引用本文： 鄭偉偉, 楊民, 武成, 蘇顯林. 滑膜間充質干細胞體內外成骨特性的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(1): 102-109. doi: 10.7507/1002-1892.20160021 復制
骨質破壞和骨缺損是臨床常見疾病，組織工程技術的發展為骨缺損修復提供了新方法。滑膜間充質干細胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）是目前組織工程研究熱點。SMSCs易于獲取，體外增殖和分化能力強，較其他來源MSCs有明顯優勢[1-3]。然而，SMSCs在體外誘導成骨以及在體內成骨罕見報道。本實驗通過將SMSCs體外擴增、培養、成骨分化，以及將SMSCs與羥基磷灰石/殼聚糖 /聚乳酸（hydroxylapatite/chitosan/poly L-latic acid，HA/CS/PLLA） 復合植入大鼠體內，探索SMSCs體內、體外分化成骨的能力，以期為構建組織工程骨提供種子細胞。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12周齡雄性SD大鼠26只，體質量200～250 g，由皖南醫學院弋磯山醫院中心實驗室提供。
FBS、胰蛋白酶-EDTA（HyClone公司，美國）；H-DMEM培養液（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、Ⅱ型膠原酶、HA、CS、PLLA、MTT、ALP試劑盒、茜素紅染液、氯化十六烷基吡啶（Sigma公司，美國）；Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；PrimeScriptTM RT-PCR 試劑盒（Takara公司，日本）。M?nnedorf多功能酶標儀（Tecan公司，瑞士）；紫外分光光度計（Genova Nano公司，英國）；CytoFLEX流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；DP70倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；Image J軟件（National Institutes of Health公司，美國）。
1.2 SMSCs分離培養及鑒定
1.2.1 SMSCs分離培養
取SD大鼠2只，斷頸處死，75%乙醇浸泡15～20 min，打開膝關節腔取出滑膜，PBS沖洗3遍；將滑膜周圍脂肪組織和部分結締組織剝離干凈，眼科剪將滑膜組織剪成1mm×1mm×1 mm大小碎塊，加入10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃、200 r/min震蕩消化3 h；消化后過200目濾網，以離心半徑5 cm、1 000 r/min離心5 min，棄沉淀重懸，接入培養瓶培養，置于37℃、5%CO2及飽和濕度恒溫培養箱內。24 h后可見細胞貼壁生長，每3天換液1次，待細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶消化傳代。倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。取第3代細胞行Giemsa染色，倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.2.2 流式細胞儀鑒定
根據文獻[1]方法，采用流式細胞儀對第3代SMSCs表面標記物CD147、CD90、CD105、CD44、CD117、CD34、CD14、CD45進行檢測。
1.2.3 MTT法繪制細胞曲線
取第1、2、3代SM SCs，制備濃度為1.5×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度恒溫培養箱內，每孔加入5 g/L MTT 100 μL，細胞培養箱中孵育4 h，棄培養液，將培養板晾干后每孔加入DMSO 100 μL。培養后1～6d于酶標儀450nm波長處測定各孔吸光度（A）值。
1.2.4 成脂誘導鑒定
取第3代SMSCs，以成脂誘導培養基（含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、10μg/ mL胰島素、1 mmol/L地塞米松、0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的DMEM 培養基）培養14 d，PBS洗凈，行油紅O染色觀察。
1.2.5 成骨誘導鑒定
取第3代SMSCs，以成骨誘導培養基（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.05mmol/L維生素C、100 mmol/L地塞米松的DMEM培養基）培養7 d行ALP染色鑒定，21 d行茜素紅染色鑒定。
1.3 SMSCs體外成骨培養觀測
