引用本文： 梁嘉碧, 李俊, 汪婷, 梁雨虹, 鄒學農, 周光前, 周治宇. 原位交聯透明質酸水凝膠的制備及體外生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(6): 767-771. doi: 10.7507/1002-1892.20160156 復制
原位交聯水凝膠是一類以溶液狀態給藥后，能在用藥部位發生相轉變，由液態轉化形成半固體凝膠的制劑。將這類材料應用于微創手術中，不僅能最大限度減輕患者痛苦與瘢痕形成，還能降低手術費用、縮短治療時間[1-5]。透明質酸鈉具有良好的理化性能及生物相容性[6-10]，目前已廣泛用于心臟瓣膜、軟骨、神經、角膜及皮膚的修復重建 [11-13]。但它在體內因受到透明質酸酶的酶解作用而降解迅速，存留時間較短。研究表明，透明質酸鈉經交聯劑交聯修飾后可得到高分子凝膠，能彌補這一缺點，同時仍具有良好的生物相容性[14-15]。
本研究擬將巰基化修飾后的透明質酸與交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol acrylate，PEGDA）交聯，制備一種交聯時間可控、存留時間長、細胞毒性低、生物相容性好，且無需任何特殊條件架。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
透明質酸（相對分子質量300 000；華熙福瑞達生物醫藥有限公司）；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG；相對分子質量3 500）、3，3-二巰基二丙酸酰肼[dithiobis (propanoic dihydrazide)，DTP]、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、EDCI （Sigma公司，美國）；1640培養基、FBS（HyClone公司，美國）；活/死細胞染色試劑盒（BioVision公司，美國）；金屬鈉（天津大茂化學試劑廠）。
傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet公司，美國）；核磁共振光譜儀（Bruker Daltonics公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Thermo公司，芬蘭）；培養箱（Thermo公司，美國）；熒光顯微鏡（Zeiss公司，德國）。
1.2 原位交聯透明質酸水凝膠的制備
1.2.1 PEGDA制備與檢測
取PEG 17.5 g加入250?mL二氯甲烷，通氬氣10 min，磁力攪拌，40℃水浴加熱，分2次投入金屬鈉共0.5 g、反應6 h，加入丙烯酰氯3 mL、反應18 h，過濾，濾液旋轉蒸發3 h，真空干燥24 h，獲得PEGDA。
采用傅里葉變換紅外光譜儀檢測PEGDA結構，掃描波數范圍為400～4 000 cm-1。核磁共振光譜儀測試PEGDA結構，掃描范圍為0～10 ppm。
1.2.2 巰基化透明質酸（hyaluronic acid thiolation，HA-SH）制備與檢測
取2 g透明質酸加入200 mL滅菌三蒸水中，攪拌溶解，加入2.38 g巰基化試劑DTP，鹽酸調節pH值至4.75，加入1.92 g EDCI，攪拌24 h，NaOH調節pH值至7.0，加入DTT 10 g，NaOH調節pH值至8.5，攪拌24 h，鹽酸調節pH值至3.5，裝入相對分子質量為3?500的透析袋，分別在100?mmol/L NaCl（pH3.5）和滅菌三蒸水（pH3.5）中透析，以離心半徑13.5 cm、2 500 r/min 離心5 min，取上清液冷凍干燥，獲得HA-SH。
HA-SH由重復二糖結構組成，每個二糖單元含有一個可反應的羧基，接上巰基后的相對分子質量為491。稱取HA-SH 0.005 3 g，配制成0.05 L溶液，若羧基全部被取代，內含巰基量（N總）約為10.8?μmol（0.005?3?g/491）。采用Ellman法[16]測定制備的HA-SH中巰基含量（N測），計算羧基覆蓋率（N測/N總×100%），即巰基化產率。
1.2.3 交聯反應
將HA-SH和PEGDA分別用PBS（pH7.4）配制成一定濃度（W/V）的溶液，用0.22 μm濾膜過濾滅菌，按5種不同比例混合（表 1），渦旋5?s，放置于37℃水浴中，定時觀察成膠情況；從兩種溶液混合開始計時，記錄交聯反應時間。每個濃度平行配制3份樣品。
表1
原位交聯透明質酸水凝膠的組成及交聯時間測定（n=3）
Table1.
