引用本文： 秦王馳, 梁智, 楊衛國, 林海波. 不同直徑軸狀脂肪移植的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(2): 229-236. doi: 10.7507/1002-1892.20160047 復制
目前，脂肪移植是一種常用的自體軟組織填充方法，但移植后外形的維持仍是未解決的問題。研究表明，患者年齡、取材部位不是影響療效的主要因素，取脂方法和脂肪處理方法對細胞活性有顯著作用，是影響療效的主要因素[1-4]。臨床常用的脂肪移植方法是通過負壓吸引等一系列處理，以脂肪顆粒模式進行的注射式細胞移植[5-6]。操作過程中，細胞會暴露于空氣中，增加了細胞損傷和感染風險[7]，并且移植早期脂肪細胞僅依靠受區滲液存活，中心區域組織往往發生壞死，導致移植后外形難以維持。
在參考既往研究[8-9]基礎上，我們設計了以改良1?mL注射器為取脂工具的軸狀脂肪移植方法。前期研究表明，軸狀脂肪移植方法不僅操作簡便，還維持了脂肪組織的完整性，從而維持了脂肪正常的結構和血供系統，移植至受區后能更快地在組織內外重建血運，有利于術后形態長期維持[10]。但改良1?mL注射器制備的取脂工具結構粗糙，軸狀脂肪邊緣細胞破壞較嚴重，而且每次游離的組織量較少。為了提高軸狀脂肪移植方法的應用效果，進一步改善細胞活性，我們設計出不同規格的取脂工具，現探討其可行性及效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～4周齡免疫缺陷裸鼠64只，雌雄不限，體質量8.6～12.2 g，由廣東省實驗動物中心提供。DMEM培養液（廣州賽業生物科技有限公司）；MTT（廣州朗日生物技術有限公司）；CD34單克隆抗體、即用型酶標羊抗鼠/兔聚合物（福州邁新生物技術開發有限公司）。多功能恒溫孵育箱（北京創美偉業科技有限公司）；ELX808酶標儀（Biotec公司，美國）；離心機（ThermoFisher公司，德國）；AB104-S精密天平（Mettler Toledo公司，瑞典）；生化分析儀（DADE公司，美國）；顯微鏡、DP2-TWAIN圖像分析系統（Olympus公司，日本）。
1.2 軸狀脂肪移植取脂工具設計
根據1 mL注射器結構設計取脂工具[10]，其為筒狀活塞式不銹鋼結構，通過回抽活塞將脂肪吸入；前端為斜面，邊緣圓鈍以避免對細胞的切割破壞，管壁厚度為1.5 mm，減少對組織邊緣的擠壓。為確保抽吸時形成腔內負壓并良好密閉，在活塞頂端加用醫用硅膠制備的密封圈。通過讀取活塞側壁的刻度，可知抽出脂肪體積。脂肪小葉大小為0.8～1.0?mm[11]，假定每次移植可獲取完整脂肪小葉，為了對比不同直徑軸狀脂肪的存活情況，取脂工具內徑設計為4、6、8、10 mm。
1.3 脂肪抽取及體外檢測
1.3.1 脂肪抽取
實驗用脂肪由2014年5月－2015年4月于深圳市南山區人民醫院燒傷整形美容科行自體脂肪移植的12例患者自愿捐贈，用同一內徑取脂工具分別隨機在3例患者同一供區抽取脂肪。具體抽取方法：以下腹部作為脂肪供區，0.05%利多卡因及1∶20萬U腎上腺素生理鹽水浸潤麻醉后，在自然皮膚皺褶處作長約5 mm切口。將內徑為4?mm的取脂工具針筒斜面朝前，插入切口，向皮下脂肪組織旋轉推進，輕輕回抽針塞，盡量避免形成負壓，主要依靠組織擠壓使脂肪進入注射器內。取脂同時在腹部體表抓捏，使周圍組織盡量向取脂工具的方向靠攏。脂肪取出后將針筒垂直放置，截面覆蓋無菌紗布，靜置時間約5 min，吸棄沉淀的腫脹液，置于4℃標本盒中備用。同法采用內徑為6、8、10?mm的取脂工具抽取脂肪。于抽取脂肪后30 min內進行動物實驗。
1.3.2 觀測指標