1.3.1 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達
取第3代SMSCs按1.2.3方法成骨誘導1、7、14、21、28 d，取貼壁細胞，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，以總RNA為模板，參照PrimeScriptTM RT-PCR 試劑盒說明書，25μL作為逆轉錄反應體積進行PCR檢測。各引物序列見表 1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法檢測成骨相關基因骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原、ALP、Runx-2 mRNA相對表達量，以β-actin作為內參。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.3.2 ELISA法檢測ALP活性
取第3代SMSCs，以1.0×105個/孔接種于12孔板，加入含10%FBS的H-DMEM培養基進行培養，待細胞達100%融合時，于其中6孔加入成骨誘導液作為成骨誘導組，其余6 孔作為對照組，每個時間點設置1個孔板。分別于成骨誘導后1、3、5、7、9、11 d，PBS漂洗2次，加入1mL PBS溶液，4℃超聲裂解細胞，采用ELISA試劑盒和BCA試劑盒分析細胞裂解液中ALP和總蛋白（to talprotein，TP）含量，各組ALP活性以ALP/TP表示。
1.3.3 茜素紅S法檢測鈣鹽沉積
取第3代SMSCs，以1.0×105個/孔接種于12孔板，加入含10%FBS的H-DMEM培養基進行培養，待細胞達100%融合時，于其中4孔加入成骨誘導液作為成骨誘導組，其余4孔作為對照組，每個時間點設置1個孔板。成骨誘導7、14、21、28 d，棄培養液，70%乙醇固定30 min，PBS清洗5遍。0.5%茜素紅染液室溫浸染30 min后，去除多余染料，PBS清洗3遍，倒置熒光顯微鏡下觀察。加入氯化十六烷基室溫下浸潤30min，吸棄上清液，于分光光度計562 nm波長處測量A值，作為鈣含量。
1.4 SMSCs體內成骨培養觀測
1.4.1 HA/CS/PLLA支架材料掃描電鏡觀察
HA/CS/PLLA 支架材料由中國科技大學微尺度實驗室提供，制備方法參照文獻[4]。將HA/CS/PLLA支架材料PBS沖洗后，3%戊二醛固定3 h，乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯溶液中浸泡20 min，臨界點干燥、噴金，掃描電鏡觀察。
1.4.2 細胞-支架復合物制備
將環氧乙烷消毒后的HA/CS/PLLA材料置入培養皿中，取第3代SMSCs調整成濃度為1.0×106個/mL的細胞懸液，接種于支架材料上，每個材料接種10 μL，置于37℃、5%CO2及飽和濕度恒溫培養箱中培養3 h，然后緩慢加入含10%FBS的H-DMEM培養基，復合培養72h，備用。
1.4.3 實驗分組及方法
取SD大鼠24只，隨機分為實驗組和對照組（n=12）。3%戊巴比妥鈉（30mg/ kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下切開右下肢皮膚，鈍性分離肌肉，實驗組于肌袋內植入復合培養72h的細胞-支架復合物，對照組僅植入支架材料。縫合切口，分籠飼養。
1.4.4 觀測指標
①大體觀察：術后觀察大鼠活動、切口愈合及進食情況。②X線片觀察：術后4、8周，兩組分別取6只動物處死，于右下肢行X線片檢查，采用Image J軟件計算相對灰度值。③組織學觀察：術后4、8周，取出兩組植入物，去除材料周圍脂肪及纖維組織，PBS沖洗；標本于10%多聚甲醛固定72h，乙醇梯度脫水、石蠟包埋切片，片厚5 μm，每個標本取3張切片，常規行HE染色，光鏡下觀察。高倍鏡下隨機測定每張切片3個非重復視野內新骨面積，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SMSCs分離培養及鑒定
2.1.1 形態學觀察
分離的原代細胞24 h后貼壁，呈不規則形狀生長（圖 1a）。第2代SMSCs形態混雜，主要以梭形、長梭形為主，可見少量圓形巨噬樣細胞（圖 1b）。第3代SMSCs鋪滿瓶底，呈長梭形，主要為滑膜成纖維樣細胞（圖 1c）。第3代細胞Giemsa染色示細胞為長梭形成纖維樣細胞（圖 2）。
圖1
SMSCs形態學觀察 ? 原代細胞（倒置相差顯微鏡×10） ? 第2代細胞（倒置相差顯微鏡×20） ? 第3代細胞（倒置相差顯微鏡 ×20） 圖 2 第3代SMSCs Giemsa染色觀察（倒置熒光顯微鏡×20） 圖 3 MTT法檢測第1～3代細胞增殖曲線 圖 4 SMSCs多向分化鑒定（倒置熒光顯微鏡×20） ? 成脂誘導14 d油紅O染色 ? 成骨誘導7 d ALP染色 ? 成骨誘導28 d茜素紅染色 圖 5 實時熒光定量PCR檢測SMSCs體外成骨培養各時間點目的基因表達
Figure1.
