引用本文： 歐陽毅, 王鵬, 宋斌, 侯景義, 陳仲, 鄧海權, 沈慧勇, 吳燕峰, 李衛平, 楊睿. TNF-α誘導滑膜MSCs與BMSCs凋亡的比較研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(4): 473-478. doi: 10.7507/1002-1892.20160095 復制
MSCs是非血源性的具有多向分化能力的干細胞，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及肌肉細胞等，被廣泛應用于組織工程和疾病治療研究[1]。BMSCs是常用的種子細胞之一，目前已有直接用于治療強直性脊柱炎等炎性疾病的報道[2]。但BMSCs移植后易發生凋亡，影響了其治療效果[3]。研究表明，TNF-α是參與強直性脊柱炎等炎性疾病發病、引起炎性癥狀的重要炎性因子[4-5]。TNF-α可誘導多種組織細胞凋亡，已有研究表明TNF-α可誘導MSCs凋亡，這可能是影響BMSCs治療強直性脊柱炎療效的因素之一[6-7]。因此，在TNF-α環境下選擇一種抗凋亡能力較強的種子細胞，提高干細胞治療效果，是當前研究方向之一。滑膜MSCs（synovium-derived MSCs，SMSCs）作為MSCs家族成員之一，除了具有高度增殖能力和多向分化能力外[8-9]，還具有一定免疫調節能力[10]，已被廣泛應用于組織工程研究中[11-13]，但其抗凋亡能力尚未明確。本研究通過對TNF-α誘導SMSCs和BMSCs凋亡進行比較，探討SMSCs的抗凋亡能力，以期提供抗凋亡能力較強的種子細胞。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
Ⅱ型膠原酶（MP Biomedicals公司，美國）；PBS、H-DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA、青-鏈霉素溶液（GIBCO公司，美國）；FBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；Percoll分離液（Pharmacia Biotech公司，美國）；抗人CD14-PE、CD29-PE、CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-FITC抗體、膜聯蛋白V/7-氨基放線菌素D[Annexin V-PE/7-aminoactinomycin D（7-AAD）]細胞凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）；地塞米松、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、重組人胰島素、抗壞血酸、β-磷酸甘油、油紅O、茜素紅、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉、1.25 μg/mL牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、抗壞血酸、TGF-β1、甲苯胺藍、放線菌酮（Sigma公司，美國）；石蠟、4%多聚甲醛、二甲苯（廣州化學試劑廠）；TNF-α（Peprotech公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化學研究所，日本）；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（北京康為世紀生物科技有限公司）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、ECL發光液（Millipore公司，美國）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶降解產物8、3（Cleaved Caspase-8、3）抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）。
CO2細胞培養箱、超凈工作臺、離心機、酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；流式細胞儀（BD公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；平板搖床（HEIDOLPH公司，德國）；多功能熒光化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。
1.2 細胞分離培養與鑒定
1.2.1 細胞分離培養
實驗用滑膜組織與骨髓分別來源于2014年3月－2015年8月中山大學孫逸仙紀念醫院收治的半月板損傷（不合并滑膜相關疾病）患者以及招募的健康志愿者，標本獲得經醫院醫學倫理委員會批準。關節鏡取出滑膜組織后剪碎，2%Ⅱ型膠原酶消化12 h，更換培養基后在培養瓶內貼壁培養。骨髓穿刺術獲得骨髓組織后，加入等比例PBS緩沖液混勻，加入等量Percoll分離液，以900×g離心30 min，吸取中間白膜層，PBS緩沖液洗滌3次，用培養基重懸并接種于培養瓶內培養。SMSCs和BMSCs均培養于含10%FBS、100U/ mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養。當細胞達80%～90%融合時，通過0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化傳代，取第3～5代細胞進行后續實驗。
1.2.2 細胞免疫表型鑒定
取SMSCs和BMSCs經0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，以300×g離心5 min并重懸于PBS緩沖液中，加入CD14-PE、CD29-PE、CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-FITC和相應的同型對照抗體，室溫避光孵育，采用流式細胞儀對細胞表型進行分析。
1.2.3 細胞三系分化鑒定