①葡萄糖轉移實驗：將抽取的脂肪標本分別置于無菌培養皿中，每個培養皿中加入1?mL含糖（15?mmol/L）無血清DMEM及0.2 U普通胰島素，同時設置只含胰島素或DMEM的空白對照。搖勻后置入35℃、5%CO2恒溫孵育箱孵育1 h后，用生化分析儀測定培養液中的葡萄糖濃度。以空白對照與脂肪標本的濃度差值，作為脂肪標本葡萄糖轉移量。②脂肪細胞活性測定：采用MTT法測定脂肪細胞活性。分別取0.5 mL不同內徑取脂工具抽取的脂肪標本，混合10 mL MTT和0.2 mL電子耦合試劑后，加入含10%PBS的DMEM培養基（2 mL/孔）的24孔板，每孔1.5 mL；置于37℃、5%CO2恒溫孵育箱內，于0、1、2、3 h各取1 mL培養液，采用ELX808酶標儀于492?nm處測量吸光度（A）值。
1.4 體內脂肪移植及觀測
1.4.1 脂肪移植
將64只裸鼠隨機分為A、B、C、D 4組，每組16只。動物腹腔注射0.1%水合氯醛（10～12 mg/kg）麻醉后，A、B、C、D組裸鼠根據取脂工具內徑，于背部遠端分別作4、6、8、10 mm長橫切口，形成皮下腔隙，對應移植0.5 mL不同內徑取脂工具抽取的脂肪組織，縫合切口。見圖 1。
圖1
手術操作過程 ?植入前 ?植入后 ? ?圖 2 MTT法測定脂肪細胞活性 ? ?圖 3 植入后各時間點脂肪標本大體觀察從左至右分別為A、B、C、D組 ?植入后1周 ?植入后2周 ?植入后4周 ?植入后8周
Figure1.
Operative procedure ?Before transplantation ?After transplantation ? ?Fig. 2 The cell viability detection by MTT ? ?Fig. 3 Gross investigation of fat tissue in 4 groups after transplantation From left to right for groups A,B,C,and D respectively ?At 1 week ?At 2?weeks ?At 4 weeks ?At 8 weeks
1.4.2 觀測指標
①大體觀察：觀察各組裸鼠存活情況。脂肪植入后即刻以及1、2、4、8周，觀察各組裸鼠背部脂肪植入部位外觀。植入后1、2、4、8周采用斷頸法每組各處死4只裸鼠，完整取出剩余移植脂肪，肉眼觀察脂肪色澤及形態。 ②移植脂肪稱重：脂肪植入前以及植入后即刻，1、2、4、8周，采用AB104-S精密天平對裸鼠稱重，以植入后各時間點與植入前的體質量差值，作為移植脂肪質量。③組織學觀察：植入后1、2、4、8周大體觀察后，將脂肪標本置于10%中性甲醛固定48 h，脫水、石蠟包埋、切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，鏡下觀察組織和脂肪細胞形態結構。每個標本取中心部分的2 張切片，每張切片沿縱向正中線等間距取5個視野，于200倍視野下計數完整細胞，以全部視野細胞總數作為該標本完整細胞數。完整細胞標準[11-12]：未見明顯擠壓、變形，細胞壁完整清楚，細胞核結構清晰可見。④免疫組織化學染色觀察：植入后1、2、4、8周，取脂肪標本同一位置切片進行免疫組織化學染色，采用Ⅷ因子標記毛細血管，鏡下觀察毛細血管分布、形態結構。每個標本取中心部分的2張切片，每張切片沿縱向正中線等間距取5個視野，于200倍視野下計數毛細血管數量，以全部視野毛細血管總數作為該標本毛細血管數。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 體外觀測
2.1.1 葡萄糖轉移實驗
內徑為4、6、8、10 mm取脂工具抽取的脂肪標本葡萄糖轉移量分別為（1.512±0.078）、（1.598±0.040）、（1.731±0.053）、（1.889±0.069）mmol/L。隨取脂工具內徑增加，葡萄糖轉移量逐漸增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.1.2 脂肪細胞活性測定
