。
髓鞘是包繞在軸突周圍的管狀外膜，在神經電沖動的傳導過程中起著絕緣與加快動作電位傳導等作用，當髓鞘受損或畸形時，常引發多發性硬化癥等疾病，導致患者出現神經功能障礙甚至癱瘓[31]。Micu等[32]應用鈣離子指示劑X-rohod-1染料標記脊髓背側感覺神經纖維的髓鞘，以TPM對髓鞘進行成像。Condie等[33]應用CIC（Case Imaging Compound） 熒光染料選擇性標記YFP H-line小鼠脊髓中的髓鞘，以TPM同時對軸突和髓鞘進行活體共定位成像。這些TPM活體軸突與髓鞘成像研究能夠提供軸突損傷后退變與再生的動態過程，為理解脊髓損傷后軸突變化的病理生理過程奠定基礎。
4 TPM活體小膠質細胞成像
小膠質細胞是中樞神經系統內廣泛分布的巨噬細胞，它起著監控、保護、營養支持等重要作用[34-35]。CX3CR1GFP/+小鼠是一種巨噬細胞與小膠質細胞特異性表達GFP的轉基因熒光小鼠，是應用TPM進行活體小膠質細胞成像的理想動物模型[36]。當脊髓損傷后數分鐘內，應用TPM能夠觀察到小膠質細胞迅速包圍損傷點周圍，通過NO信號通路調控途徑，小膠質細胞的形態從靜息狀態下的分支桿狀變成激活狀態下的阿米巴狀[37]。中樞神經系統損傷后，應用TPM對小膠質細胞進行活體成像，能直接觀察到小膠質細胞在損傷周圍的增殖過程，而小膠質細胞大多來源于中樞神經系統中增殖的小膠質細胞，而非血源性巨噬細胞，這為理解小膠質細胞的來源奠定了基礎[38]。CX3CR1GFP/+小鼠與YFP小鼠雜交繁育后獲得的新型CX3CR1GFP/+/YFP轉基因小鼠，能同時在脊髓中表達GFP標記的小膠質細胞與YFP標記的軸突，應用TPM活體脊髓成像技術能研究脊髓損傷后軸突的退變與小膠質細胞激活的相互作用[39]。研究表明血源性巨噬細胞主要參與脊髓損傷后軸突退變，而中樞神經系統中增殖的小膠質細胞并不促進軸突的退變與壞死[40]。這些TPM活體小膠質細胞成像研究闡明了脊髓損傷后小膠質細胞的病理生理動態過程，以及與軸突退變與再生的相互關系。
5 TPM活體鈣離子成像
對于脊髓內神經元功能的研究，既往主要應用膜片鉗與神經電生理檢測等手段。膜片鉗技術需要提取動物的脊髓組織，切成薄片后浸沒在溶液中進行記錄[41]。這種方法雖然能精確記錄單個神經元的功能活性，但是離體的脊髓薄片不能完全反映活體內脊髓神經元的真實功能。神經電生理技術雖然能反映活體內神經元的功能活性，但無法精確定位于單個神經元[42]。隨著鈣離子指示蛋白與GCaMP轉基因小鼠的問世，越來越多的研究團隊應用TPM對中樞神經系統內神經元和樹突進行鈣離子活體成像，研究神經元的功能活性以及突觸的可塑性[43-46]。 TPM活體鈣離子成像的優勢在于既能反映活體內神經元的功能活性，又能精確定位單個神經元和周圍神經網絡的聯系，是研究活體內神經元功能與突觸可塑性的理想技術手段。
Johannssen等[47-48] 應用顯微注射儀將微量鈣離子指示染料OGB-1注入小鼠腰段脊髓背角，標記脊髓背角的中間神經元，應用TPM觀察脊髓背角單個神經元在靜息狀態下與電刺激狀態下的功能活性，研究背角感覺神經元的病理生理機制；然而這種鈣離子指示染料只能在體內持續數小時，無法長時間對鈣離子活性進行活體成像研究。Nishida等[49]應用電轉技術將鈣離子指示質粒注入孕12.5 d的ICR鼠子宮內胎鼠脊髓中，當小鼠成年后，鈣離子指示蛋白可長期表達于顯微注射的脊髓局部，通過TPM能夠長期研究脊髓背角神經元的功能，以及各種痛覺刺激傳導對脊髓背角神經元的影響及作用機制；然而這種轉染方法的成功率與熒光蛋白表達量都不太穩定。隨著鈣離子指示蛋白GCaMP6s的問世，可通過腺相關病毒包裝GCaMP6s，采用顯微注射技術將AAV-Syn-GCaMP6s注入成年動物中樞神經系統中，待病毒轉染后，GCaMP6s能夠持續表達于神經元中長達數月[50]，聯合應用TPM能實現長期活體內脊髓鈣離子功能的持續成像，為研究活體脊髓病理生理情況下的神經元鈣離子活性與神經網絡功能聯系開辟了新的方法。