①成脂分化：取SMSCs和BMSCs以1×105個/孔密度分別接種于培養板中，24 h后更換為成脂分化誘導培養基（含1μmol/L地塞米松、200 μmol/L吲哚美辛、0.5mmol/ L IBMX、10μg/mL重組人胰島素、10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素），每3天換液1次，21d后行油紅O染色，鏡下觀察脂滴形成情況。②成骨分化：取SMSCs和BMSCs同上法培養24 h后更換為成骨分化誘導培養基（含0.1 μmol/ L地塞米松、50μmol/ L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10%FBS、100U/ mL青霉素和100 U/mL鏈霉素），每3天換液1次，21 d后行茜素紅染色，鏡下觀察鈣化結節形成情況。③成軟骨分化：分別取2×105 個SMSCs和BMSCs，與成軟骨分化誘導液（含6.25μg/ mL胰島素、6.25 μg/mL轉鐵蛋白、6.25 μg/ mL亞硒酸鈉、1.25μg/mL牛血清白蛋白、1mmol/L丙酮酸鈉、37.5μg/mL抗壞血酸、50ng/ mL TGF-β1、2.5%FBS、100 U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素）一并加入15mL聚丙烯管中；以500×g離心10min，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后可見細胞團懸起，之后每3天換液1次，21 d時獲得軟骨球，經多聚甲醛固定、石蠟包埋切片后，甲苯胺藍染色觀察。
1.3 TNF-α誘導細胞凋亡實驗
1.3.1 實驗分組及方法
實驗分為4組，分別為SMSCs、BMSCs凋亡誘導組（SMSCs、BMSCs實驗組）及對應的對照組。取對數生長期SMSCs和BMSCs，經0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后接種于培養板。貼壁培養24 h后兩實驗組更換為含20 ng/mL TNF-α和10 μg/mL 放線菌酮的培養基，對應的對照組更換為正常培養基。倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態及生長狀態。
1.3.2 觀測指標
①細胞存活率檢測：采用CCK-8試劑盒對細胞存活率進行檢測。具體方法：取對數生長期SMSCs和BMSCs經0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，以5×103個/孔密度接種于96孔培養板，按1.3.1方法分組誘導凋亡后每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育24h后，用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值。按CCK-8試劑盒說明書中的公式計算細胞存活率。
②細胞凋亡率檢測：采用Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。具體方法：誘導培養24h取各組細胞經冰PBS緩沖液沖洗3次后，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化并重懸于100μL結合緩沖液中，加入5 μL Annexin V-PE和5μL 7-AAD，充分混勻后避光室溫孵育15min，采用流式細胞儀檢測，Flowjo軟件對結果進行分析。
③Cleaved Caspase-8、3蛋白表達檢測：采用Western blot法對Cleaved Caspase-8、3進行檢測。具體方法：誘導培養24h，取各組細胞經冰PBS緩沖液沖洗3次后，加入預冷的RIPA裂解液對其進行勻漿，冰浴30 min后，4°C、16 000×g離心30 min，吸取上清蛋白后加入蛋白上樣緩沖液并煮沸變性5 min。通過SDS-PAGE分離蛋白后轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗用Cleaved Caspase-8、3抗體，4°C孵育過夜，TBST緩沖液洗3次，用相應二抗室溫孵育1 h，ECL化學發光液顯色。以GAPDH作為內參，采用Image J軟件對圖像進行分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，SMSCs和BMSCs均呈梭形、成纖維細胞樣生長。流式細胞術檢測示，SMSCs和BMSCs均陽性表達CD29-PE、CD90-FITC和CD105-PE，SMSCs陽性表達率分別為98.40%± 1.91%、97.81%±2.53%、99.32± 1.81%，BMSCs分別為98.24%±2.33%、99.15%±2.78%、99.53%±3.56%；SMSCs和BMSCs均陰性表達CD14-PE、CD45-FITC和HLA-DR-FITC，SMSCs陽性表達率分別為0.06%± 0.07%、0.11%±0.13%、0.15%±0.09%，BMSCs分別為0.10%±0.09%、0.08%±0.07%、0.13%±0.11%。兩組細胞上述免疫表型陽性表達率之間無顯著差異。
成脂誘導21 d，油紅O染色示SMSCs和BMSCs均可見明顯脂滴形成；成骨誘導21 d，茜素紅染色示SMSCs和BMSCs均可見明顯鈣結節形成；成軟骨誘導21 d，甲苯胺藍染色均呈陽性，提示均能分化成軟骨細胞。上述結果表明SMSCs和BMSCs均符合MSCs鑒定標準[14]。見圖 1、2。
圖1
SMSCs和BMSCs三系分化鑒定（×100） 從左至右分別為成脂、成骨、成軟骨誘導分化 ? SMSCs ? BMSCs 圖 2 第3代SMSCs和BMSCs形態觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? SMSCs ? BMSCs 圖 3 TNF-α誘導細胞凋亡后24 h各組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡 ×40） ? SMSCs實驗組 ? SMSCs對照組 ? BMSCs實驗組 ? BMSCs對照組
Figure1.