隨著觀察時間延長，各組A值均逐漸降低，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。同一時間點，隨取脂工具內徑增加，A值均呈逐漸增加趨勢，其中A、B組與D組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
2.2 動物實驗
2.2.1 大體觀察
4組實驗動物均存活至實驗完成。植入脂肪組織后，各組裸鼠背部受區部位皮膚明顯隆起，但隨時間延長，背部均趨于平坦；C、D組隆起程度優于A、B組。植入后1、2周，4組取出的脂肪標本顏色、形態無明顯差異；4、8周時A、B組脂肪標本收縮，呈暗白色，內部出現液化壞死區域，C、D組脂肪標本仍保持原黃色和集聚形態，可見血管長入脂肪組織。見圖 3。
2.2.2 移植脂肪稱重
脂肪植入后即刻及1周時，4 組脂肪質量比較差異無統計學意義（P>0.05）。2、4、8周時，A組脂肪質量明顯小于其他3組，B組小于C、D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、D組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后各組移植脂肪質量比較（n=4，g，2.2.3 組織學觀察
植入后1周，各組移植脂肪細胞結構清楚，組織邊緣無明顯細胞壞死、溶解等炎性反應；其中A、B、C組脂肪小葉受壓較明顯，D組脂肪細胞呈輕度受壓狀態，細胞形態接近正常。2周，D組脂肪細胞形態優于其余3組，細胞間炎性浸潤及膠原纖維增生少，中心區域的淋巴細胞浸潤不明顯。4周，A、B組出現較多的細胞破壞溶解和大泡現象，細胞形態不規則；C、D組炎性浸潤及膠原纖維增生主要集中于組織塊邊緣，但細胞結構接近正常。8周，A、B、C組可見明顯增生的膠原纖維及其間內散在的脂肪細胞，以及脂肪細胞融合后形成的大泡，淋巴細胞較前減少；D組脂肪小葉結構基本保持正常，脂肪細胞完整性較好，大小均勻，血管密度高。見圖 4。
圖2
植入后各時間點脂肪標本組織學觀察（HE×200） 從左至右分別為A、B、C、D組 ?植入后1周 ?植入后2周 ?植入后4 周 ?植入后8周
Figure2.
Histological observation of fat tissue in 4 groups after transplantation (HE×200) From left to right for groups A,B,C,and D respectively ?At 1 week ?At 2 weeks ?At 4 weeks ?At 8 weeks
完整脂肪細胞計數顯示，植入后1周各組完整脂肪細胞數比較，差異無統計學意義（P>0.05）；其余各時間點，A組完整脂肪細胞數明顯少于其余3組，B組少于C、D組，比較差異有統計學意義（P<0.05），C、D組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
植入后各時間點各組完整脂肪細胞數比較（n=4，2.2.4 免疫組織化學染色觀察
植入后1周，毛細血管在各組脂肪組織內均勻分布，血管無明顯擴張及變形；2周，A、B、C組毛細血管主要集中在組織邊緣，D組毛細血管則均勻分布在標本邊緣和中央，形態良好；4、8周，D組毛細血管明顯多于其余3組，血管周圍脂肪細胞存活良好。見圖 5。
圖3
植入后各時間點脂肪標本免疫組織化學染色觀察（×200） 從左至右分別為A、B、C、D組 ?植入后1周 ?植入后2周 ?植入后4周 ?植入后8周
Figure3.