Morphological observation of SMSCs ? Primary SMSCs (Inverted phase contrast microscope×10) ? The 2rd passage SMSCs (Inverted phase contrast microscope×20) ? The 3rd passage SMSCs (Inverted phase contrast microscope×20) Fig. 2 Giemsa staining observation of the 3rd passage SMSCs (Inverted fluorescent microscope×20) Fig. 3 The proliferation curve of passages 1-3 SMSCs by MTT method Fig. 4 Identification of multiple differentiation potential of SMSCs (Inverted fluorescent microscope×20) ? Oil red O staining of SMSCs after adipogenic induction for 14 days ? ALP staining of SMSCs after osteogenic induction for 7 days ? Alirazin red staining of SMSCs after osteogenic induction for 28days Fig. 5 Relative expressions of osteogenic related genes at different time points by real-time fluorescent quantitative PCR
2.1.2 流式細胞儀鑒定
第3代SMSCs流式細胞儀檢測結果示，CD147、CD90、CD105、CD44呈陽性表達，表達率分別為98.92%±0.21%、96.41%±0.18%、99.56%±0.17%、95.45%±0.29%；而CD117、CD34、CD14、
CD45呈陰性表達，表達率分別為4.53%± 1.23%、3.85%±1.07%、7.36%±2.34%、4.41%±1.21%。
2.1.3 MTT法檢測細胞增殖率
隨著培養時間延長，第1～3代細胞A值均逐漸增高；第2、3代細胞呈S形增殖曲線，1、2 d為平臺期，3～5 d為對數生長期，6 d后細胞密度較大，細胞間接觸抑制生長，進入平臺期。見圖 3。
2.1.4 成脂、成骨誘導鑒定
SMSCs成脂誘導14d，油紅O染色可見紅染的塊狀脂滴（圖 4 a）；成骨誘導7 d，ALP染色可見細胞質咖啡樣深染（圖 4 b）；成骨誘導28 d，茜素紅染色可見紅色鈣化灶（圖 4 c）。
2.2 SMSCs體外成骨培養觀測
2.2.1 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達
成骨分化晚期標志基因OCN在培養7 d上升不明顯；與1、7 d比較，OCN在14 d后上升顯著，28 d達峰值，差異有統計學意義（P<0.05）。與培養1d相比，成骨分化早期標志基因Ⅰ型膠原在培養7d上升顯著，差異有統計學意義（P<0.05）；14、21、28 d與1d相比無明顯上調（P>0.05）。而成骨標志基因ALP、Runx-2在培養7～28 d均明顯上調，與1d時比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
2.2.2 ALP活性測定
成骨誘導組誘導1、3 d，ALP活性均增加不明顯，5 d ALP活性明顯增強，7 d時達峰值，9、11 d ALP活性逐漸降低；5～11d ALP活性均顯著高于1、3 d，差異有統計學意義（P<0.05），且5～11 d各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。誘導后5、7、9、11 d成骨誘導組ALP活性均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
成骨誘導后各時間點成骨誘導組及對照組ALP活性比較（n=6，2.2.3 茜素紅鈣含量測定
SMSCs成骨誘導7 d時茜素紅染色未見鈣基質，14 d開始出現鈣沉積，21 d可見鈣化結節，28 d可見大量鈣化結節和鈣沉積；對照組各時間點均未見紅染的鈣化灶。見圖 6。成骨誘導組誘導培養14、21、28 d，鈣含量顯著高于7d時，也均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
圖2
成骨誘導組及對照組誘導培養后各時間點茜素紅染色觀察（倒置熒光顯微鏡×20） ? 成骨誘導組7 d ? 成骨誘導組14 d ? 成骨誘導組21 d ? 成骨誘導組28 d ? 對照組28 d 圖 7 HA/CS/PLLA支架材料掃描電鏡觀察 ? ×1 000 ? ×10 k 圖 8 實驗組及對照組術后各時間點X線片觀察 ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 對照組4周 ? 對照組8周 圖 9 實驗組及對照組術后各時間點組織學觀察（HE×10） ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 對照組4周 ? 對照組8周
Figure2.
