引用本文： 莫翠萍, 任力杰, 趙振富, 周光前, 姚曉璐, 龔飛鵬, 陳鋼. BMSCs移植治療大鼠脊髓損傷效果及局部細胞因子表達變化. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(3): 265-271. doi: 10.7507/1002-1892.20160054 復制
脊髓損傷的病理生理過程包括兩個階段：原發性損傷（物理機械性損傷）和繼發性損傷，繼發性損傷是原發性損傷后短期內局部缺血和炎性反應造成的脊髓神經組織再次損傷。繼發性損傷后會出現局部缺血，大量神經細胞壞死、免疫炎性反應、氧自由基釋放、離子通道紊亂、星形膠質細胞膠質化、幸存的軸突發生脫髓鞘改變等[1]。這一系列繼發性損傷又通過細胞分子水平的級聯放大作用，導致原發性損傷再次擴大[2]。內源性修復和機體的再生機制可減輕繼發性損傷，主要通過星形膠質細胞膠質化、血管再生、重建損傷的神經環路等達到修復效果[3]。因此，控制脊髓繼發性損傷炎性因子的分泌為脊髓損傷再生修復研究提供了一個潛在的切入點。
BMSCs具有多向分化潛能，通過外源移植可替代脊髓損傷丟失的神經細胞，又因其可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞和成肌細胞，且具有較低的免疫原性與免疫抑制性，在干細胞移植治療脊髓損傷研究中具有較廣闊的應用前景。本研究通過Allen撞擊裝置制備大鼠T9、10脊髓損傷模型，檢測BMSCs移植治療后相關神經標志物的表達情況，同時采用抗體芯片技術檢測局部細胞因子表達變化，從細胞分泌方面進一步探討脊髓損傷修復的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級8周齡雌性SD大鼠15只，體質量250～300 g，由廣東省醫學動物實驗中心提供。L-DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶、FBS（GIBCO公司，美國）；小鼠抗巢蛋白（Nestin）抗體、兔抗神經元特異性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）抗體、鼠抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、Alexa Fluor 94驢抗兔IgG（H+L）熒光抗體、AlexaFluor 594驢抗鼠IgG（H+L）熒光抗體（Abcam公司，英國）；Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG（H+L）熒光抗體（Invitrogen公司，美國）；戊巴比妥鈉（Ekear公司，美國）。RayBiotech抗體芯片AAR-CYT-1-8（RayBiotech公司，美國）。熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ImageJ 2X軟件（Rawak software公司，德國）。
1.2 大鼠BMSCs分離培養及鑒定
取3只大鼠，腹腔注射過量2%戊巴比妥鈉處死。取雙側股骨，剔除骨表面肌肉及軟組織，PBS洗3次，用注射器抽取L-DMEM培養基，插入骨髓腔中沖出骨髓液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后更換培養液，棄除漂浮骨組織、軟組織及血細胞等雜細胞。之后根據細胞生長情況，2～3 d更換培養液，待8～10 d細胞融合至80%左右進行傳代。經倒置相差顯微鏡觀察細胞形態以及流式細胞儀檢測細胞表面標記物，鑒定培養細胞為BMSCs。
1.3 BMSCs標記及觀察
取5μL腺病毒rAd-EGFP（1×1010?PFU/mL，由深圳百恩維生物科技有限公司構建），稀釋于2?mL L-DMEM培養基中，感染復數為100。取第5代BMSCs，取5×105個接種于直徑為6 cm的細胞培養皿，待細胞充分貼壁鋪展開后，加入稀釋的腺病毒rAd-EGFP以及2μL Polybrene助轉劑（8?mg/mL）。37℃培養箱中孵育1 h，棄病毒液，更換完全培養基進行培養。轉染后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光表達情況。
1.4 動物模型制備及分組
取12只大鼠根據處理方法不同，隨機分為實驗組及對照組，每組6只。兩組大鼠以腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉后，俯臥四肢固定。沿T10處正中線作長約3 cm縱切口，逐層切開暴露棘突、椎板和橫突。確定T10椎體位置，分別暴露其上、下棘突及椎板，用咬骨鉗咬除棘突、椎板，暴露T10脊髓。用改良Allen撞擊裝置制備脊髓損傷模型，具體步驟：用拉鉤拉開脊髓兩側軟組織，使質量為40 g的撞擊棒從5 cm高套管內自由落體，致傷能量200?g·cm。造模成功標準[4]：硬脊膜保持完整且呈紫紅色，撞擊后脊髓組織出現水腫出血、膨脹，大鼠尾巴偶出現痙攣性擺動。兩組大鼠均造模成功。