Immunohistochemical observation of fat tissue in 4 groups after transplantation (×200) From left to right for groups A,B,C,and D respectively ?At 1 week ?At 2 weeks ?At 4 weeks ?At 8 weeks
毛細血管計數顯示，隨取脂工具內徑增大，各時間點A、B、C、D組毛細血管數呈增加趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
植入后各時間點各組毛細血管數比較（n=4，3 討論
脂肪組織移植后，細胞活性能否良好保持是決定術后吸收率的主要因素。脂肪組織植入受區后，早期必須依靠周圍組織間液的滲透提供營養，但是這種滲透作用的供應區域有限，只能滋養靠近受區邊緣150～200 nm范圍內的脂肪細胞[13]。若不能及時有效地建立血供，大部分脂肪細胞將發生壞死。有研究發現，移植脂肪能夠耐受的缺血時間最長期限僅為移植后4 d[14]。所以脂肪移植后若能盡早建立充足血供，將最大程度避免脂肪細胞壞死。
脂肪組織血供的建立主要靠受區血管向移植組織生長，并構建微血管體系[15-16]。通過人體脂肪移植轉基因裸鼠實驗證明[17]，移植后再生的血管不是來源于受體裸鼠，而是移植脂肪組織。因此在取材時能保持原脂肪組織結構，將有利于移植后在受區建立新的血供系統，促進脂肪組織成活。我們既往研究[10]也證明了這一點。本研究結果表明，隨著獲得的軸狀脂肪直徑增加（取脂工具內徑增加），脂肪組織移植后外觀維持更好，剩余脂肪也明顯增多。
體外葡萄糖轉移實驗和MTT結果顯示，采用內徑較大的取脂工具獲得的軸狀脂肪能保留更多的活性脂肪細胞。組織學觀察發現，改良的取脂工具基本避免了手術過程中對脂肪組織邊緣的擠壓和破壞作用，術后各時間點C、D組完整脂肪細胞數、脂肪細胞形態均優于A、B組，并且4周后D組炎性反應、中央區壞死融合程度及形成的空泡均少于A、B、C組，說明脂肪細胞結構得到最大限度保護后，術后移植組織存活更好。免疫組織化學染色提示，D組脂肪組織移植后，毛細血管數明顯高于其余組，并且分布均勻，能保證移植脂肪的血供，維持脂肪小葉的形態和組織結構。
本研究結果表明，采用內徑10 mm取脂工具獲取的軸狀脂肪移植后存活較好。但臨床應用過程中我們發現，該內徑取脂工具取脂術中疼痛程度以及術后形成局部血腫、皮下瘀斑等并發癥明顯高于其他內徑取脂工具，供區切口瘢痕也比較長。同時，我們發現C、D組細胞活性、移植脂肪質量及完整脂肪細胞數比較，差異無統計學意義，說明單純增加取脂工具內徑以增大軸狀脂肪直徑的方法在促進脂肪存活方面作用有限，且內徑>10 mm的取脂工具因相關并發癥較多也難以廣泛應用于臨床。因此，我們認為采用內徑為8、10 mm取脂工具獲取的軸狀脂肪移植效果較好。但因裸鼠存活時間有限，該結論有待延長觀察時間并臨床應用觀察明確。
目前，脂肪移植是一種常用的自體軟組織填充方法，但移植后外形的維持仍是未解決的問題。研究表明，患者年齡、取材部位不是影響療效的主要因素，取脂方法和脂肪處理方法對細胞活性有顯著作用，是影響療效的主要因素[1-4]。臨床常用的脂肪移植方法是通過負壓吸引等一系列處理，以脂肪顆粒模式進行的注射式細胞移植[5-6]。操作過程中，細胞會暴露于空氣中，增加了細胞損傷和感染風險[7]，并且移植早期脂肪細胞僅依靠受區滲液存活，中心區域組織往往發生壞死，導致移植后外形難以維持。