Alirazin red staining observation of SMSC-induced group and control group at different time points after osteogenic induction (Inverted fluorescent microscope×20) ? SMSC-induced group at 7 days ? SMSC-induced group at 14 days ? SMSC-induced group at 21 days ? SMSC-induced group at 28 days ? Control group at 28 days Fig. 7 Scanning electron microscope observation of HA/CS/PLLA ? ×1 000 ? ×10k Fig. 8 X-ray films observation of experimental group and control group at different time points after in vivo implantation ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks Fig. 9 Histological observation of experimental group and control group at different time points after in vivo implantation (HE×10) ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks
表3
誘導后各時間點成骨誘導組及對照組鈣含量比較（n=6，2.3 SMSCs體內成骨培養觀測
2.3.1 HA/CS/PLLA支架材料掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，材料表面分布著大小不等的孔隙，內部為三維網狀結構（圖 7），為細胞附著、生長以及營養物質運輸提供了有利場所。
2.3.2 大體觀察
24只大鼠全部存活，術后切口均Ⅰ 期愈合，無炎性反應發生；實驗期間動物進食正常。
2.3.3 X線片檢測
術后4、8周，實驗組與對照組均有高密度影，其中實驗組骨密度高于對照組（圖 8）。4、8周實驗組相對灰度值分別為12.61±1.44和29.73±1.67，均分別高于對照組的4.85±0.84和13.23±0.92，差異有統計學意義（t=13.964，P=0.000；t=25.962，P=0.000）。
2.3.3 組織學觀察
術后4周，對照組可見大量成骨細胞及少量未成熟的骨基質，支架材料未完全降解；實驗組可見大量成骨細胞及未成熟的骨基質，還有較多軟骨基質形成，支架材料完全降解。術后8 周，對照組可見少量新骨形成，支架材料完全降解，并可見大量未成熟的骨基質；實驗組可見大量新骨，并有少量未成熟的骨基質，纖維結締組織長入其中。見圖 9。
圖像分析顯示，術后4、8周實驗組新骨面積分別為（2.41±0.29）μm2和（12.93±1.09）μm2，均高于對照組的（0.62±0.21）μm2和（8.44±0.91）μm2，差異有統計學意義（t=14.998，P=0.000；t=9.486，P=0.000）。
3 討論
3.1 SMSCs來源和特征
SMSCs來源于滑膜組織，而滑膜組織缺少血管，因此SMSCs原代培養中不會因血細胞的摻雜受到影響，并且滑膜可再生，在腔鏡下也易于獲取。滑膜細胞包含多種類型，主要有巨噬樣細胞和成纖維樣細胞，SMSCs具有成纖維樣細胞形態特征[5-6]；且體外培養中，SMSCs增殖速率較其他MSCs更快[1-2]。因此，SMSCs在組織工程中的應用更具優勢。
SMSCs具有和其他MSCs相似的表面抗原決定簇，迄今為止尚未發現SMSCs特有的表面抗原決定簇，但相較于BMSCs，SMSCs的CD90表達量更高。本研究發現SMSCs高表達CD147、CD90、CD105、CD44，而CD117、CD34、CD14、CD45則呈陰性表達，與文獻報道一致[1]。
3.2 SMSCs體外成骨分化
正常情況下滑膜細胞不具有成骨作用，而在病理情況下，如骨關節病患者的關節滑液中，發現有焦磷酸鈣礦化顆粒，且關節緣有骨贅形成[7-8]，體外培養其滑膜成纖維細胞能形成礦化結節[9]，說明滑膜細胞具有成骨分化潛能。SMSCs成骨誘導既往已有學者研究[2, 10]，本實驗使用的成骨誘導液[11]，其中地塞米松參與BMSCs增殖及調控早期Ⅰ型膠原形成；β-甘油磷酸鈉屬于有機磷類，可被ALP水解，釋放無機磷，從而促進細胞外基質礦化。本實驗中SM SCs體外成骨誘導后ALP染色和茜素紅染色陽性，驗證了該成骨誘導液的可行性。
為了進一步從轉錄水平上驗證這一結果，我們對成骨誘導后不同時間點SMSCs成骨相關基因的表達進行檢測。OCN是成骨分化晚期的標志基因，其在誘導1～7 d上升并不明顯，而14 d后上升顯著，并在28d達最大值（P<0.05）；而Ⅰ型膠原、ALP、Runx-2均為成骨分化早期的標志基因，尤其在1～7d上升顯著（P<0.05），7 d后開始回落。ALP是骨形成必需的酶，也是評價骨形成的常見指標，細胞外基質中ALP增加會促使細胞外基質礦化，表現為大量鈣鹽沉積。實驗中細胞在誘導后1、3 d ALP增加并不明顯，5 d ALP活性開始明顯增強，7 d達峰值。茜素紅染色可以看出，在成骨誘導14 d開始有鈣鹽沉積，21 d有鈣化結節形成，28 d有大量被染成紅色的鈣鹽沉積和鈣結節。提示SMSCs成骨誘導 7d，細胞外基質開始成熟；14 d進入細胞外基質礦化期，產生大量鈣鹽，從而實現SMSCs成骨分化。
3.3 SMSCs體內成骨
為了觀察SMSCs在體內能否形成新骨，本實驗使用了骨組織工程支架材料HA/CS/PLLA。HA/ CS/ PLLA具有良好的骨傳導性和骨誘導性[12-13]，且植入體內后未發現排斥反應和毒性反應。由于SMSCs成骨分化與其所處環境有關，因此我們將SMSCs與HA/CS/PLLA復合培養72 h后植入大鼠下肢肌袋內。4周和8周分別行X線片觀察和組織學觀察，發現兩組均有新骨形成，而實驗組成骨量均高于對照組（P<0.05），提示SMSCs可在體內異位成骨；而4周時材料內可見大量軟骨基質，對照組未見明顯軟骨基質，提示SMSCs可能是經軟骨成骨。