模型制備后，實驗組用胰島素注射器吸取10?μL標記的BMSCs（1×106個），分別于脊髓損傷頭、尾側2 mm處注射，留針1 min。對照組同法注射10μL PBS。常規分層縫合切口。術后7 d內每日腹腔注射慶大霉素，預防感染；人工排尿直至大鼠恢復自主排尿。
1.5 觀測指標
1.5.1 一般情況
術后觀察大鼠存活、切口愈合以及飲食等情況。觀察兩組大鼠肢體運動功能恢復情況，于術后即刻及1、2、3、4、5周采用BBB評分法進行運動功能評分。
1.5.2 組織學觀察
術后5周，腹腔注射過量2%戊巴比妥鈉處死兩組大鼠，4%多聚甲醛全身灌注固定。各組取4只大鼠標本進行組織學及免疫熒光染色觀察。以原切口入路，取損傷脊髓樣本分別進行冠狀面、橫斷面切片。取部分切片行HE染色，鏡下觀察損傷脊髓愈合程度與細胞排列等情況。
1.5.3 免疫熒光染色觀察
術后5周，兩組切片用3% H2O2作用30 min消除組織內過氧化物酶，PBS洗3次。1%牛血清白蛋白與0.3%Triton X-100室溫孵育1?h進行封閉及細胞透化。一抗工作液用1%牛血清白蛋白稀釋抗體，稀釋比分別為Nestin 1:200、Neu N 1:500、GFAP 1:500；加入一抗工作液，放入濕盒內，置于4°C冰箱孵育過夜。取出玻片，常溫中復溫30 min，滴加與一抗來源配對的1:500比例稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次，封片。熒光顯微鏡下觀察Nestin、NeuN、GFAP表達情況，采用ImageJ 2X軟件檢測熒光表達量。
1.5.4 抗體芯片技術檢測脊髓損傷治療后細胞因子表達差異
術后5周，實驗組及對照組各取1只大鼠，原切口入路取損傷脊髓約0.5 cm，將脊髓組織蛋白樣品置于細胞凍存管后液氮保存，進行細胞因子抗體芯片檢測。采用RayBiotech抗體芯片AAR-CYT-1-8檢測19個細胞因子表達量，并計算實驗組及對照組比值；包括：中性粒細胞趨化因子2 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 2，CINC-2)、CINC-3、睫狀肌營養因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF)、炎性內皮趨化因子（Fractaline）、粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-mac rophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、脂多糖趨化因子（lipopolysaccharide chemotactic factor，LIX）、瘦素（Leptin）、單核細胞趨化蛋白1 (chemoattractant protein 1，MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白3α（macrophage inflammatory protein 3α，MIP-3α）、β-NGF、基質金屬蛋白酶組織抑制劑1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)、TNF-α、VEGF。以變化倍數（實驗組/對照組）> 1.5以及< 0.7作為存在差異的閾值。
1.6 統計學方法
采用SPSS15.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs標記觀察
熒光顯微鏡下觀察，經過腺病毒rAd-EGFP轉染后的BMSCs大部分攜帶綠色熒光蛋白，轉染率達60%以上（圖 1）。
圖1
熒光顯微鏡觀察轉染后BMSCs（×200） 圖 2術后5周兩組大鼠脊髓組織學觀察（HE×40）箭頭示損傷中心 ? 對照組橫斷面 ? 實驗組橫斷面 ? 對照組冠狀面 ? 實驗組冠狀面 圖 3術后5周兩組免疫熒光染色觀察（×200） ? 對照組Nestin表達 ? 實驗組Nestin表達 ? 對照組NeuN表達 ? 實驗組NeuN表達 ? 對照組GFAP表達 ? 實驗組GFAP表達 圖 4兩組細胞因子表達差異情況 1: CNTF 2: TIMP-1 3：IL-1β4: GM-CSF 5: TNF-α6: Leptin ? 對照組 ? 實驗組
Figure1.
