引用本文： 葉維, 包倪榮, 趙建寧. 犬肩袖損傷愈合模型的研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(4): 461-465. doi: 10.7507/1002-1892.20160093 復制
肩袖是覆蓋于肩關節前、上、后方的肩胛下肌、岡上肌、岡下肌、小圓肌等肌腱的總稱，與關節囊緊密相連，肩袖斷裂后將嚴重影響上肢外展功能。盡管外科治療手段不斷發展，但是肩袖損傷修復失敗率仍較高[1-4]，成為臨床關注焦點之一。動物模型是各種新型修復材料及術式研究的基礎，目前用于制備肩袖損傷修復模型的動物包括小鼠、羊、犬[5-9]。與其他動物相比，犬體型及肩袖結構與人相似，因而相關研究多選擇犬來制備模型。分析既往相關研究報道，我們發現犬肩袖損傷修復模型未使用外固定支架進行制動處理，從而影響了肩袖損傷修復效果觀察。為此，我們提出犬肩袖損傷修復制動模型，即在修復術后采用外固定架將肘關節屈曲90°位固定6周，以更客觀觀察肩袖修復進程；預實驗結果顯示制動可減少肩袖再次撕裂的不利因素，有利于肩袖愈合，能較準確模擬臨床肩袖損傷修復術后情況。本研究基于犬肩袖損傷制動模型，比較研究不同損傷類型及修復方法的差異，為臨床選擇手術方法，以及提供能準確模擬臨床肩袖損傷修復術后恢復進程的動物模型提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性比格犬12只，體質量10～15 kg，由南京軍區南京總醫院比較醫學中心提供。速眠新2號（吉林省華牧動物保健品有限公司）；丙泊酚（西安力邦有限公司）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）；Masson染色試劑盒（北京索來寶科技有限公司）。外固定架（上海捷邁醫療有限公司）。生物力學測試機（Instron公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將12只犬隨機分為3組（n=4），分別為急性肩袖損傷+Mason-Allen縫合修復組（A組）、巨大肩袖損傷+Mason-Allen縫合修復組（B組）及巨大肩袖損傷+Mason-Allen縫合修復并自體半腱肌擴張部修復組（C組）。3組動物臀部肌肉注射速眠新2號（0.08～0.10 mg/kg），待四肢無力、不能行走時，于后肢小隱靜脈注射丙泊酚注射液（0.1 mL/kg）麻醉，右側臥位固定于手術架。作左側肱骨大結節正中切口，長3～5 cm，鈍性分離皮下、結締組織層，牽開肱二頭肌，充分暴露肱骨大結節-岡下肌腱連接部。用尖刀片在止點處游離岡下肌腱，修剪岡下肌腱末端。A組在肱骨大結節上清理殘余的岡下肌腱末端，對肱骨大結節岡下肌止點骨皮質層進行去表面皮質化處理，再用1 mm克氏針在肱骨大結節上打2個骨孔，取愛惜邦縫合線以Mason-Allen縫合法經骨隧道重建岡下肌止點。B、C組用組織剪于離斷岡下肌肌腱末端5 mm處剪斷，模擬巨大肩袖損傷；然后B組同A組縫合方法修復岡下肌，C組在A組縫合修復基礎上，取自體半腱肌擴張部覆蓋于巨大肩袖損傷處。3組肩袖損傷修復后，于尺骨干和肱骨干上鉆孔，置外固定架固定肘關節于屈曲90°位6周。見圖 1。最后用不可吸收線依次關閉皮下組織層及皮膚，適當加壓包扎。術后3 d內，每天臀部肌肉注射青霉素80萬U預防感染；分籠正常喂養。
圖1
動物模型制備 ? A組急性肩袖損傷 ? A組損傷縫合修復 ? B組巨大肩袖損傷 ? B組損傷縫合修復 ? C組自體半腱肌擴張部修復后 ? 術后外固定支架固定制動 圖 2 術后6周各組岡下肌肌腱大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組 圖 3 術后6周各組組織學觀察（Masson染色×20） ? A組 ? B組 ? C組
Figure1.