Composition and crosslinking time of the in situ crosslinking hyaluronic acid hydrogels(n=3)
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞毒性檢測
① 浸提液制備：取1.5%HA-SH及4%PEGDA交聯獲得的透明質酸水凝膠0.1?g，加入1 mL含10%FBS的1640培養基浸提24?h。② 細胞分組培養：實驗分為4組，分別為水凝膠組（實驗組）、生理鹽水組（陰性對照組）、DMSO組（陽性對照組）以及未處理組（空白對照組）。取L929細胞（HyClone公司，美國），調整至濃度為4×104 個 /100?μL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100?μL，每組3 個復孔。待細胞融合達95%時，按照分組分別加入浸提液、含10%FBS的1640培養基、DMSO溶液或生理鹽水（表 2）。于37°C、5%CO2培養箱中培養24 h。③ 細胞毒性檢測：參照ISO10993.5醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗的方法與要求對產品進行毒性評價。培養24 h后各組取3孔，棄上清，每孔加入100?μL含10%FBS的1640培養基和20?μL MTS試劑，混勻，置于培養箱孵育2?h，于酶標儀測定490 nm處吸光度（A）值。按照以下公式分別計算實驗組、陰性對照組、陽性對照組細胞相對增殖率，細胞相對增殖率 =實驗組、陰性對照組或陽性對照組A值/空白對照組A值×100%。材料毒性分級標準：細胞相對增殖率≥ 90%為0級，70%～90%為1級，50%～70%為2級，30%～50%為3級，0～30%為4級。
表2
各組培養試劑成分（μL）
Table2.
Ingredients of nutrient solution(μL)
1.3.2 生物相容性檢測
取HA-SH和PEGDA分別用DMEM/F12培養基配制成濃度為1.5% （W/V）和4%（W/V）的溶液，濾膜過濾滅菌，混合后渦旋5?s，加入人BMSCs（本實驗室自制），混勻，調整細胞懸液濃度為2×106 個 / mL，接種于24孔板中，每孔100?μL，于37°C、5%CO2 培養箱中培養。培養72 h后，采用活/死細胞染色試劑進行染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態及生長黏附情況，細胞質呈綠染為活細胞、紅染為死細胞。
2 結果
2.1 PEGDA及HA-SH檢測
傅里葉變換紅外光譜儀分析顯示，PEGDA在3?500?cm-1表征羥基的特征峰明顯減弱，而在1?700?cm-1左右出現丙烯酸酯的羰基特征峰，提示大多數羥基被丙烯酸酯基取代。見圖 1。
圖1
PEGDA的紅外吸收光譜圖 圖 2 PEGDA的核磁共振氫譜圖 圖 3 1.5%HA-SH與4%PEGDA交聯形成的透明質酸水凝膠外觀 圖 4 培養72 h熒光顯微鏡觀察BMSCs形態 ? ×40 ? ×100 ? ×200 圖 5 培養72 h人BMSCs活/死細胞染色觀察（熒光顯微鏡× 100）
Figure1.