BMSCs observation under fluorescence microscope after transfection (×200) Fig. 2 Histological observation of spinal cord in 2 groups after 5 weeks (HE×40) Arrow indicated the injury site ? Transverse section in the control group ? Transverse section in the experimental group ? Coronal section in the control group ? Coronal section in the experimental group Fig. 3 Immunofluorescent staining of spinal cord in 2 groups after 5 weeks (×200) ? Nestin expression in the control group ? Nestin expression in the experimental group ? NeuN expression in the control group ? NeuN expression in the experimental group ? GFAP expression in the control group ? GFAP expression in the experimental group Fig. 4 Expressions of cytokines in 2 groups 1: CNTF 2: TIMP-1 3: IL-1β4: GM-CSF 5: TNF-α6: Leptin ? Control group ? Experimental group
2.2 一般情況
術后5周實驗組及對照組各2只大鼠因尿路感染死亡，其余大鼠均存活至實驗完成。兩組存活大鼠切口均愈合良好，表皮平整，切口處肌肉匯合生長，覆蓋損傷的脊髓。
術后對照組大鼠肢體運動功能逐漸恢復，但4周后無顯著提高；而實驗組大鼠5周內運動功能呈逐步恢復趨勢，且優于對照組。除術后即刻兩組BBB評分比較差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余各時間點實驗組均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點兩組大鼠BBB評分比較（n=4，2.3 組織學觀察
術后5周，實驗組脊髓灰質結構較紊亂，細胞排列稍不整齊，有較小壞死區形成的空洞，但白質部分保持完整，瘢痕組織較少，脊髓組織結構均較清晰。對照組可見灰質幾乎全部被破壞，并形成巨大的空腔，完整的細胞結構較少，瘢痕組織較實驗組多，其白質區范圍也較實驗組窄，結構較紊亂。見圖 2。
2.4 免疫熒光染色觀察
術后5周，對照組僅見少量Nestin、NeuN陽性細胞，實驗組Nestin、NeuN陽性細胞均較對照組明顯增加；對照組GFAP陽性細胞胞體變大、粗短增生；實驗組GFAP陽性細胞呈清晰細長絲狀。見圖 3。
實驗組Nestin、NeuN熒光表達量分別為0.259±0.055、0.240±0.040，較對照組0.064±0.011、0.030±0.002顯著增加，比較差異有統計學意義（t=6.072，P=0.004；t=7.469，P=0.002）。而實驗組GFAP熒光表達量為0.161±0.022，較對照組0.285±0.059顯著降低，比較差異有統計學意義（t=3.398，P=0.027）。
2.5 脊髓損傷治療后細胞因子表達檢測
篩選結果顯示，19個細胞因子中6個表達存在差異，分別為Leptin、CNTF、GM-CSF、TNF-α、IL-1β及TIMP-1（圖 4）。其中實驗組Leptin、CNTF高于對照組，GM-CSF、TNF-α、IL-1β與TIMP-1低于對照組。見表 2。
表2
19個細胞因子表達情況
Table2.
The expressions of 19 cytokines
3 討論
研究表明，細胞因子分泌調控BMSCs治療脊髓損傷作用的機制為：BMSCs進入損傷處，分化為神經相關細胞；同時BMSCs產生神經營養因子，通過旁分泌途徑改善損傷脊髓的微環境，促進血管再生、突觸再生以及神經環路重建[5]。本研究通過探討體內脊髓損傷治療后神經相關標志物的表達情況，以及利用抗體芯片技術檢測相關細胞因子分泌情況，提供了外源干細胞進入體內通過調節損傷脊髓中細胞因子的含量，從而穩定修復微環境的證據。