Establishment of the experimental canine model ? Acute rotator cuff injury in group A ? Suture repair in group A ? Huge rotator cuff injury in group B ? Suture repair in group B ? Suture repair combined with autogenous semitendinosus expansion repair ? External fixation for immobilization after operation Fig. 2 Gross observation of the infraspinatus tendon at 6 weeks after operation ? Group A ? Group B ? Group C Fig. 3 Histological observation at 6 weeks after operation (Masson staining×20) ? Group A ? Group B ? Group C
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察術后各組動物存活、切口愈合及行走等情況。
1.3.2 大體觀察
術后6周取各組動物，腿部靜脈空氣栓塞處死，于原手術切口入路，大體觀察岡下肌肌腱末端愈合情況。
1.3.3 生物力學測試
大體觀察后切取修復后肩關節，鈍性分離皮下、肌肉、結締組織層，牽開肱二頭肌及三角肌，保護修復后的岡下肌肌腱組織，手術刀剔除肩胛骨上的岡上肌、大圓肌、小圓肌和肩胛下肌以及附著于肱骨干的肌肉，最后于肩胛骨上游離岡下肌，獲得岡下肌-肱骨復合體，用于生物力學測試。將樣本肌肉端置于干冰盒內，肌腱止點處于常溫中，待肌肉部分凝固成塊狀后放置于生物力學測試機上，標本固定后加載3 N前負荷，調整負荷為8～50N，固定往復位移1 mm，頻率0.25 Hz，循環牽拉40周。然后以1 mm/s前進位移牽拉岡上肌肌腱至斷裂，記錄測試過程中的峰值，作為極限負荷。
1.3.4 組織學觀察
生物力學測試后，取肌腱止點處組織固定于10%甲醛溶液，石蠟包埋后，2 μm厚切片，行Masson染色。光鏡下觀察肌腱細胞及纖維改變。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后各組動物均存活至實驗完成。切口均愈合良好，無感染發生。術后患肢外固定支架在位，避免手術部位負重，通過其他3條腿能穩定行走，不影響其正常活動。
2.2 大體觀察
A組：岡下肌肌腱末端瘢痕組織明顯多于正常肌腱組織；B組：岡下肌肌腱末端未見明顯肌腱組織，分離周圍瘢痕組織仍未見明顯肌腱成分；C組：岡下肌肌腱雖然部分覆蓋瘢痕組織，但仍可觀察到肌腱及其大致走向。見圖 2。
2.3 生物力學測試
A、B、C組極限負荷分別為（223.75±24.28）、（159.25±34.87）、（233.25±14.24）N，B組顯著低于A、C組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、C組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 組織學觀察
鏡下觀察示，A組肌腱纖維排列大致正常，肌腱細胞數目較多；B組肌腱纖維排列較紊亂，并且肌腱細胞明顯少于A組；C組肌腱纖維排列整齊，且肌腱細胞多于B組。見圖 3。
3 討論
猩猩的肩袖結構與人類最相似，是肩袖損傷研究理想的動物模型，但因價格昂貴、飼養條件要求高影響了其在研究中的應用[10-11]。既往用于制備肩袖損傷修復模型的動物包括小鼠、羊、犬，均為爬行動物。Derwin等[12]建立了犬肩袖損傷模型，經生物力學測試，該動物模型在模擬肩袖巨大全層撕裂以及部分撕裂方面具有優勢。因此，本研究選取比格犬作為建模對象。