Differentiation identification of SMSCs and BMSCs (×100) Adipogenesis,osteogenesis,and chondrogenesis were shown from left to right ? SMSCs ? BMSCs Fig. 2 Morphology observation of SMSCs and BMSCs at passage 3 (Inverted phase contrast microscope×40) ? SMSCs ? BMSCs Fig. 3 Morphology observation after 24 hours of apoptosis induced by TNF-α (Inverted phase contrast microscope×40) ? SMSCs experimental group ? SMSCs control group ? BMSCs experimental group ? BMSCs control group
2.2 TNF-α誘導細胞凋亡觀察
2.2.1 細胞形態觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，誘導凋亡培養早期兩實驗組細胞生長及形態與對應的對照組比較無明顯差異，6 h后可見少量細胞脫壁漂浮，24 h后大量細胞脫壁漂浮、細胞生長狀態差；而兩對照組細胞培養24 h均未見脫壁漂浮，生長狀態良好。見圖 3。
2.2.2 細胞存活率檢測
培養24 h，兩對照組細胞存活率均為100%；SMSCs實驗組和BMSCs實驗組分別為60.13%±8.63%和46.55%±10.54%，均顯著低于對照組，差異有統計學意義（t=14.230，P=0.000；t=15.420，P=0.000）；SMSCs實驗組細胞存活率顯著高于BMSCs實驗組，比較差異有統計學意義（t=3.152，P=0.006）。
2.2.3 細胞凋亡率檢測
培養24 h，SMSCs和BMSCs對照組細胞凋亡率分別為1.12%±0.24%和1.35%±0.31%；SMSCs實驗組和BMSCs實驗組細胞凋亡率分別為36.54%±8.63%和53.77%±11.52%，均顯著高于對照組，差異有統計學意義（t=12.970，P=0.000；t=14.380，P=0.000）；BMSCs實驗組細胞凋亡率顯著高于SMSCs實驗組，比較差異有統計學意義（t=3.785，P=0.001）。
2.2.4 Cleaved Caspase-8、3蛋白表達檢測
培養24 h，兩對照組細胞Cleaved Caspase-8、3蛋白幾乎不表達，兩實驗組細胞Cleaved Caspase-8、3蛋白明顯高表達。見圖 4。其中，BMSCs實驗組細胞Cleaved Caspase-8、3蛋白表達分別為2.42±0.45、0.44±0.11，均明顯高于SMSCs實驗組的0.95±0.15、0.23±0.05，比較差異有統計學意義（t=9.800，P=0.000；t=5.496，P=0.000）。
圖4
Western blot檢測各組細胞Cleaved Caspase-8、3蛋白的表達 1：SMSCs對照組 2：BMSCs對照組 3：SMSCs實驗組 4：BMSCs實驗組
Figure4.