Nestin是分布在細胞質的第Ⅵ類中間絲蛋白，其作為神經干細胞標記物，參與了細胞骨架的構成。在中樞神經系統發育過程中僅在胚胎期表達，出生后便停止表達[6]；同時，當神經干細胞進入成熟階段分化為神經元或膠質細胞后Nestin表達消失[7]。NeuN作為成熟神經元的特異性標記物，在神經前體細胞遷移完成之前罕見表達，細胞遷移結束后才出現表達[8]。GFAP作為星形膠質細胞的特異性標志物，與神經元的關系十分密切。有研究發現神經元與膠質細胞間存在交叉通訊，如星形膠質細胞可調節神經元的存活及突觸功能的活動[9]。輻射狀的星形膠質細胞被認為是另一類神經干細胞，其可通過不對稱分裂方式產生新的膠質細胞和神經元[10]。
本研究中實驗組Nestin表達較對照組明顯增加，說明干細胞移植對損傷脊髓組織內神經干細胞的激活有一定作用，這類細胞與脊髓損傷修復密切相關。實驗組NeuN表達較對照組亦明顯增加，說明干細胞移植對神經元修復具有重要作用。但對照組GFAP表達較實驗組明顯增加，結合BBB評分結果實驗組運動功能恢復優于對照組，說明干細胞移植后對脊髓損傷運動功能恢復有一定作用。干細胞移植后會激起體內神經相關細胞生理生化上的改變，運動神經元雖然大量壞死丟失，但膠質細胞也劇增，在形成膠質瘢痕的同時，膠質細胞本身也釋放神經營養因子，協助脊髓再生。
膠質細胞增生為脊髓損傷修復期中持續且普遍存在的標志性病理生理過程，與炎性反應的細胞因子關系密切。這類膠質細胞常出現在損傷區周圍，是由急性脊髓損傷后炎性因子激活[11]。在脊髓損傷不同時期，膠質細胞的活化增生也有不同作用。急性損傷后，早期炎性反應較重，膠質細胞大量增生，活化的膠質細胞在阻擋損傷區域擴大上起著積極作用[12]。而中晚期膠質細胞繼續活化易形成膠質瘢痕，阻擋神經軸突的再生延長[13]，阻礙了神經環路的重建，造成了神經上、下單元物質信息交流障礙，影響脊髓損傷修復；但與此同時，有部分膠質細胞也釋放神經營養因子，對脊髓損傷修復起到積極作用。本研究中對照組GFAP表達量顯著高于實驗組，即對照組中存在星形膠質細胞增生的現象，導致膠質瘢痕阻礙神經再生修復。蘇國輝[14]認為膠質瘢痕中的主要成分硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sul fate proteoglycan，CSPGs）是阻礙軸突再生的化學性屏障。BMSCs移植治療脊髓損傷可減少膠質瘢痕形成，可能是通過BMSCs分泌神經營養因子中和損傷部位不利因素，如降低星形膠質細胞核內CSPGs表達來減緩膠質瘢痕形成，促進神經再生修復[15]。但有關移植BMSCs分泌的細胞因子減弱膠質瘢痕形成的機制仍需進一步探討。
炎性反應對脊髓損傷后期修復具有一定影響，炎性反應導致的神經毒性、神經元凋亡壞死等會影響神經再生。本研究比較了脊髓損傷5周后兩組脊髓中相關炎性反應細胞因子的表達情況。結果顯示，實驗組中Leptin與CNTF均較對照組升高。Leptin是一類具有抗炎性作用的細胞因子，在急性炎性刺激的應答中具有時間依賴性[16]。Leptin可降低內毒素誘導的TNF水平，減弱TNF-α誘導的炎性級聯反應[17]，上調凋亡基因Bax、Caspase-3表達，減少神經細胞凋亡。CNTF能促使多種神經細胞的存活，是維持脊髓運動神經元存活及突起生長的神經營養因子，在神經系統發育、分化和神經損傷修復中具有重要作用。脊髓損傷后CNTF可作用于損傷部位的神經元或神經膠質細胞而發揮神經營養作用，它是中樞神經系統的一個損傷修復因子[18]。GM-CSF是一種多效能的細胞因子，一方面可促進粒細胞、巨噬細胞分化成熟，提高機體防御能力，另一方面活化的巨噬細胞可分泌多種促炎性因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，擴大炎性反應，形成炎性瀑布流[19]。對照組脊髓損傷后功能恢復較實驗組差，GM-CSF、IL-1β與TNF-α均較實驗組升高，說明損傷后導致的炎性級聯反應嚴重阻礙了脊髓修復進程。另外脊髓中樞神經中的膠質細胞可產生炎性因子和趨化因子，調控炎性細胞進入脊髓損傷區域[20]，對照組GFAP高表達與促炎性因子GM-CSF、IL-1β、TNF-α大量存在對脊髓損傷修復過程起到一定的阻礙作用。而實驗組中Leptin與CNTF的高水平表達促進了脊髓損傷后神經的再生修復，可能通過減弱TNF-α誘發的炎性瀑布與分泌神經營養因子等方式協助脊髓損傷再生。這些細胞因子參與損傷修復活動可能是由移植的BMSCs產生或是由損傷微環境啟動修復機制共同參與作用，具體機制有待進一步明確。