Uezono等[13]以SD小鼠為模型，研究肩袖重建后制動對療效的影響。研究將小鼠隨機分為3組，均采用脫細胞真皮基質支架重建，重建后分別作不制動及制動2、6周處理，結果顯示制動2周組小鼠膠原合成優于其他組，且承重負荷更大，提示在動物模型中患肢制動處理有利于肩袖愈合。但是小鼠體型小，安裝制動裝置較困難。我們采用外固定支架裝置將比格犬患肢肘關節固定于屈曲90°位，預實驗結果顯示該處理方法能有效避免患肢負重等因素對修復過程的影響，能較準確模擬臨床肩袖損傷修復后愈合過程。
臨床上將肩袖損傷分為小、中、大度[14-16]，本實驗我們制備了急性肩袖損傷和巨大肩袖損傷，均予以Mason-Allen縫合修復。經大體觀察、生物力學測試及組織學觀察顯示，在相同修復方法下，急性肩袖損傷修復后的肌腱生物力學強度以及肌腱細胞數量、肌腱纖維排列均優于巨大肩袖損傷，與臨床上巨大肩袖損傷修復失敗率高于小、中度肩袖損傷結果類似[17]。
臨床上肩袖損傷多采用關節鏡下單純單排或雙排縫合修復，理論上雙排縫合可以提供更好的強度支持，有利于腱-骨貼附，但這種理論上的優勢并未在臨床實踐中得到體現。提示在單純縫合基礎上聯合支架材料進行修復可能會獲得更好療效，因此用于肩袖修補的支架材料也逐漸成為研究熱點[18-19]。Ide等[20]應用脫細胞真皮支架（GraftJacket）修復SD小鼠肩袖損傷模型，組織學及生物力學測試結果顯示GraftJacket修復后效果優于未使用脫細胞真皮支架修復的對照組。但也有研究表明[21]生物支架難以提供足夠的生物力學強度，且可能導致炎性反應。為避免以上問題，我們選擇自體半腱肌擴張部組織增強肩袖修復。本結果顯示，巨大肩袖損傷后，Mason-Allen縫合并自體半腱肌擴張部修復后，肌腱生物力學強度以及肌腱細胞數量、肌腱纖維排列顯著優于單純Mason-Allen縫合修復。我們認為，自體半腱肌擴張部修補巨大肩袖損傷不僅能提高肩袖愈合，達到滿意生物力學強度，還可提供一個支架結構有助于肩袖肌腱細胞的增殖與吸附。
綜上述，犬巨大肩袖損傷縫合并自體半腱肌擴張部修復的制動模型，可為肩袖損傷相關研究提供合適的動物模型。但本研究也存在不足之處：①樣本量太少，缺乏大樣本數據分析，對結果的預判可能存在偏差；②觀察時間僅6周，遠期腱-骨愈合療效有待驗證；③缺少更多的定量分析指標。以上不足均有待進一步研究完善。
肩袖是覆蓋于肩關節前、上、后方的肩胛下肌、岡上肌、岡下肌、小圓肌等肌腱的總稱，與關節囊緊密相連，肩袖斷裂后將嚴重影響上肢外展功能。盡管外科治療手段不斷發展，但是肩袖損傷修復失敗率仍較高[1-4]，成為臨床關注焦點之一。動物模型是各種新型修復材料及術式研究的基礎，目前用于制備肩袖損傷修復模型的動物包括小鼠、羊、犬[5-9]。與其他動物相比，犬體型及肩袖結構與人相似，因而相關研究多選擇犬來制備模型。分析既往相關研究報道，我們發現犬肩袖損傷修復模型未使用外固定支架進行制動處理，從而影響了肩袖損傷修復效果觀察。為此，我們提出犬肩袖損傷修復制動模型，即在修復術后采用外固定架將肘關節屈曲90°位固定6周，以更客觀觀察肩袖修復進程；預實驗結果顯示制動可減少肩袖再次撕裂的不利因素，有利于肩袖愈合，能較準確模擬臨床肩袖損傷修復術后情況。本研究基于犬肩袖損傷制動模型，比較研究不同損傷類型及修復方法的差異，為臨床選擇手術方法，以及提供能準確模擬臨床肩袖損傷修復術后恢復進程的動物模型提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雄性比格犬12只，體質量10～15 kg，由南京軍區南京總醫院比較醫學中心提供。速眠新2號（吉林省華牧動物保健品有限公司）；丙泊酚（西安力邦有限公司）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）；Masson染色試劑盒（北京索來寶科技有限公司）。外固定架（上海捷邁醫療有限公司）。生物力學測試機（Instron公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將12只犬隨機分為3組（n=4），分別為急性肩袖損傷+Mason-Allen縫合修復組（A組）、巨大肩袖損傷+Mason-Allen縫合修復組（B組）及巨大肩袖損傷+Mason-Allen縫合修復并自體半腱肌擴張部修復組（C組）。