骨誘導材料的異位成骨機制目前尚不明確，其可能機制為：HA/CS/PLLA周圍的結締組織和血管組織可成為MSCs和成骨祖細胞來源，在骨誘導材料適宜的微環境下可促進細胞向成骨細胞分化并形成新骨。本實驗結果表明，SMSCs在體外經成骨誘導后可轉化為成骨細胞；而在體內適宜的成骨信號分子和微環境作用下也可轉化為成骨細胞[14-18]，HA/CS/PLLA支架材料可能為SMSCs體內成骨分化提供了適宜的微環境。HA/CS/PLLA支架材料具有多孔結構，有助于復合SMSCs以及周邊MSCs、成骨細胞及血細胞，促進其在材料內黏附、增殖和分化，也有利于各種生長因子和營養物質在支架內均勻分布，增加了其“成骨微環境”的作用范圍，最終誘導SM SCs 向骨前體細胞轉化，在體內異位成骨。本實驗SMSCs在植入大鼠體內前并未經體外成骨誘導，雖然有學者認為體外成骨誘導可提高MSCs體內成骨能力[20-21]，但體外成骨誘導會對細胞表型產生破壞，不僅增加了體外培養時間，甚至存在激發惡性腫瘤的風險[22]，給臨床應用帶來諸多不確定因素。
綜上述，SMSCs經成骨誘導后可分化成骨，在體內亦可形成新骨，為骨組織工程種子細胞的選擇提供了新參考。
骨質破壞和骨缺損是臨床常見疾病，組織工程技術的發展為骨缺損修復提供了新方法。滑膜間充質干細胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）是目前組織工程研究熱點。SMSCs易于獲取，體外增殖和分化能力強，較其他來源MSCs有明顯優勢[1-3]。然而，SMSCs在體外誘導成骨以及在體內成骨罕見報道。本實驗通過將SMSCs體外擴增、培養、成骨分化，以及將SMSCs與羥基磷灰石/殼聚糖 /聚乳酸（hydroxylapatite/chitosan/poly L-latic acid，HA/CS/PLLA） 復合植入大鼠體內，探索SMSCs體內、體外分化成骨的能力，以期為構建組織工程骨提供種子細胞。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12周齡雄性SD大鼠26只，體質量200～250 g，由皖南醫學院弋磯山醫院中心實驗室提供。
FBS、胰蛋白酶-EDTA（HyClone公司，美國）；H-DMEM培養液（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、Ⅱ型膠原酶、HA、CS、PLLA、MTT、ALP試劑盒、茜素紅染液、氯化十六烷基吡啶（Sigma公司，美國）；Trizol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；PrimeScriptTM RT-PCR 試劑盒（Takara公司，日本）。M?nnedorf多功能酶標儀（Tecan公司，瑞士）；紫外分光光度計（Genova Nano公司，英國）；CytoFLEX流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；DP70倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Leica公司，德國）；Image J軟件（National Institutes of Health公司，美國）。
1.2 SMSCs分離培養及鑒定
1.2.1 SMSCs分離培養
取SD大鼠2只，斷頸處死，75%乙醇浸泡15～20 min，打開膝關節腔取出滑膜，PBS沖洗3遍；將滑膜周圍脂肪組織和部分結締組織剝離干凈，眼科剪將滑膜組織剪成1mm×1mm×1 mm大小碎塊，加入10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃、200 r/min震蕩消化3 h；消化后過200目濾網，以離心半徑5 cm、1 000 r/min離心5 min，棄沉淀重懸，接入培養瓶培養，置于37℃、5%CO2及飽和濕度恒溫培養箱內。24 h后可見細胞貼壁生長，每3天換液1次，待細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶消化傳代。倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。取第3代細胞行Giemsa染色，倒置熒光顯微鏡下觀察。
1.2.2 流式細胞儀鑒定
根據文獻[1]方法，采用流式細胞儀對第3代SMSCs表面標記物CD147、CD90、CD105、CD44、CD117、CD34、CD14、CD45進行檢測。
1.2.3 MTT法繪制細胞曲線
取第1、2、3代SM SCs，制備濃度為1.5×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度恒溫培養箱內，每孔加入5 g/L MTT 100 μL，細胞培養箱中孵育4 h，棄培養液，將培養板晾干后每孔加入DMSO 100 μL。培養后1～6d于酶標儀450nm波長處測定各孔吸光度（A）值。
1.2.4 成脂誘導鑒定
取第3代SMSCs，以成脂誘導培養基（含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、10μg/ mL胰島素、1 mmol/L地塞米松、0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛的DMEM 培養基）培養14 d，PBS洗凈，行油紅O染色觀察。
1.2.5 成骨誘導鑒定
取第3代SMSCs，以成骨誘導培養基（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、0.05mmol/L維生素C、100 mmol/L地塞米松的DMEM培養基）培養7 d行ALP染色鑒定，21 d行茜素紅染色鑒定。
1.3 SMSCs體外成骨培養觀測
1.3.1 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達