綜上述，脊髓損傷后炎性反應引起膠質細胞活化增生產生不利于脊髓修復的微環境，脊髓組織結構受到嚴重破壞導致細胞大量死亡，炎性因子以及壞死細胞內釋放的蛋白酶導致細胞骨架蛋白降解，神經元細胞大量死亡。當外源性BMSCs移植進入損傷區后，釋放神經營養因子，對脊髓損傷修復起到積極作用，在合適脊髓修復的膠質增生化程度較低的微環境里，GFAP陽性細胞也會釋放神經營養因子協同BMSCs分泌的神經因子促進脊髓修復。BMSCs對脊髓損傷的修復可能是通過膠質細胞與其自身共同合理調節促炎性因子與抗炎性因子的釋放，以及分泌相關神經營養因子，從旁分泌途徑上達到神經修復的作用，但這些炎性因子在脊髓損傷修復過程中發揮的具體作用機制有待進一步探究。
脊髓損傷的病理生理過程包括兩個階段：原發性損傷（物理機械性損傷）和繼發性損傷，繼發性損傷是原發性損傷后短期內局部缺血和炎性反應造成的脊髓神經組織再次損傷。繼發性損傷后會出現局部缺血，大量神經細胞壞死、免疫炎性反應、氧自由基釋放、離子通道紊亂、星形膠質細胞膠質化、幸存的軸突發生脫髓鞘改變等[1]。這一系列繼發性損傷又通過細胞分子水平的級聯放大作用，導致原發性損傷再次擴大[2]。內源性修復和機體的再生機制可減輕繼發性損傷，主要通過星形膠質細胞膠質化、血管再生、重建損傷的神經環路等達到修復效果[3]。因此，控制脊髓繼發性損傷炎性因子的分泌為脊髓損傷再生修復研究提供了一個潛在的切入點。
BMSCs具有多向分化潛能，通過外源移植可替代脊髓損傷丟失的神經細胞，又因其可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞和成肌細胞，且具有較低的免疫原性與免疫抑制性，在干細胞移植治療脊髓損傷研究中具有較廣闊的應用前景。本研究通過Allen撞擊裝置制備大鼠T9、10脊髓損傷模型，檢測BMSCs移植治療后相關神經標志物的表達情況，同時采用抗體芯片技術檢測局部細胞因子表達變化，從細胞分泌方面進一步探討脊髓損傷修復的機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
SPF級8周齡雌性SD大鼠15只，體質量250～300 g，由廣東省醫學動物實驗中心提供。L-DMEM培養基、0.25%胰蛋白酶、FBS（GIBCO公司，美國）；小鼠抗巢蛋白（Nestin）抗體、兔抗神經元特異性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）抗體、鼠抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、Alexa Fluor 94驢抗兔IgG（H+L）熒光抗體、AlexaFluor 594驢抗鼠IgG（H+L）熒光抗體（Abcam公司，英國）；Alexa Fluor 488羊抗鼠IgG（H+L）熒光抗體（Invitrogen公司，美國）；戊巴比妥鈉（Ekear公司，美國）。RayBiotech抗體芯片AAR-CYT-1-8（RayBiotech公司，美國）。熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；ImageJ 2X軟件（Rawak software公司，德國）。
1.2 大鼠BMSCs分離培養及鑒定
取3只大鼠，腹腔注射過量2%戊巴比妥鈉處死。取雙側股骨，剔除骨表面肌肉及軟組織，PBS洗3次，用注射器抽取L-DMEM培養基，插入骨髓腔中沖出骨髓液，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后更換培養液，棄除漂浮骨組織、軟組織及血細胞等雜細胞。之后根據細胞生長情況，2～3 d更換培養液，待8～10 d細胞融合至80%左右進行傳代。經倒置相差顯微鏡觀察細胞形態以及流式細胞儀檢測細胞表面標記物，鑒定培養細胞為BMSCs。
1.3 BMSCs標記及觀察
取5μL腺病毒rAd-EGFP（1×1010?PFU/mL，由深圳百恩維生物科技有限公司構建），稀釋于2?mL L-DMEM培養基中，感染復數為100。取第5代BMSCs，取5×105個接種于直徑為6 cm的細胞培養皿，待細胞充分貼壁鋪展開后，加入稀釋的腺病毒rAd-EGFP以及2μL Polybrene助轉劑（8?mg/mL）。37℃培養箱中孵育1 h，棄病毒液，更換完全培養基進行培養。轉染后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光表達情況。
1.4 動物模型制備及分組
取12只大鼠根據處理方法不同，隨機分為實驗組及對照組，每組6只。兩組大鼠以腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉后，俯臥四肢固定。沿T10處正中線作長約3 cm縱切口，逐層切開暴露棘突、椎板和橫突。確定T10椎體位置，分別暴露其上、下棘突及椎板，用咬骨鉗咬除棘突、椎板，暴露T10脊髓。用改良Allen撞擊裝置制備脊髓損傷模型，具體步驟：用拉鉤拉開脊髓兩側軟組織，使質量為40 g的撞擊棒從5 cm高套管內自由落體，致傷能量200?g·cm。造模成功標準[4]：硬脊膜保持完整且呈紫紅色，撞擊后脊髓組織出現水腫出血、膨脹，大鼠尾巴偶出現痙攣性擺動。兩組大鼠均造模成功。