3組動物臀部肌肉注射速眠新2號（0.08～0.10 mg/kg），待四肢無力、不能行走時，于后肢小隱靜脈注射丙泊酚注射液（0.1 mL/kg）麻醉，右側臥位固定于手術架。作左側肱骨大結節正中切口，長3～5 cm，鈍性分離皮下、結締組織層，牽開肱二頭肌，充分暴露肱骨大結節-岡下肌腱連接部。用尖刀片在止點處游離岡下肌腱，修剪岡下肌腱末端。A組在肱骨大結節上清理殘余的岡下肌腱末端，對肱骨大結節岡下肌止點骨皮質層進行去表面皮質化處理，再用1 mm克氏針在肱骨大結節上打2個骨孔，取愛惜邦縫合線以Mason-Allen縫合法經骨隧道重建岡下肌止點。B、C組用組織剪于離斷岡下肌肌腱末端5 mm處剪斷，模擬巨大肩袖損傷；然后B組同A組縫合方法修復岡下肌，C組在A組縫合修復基礎上，取自體半腱肌擴張部覆蓋于巨大肩袖損傷處。3組肩袖損傷修復后，于尺骨干和肱骨干上鉆孔，置外固定架固定肘關節于屈曲90°位6周。見圖 1。最后用不可吸收線依次關閉皮下組織層及皮膚，適當加壓包扎。術后3 d內，每天臀部肌肉注射青霉素80萬U預防感染；分籠正常喂養。
圖1
動物模型制備 ? A組急性肩袖損傷 ? A組損傷縫合修復 ? B組巨大肩袖損傷 ? B組損傷縫合修復 ? C組自體半腱肌擴張部修復后 ? 術后外固定支架固定制動 圖 2 術后6周各組岡下肌肌腱大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組 圖 3 術后6周各組組織學觀察（Masson染色×20） ? A組 ? B組 ? C組
Figure1.
Establishment of the experimental canine model ? Acute rotator cuff injury in group A ? Suture repair in group A ? Huge rotator cuff injury in group B ? Suture repair in group B ? Suture repair combined with autogenous semitendinosus expansion repair ? External fixation for immobilization after operation Fig. 2 Gross observation of the infraspinatus tendon at 6 weeks after operation ? Group A ? Group B ? Group C Fig. 3 Histological observation at 6 weeks after operation (Masson staining×20) ? Group A ? Group B ? Group C
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察術后各組動物存活、切口愈合及行走等情況。
1.3.2 大體觀察
術后6周取各組動物，腿部靜脈空氣栓塞處死，于原手術切口入路，大體觀察岡下肌肌腱末端愈合情況。
1.3.3 生物力學測試
大體觀察后切取修復后肩關節，鈍性分離皮下、肌肉、結締組織層，牽開肱二頭肌及三角肌，保護修復后的岡下肌肌腱組織，手術刀剔除肩胛骨上的岡上肌、大圓肌、小圓肌和肩胛下肌以及附著于肱骨干的肌肉，最后于肩胛骨上游離岡下肌，獲得岡下肌-肱骨復合體，用于生物力學測試。將樣本肌肉端置于干冰盒內，肌腱止點處于常溫中，待肌肉部分凝固成塊狀后放置于生物力學測試機上，標本固定后加載3 N前負荷，調整負荷為8～50N，固定往復位移1 mm，頻率0.25 Hz，循環牽拉40周。然后以1 mm/s前進位移牽拉岡上肌肌腱至斷裂，記錄測試過程中的峰值，作為極限負荷。
1.3.4 組織學觀察