Fourier transformation infrared spectrometer of PEGDA Fig. 2 1H nuclear magnetic resonance spectrometer of PEGDA Fig. 3 The appearance of the hydrogel crosslinking by 1.5%HA-SH and 4%PEGDA Fig. 4 Morphology observation of hBMSCs under fluorescence microscopy at 72?hours ? ×40 ? ×100 ? ×200 Fig. 5 hBMSCs viability observation by live/dead cell staining at 72 hours (Fluorescence microscopy×100)
核磁共振光譜儀分析顯示，PEGDA的核磁共振氫譜在5～7?ppm出現3組表征丙烯酸酯基的與烯鍵相連的氫的特征峰。見圖 2。HA-SH的巰基化產率為65.4%。
2.2 交聯反應時間及大體觀察
2%～6%PEGDA與0.5%～1.5%HA-SH經不同比例混合后，交聯反應在2～70 min內完成。見表 1。大體觀察示，不同濃度及比例交聯形成的透明質酸水凝膠均呈透明狀。見圖 3。
2.3 細胞毒性檢測
實驗組、陰性對照組及陽性對照組細胞相對增殖率分別為87.08%±2.35%、97.92%±3.55%及8.33%± 1.03%，細胞毒性分級分別為1級、0級和4級。提示制備的透明質酸水凝膠材料細胞毒性分級滿足生物醫用材料的要求。
2.4 生物相容性檢測
培養72 h后，熒光顯微鏡下觀察人BMSCs在透明質酸水凝膠中生長狀態穩定，形態良好，輪廓清晰，分布均勻。活/死細胞染色示以綠染的活細胞為主，只有極少數紅染的死細胞。見圖 4、5。
3 討論
化學交聯一般通過縮聚反應和加聚反應來實現，如橡膠的硫化、不飽和聚酯樹脂的固化等。本研究將透明質酸進行巰基化后，與PEGDA進行交聯形成透明狀水凝膠，交聯過程不需要特殊環境與條件，也不需要特殊設備。通過調整HA-SH和PEGDA的配比，材料可控制在2～70 min內發生相轉變。
PEGDA的合成分為“醇-酸”法、“醇-酰氯”法和“醇鈉-酰氯”法[17-20]。其中“醇-酸”法使用較多，其優點是原料易獲得、反應體系簡單、副反應少，并且反應不受氧氣和水分的影響。但這一反應中PEG的端羥基活性較低，隨著相對分子質量增大，端羥基轉化程度降低，因此僅適用于相對分子質量小的PEGDA合成。由于丙烯酰氯的反應活性較高，“醇-酰氯”法反應速度較“醇-酸”法有所提高，在室溫下即可進行，但該方法仍不宜合成相對分子質量過大的PEGDA。“醇鈉-酰氯”法在前兩種方法基礎上進一步改進，其反應速度更快，且可用于相對分子質量更大的PEGDA合成。本研究選擇“醇鈉-酰氯”法合成的PEGDA相對分子質量達3 500。實驗過程中需要注意，丙烯酰氯易受水分影響，故實驗裝置必須嚴格控水，所有容器烘干，與外界相連的部分需加干燥管，內填充無水氯化鈣。另外，金屬鈉暴露于空氣中會迅速氧化，并在金屬塊表面形成氧化鈉，影響反應進程，故反應裝置中需充入惰性氣體進行保護。通過傅里葉變換紅外光譜儀檢測PEGDA結構，提示所得產物在3?500?cm-1表征羥基的特征峰明顯減弱，而在1?700?cm-1左右出現丙烯酸酯的羰基特征峰；核磁共振光譜儀檢測顯示，所得產物在5～7?ppm出現了3組丙烯酸酯基的特征峰，表明有目標產物生成。
天然透明質酸分子中具有大量的羧基、羥基和乙酰氨基，研究常利用羧基改性獲得衍生物。用EDCI對糖胺聚糖進行化學修飾的方法已應用了30多年，是目前得到普遍認可的修飾方法[15-16]。本研究通過采用EDCI將巰基修飾至透明質酸的羧基上，獲得HA-SH，以Ellman法測算顯示經過優化后巰基化產率達65.4%。
本研究中PEGDA與HA-SH發生交聯反應，產生二硫鍵，形成水凝膠，交聯反應可在室溫條件下進行。交聯時間隨PEGDA與HA-SH的濃度和比例變化而變化，PEGDA濃度在2%～6%、HA-SH濃度在0.5%～1.5%范圍內，交聯反應可控制在2～70?min，最終成功制備了透明質酸水凝膠材料。
生物材料或組織工程支架需具備良好的生物相容性，本研究按照ISO10993.5醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗的方法與要求，檢測了透明質酸水凝膠的毒性。結果提示水凝膠的細胞毒性分級為1級，符合生物醫用材料的要求。進一步將人BMSCs接種于透明質酸水凝膠中培養，72 h后觀察發現細胞生長狀態良好，活/死細胞染色以活細胞為主。