Expressions of Cleaved Caspase-8,3 detected by Western blot 1: SMSCs control group 2: BMSCs control group 3: SMSCs experimental group 4: BMSCs experimental group
3 討論
MSCs已被廣泛應用于組織工程和疾病治療中。我們前期對非甾體抗炎藥治療無效的強直性脊柱炎患者進行BMSCs治療，4周時患者強直性脊柱炎疾病活動度評分顯著降低，MRI評估的炎癥水平也顯著降低，但20周時疾病活動度評分和炎癥水平與BMSCs治療前無顯著差異，分析原因可能與BMSCs凋亡有關[2]。移植后的MSCs發生凋亡的具體機制尚未完全明確，營養缺乏、缺氧、細胞因子和氧化應激反應等可能參與其中[15-17]，而TNF-α在MSCs的凋亡過程中發揮不可忽視的作用。TNF-α是炎性疾病中重要的促炎因子之一，廣泛參與細胞增殖分化；同時，TNF-α可通過與TNF受體1（TNF receptor 1，TNFR1）結合激活Caspase-8。Caspase-8在表達TNFR1的細胞中是外源性凋亡途徑的中間產物，激活的Caspase-8可激活下游的Caspase蛋白，如Caspase-3等，最終誘導細胞發生凋亡[18-19]。激活后的Caspase-8、3會生成相應的降解產物，對細胞凋亡程度起著重要提示作用。Mao等[7]發現TNF-α能有效誘導MSCs凋亡，TNF-α對移植后的MSCs可能起促凋亡作用。TNF-α和放線菌酮共刺激是模擬TNF-α體內誘導凋亡的常用方法[20]，本研究中兩種MSCs經TNF-α和放線菌酮共刺激24 h后也發生顯著凋亡。
我們前期通過將SMSCs與人外周血淋巴細胞共培養后，發現淋巴細胞增殖降低，說明SMSCs有免疫調節能力[10]，具有作為治療自身免疫性疾病等炎性疾病種子細胞的潛力。然而，對SMSCs的抗凋亡能力尚缺乏相關研究。為此，本實驗通過比較SMSCs和BMSCs在TNF-α誘導下的凋亡差異，探索SMSCs抗凋亡能力，為尋找抗凋亡能力較高的種子細胞提供理論依據。本研究結果顯示，兩實驗組中細胞存活率較對應的對照組明顯降低，凋亡率顯著增高，提示細胞發生了凋亡；而SMSCs實驗組細胞存活率顯著高于BMSCs實驗組，凋亡率顯著低于BMSCs實驗組。同時，Western blot檢測結果顯示兩實驗組Cleaved Caspase-8、3明顯表達，進一步說明細胞發生了明顯凋亡；而SMSCs實驗組Cleaved Caspase-8、3表達顯著低于BMSCs實驗組，說明SMSCs具有更強的抗凋亡能力。在TNF-α參與的炎性環境中SMSCs可作為較理想的種子細胞來源，有望改善干細胞治療療效。下一步我們將對SMSCs比BMSCs具有更強抗凋亡能力的具體機制進行深入研究，并進行體內實驗，為SMSCs在組織工程和疾病治療中的應用提供充分的理論依據和實驗基礎。
MSCs是非血源性的具有多向分化能力的干細胞，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及肌肉細胞等，被廣泛應用于組織工程和疾病治療研究[1]。BMSCs是常用的種子細胞之一，目前已有直接用于治療強直性脊柱炎等炎性疾病的報道[2]。但BMSCs移植后易發生凋亡，影響了其治療效果[3]。研究表明，TNF-α是參與強直性脊柱炎等炎性疾病發病、引起炎性癥狀的重要炎性因子[4-5]。TNF-α可誘導多種組織細胞凋亡，已有研究表明TNF-α可誘導MSCs凋亡，這可能是影響BMSCs治療強直性脊柱炎療效的因素之一[6-7]。因此，在TNF-α環境下選擇一種抗凋亡能力較強的種子細胞，提高干細胞治療效果，是當前研究方向之一。滑膜MSCs（synovium-derived MSCs，SMSCs）作為MSCs家族成員之一，除了具有高度增殖能力和多向分化能力外[8-9]，還具有一定免疫調節能力[10]，已被廣泛應用于組織工程研究中[11-13]，但其抗凋亡能力尚未明確。本研究通過對TNF-α誘導SMSCs和BMSCs凋亡進行比較，探討SMSCs的抗凋亡能力，以期提供抗凋亡能力較強的種子細胞。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
Ⅱ型膠原酶（MP Biomedicals公司，美國）；PBS、H-DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA、青-鏈霉素溶液（GIBCO公司，美國）；FBS（浙江天杭生物科技股份有限公司）；Percoll分離液（Pharmacia Biotech公司，美國）；抗人CD14-PE、CD29-PE、CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-FITC抗體、膜聯蛋白V/7-氨基放線菌素D[Annexin V-PE/7-aminoactinomycin D（7-AAD）]細胞凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）；地塞米松、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、重組人胰島素、抗壞血酸、β-磷酸甘油、油紅O、茜素紅、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉、1.25 μg/mL牛血清白蛋白、丙酮酸鈉、抗壞血酸、TGF-β1、甲苯胺藍、放線菌酮（Sigma公司，美國）；石蠟、4%多聚甲醛、二甲苯（廣州化學試劑廠）；TNF-α（Peprotech公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；同仁化學研究所，日本）；RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（北京康為世紀生物科技有限公司）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、ECL發光液（Millipore公司，美國）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶降解產物8、3（Cleaved Caspase-8、3）抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）。