在參考既往研究[8-9]基礎上，我們設計了以改良1?mL注射器為取脂工具的軸狀脂肪移植方法。前期研究表明，軸狀脂肪移植方法不僅操作簡便，還維持了脂肪組織的完整性，從而維持了脂肪正常的結構和血供系統，移植至受區后能更快地在組織內外重建血運，有利于術后形態長期維持[10]。但改良1?mL注射器制備的取脂工具結構粗糙，軸狀脂肪邊緣細胞破壞較嚴重，而且每次游離的組織量較少。為了提高軸狀脂肪移植方法的應用效果，進一步改善細胞活性，我們設計出不同規格的取脂工具，現探討其可行性及效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～4周齡免疫缺陷裸鼠64只，雌雄不限，體質量8.6～12.2 g，由廣東省實驗動物中心提供。DMEM培養液（廣州賽業生物科技有限公司）；MTT（廣州朗日生物技術有限公司）；CD34單克隆抗體、即用型酶標羊抗鼠/兔聚合物（福州邁新生物技術開發有限公司）。多功能恒溫孵育箱（北京創美偉業科技有限公司）；ELX808酶標儀（Biotec公司，美國）；離心機（ThermoFisher公司，德國）；AB104-S精密天平（Mettler Toledo公司，瑞典）；生化分析儀（DADE公司，美國）；顯微鏡、DP2-TWAIN圖像分析系統（Olympus公司，日本）。
1.2 軸狀脂肪移植取脂工具設計
根據1 mL注射器結構設計取脂工具[10]，其為筒狀活塞式不銹鋼結構，通過回抽活塞將脂肪吸入；前端為斜面，邊緣圓鈍以避免對細胞的切割破壞，管壁厚度為1.5 mm，減少對組織邊緣的擠壓。為確保抽吸時形成腔內負壓并良好密閉，在活塞頂端加用醫用硅膠制備的密封圈。通過讀取活塞側壁的刻度，可知抽出脂肪體積。脂肪小葉大小為0.8～1.0?mm[11]，假定每次移植可獲取完整脂肪小葉，為了對比不同直徑軸狀脂肪的存活情況，取脂工具內徑設計為4、6、8、10 mm。
1.3 脂肪抽取及體外檢測
1.3.1 脂肪抽取
實驗用脂肪由2014年5月－2015年4月于深圳市南山區人民醫院燒傷整形美容科行自體脂肪移植的12例患者自愿捐贈，用同一內徑取脂工具分別隨機在3例患者同一供區抽取脂肪。具體抽取方法：以下腹部作為脂肪供區，0.05%利多卡因及1∶20萬U腎上腺素生理鹽水浸潤麻醉后，在自然皮膚皺褶處作長約5 mm切口。將內徑為4?mm的取脂工具針筒斜面朝前，插入切口，向皮下脂肪組織旋轉推進，輕輕回抽針塞，盡量避免形成負壓，主要依靠組織擠壓使脂肪進入注射器內。取脂同時在腹部體表抓捏，使周圍組織盡量向取脂工具的方向靠攏。脂肪取出后將針筒垂直放置，截面覆蓋無菌紗布，靜置時間約5 min，吸棄沉淀的腫脹液，置于4℃標本盒中備用。同法采用內徑為6、8、10?mm的取脂工具抽取脂肪。于抽取脂肪后30 min內進行動物實驗。
1.3.2 觀測指標
①葡萄糖轉移實驗：將抽取的脂肪標本分別置于無菌培養皿中，每個培養皿中加入1?mL含糖（15?mmol/L）無血清DMEM及0.2 U普通胰島素，同時設置只含胰島素或DMEM的空白對照。搖勻后置入35℃、5%CO2恒溫孵育箱孵育1 h后，用生化分析儀測定培養液中的葡萄糖濃度。以空白對照與脂肪標本的濃度差值，作為脂肪標本葡萄糖轉移量。②脂肪細胞活性測定：采用MTT法測定脂肪細胞活性。分別取0.5 mL不同內徑取脂工具抽取的脂肪標本，混合10 mL MTT和0.2 mL電子耦合試劑后，加入含10%PBS的DMEM培養基（2 mL/孔）的24孔板，每孔1.5 mL；置于37℃、5%CO2恒溫孵育箱內，于0、1、2、3 h各取1 mL培養液，采用ELX808酶標儀于492?nm處測量吸光度（A）值。
1.4 體內脂肪移植及觀測
1.4.1 脂肪移植
將64只裸鼠隨機分為A、B、C、D 4組，每組16只。動物腹腔注射0.1%水合氯醛（10～12 mg/kg）麻醉后，A、B、C、D組裸鼠根據取脂工具內徑，于背部遠端分別作4、6、8、10 mm長橫切口，形成皮下腔隙，對應移植0.5 mL不同內徑取脂工具抽取的脂肪組織，縫合切口。見圖 1。
圖1
手術操作過程 ?植入前 ?植入后 ? ?圖 2 MTT法測定脂肪細胞活性 ? ?圖 3 植入后各時間點脂肪標本大體觀察從左至右分別為A、B、C、D組 ?植入后1周 ?植入后2周 ?植入后4周 ?植入后8周
Figure1.