綜上述，本研究制備的原位交聯透明質酸水凝膠材料，交聯時間可控且操作簡便，體外生物相容性好，下一步我們將進行體內組織相容性相關研究，進一步研討其作為種子細胞載體或組織缺損填充材料的可行性。
原位交聯水凝膠是一類以溶液狀態給藥后，能在用藥部位發生相轉變，由液態轉化形成半固體凝膠的制劑。將這類材料應用于微創手術中，不僅能最大限度減輕患者痛苦與瘢痕形成，還能降低手術費用、縮短治療時間[1-5]。透明質酸鈉具有良好的理化性能及生物相容性[6-10]，目前已廣泛用于心臟瓣膜、軟骨、神經、角膜及皮膚的修復重建 [11-13]。但它在體內因受到透明質酸酶的酶解作用而降解迅速，存留時間較短。研究表明，透明質酸鈉經交聯劑交聯修飾后可得到高分子凝膠，能彌補這一缺點，同時仍具有良好的生物相容性[14-15]。
本研究擬將巰基化修飾后的透明質酸與交聯劑聚乙二醇二丙烯酸酯（polyethylene glycol acrylate，PEGDA）交聯，制備一種交聯時間可控、存留時間長、細胞毒性低、生物相容性好，且無需任何特殊條件架。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
透明質酸（相對分子質量300 000；華熙福瑞達生物醫藥有限公司）；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG；相對分子質量3 500）、3，3-二巰基二丙酸酰肼[dithiobis (propanoic dihydrazide)，DTP]、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、EDCI （Sigma公司，美國）；1640培養基、FBS（HyClone公司，美國）；活/死細胞染色試劑盒（BioVision公司，美國）；金屬鈉（天津大茂化學試劑廠）。
傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet公司，美國）；核磁共振光譜儀（Bruker Daltonics公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Thermo公司，芬蘭）；培養箱（Thermo公司，美國）；熒光顯微鏡（Zeiss公司，德國）。
1.2 原位交聯透明質酸水凝膠的制備
1.2.1 PEGDA制備與檢測
取PEG 17.5 g加入250?mL二氯甲烷，通氬氣10 min，磁力攪拌，40℃水浴加熱，分2次投入金屬鈉共0.5 g、反應6 h，加入丙烯酰氯3 mL、反應18 h，過濾，濾液旋轉蒸發3 h，真空干燥24 h，獲得PEGDA。
采用傅里葉變換紅外光譜儀檢測PEGDA結構，掃描波數范圍為400～4 000 cm-1。核磁共振光譜儀測試PEGDA結構，掃描范圍為0～10 ppm。
1.2.2 巰基化透明質酸（hyaluronic acid thiolation，HA-SH）制備與檢測
取2 g透明質酸加入200 mL滅菌三蒸水中，攪拌溶解，加入2.38 g巰基化試劑DTP，鹽酸調節pH值至4.75，加入1.92 g EDCI，攪拌24 h，NaOH調節pH值至7.0，加入DTT 10 g，NaOH調節pH值至8.5，攪拌24 h，鹽酸調節pH值至3.5，裝入相對分子質量為3?500的透析袋，分別在100?mmol/L NaCl（pH3.5）和滅菌三蒸水（pH3.5）中透析，以離心半徑13.5 cm、2 500 r/min 離心5 min，取上清液冷凍干燥，獲得HA-SH。
HA-SH由重復二糖結構組成，每個二糖單元含有一個可反應的羧基，接上巰基后的相對分子質量為491。稱取HA-SH 0.005 3 g，配制成0.05 L溶液，若羧基全部被取代，內含巰基量（N總）約為10.8?μmol（0.005?3?g/491）。采用Ellman法[16]測定制備的HA-SH中巰基含量（N測），計算羧基覆蓋率（N測/N總×100%），即巰基化產率。
1.2.3 交聯反應
將HA-SH和PEGDA分別用PBS（pH7.4）配制成一定濃度（W/V）的溶液，用0.22 μm濾膜過濾滅菌，按5種不同比例混合（表 1），渦旋5?s，放置于37℃水浴中，定時觀察成膠情況；從兩種溶液混合開始計時，記錄交聯反應時間。每個濃度平行配制3份樣品。
表1
原位交聯透明質酸水凝膠的組成及交聯時間測定（n=3）
Table1.