模型制備后，實驗組用胰島素注射器吸取10?μL標記的BMSCs（1×106個），分別于脊髓損傷頭、尾側2 mm處注射，留針1 min。對照組同法注射10μL PBS。常規分層縫合切口。術后7 d內每日腹腔注射慶大霉素，預防感染；人工排尿直至大鼠恢復自主排尿。
1.5 觀測指標
1.5.1 一般情況
術后觀察大鼠存活、切口愈合以及飲食等情況。觀察兩組大鼠肢體運動功能恢復情況，于術后即刻及1、2、3、4、5周采用BBB評分法進行運動功能評分。
1.5.2 組織學觀察
術后5周，腹腔注射過量2%戊巴比妥鈉處死兩組大鼠，4%多聚甲醛全身灌注固定。各組取4只大鼠標本進行組織學及免疫熒光染色觀察。以原切口入路，取損傷脊髓樣本分別進行冠狀面、橫斷面切片。取部分切片行HE染色，鏡下觀察損傷脊髓愈合程度與細胞排列等情況。
1.5.3 免疫熒光染色觀察
術后5周，兩組切片用3% H2O2作用30 min消除組織內過氧化物酶，PBS洗3次。1%牛血清白蛋白與0.3%Triton X-100室溫孵育1?h進行封閉及細胞透化。一抗工作液用1%牛血清白蛋白稀釋抗體，稀釋比分別為Nestin 1:200、Neu N 1:500、GFAP 1:500；加入一抗工作液，放入濕盒內，置于4°C冰箱孵育過夜。取出玻片，常溫中復溫30 min，滴加與一抗來源配對的1:500比例稀釋的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS沖洗3次，封片。熒光顯微鏡下觀察Nestin、NeuN、GFAP表達情況，采用ImageJ 2X軟件檢測熒光表達量。
1.5.4 抗體芯片技術檢測脊髓損傷治療后細胞因子表達差異
術后5周，實驗組及對照組各取1只大鼠，原切口入路取損傷脊髓約0.5 cm，將脊髓組織蛋白樣品置于細胞凍存管后液氮保存，進行細胞因子抗體芯片檢測。采用RayBiotech抗體芯片AAR-CYT-1-8檢測19個細胞因子表達量，并計算實驗組及對照組比值；包括：中性粒細胞趨化因子2 (cytokine-induced neutrophil chemoattractant 2，CINC-2)、CINC-3、睫狀肌營養因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF)、炎性內皮趨化因子（Fractaline）、粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-mac rophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、干擾素γ（interferonγ，IFN-γ）、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、脂多糖趨化因子（lipopolysaccharide chemotactic factor，LIX）、瘦素（Leptin）、單核細胞趨化蛋白1 (chemoattractant protein 1，MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白3α（macrophage inflammatory protein 3α，MIP-3α）、β-NGF、基質金屬蛋白酶組織抑制劑1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)、TNF-α、VEGF。以變化倍數（實驗組/對照組）> 1.5以及< 0.7作為存在差異的閾值。
1.6 統計學方法
采用SPSS15.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs標記觀察
熒光顯微鏡下觀察，經過腺病毒rAd-EGFP轉染后的BMSCs大部分攜帶綠色熒光蛋白，轉染率達60%以上（圖 1）。
圖1
熒光顯微鏡觀察轉染后BMSCs（×200） 圖 2術后5周兩組大鼠脊髓組織學觀察（HE×40）箭頭示損傷中心 ? 對照組橫斷面 ? 實驗組橫斷面 ? 對照組冠狀面 ? 實驗組冠狀面 圖 3術后5周兩組免疫熒光染色觀察（×200） ? 對照組Nestin表達 ? 實驗組Nestin表達 ? 對照組NeuN表達 ? 實驗組NeuN表達 ? 對照組GFAP表達 ? 實驗組GFAP表達 圖 4兩組細胞因子表達差異情況 1: CNTF 2: TIMP-1 3：IL-1β4: GM-CSF 5: TNF-α6: Leptin ? 對照組 ? 實驗組
Figure1.