CO2細胞培養箱、超凈工作臺、離心機、酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；流式細胞儀（BD公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；平板搖床（HEIDOLPH公司，德國）；多功能熒光化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。
1.2 細胞分離培養與鑒定
1.2.1 細胞分離培養
實驗用滑膜組織與骨髓分別來源于2014年3月－2015年8月中山大學孫逸仙紀念醫院收治的半月板損傷（不合并滑膜相關疾病）患者以及招募的健康志愿者，標本獲得經醫院醫學倫理委員會批準。關節鏡取出滑膜組織后剪碎，2%Ⅱ型膠原酶消化12 h，更換培養基后在培養瓶內貼壁培養。骨髓穿刺術獲得骨髓組織后，加入等比例PBS緩沖液混勻，加入等量Percoll分離液，以900×g離心30 min，吸取中間白膜層，PBS緩沖液洗滌3次，用培養基重懸并接種于培養瓶內培養。SMSCs和BMSCs均培養于含10%FBS、100U/ mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的H-DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養。當細胞達80%～90%融合時，通過0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化傳代，取第3～5代細胞進行后續實驗。
1.2.2 細胞免疫表型鑒定
取SMSCs和BMSCs經0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，以300×g離心5 min并重懸于PBS緩沖液中，加入CD14-PE、CD29-PE、CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、HLA-DR-FITC和相應的同型對照抗體，室溫避光孵育，采用流式細胞儀對細胞表型進行分析。
1.2.3 細胞三系分化鑒定
①成脂分化：取SMSCs和BMSCs以1×105個/孔密度分別接種于培養板中，24 h后更換為成脂分化誘導培養基（含1μmol/L地塞米松、200 μmol/L吲哚美辛、0.5mmol/ L IBMX、10μg/mL重組人胰島素、10%FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素），每3天換液1次，21d后行油紅O染色，鏡下觀察脂滴形成情況。②成骨分化：取SMSCs和BMSCs同上法培養24 h后更換為成骨分化誘導培養基（含0.1 μmol/ L地塞米松、50μmol/ L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油、10%FBS、100U/ mL青霉素和100 U/mL鏈霉素），每3天換液1次，21 d后行茜素紅染色，鏡下觀察鈣化結節形成情況。③成軟骨分化：分別取2×105 個SMSCs和BMSCs，與成軟骨分化誘導液（含6.25μg/ mL胰島素、6.25 μg/mL轉鐵蛋白、6.25 μg/ mL亞硒酸鈉、1.25μg/mL牛血清白蛋白、1mmol/L丙酮酸鈉、37.5μg/mL抗壞血酸、50ng/ mL TGF-β1、2.5%FBS、100 U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素）一并加入15mL聚丙烯管中；以500×g離心10min，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后可見細胞團懸起，之后每3天換液1次，21 d時獲得軟骨球，經多聚甲醛固定、石蠟包埋切片后，甲苯胺藍染色觀察。
1.3 TNF-α誘導細胞凋亡實驗
1.3.1 實驗分組及方法
實驗分為4組，分別為SMSCs、BMSCs凋亡誘導組（SMSCs、BMSCs實驗組）及對應的對照組。取對數生長期SMSCs和BMSCs，經0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后接種于培養板。貼壁培養24 h后兩實驗組更換為含20 ng/mL TNF-α和10 μg/mL 放線菌酮的培養基，對應的對照組更換為正常培養基。倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態及生長狀態。
1.3.2 觀測指標
①細胞存活率檢測：采用CCK-8試劑盒對細胞存活率進行檢測。具體方法：取對數生長期SMSCs和BMSCs經0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化后，以5×103個/孔密度接種于96孔培養板，按1.3.1方法分組誘導凋亡后每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育24h后，用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值。按CCK-8試劑盒說明書中的公式計算細胞存活率。
②細胞凋亡率檢測：采用Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。具體方法：誘導培養24h取各組細胞經冰PBS緩沖液沖洗3次后，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化并重懸于100μL結合緩沖液中，加入5 μL Annexin V-PE和5μL 7-AAD，充分混勻后避光室溫孵育15min，采用流式細胞儀檢測，Flowjo軟件對結果進行分析。