Composition and crosslinking time of the in situ crosslinking hyaluronic acid hydrogels(n=3)
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞毒性檢測
① 浸提液制備：取1.5%HA-SH及4%PEGDA交聯獲得的透明質酸水凝膠0.1?g，加入1 mL含10%FBS的1640培養基浸提24?h。② 細胞分組培養：實驗分為4組，分別為水凝膠組（實驗組）、生理鹽水組（陰性對照組）、DMSO組（陽性對照組）以及未處理組（空白對照組）。取L929細胞（HyClone公司，美國），調整至濃度為4×104 個 /100?μL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100?μL，每組3 個復孔。待細胞融合達95%時，按照分組分別加入浸提液、含10%FBS的1640培養基、DMSO溶液或生理鹽水（表 2）。于37°C、5%CO2培養箱中培養24 h。③ 細胞毒性檢測：參照ISO10993.5醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗的方法與要求對產品進行毒性評價。培養24 h后各組取3孔，棄上清，每孔加入100?μL含10%FBS的1640培養基和20?μL MTS試劑，混勻，置于培養箱孵育2?h，于酶標儀測定490 nm處吸光度（A）值。按照以下公式分別計算實驗組、陰性對照組、陽性對照組細胞相對增殖率，細胞相對增殖率 =實驗組、陰性對照組或陽性對照組A值/空白對照組A值×100%。材料毒性分級標準：細胞相對增殖率≥ 90%為0級，70%～90%為1級，50%～70%為2級，30%～50%為3級，0～30%為4級。
表2
各組培養試劑成分（μL）
Table2.
Ingredients of nutrient solution(μL)
1.3.2 生物相容性檢測
取HA-SH和PEGDA分別用DMEM/F12培養基配制成濃度為1.5% （W/V）和4%（W/V）的溶液，濾膜過濾滅菌，混合后渦旋5?s，加入人BMSCs（本實驗室自制），混勻，調整細胞懸液濃度為2×106 個 / mL，接種于24孔板中，每孔100?μL，于37°C、5%CO2 培養箱中培養。培養72 h后，采用活/死細胞染色試劑進行染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態及生長黏附情況，細胞質呈綠染為活細胞、紅染為死細胞。
2 結果
2.1 PEGDA及HA-SH檢測
傅里葉變換紅外光譜儀分析顯示，PEGDA在3?500?cm-1表征羥基的特征峰明顯減弱，而在1?700?cm-1左右出現丙烯酸酯的羰基特征峰，提示大多數羥基被丙烯酸酯基取代。見圖 1。
圖1
PEGDA的紅外吸收光譜圖 圖 2 PEGDA的核磁共振氫譜圖 圖 3 1.5%HA-SH與4%PEGDA交聯形成的透明質酸水凝膠外觀 圖 4 培養72 h熒光顯微鏡觀察BMSCs形態 ? ×40 ? ×100 ? ×200 圖 5 培養72 h人BMSCs活/死細胞染色觀察（熒光顯微鏡× 100）
Figure1.