Operative procedure ?Before transplantation ?After transplantation ? ?Fig. 2 The cell viability detection by MTT ? ?Fig. 3 Gross investigation of fat tissue in 4 groups after transplantation From left to right for groups A,B,C,and D respectively ?At 1 week ?At 2?weeks ?At 4 weeks ?At 8 weeks
1.4.2 觀測指標
①大體觀察：觀察各組裸鼠存活情況。脂肪植入后即刻以及1、2、4、8周，觀察各組裸鼠背部脂肪植入部位外觀。植入后1、2、4、8周采用斷頸法每組各處死4只裸鼠，完整取出剩余移植脂肪，肉眼觀察脂肪色澤及形態。 ②移植脂肪稱重：脂肪植入前以及植入后即刻，1、2、4、8周，采用AB104-S精密天平對裸鼠稱重，以植入后各時間點與植入前的體質量差值，作為移植脂肪質量。③組織學觀察：植入后1、2、4、8周大體觀察后，將脂肪標本置于10%中性甲醛固定48 h，脫水、石蠟包埋、切片，片厚5 μm。取部分切片行HE染色，鏡下觀察組織和脂肪細胞形態結構。每個標本取中心部分的2 張切片，每張切片沿縱向正中線等間距取5個視野，于200倍視野下計數完整細胞，以全部視野細胞總數作為該標本完整細胞數。完整細胞標準[11-12]：未見明顯擠壓、變形，細胞壁完整清楚，細胞核結構清晰可見。④免疫組織化學染色觀察：植入后1、2、4、8周，取脂肪標本同一位置切片進行免疫組織化學染色，采用Ⅷ因子標記毛細血管，鏡下觀察毛細血管分布、形態結構。每個標本取中心部分的2張切片，每張切片沿縱向正中線等間距取5個視野，于200倍視野下計數毛細血管數量，以全部視野毛細血管總數作為該標本毛細血管數。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 體外觀測
2.1.1 葡萄糖轉移實驗
內徑為4、6、8、10 mm取脂工具抽取的脂肪標本葡萄糖轉移量分別為（1.512±0.078）、（1.598±0.040）、（1.731±0.053）、（1.889±0.069）mmol/L。隨取脂工具內徑增加，葡萄糖轉移量逐漸增加，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.1.2 脂肪細胞活性測定
隨著觀察時間延長，各組A值均逐漸降低，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。同一時間點，隨取脂工具內徑增加，A值均呈逐漸增加趨勢，其中A、B組與D組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 2。
2.2 動物實驗
2.2.1 大體觀察
4組實驗動物均存活至實驗完成。植入脂肪組織后，各組裸鼠背部受區部位皮膚明顯隆起，但隨時間延長，背部均趨于平坦；C、D組隆起程度優于A、B組。植入后1、2周，4組取出的脂肪標本顏色、形態無明顯差異；4、8周時A、B組脂肪標本收縮，呈暗白色，內部出現液化壞死區域，C、D組脂肪標本仍保持原黃色和集聚形態，可見血管長入脂肪組織。見圖 3。
2.2.2 移植脂肪稱重
脂肪植入后即刻及1周時，4 組脂肪質量比較差異無統計學意義（P>0.05）。2、4、8周時，A組脂肪質量明顯小于其他3組，B組小于C、D組，比較差異有統計學意義（P<0.05）；C、D組間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。
表1
術后各組移植脂肪質量比較（n=4，g，2.2.3 組織學觀察
植入后1周，各組移植脂肪細胞結構清楚，組織邊緣無明顯細胞壞死、溶解等炎性反應；其中A、B、C組脂肪小葉受壓較明顯，D組脂肪細胞呈輕度受壓狀態，細胞形態接近正常。2周，D組脂肪細胞形態優于其余3組，細胞間炎性浸潤及膠原纖維增生少，中心區域的淋巴細胞浸潤不明顯。4周，A、B組出現較多的細胞破壞溶解和大泡現象，細胞形態不規則；C、D組炎性浸潤及膠原纖維增生主要集中于組織塊邊緣，但細胞結構接近正常。8周，A、B、C組可見明顯增生的膠原纖維及其間內散在的脂肪細胞，以及脂肪細胞融合后形成的大泡，淋巴細胞較前減少；D組脂肪小葉結構基本保持正常，脂肪細胞完整性較好，大小均勻，血管密度高。見圖 4。
圖2
植入后各時間點脂肪標本組織學觀察（HE×200） 從左至右分別為A、B、C、D組 ?植入后1周 ?植入后2周 ?植入后4 周 ?植入后8周
Figure2.