6 總結與展望
TPM與轉基因熒光小鼠的結合能夠提供脊髓活體內細胞動態變化的過程，但仍有許多局限性：① 雙光子激光對活體組織的穿透能力有限，觀察深度僅限于脊髓背側的神經纖維與背角神經元，目前尚無相關脊髓腹側神經纖維與前角神經元的TPM活體成像研究報道；② 出血與軟組織再生對TPM活體成像技術的影響較大，特別是重復手術造成的損傷與炎性反應加大了TPM成像難度；③ TPM需要結合轉基因動物或熒光標記細胞進行活體成像，對于未帶熒光標記的細胞和相應的轉基因動物無法成像。然而TPM活體脊髓成像技術對于研究脊髓損傷后神經的再生模式，神經干細胞移植后體內的增殖、遷移、分化過程，以及在體內分化為神經細胞后與宿主神經網絡之間的聯系有獨到優勢。隨著轉基因技術的發展與多光子激光體系的推出，越來越多的細胞亞型有望應用于TPM活體成像領域，多光子激光系統對活體組織的穿透能力逐漸加強，成像深度逐漸加大，這些都有利于闡釋脊髓損傷的病理生理過程以及神經再生與功能重建的作用機制，為將來的臨床應用奠定基礎。
目前，雙光子顯微鏡（two-photon microscopy，TPM）已廣泛應用于神經科學領域。通過結合特定細胞類型表達熒光蛋白的轉基因動物模型，TPM能在長時間內對活體動物神經系統進行多次三維結構與功能的動態成像[1-2]。與彌散張量成像與MRI成像技術相比，TPM活體成像技術能在時間與空間上提供細胞水平的高分辨率三維重構圖像，有利于研究神經元的突觸可塑性以及神經細胞與膠質細胞的相互作用關系[3-7]，更直觀地提供脊髓損傷的病理生理過程與評估藥物干預的治療效果。本文就近年來TPM活體脊髓成像的研究進展進行綜述。
1 TPM活體成像技術的發展
20世紀90年代，美國康奈爾大學科學家Winfried Denk將雙光子激發技術與激光掃描共聚焦顯微鏡相結合，研發出了TPM[8]。TPM對生物樣品成像具備光漂白性小、光毒性小、穿透性強等優點，一經問世即很快應用于活體動物神經科學領域的研究中。TPM尤其適用于對小型動物模型（如斑馬魚、果蠅、小鼠、大鼠）進行活體成像，實現了更深層次、低激光、低熱損傷、高信噪比的活體成像，能對同一動物在長時間內進行反復多次動態成像[9-13]。為了研究中樞神經系統突觸的可塑性，Grutzendler等[14]應用TPM對轉基因小鼠的大腦皮層進行長時間結構成像，發現樹突棘在發育過程中保持著高度穩定性。在TPM成像過程中，應用磨薄顱骨技術對小鼠大腦皮層進行活體成像，能有效降低因開顱手術造成的出血與炎性反應，避免暴露大腦組織，進而研究大腦皮層樹突棘在生理條件下的穩定性與可塑性[15]。TPM活體成像技術的發展，為研究神經疾病細胞水平結構與功能的變化開辟了新途徑。
2 TPM活體脊髓成像技術的發展
Kerschensteiner等[16]應用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記神經細胞的轉基因小鼠，對單根軸突進行針刺損傷后，采用TPM持續觀察活體內單根軸突的退變與瓦勒變性的動態過程，此研究開辟了TPM活體脊髓成像的新領域。不同于大腦皮層與顱骨固定術，固定脊柱與脊髓是活體成像的一大難點；并且脊髓位于軀體深部，動物的呼吸與心跳對脊髓帶來的活動會嚴重影響TPM活體脊髓成像的質量，斷層掃描圖片需經過復雜的后期處理與重建才能得到清晰圖片[17]。Davalos等[18]應用小鼠懸吊與脊柱鉗夾固定法，有效降低了呼吸與心跳給成像帶來的干擾，使成像質量更加穩定。