Fourier transformation infrared spectrometer of PEGDA Fig. 2 1H nuclear magnetic resonance spectrometer of PEGDA Fig. 3 The appearance of the hydrogel crosslinking by 1.5%HA-SH and 4%PEGDA Fig. 4 Morphology observation of hBMSCs under fluorescence microscopy at 72?hours ? ×40 ? ×100 ? ×200 Fig. 5 hBMSCs viability observation by live/dead cell staining at 72 hours (Fluorescence microscopy×100)
核磁共振光譜儀分析顯示，PEGDA的核磁共振氫譜在5～7?ppm出現3組表征丙烯酸酯基的與烯鍵相連的氫的特征峰。見圖 2。HA-SH的巰基化產率為65.4%。
2.2 交聯反應時間及大體觀察
2%～6%PEGDA與0.5%～1.5%HA-SH經不同比例混合后，交聯反應在2～70 min內完成。見表 1。大體觀察示，不同濃度及比例交聯形成的透明質酸水凝膠均呈透明狀。見圖 3。
2.3 細胞毒性檢測
實驗組、陰性對照組及陽性對照組細胞相對增殖率分別為87.08%±2.35%、97.92%±3.55%及8.33%± 1.03%，細胞毒性分級分別為1級、0級和4級。提示制備的透明質酸水凝膠材料細胞毒性分級滿足生物醫用材料的要求。
2.4 生物相容性檢測
培養72 h后，熒光顯微鏡下觀察人BMSCs在透明質酸水凝膠中生長狀態穩定，形態良好，輪廓清晰，分布均勻。活/死細胞染色示以綠染的活細胞為主，只有極少數紅染的死細胞。見圖 4、5。
3 討論
化學交聯一般通過縮聚反應和加聚反應來實現，如橡膠的硫化、不飽和聚酯樹脂的固化等。本研究將透明質酸進行巰基化后，與PEGDA進行交聯形成透明狀水凝膠，交聯過程不需要特殊環境與條件，也不需要特殊設備。通過調整HA-SH和PEGDA的配比，材料可控制在2～70 min內發生相轉變。
PEGDA的合成分為“醇-酸”法、“醇-酰氯”法和“醇鈉-酰氯”法[17-20]。其中“醇-酸”法使用較多，其優點是原料易獲得、反應體系簡單、副反應少，并且反應不受氧氣和水分的影響。但這一反應中PEG的端羥基活性較低，隨著相對分子質量增大，端羥基轉化程度降低，因此僅適用于相對分子質量小的PEGDA合成。由于丙烯酰氯的反應活性較高，“醇-酰氯”法反應速度較“醇-酸”法有所提高，在室溫下即可進行，但該方法仍不宜合成相對分子質量過大的PEGDA。“醇鈉-酰氯”法在前兩種方法基礎上進一步改進，其反應速度更快，且可用于相對分子質量更大的PEGDA合成。本研究選擇“醇鈉-酰氯”法合成的PEGDA相對分子質量達3 500。實驗過程中需要注意，丙烯酰氯易受水分影響，故實驗裝置必須嚴格控水，所有容器烘干，與外界相連的部分需加干燥管，內填充無水氯化鈣。另外，金屬鈉暴露于空氣中會迅速氧化，并在金屬塊表面形成氧化鈉，影響反應進程，故反應裝置中需充入惰性氣體進行保護。通過傅里葉變換紅外光譜儀檢測PEGDA結構，提示所得產物在3?500?cm-1表征羥基的特征峰明顯減弱，而在1?700?cm-1左右出現丙烯酸酯的羰基特征峰；核磁共振光譜儀檢測顯示，所得產物在5～7?ppm出現了3組丙烯酸酯基的特征峰，表明有目標產物生成。
天然透明質酸分子中具有大量的羧基、羥基和乙酰氨基，研究常利用羧基改性獲得衍生物。用EDCI對糖胺聚糖進行化學修飾的方法已應用了30多年，是目前得到普遍認可的修飾方法[15-16]。本研究通過采用EDCI將巰基修飾至透明質酸的羧基上，獲得HA-SH，以Ellman法測算顯示經過優化后巰基化產率達65.4%。
本研究中PEGDA與HA-SH發生交聯反應，產生二硫鍵，形成水凝膠，交聯反應可在室溫條件下進行。交聯時間隨PEGDA與HA-SH的濃度和比例變化而變化，PEGDA濃度在2%～6%、HA-SH濃度在0.5%～1.5%范圍內，交聯反應可控制在2～70?min，最終成功制備了透明質酸水凝膠材料。
生物材料或組織工程支架需具備良好的生物相容性，本研究按照ISO10993.5醫療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性試驗的方法與要求，檢測了透明質酸水凝膠的毒性。結果提示水凝膠的細胞毒性分級為1級，符合生物醫用材料的要求。進一步將人BMSCs接種于透明質酸水凝膠中培養，72 h后觀察發現細胞生長狀態良好，活/死細胞染色以活細胞為主。
綜上述，本研究制備的原位交聯透明質酸水凝膠材料，交聯時間可控且操作簡便，體外生物相容性好，下一步我們將進行體內組織相容性相關研究，進一步研討其作為種子細胞載體或組織缺損填充材料的可行性。