取第3代SMSCs按1.2.3方法成骨誘導1、7、14、21、28 d，取貼壁細胞，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，以總RNA為模板，參照PrimeScriptTM RT-PCR 試劑盒說明書，25μL作為逆轉錄反應體積進行PCR檢測。各引物序列見表 1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用2-ΔΔCt法檢測成骨相關基因骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型膠原、ALP、Runx-2 mRNA相對表達量，以β-actin作為內參。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences for target genes
1.3.2 ELISA法檢測ALP活性
取第3代SMSCs，以1.0×105個/孔接種于12孔板，加入含10%FBS的H-DMEM培養基進行培養，待細胞達100%融合時，于其中6孔加入成骨誘導液作為成骨誘導組，其余6 孔作為對照組，每個時間點設置1個孔板。分別于成骨誘導后1、3、5、7、9、11 d，PBS漂洗2次，加入1mL PBS溶液，4℃超聲裂解細胞，采用ELISA試劑盒和BCA試劑盒分析細胞裂解液中ALP和總蛋白（to talprotein，TP）含量，各組ALP活性以ALP/TP表示。
1.3.3 茜素紅S法檢測鈣鹽沉積
取第3代SMSCs，以1.0×105個/孔接種于12孔板，加入含10%FBS的H-DMEM培養基進行培養，待細胞達100%融合時，于其中4孔加入成骨誘導液作為成骨誘導組，其余4孔作為對照組，每個時間點設置1個孔板。成骨誘導7、14、21、28 d，棄培養液，70%乙醇固定30 min，PBS清洗5遍。0.5%茜素紅染液室溫浸染30 min后，去除多余染料，PBS清洗3遍，倒置熒光顯微鏡下觀察。加入氯化十六烷基室溫下浸潤30min，吸棄上清液，于分光光度計562 nm波長處測量A值，作為鈣含量。
1.4 SMSCs體內成骨培養觀測
1.4.1 HA/CS/PLLA支架材料掃描電鏡觀察
HA/CS/PLLA 支架材料由中國科技大學微尺度實驗室提供，制備方法參照文獻[4]。將HA/CS/PLLA支架材料PBS沖洗后，3%戊二醛固定3 h，乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯溶液中浸泡20 min，臨界點干燥、噴金，掃描電鏡觀察。
1.4.2 細胞-支架復合物制備
將環氧乙烷消毒后的HA/CS/PLLA材料置入培養皿中，取第3代SMSCs調整成濃度為1.0×106個/mL的細胞懸液，接種于支架材料上，每個材料接種10 μL，置于37℃、5%CO2及飽和濕度恒溫培養箱中培養3 h，然后緩慢加入含10%FBS的H-DMEM培養基，復合培養72h，備用。
1.4.3 實驗分組及方法
取SD大鼠24只，隨機分為實驗組和對照組（n=12）。3%戊巴比妥鈉（30mg/ kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下切開右下肢皮膚，鈍性分離肌肉，實驗組于肌袋內植入復合培養72h的細胞-支架復合物，對照組僅植入支架材料。縫合切口，分籠飼養。
1.4.4 觀測指標
①大體觀察：術后觀察大鼠活動、切口愈合及進食情況。②X線片觀察：術后4、8周，兩組分別取6只動物處死，于右下肢行X線片檢查，采用Image J軟件計算相對灰度值。③組織學觀察：術后4、8周，取出兩組植入物，去除材料周圍脂肪及纖維組織，PBS沖洗；標本于10%多聚甲醛固定72h，乙醇梯度脫水、石蠟包埋切片，片厚5 μm，每個標本取3張切片，常規行HE染色，光鏡下觀察。高倍鏡下隨機測定每張切片3個非重復視野內新骨面積，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SMSCs分離培養及鑒定
2.1.1 形態學觀察
分離的原代細胞24 h后貼壁，呈不規則形狀生長（圖 1a）。第2代SMSCs形態混雜，主要以梭形、長梭形為主，可見少量圓形巨噬樣細胞（圖 1b）。第3代SMSCs鋪滿瓶底，呈長梭形，主要為滑膜成纖維樣細胞（圖 1c）。第3代細胞Giemsa染色示細胞為長梭形成纖維樣細胞（圖 2）。
圖1
SMSCs形態學觀察 ? 原代細胞（倒置相差顯微鏡×10） ? 第2代細胞（倒置相差顯微鏡×20） ? 第3代細胞（倒置相差顯微鏡 ×20） 圖 2 第3代SMSCs Giemsa染色觀察（倒置熒光顯微鏡×20） 圖 3 MTT法檢測第1～3代細胞增殖曲線 圖 4 SMSCs多向分化鑒定（倒置熒光顯微鏡×20） ? 成脂誘導14 d油紅O染色 ? 成骨誘導7 d ALP染色 ? 成骨誘導28 d茜素紅染色 圖 5 實時熒光定量PCR檢測SMSCs體外成骨培養各時間點目的基因表達
Figure1.
Morphological observation of SMSCs ? Primary SMSCs (Inverted phase contrast microscope×10) ? The 2rd passage SMSCs (Inverted phase contrast microscope×20) ? The 3rd passage SMSCs (Inverted phase contrast microscope×20) Fig. 2 Giemsa staining observation of the 3rd passage SMSCs (Inverted fluorescent microscope×20) Fig. 3 The proliferation curve of passages 1-3 SMSCs by MTT method Fig. 4 Identification of multiple differentiation potential of SMSCs (Inverted fluorescent microscope×20) ? Oil red O staining of SMSCs after adipogenic induction for 14 days ? ALP staining of SMSCs after osteogenic induction for 7 days ? Alirazin red staining of SMSCs after osteogenic induction for 28days Fig. 5 Relative expressions of osteogenic related genes at different time points by real-time fluorescent quantitative PCR