BMSCs observation under fluorescence microscope after transfection (×200) Fig. 2 Histological observation of spinal cord in 2 groups after 5 weeks (HE×40) Arrow indicated the injury site ? Transverse section in the control group ? Transverse section in the experimental group ? Coronal section in the control group ? Coronal section in the experimental group Fig. 3 Immunofluorescent staining of spinal cord in 2 groups after 5 weeks (×200) ? Nestin expression in the control group ? Nestin expression in the experimental group ? NeuN expression in the control group ? NeuN expression in the experimental group ? GFAP expression in the control group ? GFAP expression in the experimental group Fig. 4 Expressions of cytokines in 2 groups 1: CNTF 2: TIMP-1 3: IL-1β4: GM-CSF 5: TNF-α6: Leptin ? Control group ? Experimental group
2.2 一般情況
術后5周實驗組及對照組各2只大鼠因尿路感染死亡，其余大鼠均存活至實驗完成。兩組存活大鼠切口均愈合良好，表皮平整，切口處肌肉匯合生長，覆蓋損傷的脊髓。
術后對照組大鼠肢體運動功能逐漸恢復，但4周后無顯著提高；而實驗組大鼠5周內運動功能呈逐步恢復趨勢，且優于對照組。除術后即刻兩組BBB評分比較差異無統計學意義（P > 0.05）外，其余各時間點實驗組均顯著高于對照組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點兩組大鼠BBB評分比較（n=4，2.3 組織學觀察
術后5周，實驗組脊髓灰質結構較紊亂，細胞排列稍不整齊，有較小壞死區形成的空洞，但白質部分保持完整，瘢痕組織較少，脊髓組織結構均較清晰。對照組可見灰質幾乎全部被破壞，并形成巨大的空腔，完整的細胞結構較少，瘢痕組織較實驗組多，其白質區范圍也較實驗組窄，結構較紊亂。見圖 2。
2.4 免疫熒光染色觀察
術后5周，對照組僅見少量Nestin、NeuN陽性細胞，實驗組Nestin、NeuN陽性細胞均較對照組明顯增加；對照組GFAP陽性細胞胞體變大、粗短增生；實驗組GFAP陽性細胞呈清晰細長絲狀。見圖 3。
實驗組Nestin、NeuN熒光表達量分別為0.259±0.055、0.240±0.040，較對照組0.064±0.011、0.030±0.002顯著增加，比較差異有統計學意義（t=6.072，P=0.004；t=7.469，P=0.002）。而實驗組GFAP熒光表達量為0.161±0.022，較對照組0.285±0.059顯著降低，比較差異有統計學意義（t=3.398，P=0.027）。
2.5 脊髓損傷治療后細胞因子表達檢測
篩選結果顯示，19個細胞因子中6個表達存在差異，分別為Leptin、CNTF、GM-CSF、TNF-α、IL-1β及TIMP-1（圖 4）。其中實驗組Leptin、CNTF高于對照組，GM-CSF、TNF-α、IL-1β與TIMP-1低于對照組。見表 2。
表2
19個細胞因子表達情況
Table2.
The expressions of 19 cytokines
3 討論
研究表明，細胞因子分泌調控BMSCs治療脊髓損傷作用的機制為：BMSCs進入損傷處，分化為神經相關細胞；同時BMSCs產生神經營養因子，通過旁分泌途徑改善損傷脊髓的微環境，促進血管再生、突觸再生以及神經環路重建[5]。本研究通過探討體內脊髓損傷治療后神經相關標志物的表達情況，以及利用抗體芯片技術檢測相關細胞因子分泌情況，提供了外源干細胞進入體內通過調節損傷脊髓中細胞因子的含量，從而穩定修復微環境的證據。