③Cleaved Caspase-8、3蛋白表達檢測：采用Western blot法對Cleaved Caspase-8、3進行檢測。具體方法：誘導培養24h，取各組細胞經冰PBS緩沖液沖洗3次后，加入預冷的RIPA裂解液對其進行勻漿，冰浴30 min后，4°C、16 000×g離心30 min，吸取上清蛋白后加入蛋白上樣緩沖液并煮沸變性5 min。通過SDS-PAGE分離蛋白后轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗用Cleaved Caspase-8、3抗體，4°C孵育過夜，TBST緩沖液洗3次，用相應二抗室溫孵育1 h，ECL化學發光液顯色。以GAPDH作為內參，采用Image J軟件對圖像進行分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，SMSCs和BMSCs均呈梭形、成纖維細胞樣生長。流式細胞術檢測示，SMSCs和BMSCs均陽性表達CD29-PE、CD90-FITC和CD105-PE，SMSCs陽性表達率分別為98.40%± 1.91%、97.81%±2.53%、99.32± 1.81%，BMSCs分別為98.24%±2.33%、99.15%±2.78%、99.53%±3.56%；SMSCs和BMSCs均陰性表達CD14-PE、CD45-FITC和HLA-DR-FITC，SMSCs陽性表達率分別為0.06%± 0.07%、0.11%±0.13%、0.15%±0.09%，BMSCs分別為0.10%±0.09%、0.08%±0.07%、0.13%±0.11%。兩組細胞上述免疫表型陽性表達率之間無顯著差異。
成脂誘導21 d，油紅O染色示SMSCs和BMSCs均可見明顯脂滴形成；成骨誘導21 d，茜素紅染色示SMSCs和BMSCs均可見明顯鈣結節形成；成軟骨誘導21 d，甲苯胺藍染色均呈陽性，提示均能分化成軟骨細胞。上述結果表明SMSCs和BMSCs均符合MSCs鑒定標準[14]。見圖 1、2。
圖1
SMSCs和BMSCs三系分化鑒定（×100） 從左至右分別為成脂、成骨、成軟骨誘導分化 ? SMSCs ? BMSCs 圖 2 第3代SMSCs和BMSCs形態觀察（倒置相差顯微鏡×40） ? SMSCs ? BMSCs 圖 3 TNF-α誘導細胞凋亡后24 h各組細胞形態觀察（倒置相差顯微鏡 ×40） ? SMSCs實驗組 ? SMSCs對照組 ? BMSCs實驗組 ? BMSCs對照組
Figure1.
Differentiation identification of SMSCs and BMSCs (×100) Adipogenesis,osteogenesis,and chondrogenesis were shown from left to right ? SMSCs ? BMSCs Fig. 2 Morphology observation of SMSCs and BMSCs at passage 3 (Inverted phase contrast microscope×40) ? SMSCs ? BMSCs Fig. 3 Morphology observation after 24 hours of apoptosis induced by TNF-α (Inverted phase contrast microscope×40) ? SMSCs experimental group ? SMSCs control group ? BMSCs experimental group ? BMSCs control group
2.2 TNF-α誘導細胞凋亡觀察
2.2.1 細胞形態觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，誘導凋亡培養早期兩實驗組細胞生長及形態與對應的對照組比較無明顯差異，6 h后可見少量細胞脫壁漂浮，24 h后大量細胞脫壁漂浮、細胞生長狀態差；而兩對照組細胞培養24 h均未見脫壁漂浮，生長狀態良好。見圖 3。
2.2.2 細胞存活率檢測
培養24 h，兩對照組細胞存活率均為100%；SMSCs實驗組和BMSCs實驗組分別為60.13%±8.63%和46.55%±10.54%，均顯著低于對照組，差異有統計學意義（t=14.230，P=0.000；t=15.420，P=0.000）；SMSCs實驗組細胞存活率顯著高于BMSCs實驗組，比較差異有統計學意義（t=3.152，P=0.006）。
2.2.3 細胞凋亡率檢測
培養24 h，SMSCs和BMSCs對照組細胞凋亡率分別為1.12%±0.24%和1.35%±0.31%；SMSCs實驗組和BMSCs實驗組細胞凋亡率分別為36.54%±8.63%和53.77%±11.52%，均顯著高于對照組，差異有統計學意義（t=12.970，P=0.000；t=14.380，P=0.000）；BMSCs實驗組細胞凋亡率顯著高于SMSCs實驗組，比較差異有統計學意義（t=3.785，P=0.001）。
2.2.4 Cleaved Caspase-8、3蛋白表達檢測
培養24 h，兩對照組細胞Cleaved Caspase-8、3蛋白幾乎不表達，兩實驗組細胞Cleaved Caspase-8、3蛋白明顯高表達。見圖 4。其中，BMSCs實驗組細胞Cleaved Caspase-8、3蛋白表達分別為2.42±0.45、0.44±0.11，均明顯高于SMSCs實驗組的0.95±0.15、0.23±0.05，比較差異有統計學意義（t=9.800，P=0.000；t=5.496，P=0.000）。
圖4
Western blot檢測各組細胞Cleaved Caspase-8、3蛋白的表達 1：SMSCs對照組 2：BMSCs對照組 3：SMSCs實驗組 4：BMSCs實驗組
Figure4.