為了對小鼠同一脊髓區域進行多次TPM成像，每次成像完畢后，需要縫合小鼠背部肌肉與皮膚，下次成像時再打開皮膚和肌肉，重新暴露脊髓節段[19]。這種重復手術雖然操作簡便，但也存在很多問題，如增加動物感染風險，造成脊髓局部損傷，激活脊髓局部的免疫反應，對動物造成長期疼痛。這些問題都會對動物TPM活體脊髓成像造成很大干擾，因此研發出一種長期的活體內動態成像觀察窗口意義重大。Farrar等[20] 發明了一種小鼠脊柱脊髓固定觀察裝置，通過將觀察窗口植入小鼠腰段脊柱，在暴露的脊髓節段上涂生物硅膠，用玻璃片封閉裝置，從而使小鼠能夠長期攜帶觀察裝置生存，每次成像時將小鼠麻醉后放入外固定架上即可，避免了重復手術對成像帶來的干擾。此項發明開辟了長期TPM活體脊髓成像的新途徑。隨著長期觀察窗口理念的提出，各種改進的觀察窗口相繼出現，更有利于應用TPM對活體脊髓進行長時間動態觀察[21-22]。
3 TPM活體軸突與髓鞘成像
脊髓損傷后軸突的再生與功能重建一直是神經科學領域研究的熱點與難點。當前基于脊髓損傷的研究主要應用各種離體手段，如使用生物素葡聚糖胺順行示蹤技術標記皮質脊髓束軸突和免疫組織化學方法標記軸突，這些方法需要處死動物提取脊髓組織進行染色[23-25]，無法提供脊髓損傷后軸突在活體內的動態變化信息。黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）H-line小鼠是一種神經系統特異性表達YFP的轉基因小鼠，其神經細胞的胞體、樹突、軸突特異性表達YFP，非神經細胞不表達YFP[26]，是應用TPM進行活體軸突成像的理想動物模型。對YFP H-line小鼠背側脊髓進行軸突橫斷損傷后，可應用TPM在損傷后不同時間點對單根軸突的再生過程進行持續成像，研究脊髓背側感覺神經再生的動態過程[27-28]。近期TPM活體軸突成像研究報道，在脊髓損傷后3 d內軸突會發生進行性退變與壞死，使用甲潑尼龍沖擊治療能有效緩解軸突的進行性退變，減少脊髓繼發性損傷[29-30]。
髓鞘是包繞在軸突周圍的管狀外膜，在神經電沖動的傳導過程中起著絕緣與加快動作電位傳導等作用，當髓鞘受損或畸形時，常引發多發性硬化癥等疾病，導致患者出現神經功能障礙甚至癱瘓[31]。Micu等[32]應用鈣離子指示劑X-rohod-1染料標記脊髓背側感覺神經纖維的髓鞘，以TPM對髓鞘進行成像。Condie等[33]應用CIC（Case Imaging Compound） 熒光染料選擇性標記YFP H-line小鼠脊髓中的髓鞘，以TPM同時對軸突和髓鞘進行活體共定位成像。這些TPM活體軸突與髓鞘成像研究能夠提供軸突損傷后退變與再生的動態過程，為理解脊髓損傷后軸突變化的病理生理過程奠定基礎。
4 TPM活體小膠質細胞成像
小膠質細胞是中樞神經系統內廣泛分布的巨噬細胞，它起著監控、保護、營養支持等重要作用[34-35]。CX3CR1GFP/+小鼠是一種巨噬細胞與小膠質細胞特異性表達GFP的轉基因熒光小鼠，是應用TPM進行活體小膠質細胞成像的理想動物模型[36]。當脊髓損傷后數分鐘內，應用TPM能夠觀察到小膠質細胞迅速包圍損傷點周圍，通過NO信號通路調控途徑，小膠質細胞的形態從靜息狀態下的分支桿狀變成激活狀態下的阿米巴狀[37]。中樞神經系統損傷后，應用TPM對小膠質細胞進行活體成像，能直接觀察到小膠質細胞在損傷周圍的增殖過程，而小膠質細胞大多來源于中樞神經系統中增殖的小膠質細胞，而非血源性巨噬細胞，這為理解小膠質細胞的來源奠定了基礎[38]。