Nestin是分布在細胞質的第Ⅵ類中間絲蛋白，其作為神經干細胞標記物，參與了細胞骨架的構成。在中樞神經系統發育過程中僅在胚胎期表達，出生后便停止表達[6]；同時，當神經干細胞進入成熟階段分化為神經元或膠質細胞后Nestin表達消失[7]。NeuN作為成熟神經元的特異性標記物，在神經前體細胞遷移完成之前罕見表達，細胞遷移結束后才出現表達[8]。GFAP作為星形膠質細胞的特異性標志物，與神經元的關系十分密切。有研究發現神經元與膠質細胞間存在交叉通訊，如星形膠質細胞可調節神經元的存活及突觸功能的活動[9]。輻射狀的星形膠質細胞被認為是另一類神經干細胞，其可通過不對稱分裂方式產生新的膠質細胞和神經元[10]。
本研究中實驗組Nestin表達較對照組明顯增加，說明干細胞移植對損傷脊髓組織內神經干細胞的激活有一定作用，這類細胞與脊髓損傷修復密切相關。實驗組NeuN表達較對照組亦明顯增加，說明干細胞移植對神經元修復具有重要作用。但對照組GFAP表達較實驗組明顯增加，結合BBB評分結果實驗組運動功能恢復優于對照組，說明干細胞移植后對脊髓損傷運動功能恢復有一定作用。干細胞移植后會激起體內神經相關細胞生理生化上的改變，運動神經元雖然大量壞死丟失，但膠質細胞也劇增，在形成膠質瘢痕的同時，膠質細胞本身也釋放神經營養因子，協助脊髓再生。
膠質細胞增生為脊髓損傷修復期中持續且普遍存在的標志性病理生理過程，與炎性反應的細胞因子關系密切。這類膠質細胞常出現在損傷區周圍，是由急性脊髓損傷后炎性因子激活[11]。在脊髓損傷不同時期，膠質細胞的活化增生也有不同作用。急性損傷后，早期炎性反應較重，膠質細胞大量增生，活化的膠質細胞在阻擋損傷區域擴大上起著積極作用[12]。而中晚期膠質細胞繼續活化易形成膠質瘢痕，阻擋神經軸突的再生延長[13]，阻礙了神經環路的重建，造成了神經上、下單元物質信息交流障礙，影響脊髓損傷修復；但與此同時，有部分膠質細胞也釋放神經營養因子，對脊髓損傷修復起到積極作用。本研究中對照組GFAP表達量顯著高于實驗組，即對照組中存在星形膠質細胞增生的現象，導致膠質瘢痕阻礙神經再生修復。蘇國輝[14]認為膠質瘢痕中的主要成分硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sul fate proteoglycan，CSPGs）是阻礙軸突再生的化學性屏障。BMSCs移植治療脊髓損傷可減少膠質瘢痕形成，可能是通過BMSCs分泌神經營養因子中和損傷部位不利因素，如降低星形膠質細胞核內CSPGs表達來減緩膠質瘢痕形成，促進神經再生修復[15]。但有關移植BMSCs分泌的細胞因子減弱膠質瘢痕形成的機制仍需進一步探討。
炎性反應對脊髓損傷后期修復具有一定影響，炎性反應導致的神經毒性、神經元凋亡壞死等會影響神經再生。本研究比較了脊髓損傷5周后兩組脊髓中相關炎性反應細胞因子的表達情況。結果顯示，實驗組中Leptin與CNTF均較對照組升高。Leptin是一類具有抗炎性作用的細胞因子，在急性炎性刺激的應答中具有時間依賴性[16]。Leptin可降低內毒素誘導的TNF水平，減弱TNF-α誘導的炎性級聯反應[17]，上調凋亡基因Bax、Caspase-3表達，減少神經細胞凋亡。CNTF能促使多種神經細胞的存活，是維持脊髓運動神經元存活及突起生長的神經營養因子，在神經系統發育、分化和神經損傷修復中具有重要作用。脊髓損傷后CNTF可作用于損傷部位的神經元或神經膠質細胞而發揮神經營養作用，它是中樞神經系統的一個損傷修復因子[18]。GM-CSF是一種多效能的細胞因子，一方面可促進粒細胞、巨噬細胞分化成熟，提高機體防御能力，另一方面活化的巨噬細胞可分泌多種促炎性因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，擴大炎性反應，形成炎性瀑布流[19]。對照組脊髓損傷后功能恢復較實驗組差，GM-CSF、IL-1β與TNF-α均較實驗組升高，說明損傷后導致的炎性級聯反應嚴重阻礙了脊髓修復進程。另外脊髓中樞神經中的膠質細胞可產生炎性因子和趨化因子，調控炎性細胞進入脊髓損傷區域[20]，對照組GFAP高表達與促炎性因子GM-CSF、IL-1β、TNF-α大量存在對脊髓損傷修復過程起到一定的阻礙作用。而實驗組中Leptin與CNTF的高水平表達促進了脊髓損傷后神經的再生修復，可能通過減弱TNF-α誘發的炎性瀑布與分泌神經營養因子等方式協助脊髓損傷再生。這些細胞因子參與損傷修復活動可能是由移植的BMSCs產生或是由損傷微環境啟動修復機制共同參與作用，具體機制有待進一步明確。
綜上述，脊髓損傷后炎性反應引起膠質細胞活化增生產生不利于脊髓修復的微環境，脊髓組織結構受到嚴重破壞導致細胞大量死亡，炎性因子以及壞死細胞內釋放的蛋白酶導致細胞骨架蛋白降解，神經元細胞大量死亡。當外源性BMSCs移植進入損傷區后，釋放神經營養因子，對脊髓損傷修復起到積極作用，在合適脊髓修復的膠質增生化程度較低的微環境里，GFAP陽性細胞也會釋放神經營養因子協同BMSCs分泌的神經因子促進脊髓修復。BMSCs對脊髓損傷的修復可能是通過膠質細胞與其自身共同合理調節促炎性因子與抗炎性因子的釋放，以及分泌相關神經營養因子，從旁分泌途徑上達到神經修復的作用，但這些炎性因子在脊髓損傷修復過程中發揮的具體作用機制有待進一步探究。