Expressions of Cleaved Caspase-8,3 detected by Western blot 1: SMSCs control group 2: BMSCs control group 3: SMSCs experimental group 4: BMSCs experimental group
3 討論
MSCs已被廣泛應用于組織工程和疾病治療中。我們前期對非甾體抗炎藥治療無效的強直性脊柱炎患者進行BMSCs治療，4周時患者強直性脊柱炎疾病活動度評分顯著降低，MRI評估的炎癥水平也顯著降低，但20周時疾病活動度評分和炎癥水平與BMSCs治療前無顯著差異，分析原因可能與BMSCs凋亡有關[2]。移植后的MSCs發生凋亡的具體機制尚未完全明確，營養缺乏、缺氧、細胞因子和氧化應激反應等可能參與其中[15-17]，而TNF-α在MSCs的凋亡過程中發揮不可忽視的作用。TNF-α是炎性疾病中重要的促炎因子之一，廣泛參與細胞增殖分化；同時，TNF-α可通過與TNF受體1（TNF receptor 1，TNFR1）結合激活Caspase-8。Caspase-8在表達TNFR1的細胞中是外源性凋亡途徑的中間產物，激活的Caspase-8可激活下游的Caspase蛋白，如Caspase-3等，最終誘導細胞發生凋亡[18-19]。激活后的Caspase-8、3會生成相應的降解產物，對細胞凋亡程度起著重要提示作用。Mao等[7]發現TNF-α能有效誘導MSCs凋亡，TNF-α對移植后的MSCs可能起促凋亡作用。TNF-α和放線菌酮共刺激是模擬TNF-α體內誘導凋亡的常用方法[20]，本研究中兩種MSCs經TNF-α和放線菌酮共刺激24 h后也發生顯著凋亡。
我們前期通過將SMSCs與人外周血淋巴細胞共培養后，發現淋巴細胞增殖降低，說明SMSCs有免疫調節能力[10]，具有作為治療自身免疫性疾病等炎性疾病種子細胞的潛力。然而，對SMSCs的抗凋亡能力尚缺乏相關研究。為此，本實驗通過比較SMSCs和BMSCs在TNF-α誘導下的凋亡差異，探索SMSCs抗凋亡能力，為尋找抗凋亡能力較高的種子細胞提供理論依據。本研究結果顯示，兩實驗組中細胞存活率較對應的對照組明顯降低，凋亡率顯著增高，提示細胞發生了凋亡；而SMSCs實驗組細胞存活率顯著高于BMSCs實驗組，凋亡率顯著低于BMSCs實驗組。同時，Western blot檢測結果顯示兩實驗組Cleaved Caspase-8、3明顯表達，進一步說明細胞發生了明顯凋亡；而SMSCs實驗組Cleaved Caspase-8、3表達顯著低于BMSCs實驗組，說明SMSCs具有更強的抗凋亡能力。在TNF-α參與的炎性環境中SMSCs可作為較理想的種子細胞來源，有望改善干細胞治療療效。下一步我們將對SMSCs比BMSCs具有更強抗凋亡能力的具體機制進行深入研究，并進行體內實驗，為SMSCs在組織工程和疾病治療中的應用提供充分的理論依據和實驗基礎。