生物力學測試后，取肌腱止點處組織固定于10%甲醛溶液，石蠟包埋后，2 μm厚切片，行Masson染色。光鏡下觀察肌腱細胞及纖維改變。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后各組動物均存活至實驗完成。切口均愈合良好，無感染發生。術后患肢外固定支架在位，避免手術部位負重，通過其他3條腿能穩定行走，不影響其正常活動。
2.2 大體觀察
A組：岡下肌肌腱末端瘢痕組織明顯多于正常肌腱組織；B組：岡下肌肌腱末端未見明顯肌腱組織，分離周圍瘢痕組織仍未見明顯肌腱成分；C組：岡下肌肌腱雖然部分覆蓋瘢痕組織，但仍可觀察到肌腱及其大致走向。見圖 2。
2.3 生物力學測試
A、B、C組極限負荷分別為（223.75±24.28）、（159.25±34.87）、（233.25±14.24）N，B組顯著低于A、C組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；A、C組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.4 組織學觀察
鏡下觀察示，A組肌腱纖維排列大致正常，肌腱細胞數目較多；B組肌腱纖維排列較紊亂，并且肌腱細胞明顯少于A組；C組肌腱纖維排列整齊，且肌腱細胞多于B組。見圖 3。
3 討論
猩猩的肩袖結構與人類最相似，是肩袖損傷研究理想的動物模型，但因價格昂貴、飼養條件要求高影響了其在研究中的應用[10-11]。既往用于制備肩袖損傷修復模型的動物包括小鼠、羊、犬，均為爬行動物。Derwin等[12]建立了犬肩袖損傷模型，經生物力學測試，該動物模型在模擬肩袖巨大全層撕裂以及部分撕裂方面具有優勢。因此，本研究選取比格犬作為建模對象。
Uezono等[13]以SD小鼠為模型，研究肩袖重建后制動對療效的影響。研究將小鼠隨機分為3組，均采用脫細胞真皮基質支架重建，重建后分別作不制動及制動2、6周處理，結果顯示制動2周組小鼠膠原合成優于其他組，且承重負荷更大，提示在動物模型中患肢制動處理有利于肩袖愈合。但是小鼠體型小，安裝制動裝置較困難。我們采用外固定支架裝置將比格犬患肢肘關節固定于屈曲90°位，預實驗結果顯示該處理方法能有效避免患肢負重等因素對修復過程的影響，能較準確模擬臨床肩袖損傷修復后愈合過程。
臨床上將肩袖損傷分為小、中、大度[14-16]，本實驗我們制備了急性肩袖損傷和巨大肩袖損傷，均予以Mason-Allen縫合修復。經大體觀察、生物力學測試及組織學觀察顯示，在相同修復方法下，急性肩袖損傷修復后的肌腱生物力學強度以及肌腱細胞數量、肌腱纖維排列均優于巨大肩袖損傷，與臨床上巨大肩袖損傷修復失敗率高于小、中度肩袖損傷結果類似[17]。
臨床上肩袖損傷多采用關節鏡下單純單排或雙排縫合修復，理論上雙排縫合可以提供更好的強度支持，有利于腱-骨貼附，但這種理論上的優勢并未在臨床實踐中得到體現。提示在單純縫合基礎上聯合支架材料進行修復可能會獲得更好療效，因此用于肩袖修補的支架材料也逐漸成為研究熱點[18-19]。Ide等[20]應用脫細胞真皮支架（GraftJacket）修復SD小鼠肩袖損傷模型，組織學及生物力學測試結果顯示GraftJacket修復后效果優于未使用脫細胞真皮支架修復的對照組。但也有研究表明[21]生物支架難以提供足夠的生物力學強度，且可能導致炎性反應。為避免以上問題，我們選擇自體半腱肌擴張部組織增強肩袖修復。本結果顯示，巨大肩袖損傷后，Mason-Allen縫合并自體半腱肌擴張部修復后，肌腱生物力學強度以及肌腱細胞數量、肌腱纖維排列顯著優于單純Mason-Allen縫合修復。我們認為，自體半腱肌擴張部修補巨大肩袖損傷不僅能提高肩袖愈合，達到滿意生物力學強度，還可提供一個支架結構有助于肩袖肌腱細胞的增殖與吸附。
綜上述，犬巨大肩袖損傷縫合并自體半腱肌擴張部修復的制動模型，可為肩袖損傷相關研究提供合適的動物模型。但本研究也存在不足之處：①樣本量太少，缺乏大樣本數據分析，對結果的預判可能存在偏差；②觀察時間僅6周，遠期腱-骨愈合療效有待驗證；③缺少更多的定量分析指標。以上不足均有待進一步研究完善。