CX3CR1GFP/+小鼠與YFP小鼠雜交繁育后獲得的新型CX3CR1GFP/+/YFP轉基因小鼠，能同時在脊髓中表達GFP標記的小膠質細胞與YFP標記的軸突，應用TPM活體脊髓成像技術能研究脊髓損傷后軸突的退變與小膠質細胞激活的相互作用[39]。研究表明血源性巨噬細胞主要參與脊髓損傷后軸突退變，而中樞神經系統中增殖的小膠質細胞并不促進軸突的退變與壞死[40]。這些TPM活體小膠質細胞成像研究闡明了脊髓損傷后小膠質細胞的病理生理動態過程，以及與軸突退變與再生的相互關系。
5 TPM活體鈣離子成像
對于脊髓內神經元功能的研究，既往主要應用膜片鉗與神經電生理檢測等手段。膜片鉗技術需要提取動物的脊髓組織，切成薄片后浸沒在溶液中進行記錄[41]。這種方法雖然能精確記錄單個神經元的功能活性，但是離體的脊髓薄片不能完全反映活體內脊髓神經元的真實功能。神經電生理技術雖然能反映活體內神經元的功能活性，但無法精確定位于單個神經元[42]。隨著鈣離子指示蛋白與GCaMP轉基因小鼠的問世，越來越多的研究團隊應用TPM對中樞神經系統內神經元和樹突進行鈣離子活體成像，研究神經元的功能活性以及突觸的可塑性[43-46]。 TPM活體鈣離子成像的優勢在于既能反映活體內神經元的功能活性，又能精確定位單個神經元和周圍神經網絡的聯系，是研究活體內神經元功能與突觸可塑性的理想技術手段。
Johannssen等[47-48] 應用顯微注射儀將微量鈣離子指示染料OGB-1注入小鼠腰段脊髓背角，標記脊髓背角的中間神經元，應用TPM觀察脊髓背角單個神經元在靜息狀態下與電刺激狀態下的功能活性，研究背角感覺神經元的病理生理機制；然而這種鈣離子指示染料只能在體內持續數小時，無法長時間對鈣離子活性進行活體成像研究。Nishida等[49]應用電轉技術將鈣離子指示質粒注入孕12.5 d的ICR鼠子宮內胎鼠脊髓中，當小鼠成年后，鈣離子指示蛋白可長期表達于顯微注射的脊髓局部，通過TPM能夠長期研究脊髓背角神經元的功能，以及各種痛覺刺激傳導對脊髓背角神經元的影響及作用機制；然而這種轉染方法的成功率與熒光蛋白表達量都不太穩定。隨著鈣離子指示蛋白GCaMP6s的問世，可通過腺相關病毒包裝GCaMP6s，采用顯微注射技術將AAV-Syn-GCaMP6s注入成年動物中樞神經系統中，待病毒轉染后，GCaMP6s能夠持續表達于神經元中長達數月[50]，聯合應用TPM能實現長期活體內脊髓鈣離子功能的持續成像，為研究活體脊髓病理生理情況下的神經元鈣離子活性與神經網絡功能聯系開辟了新的方法。
6 總結與展望
TPM與轉基因熒光小鼠的結合能夠提供脊髓活體內細胞動態變化的過程，但仍有許多局限性：① 雙光子激光對活體組織的穿透能力有限，觀察深度僅限于脊髓背側的神經纖維與背角神經元，目前尚無相關脊髓腹側神經纖維與前角神經元的TPM活體成像研究報道；② 出血與軟組織再生對TPM活體成像技術的影響較大，特別是重復手術造成的損傷與炎性反應加大了TPM成像難度；③ TPM需要結合轉基因動物或熒光標記細胞進行活體成像，對于未帶熒光標記的細胞和相應的轉基因動物無法成像。然而TPM活體脊髓成像技術對于研究脊髓損傷后神經的再生模式，神經干細胞移植后體內的增殖、遷移、分化過程，以及在體內分化為神經細胞后與宿主神經網絡之間的聯系有獨到優勢。隨著轉基因技術的發展與多光子激光體系的推出，越來越多的細胞亞型有望應用于TPM活體成像領域，多光子激光系統對活體組織的穿透能力逐漸加強，成像深度逐漸加大，這些都有利于闡釋脊髓損傷的病理生理過程以及神經再生與功能重建的作用機制，為將來的臨床應用奠定基礎。