2.1.2 流式細胞儀鑒定
第3代SMSCs流式細胞儀檢測結果示，CD147、CD90、CD105、CD44呈陽性表達，表達率分別為98.92%±0.21%、96.41%±0.18%、99.56%±0.17%、95.45%±0.29%；而CD117、CD34、CD14、
CD45呈陰性表達，表達率分別為4.53%± 1.23%、3.85%±1.07%、7.36%±2.34%、4.41%±1.21%。
2.1.3 MTT法檢測細胞增殖率
隨著培養時間延長，第1～3代細胞A值均逐漸增高；第2、3代細胞呈S形增殖曲線，1、2 d為平臺期，3～5 d為對數生長期，6 d后細胞密度較大，細胞間接觸抑制生長，進入平臺期。見圖 3。
2.1.4 成脂、成骨誘導鑒定
SMSCs成脂誘導14d，油紅O染色可見紅染的塊狀脂滴（圖 4 a）；成骨誘導7 d，ALP染色可見細胞質咖啡樣深染（圖 4 b）；成骨誘導28 d，茜素紅染色可見紅色鈣化灶（圖 4 c）。
2.2 SMSCs體外成骨培養觀測
2.2.1 實時熒光定量PCR檢測相關基因表達
成骨分化晚期標志基因OCN在培養7 d上升不明顯；與1、7 d比較，OCN在14 d后上升顯著，28 d達峰值，差異有統計學意義（P<0.05）。與培養1d相比，成骨分化早期標志基因Ⅰ型膠原在培養7d上升顯著，差異有統計學意義（P<0.05）；14、21、28 d與1d相比無明顯上調（P>0.05）。而成骨標志基因ALP、Runx-2在培養7～28 d均明顯上調，與1d時比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
2.2.2 ALP活性測定
成骨誘導組誘導1、3 d，ALP活性均增加不明顯，5 d ALP活性明顯增強，7 d時達峰值，9、11 d ALP活性逐漸降低；5～11d ALP活性均顯著高于1、3 d，差異有統計學意義（P<0.05），且5～11 d各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。誘導后5、7、9、11 d成骨誘導組ALP活性均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
成骨誘導后各時間點成骨誘導組及對照組ALP活性比較（n=6，2.2.3 茜素紅鈣含量測定
SMSCs成骨誘導7 d時茜素紅染色未見鈣基質，14 d開始出現鈣沉積，21 d可見鈣化結節，28 d可見大量鈣化結節和鈣沉積；對照組各時間點均未見紅染的鈣化灶。見圖 6。成骨誘導組誘導培養14、21、28 d，鈣含量顯著高于7d時，也均高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
圖2
成骨誘導組及對照組誘導培養后各時間點茜素紅染色觀察（倒置熒光顯微鏡×20） ? 成骨誘導組7 d ? 成骨誘導組14 d ? 成骨誘導組21 d ? 成骨誘導組28 d ? 對照組28 d 圖 7 HA/CS/PLLA支架材料掃描電鏡觀察 ? ×1 000 ? ×10 k 圖 8 實驗組及對照組術后各時間點X線片觀察 ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 對照組4周 ? 對照組8周 圖 9 實驗組及對照組術后各時間點組織學觀察（HE×10） ? 實驗組4周 ? 實驗組8周 ? 對照組4周 ? 對照組8周
Figure2.
Alirazin red staining observation of SMSC-induced group and control group at different time points after osteogenic induction (Inverted fluorescent microscope×20) ? SMSC-induced group at 7 days ? SMSC-induced group at 14 days ? SMSC-induced group at 21 days ? SMSC-induced group at 28 days ? Control group at 28 days Fig. 7 Scanning electron microscope observation of HA/CS/PLLA ? ×1 000 ? ×10k Fig. 8 X-ray films observation of experimental group and control group at different time points after in vivo implantation ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks Fig. 9 Histological observation of experimental group and control group at different time points after in vivo implantation (HE×10) ? Experimental group at 4 weeks ? Experimental group at 8 weeks ? Control group at 4 weeks ? Control group at 8 weeks