Histological observation of fat tissue in 4 groups after transplantation (HE×200) From left to right for groups A,B,C,and D respectively ?At 1 week ?At 2 weeks ?At 4 weeks ?At 8 weeks
完整脂肪細胞計數顯示，植入后1周各組完整脂肪細胞數比較，差異無統計學意義（P>0.05）；其余各時間點，A組完整脂肪細胞數明顯少于其余3組，B組少于C、D組，比較差異有統計學意義（P<0.05），C、D組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表 2。
表2
植入后各時間點各組完整脂肪細胞數比較（n=4，2.2.4 免疫組織化學染色觀察
植入后1周，毛細血管在各組脂肪組織內均勻分布，血管無明顯擴張及變形；2周，A、B、C組毛細血管主要集中在組織邊緣，D組毛細血管則均勻分布在標本邊緣和中央，形態良好；4、8周，D組毛細血管明顯多于其余3組，血管周圍脂肪細胞存活良好。見圖 5。
圖3
植入后各時間點脂肪標本免疫組織化學染色觀察（×200） 從左至右分別為A、B、C、D組 ?植入后1周 ?植入后2周 ?植入后4周 ?植入后8周
Figure3.
Immunohistochemical observation of fat tissue in 4 groups after transplantation (×200) From left to right for groups A,B,C,and D respectively ?At 1 week ?At 2 weeks ?At 4 weeks ?At 8 weeks
毛細血管計數顯示，隨取脂工具內徑增大，各時間點A、B、C、D組毛細血管數呈增加趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
植入后各時間點各組毛細血管數比較（n=4，3 討論
脂肪組織移植后，細胞活性能否良好保持是決定術后吸收率的主要因素。脂肪組織植入受區后，早期必須依靠周圍組織間液的滲透提供營養，但是這種滲透作用的供應區域有限，只能滋養靠近受區邊緣150～200 nm范圍內的脂肪細胞[13]。若不能及時有效地建立血供，大部分脂肪細胞將發生壞死。有研究發現，移植脂肪能夠耐受的缺血時間最長期限僅為移植后4 d[14]。所以脂肪移植后若能盡早建立充足血供，將最大程度避免脂肪細胞壞死。
脂肪組織血供的建立主要靠受區血管向移植組織生長，并構建微血管體系[15-16]。通過人體脂肪移植轉基因裸鼠實驗證明[17]，移植后再生的血管不是來源于受體裸鼠，而是移植脂肪組織。因此在取材時能保持原脂肪組織結構，將有利于移植后在受區建立新的血供系統，促進脂肪組織成活。我們既往研究[10]也證明了這一點。本研究結果表明，隨著獲得的軸狀脂肪直徑增加（取脂工具內徑增加），脂肪組織移植后外觀維持更好，剩余脂肪也明顯增多。
體外葡萄糖轉移實驗和MTT結果顯示，采用內徑較大的取脂工具獲得的軸狀脂肪能保留更多的活性脂肪細胞。組織學觀察發現，改良的取脂工具基本避免了手術過程中對脂肪組織邊緣的擠壓和破壞作用，術后各時間點C、D組完整脂肪細胞數、脂肪細胞形態均優于A、B組，并且4周后D組炎性反應、中央區壞死融合程度及形成的空泡均少于A、B、C組，說明脂肪細胞結構得到最大限度保護后，術后移植組織存活更好。免疫組織化學染色提示，D組脂肪組織移植后，毛細血管數明顯高于其余組，并且分布均勻，能保證移植脂肪的血供，維持脂肪小葉的形態和組織結構。
本研究結果表明，采用內徑10 mm取脂工具獲取的軸狀脂肪移植后存活較好。但臨床應用過程中我們發現，該內徑取脂工具取脂術中疼痛程度以及術后形成局部血腫、皮下瘀斑等并發癥明顯高于其他內徑取脂工具，供區切口瘢痕也比較長。同時，我們發現C、D組細胞活性、移植脂肪質量及完整脂肪細胞數比較，差異無統計學意義，說明單純增加取脂工具內徑以增大軸狀脂肪直徑的方法在促進脂肪存活方面作用有限，且內徑>10 mm的取脂工具因相關并發癥較多也難以廣泛應用于臨床。因此，我們認為采用內徑為8、10 mm取脂工具獲取的軸狀脂肪移植效果較好。但因裸鼠存活時間有限，該結論有待延長觀察時間并臨床應用觀察明確。