表3
誘導后各時間點成骨誘導組及對照組鈣含量比較（n=6，2.3 SMSCs體內成骨培養觀測
2.3.1 HA/CS/PLLA支架材料掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，材料表面分布著大小不等的孔隙，內部為三維網狀結構（圖 7），為細胞附著、生長以及營養物質運輸提供了有利場所。
2.3.2 大體觀察
24只大鼠全部存活，術后切口均Ⅰ 期愈合，無炎性反應發生；實驗期間動物進食正常。
2.3.3 X線片檢測
術后4、8周，實驗組與對照組均有高密度影，其中實驗組骨密度高于對照組（圖 8）。4、8周實驗組相對灰度值分別為12.61±1.44和29.73±1.67，均分別高于對照組的4.85±0.84和13.23±0.92，差異有統計學意義（t=13.964，P=0.000；t=25.962，P=0.000）。
2.3.3 組織學觀察
術后4周，對照組可見大量成骨細胞及少量未成熟的骨基質，支架材料未完全降解；實驗組可見大量成骨細胞及未成熟的骨基質，還有較多軟骨基質形成，支架材料完全降解。術后8 周，對照組可見少量新骨形成，支架材料完全降解，并可見大量未成熟的骨基質；實驗組可見大量新骨，并有少量未成熟的骨基質，纖維結締組織長入其中。見圖 9。
圖像分析顯示，術后4、8周實驗組新骨面積分別為（2.41±0.29）μm2和（12.93±1.09）μm2，均高于對照組的（0.62±0.21）μm2和（8.44±0.91）μm2，差異有統計學意義（t=14.998，P=0.000；t=9.486，P=0.000）。
3 討論
3.1 SMSCs來源和特征
SMSCs來源于滑膜組織，而滑膜組織缺少血管，因此SMSCs原代培養中不會因血細胞的摻雜受到影響，并且滑膜可再生，在腔鏡下也易于獲取。滑膜細胞包含多種類型，主要有巨噬樣細胞和成纖維樣細胞，SMSCs具有成纖維樣細胞形態特征[5-6]；且體外培養中，SMSCs增殖速率較其他MSCs更快[1-2]。因此，SMSCs在組織工程中的應用更具優勢。
SMSCs具有和其他MSCs相似的表面抗原決定簇，迄今為止尚未發現SMSCs特有的表面抗原決定簇，但相較于BMSCs，SMSCs的CD90表達量更高。本研究發現SMSCs高表達CD147、CD90、CD105、CD44，而CD117、CD34、CD14、CD45則呈陰性表達，與文獻報道一致[1]。
3.2 SMSCs體外成骨分化
正常情況下滑膜細胞不具有成骨作用，而在病理情況下，如骨關節病患者的關節滑液中，發現有焦磷酸鈣礦化顆粒，且關節緣有骨贅形成[7-8]，體外培養其滑膜成纖維細胞能形成礦化結節[9]，說明滑膜細胞具有成骨分化潛能。SMSCs成骨誘導既往已有學者研究[2, 10]，本實驗使用的成骨誘導液[11]，其中地塞米松參與BMSCs增殖及調控早期Ⅰ型膠原形成；β-甘油磷酸鈉屬于有機磷類，可被ALP水解，釋放無機磷，從而促進細胞外基質礦化。本實驗中SM SCs體外成骨誘導后ALP染色和茜素紅染色陽性，驗證了該成骨誘導液的可行性。
為了進一步從轉錄水平上驗證這一結果，我們對成骨誘導后不同時間點SMSCs成骨相關基因的表達進行檢測。OCN是成骨分化晚期的標志基因，其在誘導1～7 d上升并不明顯，而14 d后上升顯著，并在28d達最大值（P<0.05）；而Ⅰ型膠原、ALP、Runx-2均為成骨分化早期的標志基因，尤其在1～7d上升顯著（P<0.05），7 d后開始回落。ALP是骨形成必需的酶，也是評價骨形成的常見指標，細胞外基質中ALP增加會促使細胞外基質礦化，表現為大量鈣鹽沉積。實驗中細胞在誘導后1、3 d ALP增加并不明顯，5 d ALP活性開始明顯增強，7 d達峰值。茜素紅染色可以看出，在成骨誘導14 d開始有鈣鹽沉積，21 d有鈣化結節形成，28 d有大量被染成紅色的鈣鹽沉積和鈣結節。提示SMSCs成骨誘導 7d，細胞外基質開始成熟；14 d進入細胞外基質礦化期，產生大量鈣鹽，從而實現SMSCs成骨分化。
3.3 SMSCs體內成骨
為了觀察SMSCs在體內能否形成新骨，本實驗使用了骨組織工程支架材料HA/CS/PLLA。HA/ CS/ PLLA具有良好的骨傳導性和骨誘導性[12-13]，且植入體內后未發現排斥反應和毒性反應。由于SMSCs成骨分化與其所處環境有關，因此我們將SMSCs與HA/CS/PLLA復合培養72 h后植入大鼠下肢肌袋內。4周和8周分別行X線片觀察和組織學觀察，發現兩組均有新骨形成，而實驗組成骨量均高于對照組（P<0.05），提示SMSCs可在體內異位成骨；而4周時材料內可見大量軟骨基質，對照組未見明顯軟骨基質，提示SMSCs可能是經軟骨成骨。
骨誘導材料的異位成骨機制目前尚不明確，其可能機制為：HA/CS/PLLA周圍的結締組織和血管組織可成為MSCs和成骨祖細胞來源，在骨誘導材料適宜的微環境下可促進細胞向成骨細胞分化并形成新骨。本實驗結果表明，SMSCs在體外經成骨誘導后可轉化為成骨細胞；而在體內適宜的成骨信號分子和微環境作用下也可轉化為成骨細胞[14-18]，HA/CS/PLLA支架材料可能為SMSCs體內成骨分化提供了適宜的微環境。HA/CS/PLLA支架材料具有多孔結構，有助于復合SMSCs以及周邊MSCs、成骨細胞及血細胞，促進其在材料內黏附、增殖和分化，也有利于各種生長因子和營養物質在支架內均勻分布，增加了其“成骨微環境”的作用范圍，最終誘導SM SCs 向骨前體細胞轉化，在體內異位成骨。本實驗SMSCs在植入大鼠體內前并未經體外成骨誘導，雖然有學者認為體外成骨誘導可提高MSCs體內成骨能力[20-21]，但體外成骨誘導會對細胞表型產生破壞，不僅增加了體外培養時間，甚至存在激發惡性腫瘤的風險[22]，給臨床應用帶來諸多不確定因素。
綜上述，SMSCs經成骨誘導后可分化成骨，在體內亦可形成新骨，為骨組織工程種子細胞的選擇提供了新參考。
